CN104673743A - 一种从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，本发明提供了从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法，可通用于不同来源的组织进行原代细胞培养，是将所需要培养的组织收集在冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中，洗去组织表面血污，放在胎牛血清里剪碎，均匀铺在皿/孔上，倒置在孵箱中1-2h，利用胎牛血清使组织黏贴在培养皿/孔上，沿培养皿/孔边缓慢加入适量的相应培养液，轻轻挪入孵箱中培养。本发明的方法培养各类原代细胞的成功率高，在形态结构和功能活动上更好地保持了体内原组织的状态，表达相应特异性标记的细胞比例都很高，而且数量多，本发明为原代细胞的研究提供了丰富而全面的实验材料，在基础研究及临床应用上都具有广泛的前景。

Description

一种从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法。

背景技术

原代培养指的是通过组织块直接长出的细胞或用酶或机械方法将组织分散成的单个细胞的方法，这些细胞和组织刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，多呈二倍体核型，与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。原代细胞是研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖、分化很好的实验对象；还可直接服务于临床实践，例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用；另外，原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。细胞培养技术在生物、医学科学研究中的应用越来越广泛。

机体是由千千万万个形态结构、遗传物质不同的细胞构成，并且细胞与细胞之间存在相互调节、彼此影响，在机体内进行某一类细胞的研究是无法实现的，因为体内环境复杂，条件不容易控制，而建系的癌细胞在培养过程中往往失去了很多原有的特征，大多已发生异倍化，具异倍体核型，不能完全正确的反应体内状态；而且有些部位的细胞又不能够形成稳定的细胞株，如微小血管的平滑肌细胞。因此我们常常需要通过原代培养技术从组织中培养出原代细胞来进行研究.

目前，最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂(如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca²⁺，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。经我们实验发现分散细胞培养法步骤繁琐，对细胞的影响较大，分散程度不易掌握，在打散细胞连接时会严重破坏细胞膜上表达的蛋白成分，导致蛋白组织学的研究出现假阴性结果，另外，细胞得率低，活力下降，生长缓慢，难以成功传代。而组织块培养法避免了该弊端，具有成功率高、所需组织量少、温和、耗时短、经济、避免外源性蛋白污染等优点(Priya N,Sarcar S,Majumdar AS,et at.Explant culture:a simple,reproducible,efficient and economic technique forisolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue andlipoaspirate[J].J Tissue Engi Regen Med,2012,July 27:1-9.)，对细胞表面的蛋白质损伤比较小，可用于后续细胞表面分子筛选、细胞药物敏感试验、细胞的分选与鉴定等研究。

但是，目前组织块培养法需要组织块贴壁，细胞才有可能爬出，这是本方法最大的难点，组织块贴壁不牢易漂浮，爬出的细胞数就少，现有技术中报道的提高组织块贴壁率的培养方法也不统一，大多是少加培养液，当然还有将组织块上方放盖玻片，或者在培养皿/孔底涂胎牛血清或铺上细胞外基质，或者在培养皿/孔底面先行划痕，甚至划痕、涂胎牛血清两法并用等方法(Elliget,K.A.and Lecher,J.F.Normal human bronchial epithelial cell cultures.In Freshney,R.I.Culture of epithelial cell.New York,Wiley-Liss,1992,181-196.Nicosia,R.F.and Ottinetti,A.Modulation of microvascular growth andmorphogenesis by reconstituted basement membrane gel in three-dimensionalcultures of rat aorta:A comparative study of angiogenesis in Matrigel,collgen,fibrin,and plasma clot.In Vitro Cell Dev.Biol.1990,26:119-128.)，但这些方法要么操作难度大易污染，要么组织贴壁成功率还是不高，对于不同来源的组织所用的培养方法各异，这些培养技术不仅对实验人员的经验要求很高，而且不容易掌握。

目前尚无一种可以应用于多种来源的组织培养原代细胞，方法简单易操作，培养稳定，重复性高，初学者易掌握，成功率极高，得到的细胞形态稳定、活性好、数量足，细胞增殖能力强；且缩短试验周期，降低了实验成本，提高了实验效率的原代细胞组织块培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种原代细胞的组织块培养方法，具体是从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法，可通用于绝大多数不同来源的动物组织进行原代细胞的培养，而且该培养方法简单易掌握，成功率高，获得的原代细胞形态稳定、活性好、数量足，细胞增殖能力强。

