CN1884494B - 诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基。该培养基由以下2种培养基组成：分化养基I是在RPMI 1640培养基的基础上添加了80-120ng/L活化素A；分化培养基II是在HCM培养基的基础上添加了20-60ng/mL成纤维细胞生长因子和15-25ng/mL骨形态形成蛋白。本发明的培养基成分确定，使用安全性高；诱导方法具有周期短、分化率高、安全稳定的优点，应用前景广阔。

Description

诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及诱导人胚胎干细胞分化的方法及其专用培养基，特别是涉及一种诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基。

背景技术

干细胞(stem cell)是具有自我更新能力并具有多向分化潜能的一类细胞。这类细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小或者扩增，也可以进一步分化为更加成熟的细胞类型。根据干细胞的分化潜能，可以将其分为全能干细胞(如胚胎干细胞，它可以分化形成所有的成体组织细胞，甚至发育成为完整的个体)、多能干细胞(具有多向分化潜能，可以分化形成除自身组织细胞外的其它类型的组织细胞，如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的自我更新，如肠上皮干细胞)。胚胎干细胞的分化和增殖能力是动物发育的基础，即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体；成体干细胞的进一步分化则是成年动物体内组织和器官修复再生的基础，即维持组织和器官的大小，并在受损时分化为成体细胞，以修复组织和器官。

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES)是由受精卵发育成囊胚的内细胞团中分离得到的，具有分化上的全能性(totipotency)，可以演变成各种构成人体任何器官或组织的组成细胞，并最终发育成完整的个体。第一株哺乳动物的胚胎干细胞系是从小鼠中分离出来的(Evans MJ，Kaufman MH.Nature，292(5819)：154-156.1981；Martin GR.Proc Natl Acad Sci USA，78(12)：7634-7638.1981)。经证明，这些细胞能够整合入胚泡，参与正常的胚胎发育和组织器官的形成(Robertson E.Nature323，445-448.1986；Stewart CL.Dev Biol 161，626-628.1994)，而且在特定的条件下还能形成正常的鼠胎(Nagy A.Proc Natl Acad Sci USA 90，8421-8428.1993；Eggan K.Nat Biotechnol 20，455-459.2002)。1998年，Thomson教授成功建立了人的胚胎干细胞系(Thomson JA.Science，282(5391)：1145-1147)。到目前为止，由不同国家和地区建立的人胚胎干细胞株已达40多株，其中20多株已经商品化。

由于胚胎干细胞可以在体外无限扩增，并维持向多个方向分化的潜能，这样，通过胚胎干细胞的定向分化，就可以获得足够数量的细胞，用于细胞移植治疗和基因治疗。现在备受瞩目的“治疗性克隆”策略，就是将病人的体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞中，在早期胚胎形成后，从中分离获得人ES细胞，从而建立与患者具有相同遗传背景的胚胎干细胞系，诱导使其分化出病人所需的细胞类型，最后再植回患者体内进行治疗。这种方法可以避免由外源移植导致的免疫排斥，它的实现将为许多目前难以治愈的疾病，如糖尿病、白血病以及心血管疾病等提供一条新的治疗途径。

另外，人胚胎干细胞的研究将有助于揭示人胚胎的发育过程，并为药物筛选、药理分析及毒性评估等提供动物模型无法比拟的实验平台。

尽管人胚胎干细胞具有广阔的应用前景，但要实现这些应用，尤其是临床上的应用，仍需要解决一系列重要问题，例如安全性与有效性。安全性指的是移植到病人体内的胚胎干细胞的分化产物必须满足以下条件：(1)不含有任何动物来源的、可能污染了动物病原体的成分；(2)不会在病人体内形成肿瘤，即要解决致瘤性的问题，对动物模型的研究结果表明，目前在移植动物体内致瘤的细胞主要是一些具有干性的细胞，且干性越强越容易致瘤(Hochedlinger K.Hematol J，Suppl3：s114-117)；(3)不会在病人体内引发免疫排斥反应，对于这一点，治疗性克隆是一个很好的解决办法。有效性是指由人胚胎干细胞分化出来的细胞必须有着和正常人体细胞一样的性状和生理功能，例如体外诱导出来的心肌细胞要能够有节律地进行收缩。只有达到了这些标准，移植到病人体内的细胞才能真正发挥治疗的功效。而这些问题的解决都将有赖于在人胚胎干细胞培养体系的进一步完善、自我更新及定向分化的分子机制研究。

