CN111304156A - 一种诱导型滋养层干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导型滋养层干细胞及其制备方法和应用，涉及生物医学技术领域。该制备方法包括利用人多能干细胞作为供体细胞，在诱导培养基中培养可衍生出具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的能力的诱导型滋养层干细胞。该诱导培养基含有维生素C、表皮生长因子、WNT通路激活剂、TGF‑β通路抑制剂、ROCK通路抑制剂以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂。本发明可拓展滋养层干细胞的来源和避免伦理问题，有助于研究胎盘发育及相关疾病发生发展机制，探索体外胚胎合成及胚胎自组装过程。

Description

一种诱导型滋养层干细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种诱导型滋养层干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
滋养层干细胞CT是一类具有自我更新能力，并能分化为各种类型滋养层细胞(合体滋养层细胞，绒毛外细胞滋养层细胞等)的特殊细胞。1998年首次成功分离了鼠的原代滋养层干细胞，2015年发现可将鼠的纤维细胞诱导为滋养层干细胞，而人原代滋养层干细胞于2018年首次从囊胚和早孕期胎盘中分离获得。
跟当前采用的各种研究滋养层细胞发育的细胞模型相比，人滋养层干细胞具有以下优势：
1)永生化滋养层细胞株如HTR8和JEG-3等，为变异的滋养层细胞株或者癌性滋养层细胞，不能真实反映人滋养层细胞的正常发育途径和导致疾病的原因，而人滋养层干细胞向各亚型滋养层细胞分化跟体内自然发育过程一致；
2)鼠等动物模型、其滋养层干细胞和诱导型滋养层干细胞跟人滋养层干细胞存在着种属差异，如着床前后细胞状态不同，分化后得到的亚型滋养层细胞形态、基因表达谱及功能也有明显差异，人滋养层细胞发育障碍导致的疾病如子痫前期等在自然界鼠等动物中不会发生。因此，用动物模型可以揭示部分因果联系，但难以反映人类疾病发生发展相关的研究模型；
3)从绒毛或者胎盘原代分离的原代滋养层细胞不能自我更新，体外培养时的增殖能力有限，不具有滋养层干细胞体外自我更新能力，因此难以进行基因编辑等操作，限制了对细胞功能进一步研究的可能。
目前，人原代滋养层干细胞只能通过囊胚或者早孕期胎盘获取，构建原代人滋养层干细胞的同时也破坏了胚胎或发育中的胎盘，因此不符合伦理学要求，而利用废弃胚胎或终止妊娠后绒毛则资源极其有限。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供细胞培养基在制备诱导型滋养层干细胞中的应用、诱导型滋养层干细胞及其制备方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供一种诱导型滋养层干细胞的制备方法，其包括采用细胞培养基将人多能干细胞培养为具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的诱导型滋养层干细胞；
所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞；
所述细胞培养基包括基础培养液，且所述细胞培养基中至少还含有以下组分：0.5～2.5μg/mL维生素C、20～70ng/mL表皮生长因子、1～5μM WNT通路激活剂、0.3～1.9μMTGF-β通路抑制剂、3～7μM ROCK通路抑制剂以及0.6～1.1mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
第二方面，实施例提供一种诱导型滋养层干细胞，其采用前述实施例所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法制得。
第三方面，实施例提供如前述实施例所述的诱导型滋养层干细胞在制备用于胎盘发育障碍相关性疾病的药物中的应用。
第四方面，实施例提供如前述实施例所述的诱导型滋养层干细胞在用于研究胎盘发育过程中的调控网络中的应用。
第五方面，实施例提供如前述实施例所述的诱导型滋养层干细胞在用于模拟早期胚胎合成或胚胎干细胞自组装中的应用。
第六方面，实施例提供种细胞培养基在制备诱导型滋养层干细胞中的应用，所述制备诱导型滋养层干细胞包括：采用细胞培养基将人多能干细胞培养为具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的诱导型滋养层干细胞；
所述人多能干细胞包括胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞；