本发明采用的技术方案如下：

本发明拟在解决组织块培养法存在的技术难点—即组织块贴壁不牢易漂浮，爬出的细胞数就较少，如何提高组织块贴壁率是获得活性好、数量足原代细胞的技术关键。本发明意外发现，采用胎牛血清辅助组织贴壁的方法，可用于不同来源的组织培养原代细胞，本发明的主要技术方案是将所需要培养的组织收集在冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中，洗去组织表面血污，放在胎牛血清里用眼科剪剪碎，均匀铺在皿/孔上，倒置放于孵箱一定时间，利用胎牛血清使组织黏贴在皿/孔上，沿皿/孔边缓慢加入适量的相应培养液，轻轻挪入孵箱中静置培养。

本发明提供了一种原代细胞的组织块培养方法，包括以下步骤：

j)将组织处理器械(剪刀和镊子，剪刀优选眼科剪，镊子优选弯头镊)浸泡到75％乙醇放入超净台中，紫外灭菌30min；

k)将组织处理器械从75％乙醇中取出放超净台里晾干；

l)在装有胎牛血清的容器中加入5×双抗(5倍的青霉素-链霉素双抗)，插入冰里；所述的容器优选为离心管，所述的离心管可以是50ml的；胎牛血清的用量以可以没入组织为宜；

m)培养皿/孔中滴入适量胎牛血清；

n)取组织放入步骤c)的含抗生素的胎牛血清中，吹打组织，以去除表面血污；再将组织放入步骤d)培养皿/孔中的胎牛血清中；

o)反复剪切胎牛血清中的组织，将组织剪成或切成0.5-2mm³最优为1mm³大小的组织块，将组织块均匀地铺在培养皿/孔里，每个组织块间距为0.2cm-0.5cm；

p)倒置在孵箱中1-2h(与每种细胞对应的培养条件相同)，沿培养皿/孔边缓慢加入适量的相应培养液，勿使组织块漂起，轻轻挪入孵箱中培养；

q)3-6天换液一次，换液时轻轻吸掉原液，加入新的培养液；

r)待原代细胞从组织块爬出后，用吸管吸培养液轻轻吹打组织块将其吹掉，换上新的培养液继续培养细胞，直至长满培养皿/孔底，进行传代或进一步筛选。

本发明在步骤i)之后，还包括以下步骤：

j)细胞形态学观察与鉴定：镜下进行形态学观察，并通过免疫细胞化学、流式细胞仪等方法检测每种细胞相应的特异性标记物。

本发明步骤d)适量的胎牛血清是指待组织均匀铺满培养皿/孔上后，倒置培养时胎牛血清不向下流即可。

本发明步骤e)是为了使组织处于尽量无菌、低温的环境，细胞代谢慢，且营养丰富，最大可能地保持细胞活性，将取得的组织尽快放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中，洗去组织表面血污。

本发明步骤g)加入适量的相应培养液，所述的相应培养液为不同来源的组织(应该是根据原代细胞来确定的)常规培养液；例如小鼠原代肺微血管内皮细胞，培养液为含10％胎牛血清的高糖DMEM；例如小鼠原代胰腺导管细胞，培养液为含20％胎牛血清和2×双抗的高糖DMEM；例如人脐静脉内皮细胞，培养液为EBM-2基础培养基和内皮细胞生长因子等。

本发明步骤i)吹掉组织块的时间首先要根据每种细胞爬出组织块的时间(文献报道或实验经验)而定，其次是组织块周围长满细胞即可吹掉组织块。

本发明的技术关键在于步骤e)、f)、g)，特别是组织要放在胎牛血清里剪碎，均匀铺在培养皿/孔上，即利用胎牛血清使组织黏贴在培养皿/孔上，又能保持细胞所需营养；另外要沿培养皿/孔边缓慢加入适量的培养液，勿使组织块漂起。

本发明的一种从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法，所述的动物组织包括不同种属的正常组织和癌组织。