目前，人类胚胎干细胞的建系及培养均取得了重大的进展，已经可以在化学成分确定的培养基中进行，从而可以满足临床应用的需要。1998年，Thomson建立人胚胎干细胞系时所用的培养基成分为：80％Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，20％胎牛血清，1mM谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，1％非必需氨基酸，并以MEF作为饲养层(Thomson JA.Science，282(5391)：1145-1147)。然而血清是一种复杂的蛋白质混合物，并且不同批次血清的质量难以控制，以后的实验发现在最初建系所用的含有胎牛血清的培养基中，人胚胎干细胞形成克隆的能力非常低，将培养基中的胎牛血清换成血清替代物(Knockout Serum Replacement，KSR)，胚胎干细胞的克隆形成率能提高好几倍；再加入4ng/mL的重组人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，则能够进一步提高胚胎干细胞的克隆形成效率。这种在培养基中使用血清替代物替代胎牛血清，同时添加bFGF，并使用小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)细胞作为饲养层的培养条件，成为了目前常规的人胚胎干细胞的培养方法。

如何有效地将胚胎干细胞分化为特定组织的细胞，是实现治疗性克隆的重要环节。小鼠胚胎干细胞的分化已经积累了大量的经验，目前的研究主要集中于向外胚层(神经)和中胚层(造血细胞)分化上。向内胚层的分化一直以来进展缓慢，其中一个主要的原因是在内胚层组织里表达的基因大多在胚外内胚层中也有表达，从而难以衡量分化过程是否有效。因此，在对分化细胞进行验证时，除需检测基因的表达情况，还需要对分化细胞的功能进行论证，包括体内和体外两个方面。尽管如此，小鼠胚胎干细胞向肝脏细胞的分化，仍然取得了一些进展。获得了表达肝细胞特定蛋白的细胞，并且具有合成糖原、合成尿素等功能。此外，当分化细胞移植到体内后，可以整合到受体鼠的肝脏中，并可在一定程度上恢复受损肝脏的功能(Takumi Teratani.Hepatology：41：836-846.2005)。

在小鼠胚胎干细胞中成功运用的方案运用到人类胚胎干细胞分化时，并不一定会有效。原因在于小鼠胚胎干细胞和人类胚胎干细胞的培养条件大相径庭，在分化上存在多少差异仍是一个未知数。更为重要的是，小鼠胚胎干细胞的分化方案，并没有遵循正常的小鼠胚胎发育的模式。开启一个基因的表达只需要相关转录因子的活化，执行有关的功能也只是相关酶的表达。因此，这样得到的分化细胞，尽管表达了肝细胞的标记蛋白并具备了某些功能，但究竟在多大程度上和正常肝细胞相似仍然存在疑问。如果分化过程遵循体内的发育模式，分化过程中的细胞将会和体内发育过程中出现的细胞类似，并对所加的诱导条件作出类似的应答，那么，在这种条件下，肝细胞标记蛋白的出现，则可以作为一个比较有效的证据，证明这群细胞是肝细胞(或肝样细胞)。

发明内容

本发明的目的是提供诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的专用培养基。

本发明所提供的用于诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的培养基，由以下2种培养基组成：其中，分化养基I是在RPMI 1640培养基的基础上添加了80-120ng/L活化素A，pH7.2-7.6，分化培养基II是在HCM培养基的基础上添加了20-60ng/mL成纤维细胞生长因子(FGF)和15-25ng/mL骨形态形成蛋白(BMP)，pH7.2-7.6。

所述分化培养基II中的成纤维细胞生长因子优选为aFGF、bFGF或FGF4，骨形态形成蛋白优选为BMP2或BMP4。

优选的分化培养基配方为：分化培养基I是在RPMI1640培养基的基础上添加了100ng/L活化素A，pH7.2-7.6；分化培养基II是在HCM培养基的基础上添加了50ng/mLaFGF或20ng/mL bFGF或25ng/mL FGF4，以及20ng/mL BMP2或BMP4，pH7.2-7.6。