所述细胞培养基包括基础培养液，且所述细胞培养基中至少含有以下组分：0.5～2.5μg/mL维生素C、20～70ng/mL表皮生长因子、1～5μM WNT通路激活剂、0.3～1.9μM TGF-β通路抑制剂、3～7μM ROCK通路抑制剂以及0.6～1.1mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了诱导型滋养层干细胞的制备方法，该制备方法包括采用特定的细胞培养基将人多能干细胞培养为诱导型滋养层干细胞，且转化得到的诱导型滋养层干细胞具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中诱导型滋养层干细胞的制备流程图；
图2为本发明验证例1中诱导型滋养层干细胞的鉴定结果图；
图3为本发明验证例2中诱导型滋养层干细胞的免疫荧光染色结果图；
图4为本发明验证例3中诱导型滋养层干细胞中的GATA3、KRT7及TFAP2C的表达的检测结果；
图5为本发明验证例4中诱导型滋养层干细胞的核型鉴定结果；
图6为本发明验证例4中诱导型滋养层干细胞的另外特征，其中，图6中A为ELF5启动子区域甲基化结果，图6中B为HLA-ABC标记物荧光免疫检测结果，图6中C为19号染色体编码的miRNA表达的实时定量PCR检测结果；
图7为本发明验证例5中诱导型滋养层干细胞分化成绒毛外细胞滋养层细胞的结果，其中，图7中A为分化得到的绒毛外细胞滋养层细胞形态图，图7中B为诱导后绒毛外细胞滋养层细胞特异性标记物的流式细胞术检测结果；
图8为本发明验证例5中诱导型滋养层干细胞分化成合体滋养层细胞的结果，其中，图8中A为细胞形态图，图8中B为合体滋养层细胞相关标记物的荧光免疫检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明实施例提供了一种诱导型滋养层干细胞的制备方法，该制备方法包括采用细胞培养基将人多能干细胞培养为具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的诱导型滋养层干细胞；
所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞；
所述细胞培养基包括基础培养液，且所述细胞培养基中至少还含有以下组分：0.5～2.5μg/mL维生素C、20～70ng/mL表皮生长因子、1～5μM WNT通路激活剂、0.3～1.9μMTGF-β通路抑制剂、3～7μM ROCK通路抑制剂以及0.6～1.1mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
需要说明的是，上述组分的浓度均为组分在细胞培养基中的终浓度，下同。
在可选实施方式中，所述细胞培养基中还包括以下一种或多种组分：0.5～1.5％胰岛素样转铁蛋白添加剂、0.05～0.15mMβ-巯基乙醇和0.1％～0.5％BSA。
β-巯基乙醇做还原剂，主要保护蛋白不被自由基氧化；胰岛素样转铁蛋白添加剂提供细胞生长的胰岛素和金属元素；BSA用于维持细胞生长和稳定培养基中的蛋白质活性等。
在可选实施方式中，所述细胞培养基还包括0.1％～0.7％青链霉素混合液和/或0.1％～0.4％FBS。
在可选实施方式中，所述WNT通路的激活剂为CHIR99021。
在可选实施方式中，所述ROCK通路抑制剂为Y-27632。
在可选实施方式中，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和/或SB431542。
在可选实施方式中，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和SB431542，在所述细胞培养基中，A83-01的终浓度为0.3～0.7μM，SB431542的终浓度为0.8～1.2μM。
在可选实施方式中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠(VPA)。
在可选实施方式中，所述基础培养液选自以下培养基中的至少一种：DMEM/F12、RPMI1640和HamsF-12。
在可选实施方式中，所述亚型滋养层细胞包括绒毛外细胞滋养层细胞和/或合体滋养层细胞。
在可选实施方式中，所述人胚胎干细胞包括H1 hESC和/或HN10 hESC。
在可选实施方式中，所述诱导多能干细胞选自以下细胞中的至少一种：尿液细胞来源的iPS细胞UE005-iPS、绒毛外间充质细胞来源的iPS细胞hAMC-iPS、hAMC002-iPS以及hAMC004-iPS。
需要说明的是，本发明实施例采用的人胚胎干细胞系和人诱导多能干细胞系均未超过胚胎受精后14天。
在可选实施方式中，采用细胞培养基培养时，所述人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞的接种密度为(1～9)×105个cells/mL。
在可选实施方式中，所述制备方法包括将制备得到的诱导型滋养层干细胞进行传代培养。
在可选实施方式中，所述传代培养的细胞融合度为90～100％。
在可选实施方式中，当细胞融合度达到90～100％时，所述传代培养包括采用消化酶与细胞共孵育，以获得细胞溶液，所述消化酶为0.3～0.7mM EDTA。在转分化早期的细胞接近于多能干细胞，选择适于多能干细胞的消化酶。用EDTA消化后的细胞大多成团存在，有利于细胞的存活。