所述的不同种属包括小鼠、大鼠、猪、兔、狗、羊、人等。

所述的小鼠组织包括小鼠肺组织、小鼠胰腺组织等。

所述的人正常组织包括人牙髓组织、人牙周膜组织、人脐静脉组织等。

所述的人癌组织包括人脑胶质瘤组织、人前列腺癌原发灶组织培养、人前列腺癌淋巴结转移灶组织、人血管瘤组织。

所述的原代细胞包括通过各种动物组织获得小鼠原代肺微血管内皮细胞、小鼠原代胰腺导管细胞、小鼠原代胰腺星状细胞、人原代牙髓干细胞、人原代牙周膜细胞、人原代脐静脉内皮细胞、人原代脑胶质瘤细胞、人原代前列腺癌细胞、人原代血管瘤内皮细胞。

本发明的积极效果：

1、本发明培养的原代细胞经细胞形态学观察与鉴定：镜下观察，形态稳定、活性好、数量足，细胞增殖能力强；通过免疫细胞化学、流式细胞仪等方法检测每种细胞相应的特异性标记物，例如图1B、2B和图4。

2、本发明操作简单易行，易掌握，所需组织量少、温和、耗时短、无需特殊设备和额外试剂、避免外源性蛋白污染并大大降低了复杂操作引起的细菌污染概率等优点，对细胞表面的蛋白质损伤比较小，可用于后续细胞表面分子筛选、细胞药物敏感试验、细胞的分选与鉴定等研究。

3、本发明在组织培养的原代细胞在基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。

4、本发明适用于各类组织培养不同原代细胞，成功率高，细胞状态好，增殖快，在形态结构和功能活动上更好地保持了体内原组织的状态，为原代细胞的研究提供了丰富而全面的实验材料，为科研工作者带来了极大的方便。

附图说明

图1为小鼠不同组织培养的原代细胞生长形态图；其中A为小鼠原代微血管内皮细胞单层融合时的形态；B为小鼠原代肺血管内皮细胞经VIII因子相关抗原间接免疫组化染色照片，可见细胞阳性率几乎为100％；C为经组织块培养方法培养爬出的小鼠原代胰腺导管细胞；D为经组织块培养方法培养爬出的小鼠原代胰腺星状细胞；

图2为人不同正常组织培养的原代细胞生长形态图；其中A为人原代牙髓干细胞单层融合时的形态；B为人原代牙髓干细胞经STRO-1抗原间接免疫组化染色照片；C经组织块培养方法培养爬出的人原代牙髓细胞形态照片；D为经组织块培养方法培养爬出的人原代脐静脉内皮细胞；

图3为人不同肿瘤组织培养的原代细胞生长形态图；其中A为人脑胶质瘤细胞；B为人前列腺癌原发灶细胞；C为人前列腺转移灶细胞；D为人血管瘤内皮细胞；

图4为抗原间接标记的流式检测图；其中A为人脐静脉内皮细胞经CD31抗原间接标记的流式检测图，B为人血管瘤内皮细胞经CD105抗原间接标记的流式检测图。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法，所有操作均在室温下进行。

本实验中用到的试剂如下：

培养液依据不同原代细胞所需准备，DMEM为Corning公司，1640为Corning公司，EBM-2基础培养基和内皮细胞生长因子套装为LONZA公司，胎牛血清为Bioind(BI)公司，雄激素为Sigma公司，0.25％胰酶为Bioind(BI)公司，青霉素-链霉素双抗为Gibco购买(100×,青霉素为10000U/ml，链霉素为1000μg/ml)，培养皿为Corning公司，兔抗小鼠VIII抗体为SANTA CRUZ公司，兔抗人STRO-1抗体为Abcam公司，兔抗人CD31抗体为Abcam公司，兔抗人CD105抗体为Abcam公司，羊抗兔-PE二抗为Abcam公司，鼠抗兔-FITC二抗为Abcam公司，PBS(8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH₂PO₄、1.44gNa₂HPO₄·12H₂O溶于1000ml去离子水中，调整PH值至7.35，非特殊指出，本文中所用的PBS皆为此配方)