本发明的第二个目的是提供一种诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法。

本发明所提供的诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法，包括以下步骤：

1)向定形内胚层细胞(definitive endoderm)的诱导：取培养在MEF饲养层上的人胚胎干细胞，弃去培养基，加入分化培养基I，在37℃下培养24-48小时，然后弃去培养基，更换为添加0.15-0.25％(体积百分浓度，V/V)胎牛血清(FBS)的分化培养基I，在相同条件下培养24-48小时，再弃去培养基，更换为添加1.5-2.5％胎牛血清的分化培养基I，在相同条件下继续培养24-48小时；

2)弃去培养基，加入分化培养基II，在37℃下培养3-6天，每天更换一次培养基。

在上述诱导方法中，步骤1)中将人胚胎干细胞置于分化培养基I中的培养时间优选为24小时，然后弃去培养基，更换为添加0.2％胎牛血清的分化培养基I，培养24小时，再弃去培养基，更换为添加2％胎牛血清的分化培养基I，继续培养24小时；步骤2)中的培养时间优选为5天。

为获得更好的分化效果，步骤1)-2)中每次更换培养基前将细胞用PBS洗1-3遍。

本发明提供了一种诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基。除了分化培养基I含少量血清外，其余培养基成分确定，使用安全性高。分化培养基I中添加的Activin A可诱导人胚胎干细胞向定形内胚层细胞高效分化，再在分化培养基II中FGF和BMP的共同作用下可进一步分化为表达白蛋白的早期肝细胞。所获得的分化细胞具有典型的肝脏细胞的形态，并表达有早期肝细胞的标记蛋白CK8、Alb、CK18和AFP。整个分化过程非常高效，约占70％的细胞均表达这些早期标记蛋白。整个分化过程与肝脏的早期发育十分相似，因而是一种比较合理的分化方案。用本发明的方法及其专用培养基诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化具有周期短、分化率高、安全稳定的优点，分化获得的肝细胞可用于细胞移植治疗肝病、人工肝脏和药物的毒性测试等，此外整个分化过程也可用于人类早期胚胎发育的研究中，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为由定形内胚层向肝细胞分化过程中细胞形态的变化

图2为对分化细胞进行肝细胞标记分子AFP，Alb，CK8和CK18检测的结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化

一、人胚胎干细胞的常规培养

试剂：

PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，加ddH₂O定容至1000mL，用HCl调节溶液pH值至7.4。

200mM谷氨酰胺储存液(200×)：称取0.292g谷氨酰胺，溶解于10mL PBS中，过滤除菌，分装冻存于-70℃冰箱。

2Mβ-巯基乙醇(20000×)：取1mL 14.3M的β-巯基乙醇，加6.15mL PBS稀释，过滤除菌。

人胚胎干细胞培养基(HESM)：20％血清替代物(Knock-out SerumReplacement，KSR)，1mM谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，1％非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids)(美国Gibco公司)，4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，用ddH2O定容至1000mL。

0.5mg/mL Dispase：称取Dispase 10mg粉末，溶解于20mL DMEM/F12(美国Invitrogen公司)中，过滤除菌。

1mg/mL胶原酶IV：称取胶原酶IV粉末20mg，溶解于20mL DMEM/F12(美国Invitrogen公司)中，过滤除菌。

MEF培养基：含10％胎牛血清的DMEM(美国Gibco公司)。

丝裂霉素C工作液：将2mg丝裂霉素C溶于200mL含10％胎牛血清的DMEM中，使其终浓度为10ug/mL，过滤除菌。

0.1％明胶：称取0.1g明胶粉末，溶解于100mL双蒸水中，高压灭菌。

1、饲养层(feeder)的获得

用下述方法对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)进行处理，以作为培养人胚胎干细胞的饲养层：

1)取生长状态良好的贴壁MEF细胞，弃去MEF培养基，加入含10ug/mL丝裂霉素C的丝裂霉素C工作液；

2)在37℃下培养3个小时，培养期间用0.1％明胶处理将要接种MEF细胞的培养皿，室温放置2小时以上(或37℃放置30分钟以上)，用前吸掉明胶溶液即可；

3)取出MEF细胞，弃去含丝裂霉素C工作液，用PBS洗5遍，以便彻底洗掉残存的丝裂霉素(因为丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，可能对胚胎干细胞有毒性)；