实施例1：小鼠肺组织培养原代肺微血管内皮细胞

C57小鼠，3-4周，购于上海中科院。

1、腹腔麻醉(10％水合氯醛，0.15mL/只小鼠)，75％酒精浸泡5min；

2、将小鼠逐层打开胸腔，剪开左心尖，从右心室打5ml冰预冷的PBS冲洗至肺脏变白，取出肺组织，放入冰预冷的含双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

3、在一个60mm培养皿中滴入1滴胎牛血清，剪取肺脏边缘，放入培养皿中的胎牛血清里。

4、剪碎肺组织，大小约1mm³左右；

5、将上述剪碎的组织均匀铺于培养皿,培养箱倒置1-2小时左右。

6、小心加入培养液(含10％胎牛血清的高糖DMEM)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，60h内吹掉组织块，加入新培养液继续培养。

7、待长满后消化传代。

8、形态观察：图1A为经组织块培养方法培养长满时的小鼠原代肺血管内皮细胞形态照片，可见细胞呈梭形或多角形,单层融合呈典型鹅卵石状。

9、细胞鉴定：图1B为小鼠原代肺血管内皮细胞经VIII因子相关抗原间接免疫组化染色照片，可见细胞阳性率几乎为100％。

实施例2：小鼠胰腺组织培养原代胰腺导管细胞

C57小鼠，3-4周，购于上海中科院。

1、乙醚麻醉，75％酒精浸泡5min；

2、将小鼠逐层打开胸腔，用镊子取出胰腺组织，放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

3、在一个60mm皿中滴入1滴胎牛血清，将胰腺组织放入皿中的胎牛血清里。

4、剪碎胰腺组织，大小约1mm³左右；

5、将上述剪碎的组织均匀铺于培养皿,培养箱倒置1-2小时左右。

6、小心加入培养液(含20％胎牛血清和2×双抗的高糖DMEM)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养。

7、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

8、待长满后消化，分选，传代。

9、形态观察：图1C为经组织块培养方法培养爬出的小鼠原代胰腺导管细胞形态照片，可见细胞呈多边形或不规则立方形，单层融合呈鹅卵石样。

实施例3：小鼠肺组织培养原代胰腺星状细胞

C57小鼠，3-4周，购于上海中科院。

1、乙醚麻醉，75％酒精浸泡5min；

2、将小鼠逐层打开胸腔，用镊子取出胰腺组织，放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

3、在一个60mm皿中滴入1滴胎牛血清，将胰腺组织放入皿中的胎牛血清里。

4、剪碎胰腺组织，大小约1mm³左右；

5、将上述剪碎的组织均匀铺于培养皿,培养箱倒置1-2小时左右。

6、小心加入培养液(含20％胎牛血清和2×双抗的高糖DMEM)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养。

7、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

8、待长满后消化，分选，传代。

9、形态观察：图1D为经组织块培养方法培养爬出的小鼠原代胰腺星状细胞形态照片，可见细胞呈呈放射状爬出,在组织块周围形成“生长晕”,表现为三角、四角、五角等多种星状形态。

实施例4：人牙髓组织培养原代牙髓干细胞

牙齿，取自临床因正畸需要拔除的前磨牙，患者年龄：20-25岁。

1、将临床完整拔除的牙齿用冰预冷的含5×双抗的胎牛血清冲洗，于无菌条件下劈开牙齿。

2、取出牙髓放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

3、在12孔板的1孔中滴入1滴胎牛血清，将牙髓放入孔中的胎牛血清里。

4、剪碎牙髓组织，大小约1mm³左右；

5、将上述剪碎的组织均匀铺于孔中，培养箱倒置1-2小时左右。

6、小心加入培养液(含10％胎牛血清和2×双抗的1640培养液)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，3天换液一次。

7、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

8、待长满后消化传代。

9、形态观察：图2A为经组织块培养方法培养爬出的人原代牙髓干细胞形态照片，可见细胞大多数为长梭性成纤维状，少数为多角形、纺锤状或椭圆形。

10、细胞鉴定：图2B为人原代牙髓干细胞经STRO-1抗原间接免疫组化染色照片，可见细胞几乎均为阳性表达。

实施例5：人牙周膜组织培养原代牙周膜细胞

牙齿，取自临床因正畸需要拔除的前磨牙，患者年龄：20-25岁。

1、将临床完整拔除的牙齿用冰预冷的含5×双抗的胎牛血清冲洗。

2、放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中，用锋利的刀片刮取牙齿表面牙周膜，收集到1.5ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，。