4)加入胰酶-EDTA(美国Gibco公司)进行消化，然后用MEF培养基终止反应；

5)1000rpm离心5分钟，弃上清，用MEF培养基重悬细胞沉淀并计数；

6)按照1.6×10⁵个细胞/3.5cm培养皿的密度将经上述步骤处理的MEF细胞接种至包被有0.1％明胶的培养皿中，置于37℃培养箱中培养12-24小时，得到用于培养人胚胎干细胞的饲养层。

2、人胚胎干细胞的常规培养

在步骤1获得的MEF饲养层上用人胚胎干细胞培养基(HESM)对人胚胎干细胞H1细胞系进行培养，具体培养方法包括以下步骤：

1)从4℃冰箱中取出培养所需试剂及培养基，室温预热15分钟左右；

2)取出人胚胎干细胞，吸去HESM，将细胞用PBS洗一遍；

3)加入0.5mg/mL Dispase(或1mg/mL胶原酶IV)进行消化(1mL/3.5cm培养皿)，置于37℃培养箱中孵育10-15分钟，然后取出细胞在相差显微镜下观察，若克隆边缘出现卷边，则可终止消化；否则放回培养箱，延长消化时间，但要随时取出观察，以防止因消化过度导致克隆脱落；

4)消化结束后，吸掉Dispase或胶原酶IV，用PBS和DMEM/F12分别洗一遍后，加入适量DMEM/F12(2mL/3.5cm培养皿)；

5)用无菌直头或弯头玻璃滴管轻柔地将所有人胚胎干细胞克隆从培养皿底部刮下，并转移至无菌的15mL锥形底离心管中，用滴管温和地吹吸若干次，使人胚胎干细胞克隆变成大小较为均一小的细胞团；

6)1000rpm离心3-4分钟，小心吸掉上清，用玻璃滴管吸新鲜的HESM培养基重悬沉淀；

7)取出步骤1获得的MEF饲养层，用PBS洗三遍，将人胚胎干细胞的小团块接种于MEF饲养层上，置于37℃细胞培养箱中培养12-24小时，人胚胎干细胞贴壁后可更换新鲜的HESM培养基。每天更换一次培养基，通常5-7天传代一次。若出现以下情况之一时则需及时进行传代：(1)MEF饲养层的放置时间达到两周；(2)胚胎干细胞克隆过于致密或面积过大；(3)胚胎干细胞出现明显的自发分化。

二、人胚胎干细胞向肝脏细胞的诱导分化

分化培养基I：添加100ng/L活化素A(Activin A)的RPMI1640培养基(购自Hyclone公司)，pH7.2-7.6。

分化培养基II：添加50ng/mL酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)(或20ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)，或25ng/ml成纤维细胞生长因子4(FGF4))和20ng/mL骨形态形成蛋白2(BMP2)(或20ng/mL骨形态形成蛋白4(BMP4))的HCM培养基(购自Cambrex公司)，pH7.2-7.6。所述不同的成纤维细胞生长因子和骨形态形成蛋白作用效果相同，可任意选择。

用本发明的方法诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化，包括以下步骤：

1)向定形内胚层细胞的诱导：取步骤一培养在MEF饲养层上的人胚胎干细胞，弃去培养基，用PBS洗2遍，加入分化培养基I，置于37℃细胞培养箱中培养1天(24小时)，弃去培养基，更换为添加0.2％胎牛血清(FBS，GIB-CO公司)的分化培养基I，在相同条件下培养1天，弃去培养基，更换为添加2％胎牛血清的分化培养基I，在相同条件下培养1天；

2)弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基II，置于37℃细胞培养箱中培养5天，每天换液1次。

实施例2、分化细胞的检测

试剂：

PBST：含0.2％(体积百分比)Triton X100的PBS溶液。

封闭液：含2-3％山羊血清(或马血清)的PBST溶液。

二抗稀释液(0.1％BSA溶液)：称取0.1g牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，溶于100mLPBS中。

一、由定形内胚层细胞向肝细胞初始分化的检测

在诱导分化过程中，细胞形态逐渐变为典型的肝细胞的形态，见图1中的图A-图D(图A、B、C、D分别为分化培养3、4、6、8天后的细胞形态)，而在不加因子自发分化的对照组细胞，形态则完全不同，见图1中的图E。

用免疫荧光染色的方法对实施例1步骤二中经过3天分化培养基I和5天分化培养基II诱导的人胚胎干细胞的分化状态进行检测，以在相同条件下用未添加FGF和BMP的分化培养基培养的自发分化的人胚胎干细胞为对照，检测方法包括以下步骤：