3、少量胎牛血清重悬组织沉淀，移入12孔板的1个孔中，均匀铺开。

4、培养箱倒置1-2小时左右。

5、然后小心加入培养液(含10％胎牛血清和2×双抗的1640培养液)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，3天换液一次。

6、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

7、待长满后消化传代。

8、形态观察：图2C为经组织块培养方法培养爬出的人原代牙髓细胞形态照片，可见细胞呈成纤维状，梭形生长。细胞生长到一定密度后，呈栅栏状或漩涡状生长。

实施例6：人脐静脉组织培养原代脐静脉内皮细胞

人脐静脉组织，取自临床患者手术新鲜标本。

1、手术取下人脐静脉组织放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

2、在100mm皿中滴入约300μl胎牛血清，将人脐静脉组织放入皿中的胎牛血清里。

3、剪碎人脐静脉组织，大小约1mm³左右；

4、将上述剪碎的组织均匀铺于孔中，培养箱倒置1-2小时左右。

5、然后小心加入培养液(含内皮细胞生长因子的EBM-2培养基)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，3天换液一次。

6、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

7、待长满后消化，分选，传代。

8、形态观察：图2D为经组织块培养方法培养爬出的人原代脐静脉细胞形态照片，可见细胞呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富。

9、细胞鉴定：图4A为人脐静脉内皮细胞经CD31抗原间接标记的流式检测图，可见细胞阳性率达94.2％。

实施例7：人脑胶质瘤组织培养原代脑胶质瘤细胞

人脑胶质瘤组织，取自临床患者手术新鲜标本。

1、手术取下人脑胶质瘤组织放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

2、在100mm皿中滴入约300μl胎牛血清，将人脑胶质瘤组织放入皿中的胎牛血清里。

3、剪碎人脑胶质瘤组织，大小约1mm³左右；

4、将上述剪碎的组织均匀铺于孔中，培养箱倒置1-2小时左右。

5、小心加入培养液(含10％胎牛血清和2×双抗的1640培养液)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，3天换液一次。

6、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

7、待长满后消化传代。

8、形态观察：图2D为经组织块培养方法培养爬出的人原代脑胶质瘤细胞形态照片，可见细胞形态多样，大小不一，以梭形为主，间有三角形,多角形及不规则形。

实施例8：人前列腺癌原发灶组织培养原代前列腺癌细胞

人前列腺癌原发灶组织，取自临床患者手术新鲜标本。

1、手术取下人前列腺癌原发灶组织放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

2、在100mm皿中滴入约300μl胎牛血清，将人前列腺癌原发灶组织放入皿中的胎牛血清里。

3、剪碎人前列腺癌原发灶组织，大小约1mm³左右；

4、将上述剪碎的组织均匀铺于孔中，培养箱倒置1-2小时左右。

5、小心加入培养液(含30％胎牛血清+2×双抗+5nM雄激素的1640培养液)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，3天换液一次。

6、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

7、待长满后消化传代。

8、形态观察：图3A为经组织块培养方法培养爬出的人原代前列腺癌原发灶细胞形态照片，可见多数细胞呈梭形。

实施例9：人前列腺癌淋巴结转移灶组织培养原代前列腺癌细胞

人前列腺癌淋巴结转移灶组织，取自临床患者手术新鲜标本。

1、手术取下人前列腺癌淋巴结转移灶组织放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

2、在100mm皿中滴入约300μl胎牛血清，将人前列腺癌淋巴结转移灶组织放入皿中的胎牛血清里。

3、剪碎人前列腺癌淋巴结转移灶组织，大小约1mm³左右；

4、将上述剪碎的组织均匀铺于孔中，培养箱倒置1-2小时左右。

5、然后小心加入培养液(含30％胎牛血清+2×双抗+5nM雄激素的1640培养液)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，3天换液一次。

6、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

7、待长满后消化传代。

8、形态观察：图3B为经组织块培养方法培养爬出的人原代前列腺癌淋巴结转移灶细胞形态照片，可见可见多数细胞呈梭形。

实施例10：人血管瘤组织培养原代血管瘤内皮细胞

人血管瘤组织，取自临床患者手术新鲜标本。

1、手术取下人血管瘤组织放入冰预冷的含5×双抗的胎牛血清中洗去表面血液。

2、在100mm皿中滴入约300μl胎牛血清，将人血管瘤组织放入皿中的胎牛血清里。

3、剪碎人血管瘤组织，大小约1-2毫米左右；

4、将上述剪碎的组织均匀铺于孔中，培养箱倒置1-2小时左右。

5、然后小心加入培养液(含内皮细胞生长因子的EBM-2培养基)，注意，尽量不要让组织块浮起来，小心转移到培养箱静止培养，3天换液一次。

6、待组织块周围爬满细胞，将其吹掉，加入新培养液继续培养。

7、待长满后消化，分选，传代。

8、形态观察：图3D为经组织块培养方法培养爬出的人原代血管瘤细胞形态照片，可见细胞呈扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富，单层融合呈鹅卵石样。

9、细胞鉴定：图4B为人血管瘤内皮细胞经CD105抗原间接标记的流式检测图，可见细胞阳性率达92.7％。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种原代细胞的组织块培养方法，包括以下步骤：

a)将组织处理器械浸泡到75％乙醇放入超净台中，紫外灭菌30min；

b)将组织处理器械从75％乙醇中取出放超净台里晾干；

c)在装有胎牛血清的容器中加入5倍的青霉素-链霉素双抗，插入冰里；

d)培养皿或培养孔中滴入适量胎牛血清；

e)取组织放入步骤c)的含抗生素的胎牛血清中，吹打组织，以去除表面血污；再将组织放入步骤d)培养皿或培养孔中的胎牛血清中；

f)反复剪切胎牛血清中的组织，将组织剪成或切成0.5-2mm³的组织块，将组织块均匀地铺在培养皿或培养孔里，每个组织块间距为0.2cm-0.5cm；

g)倒置在孵箱中1-2h，沿培养皿或培养孔边缓慢加入适量的相应培养液，勿使组织块漂起，轻轻挪入孵箱中培养；

h)3-6天换液一次，换液时轻轻吸掉原液，加入新的培养液；

i)待原代细胞从组织块爬出后，用吸管吸培养液轻轻吹打组织块将其吹掉，换上新的培养液继续培养细胞，直至长满培养皿或培养孔底，进行传代或进一步筛选。

2.根据权利要求1所述的一种原代细胞的组织块培养方法，其特征在于，在步骤i)之后，还包括以下步骤：

j)细胞形态学观察与鉴定：镜下进行形态学观察，并通过免疫细胞化学、流式细胞仪检测每种细胞相应的特异性标记物。

3.根据权利要求1或2所述的一种原代细胞的组织块培养方法，其特征在于，所述的适量胎牛血清，是指胎牛血清的用量要没入组织。

4.根据权利要求1或2所述的一种原代细胞的组织块培养方法，其特征在于，步骤f)中，将组织剪成或切成1mm³大小的组织块。

5.根据权利要求1或2所述的一种原代细胞的组织块培养方法，其特征在于，所述的组织为动物组织。

6.根据权利要求1或2所述的一种原代细胞的组织块培养方法，其特征在于，所述的组织为小鼠、大鼠、猪、兔、狗、羊，或人的正常组织或癌组织。

7.根据权利要求1或2所述的一种原代细胞的组织块培养方法，其特征在于，所述的组织为小鼠肺组织、小鼠胰腺组织、人牙髓组织、人牙周膜组织、人脐静脉组织、人脑胶质瘤组织、人前列腺癌原发灶组织培养、人前列腺癌淋巴结转移灶组织，或人血管瘤组织。

8.根据权利要求1或2所述的一种原代细胞的组织块培养方法，其特征在于，所述的原代细胞为小鼠原代肺微血管内皮细胞、小鼠原代胰腺导管细胞、小鼠原代胰腺星状细胞、人原代牙髓干细胞、人原代牙周膜细胞、人原代脐静脉内皮细胞、人原代脑胶质瘤细胞、人原代前列腺癌细胞，或人原代血管瘤内皮细胞。