1)取出细胞，弃培养基，用PBS洗2遍；

2)加入4％多聚甲醛室温固定15分钟(或加入无水甲醇室温固定5-10分钟)；

3)用PBS洗3遍，每遍5分钟；

4)用PBST溶液进行透化，室温10分钟；

4)用PBS洗1遍，5分钟；

6)加入封闭液，室温封闭30-60分钟；

7)弃封闭液，加入一抗(monoclonal anti-α-Fetoprotein(AFP)Clone C3，购自Sigma公司；Polyclonal Rabbit Anti-Human Alb，购自DAKO公司；Mab toCytokeratin 8(CK8)，购自Progen Biotechnik公司；鼠抗人细胞角蛋白18(CK18)单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)(按1∶50-200的比例对上述抗体用封闭液进行稀释)，4℃放置12-24小时(或37℃孵育2小时)；

8)用PBS洗3遍，每遍5分钟；

9)加入二抗(FITC标记羊抗小鼠IgG，TRITC标记羊抗兔IgG，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)(用前先将二抗按1∶50-150比例稀释于二抗稀释液中)，37℃避光放置1小时；

10)用PBS洗3遍，每遍5分钟；

11)加入终浓度为1mg/mL的DAPI溶液(美国Roche公司)，室温放置5分钟；

12)用PBS洗3遍，每遍5分钟；

13)加入500ul PBS(或PBS∶甘油(1∶1))，在荧光显微镜下观察、拍照。

结果如图2所示(左：AFP，Alb，CK8，CK18的免疫组化染色结果，右：与DAPI重叠的结果，比例尺：50微米)，经分化培养基I和分化培养基II诱导8天的人胚胎干细胞表达有肝细胞的标记分子AFP、Alb、CK8和CK18，其中，Alb阳性细胞约占分化细胞的70％，而对照组中，Alb阳性细胞所占比例小于10％(未显示)，表明人胚胎干细胞的体外分化过程跟体内发育过程所需的因子十分相似，即Activin A诱导出定形内胚层细胞，FGF和BMP起始了由定形内胚层细胞向肝细胞的分化。

上述检测结果表明可用本发明的方法及添加有不同成纤维细胞生长因子和骨形态形成蛋白的专用培养基可将人胚胎干细胞诱导分化为成熟的肝脏细胞，且不同配方分化培养基的分化效果相同。

Claims (7)

1.用于诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的培养基，由以下分化培养基I和分化培养基II组成：其中，分化培养基I是在RPMI 1640培养基的基础上添加了80-120ng/L活化素A，pH7.2-7.6；分化培养基II是在HCM培养基的基础上添加了20-60ng/mL成纤维细胞生长因子和15-25ng/mL骨形态形成蛋白，pH7.2-7.6。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述分化培养基II中的成纤维细胞生长因子为aFGF、bFGF或FGF4，骨形态形成蛋白为BMP2或BMP4。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述分化培养基I的配方是在RPMI 1640培养基的基础上添加了100ng/L活化素A，pH7.2-7.6；分化培养基II的配方是在HCM培养基的基础上添加了50ng/mL aFGF或20ng/mL bFGF或25ng/mL FGF4，以及20ng/mL BMP2或BMP4，pH7.2-7.6。

4.一种诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法，包括以下步骤：

1)取培养在MEF饲养层上的人胚胎干细胞H1细胞系的细胞，弃去培养基，加入权利要求1-3任一项所述的分化培养基I，在37℃下培养24-48小时，然后弃去培养基，更换为添加0.15-0.25％胎牛血清的分化培养基I，在相同条件下培养24-48小时，再弃去培养基，更换为添加1.5-2.5％胎牛血清的分化培养基I，在相同条件下继续培养24-48小时；

2)弃去培养基，加入权利要求1-3任一项所述的分化培养基II，在37℃下培养3-6天，每天更换一次培养基，得到肝样细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中先将人胚胎干细胞H1细胞系的细胞置于分化培养基I中培养24小时，然后弃去培养基，更换为添加0.2％胎牛血清的分化培养基I，培养24小时，再弃去培养基，更换为添加2％胎牛血清的分化培养基I，继续培养24小时。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的培养时间为5天。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)中每次更换培养基前均将细胞用PBS洗1-3遍。

Images