在可选实施方式中，所述传代培养的比例为1：(2～4)。
在可选实施方式中，所述传代培养的培养基为所述细胞培养基。
在可选实施方式中，将人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞在所述细胞培养基中培养前，所述制备方法包括：将人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞在干细胞培养基中36～38℃预培养22～26h。
在可选实施方式中，所述干细胞培养基为mTeSR1培养基。
在可选实施方式中，所述预培养在包被有Matrigel的培养皿中进行。
本发明实施例提供了一种诱导型滋养层干细胞，该诱导型滋养层干细胞采用前述任一实施方式所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法制备得到。
本发明实施例提供了前述实施例提供的诱导型滋养层干细胞在制备用于胎盘发育障碍相关性疾病的药物中的应用。
在可选实施方式中，所述胎盘发育障碍相关性疾病包括以下疾病中的至少一种：子痫前期、子痫、胎盘植入和胎儿生长受限。需要说明的是，只要是采用本发明实施例提供的诱导型滋养层干细胞或诱导型滋养层干细胞的制备方法制备的诱导型滋养层干细胞在研究其他胎盘发育障碍相关性疾病中的应用均属于本申请的保护范围内。
本发明实施例提供了前述实施例提供的诱导型滋养层干细胞在用于研究胎盘发育过程中的调控网络中的应用。
在可选实施方式中，所述调控网络包括转录因子、胞外信号、表观遗传修饰、代谢及细胞周期中的至少一种。
本发明实施例提供了前述实施例提供的诱导型滋养层干细胞用于模拟早期胚胎合成或胚胎干细胞自组装中的应用。
需要说明的是，所述早期胚胎合成或胚胎干细胞自组装，为来源于同一个个体的诱导多能干细胞和其衍生出的诱导型滋养层干细胞，在特定的培养条件下，自发组装成类似于早期发育过程中的胚胎，用于研究胚胎早期发育过程。
此外，本发明实施例还提供了细胞培养基在制备诱导型滋养层干细胞中的应用，所述制备诱导型滋养层干细胞包括：采用细胞培养基将人多能干细胞培养为具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的诱导型滋养层干细胞；
所述人多能干细胞包括胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞；
所述细胞培养基包括基础培养液，且所述细胞培养基中至少含有以下组分：0.5～2.5μg/mL维生素C、20～70ng/mL表皮生长因子、1～5μM WNT通路激活剂、0.3～1.9μM TGF-β通路抑制剂、3～7μM ROCK通路抑制剂以及0.6～1.1mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
需要说明的，在该应用中，该细胞培养基同前述实施方式所述的制备方法中的细胞培养基相同，在此不再赘述。
实施例
实施例中采用的实验材料。
胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞：胚胎干细胞株为H1细胞株(H1hESC)和HN10细胞株(HN10 hESC)，诱导多能干细胞由南方医科大学南方医院分娩后胎盘羊膜分离得到的羊膜间充质细胞经非整合非病毒方式重编程获取(具体详见Wei et al.Generation oftrophoblast-like cells from the amnion in vitro:A novel cellular model fortrophoblast development.Placenta 51:28-37.doi:10.1016/j.placenta.2017.01.12)。实验开展已获得南方医科大学南方医院伦理委员会批准。
mTeSR1培养基的配制：在后续实施例中所用的iPSC(诱导多能干细胞)培养基mTeSR1(StemCell)为商品化生产的培养基，包括mTeSR1基地液(basal)和mTeSR1添加液(supplemental)，按产品说明书的配制方法：将mTeSR1 supplemental(100mL)置于4℃过夜解冻，次日，在生物安全柜中，将解冻的mTeSR1 supplemental加入到mTeSR1 basal培养基(400mL)中，充分混匀，分装至50ml离心管(40mL/管)，于-20℃保存，使用前将其置于4℃过夜解冻，解冻的培养基不用时4℃保存，有效期2周。
细胞培养基(滋养层干细胞培养基)：在生物安全柜中，取DMEM/F12基础培养液，加入1％胰岛素样转铁蛋白添加剂(ITS-X supplement)、0.1mMβ-巯基乙醇、0.3％BSA、0.5％青链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin)，1.5g/mL维生素C、50ng/mL表皮生长因子、0.2％FBS、2μM CHIR99021、0.5μM A83-01、1μM SB431542以及5μM Y-27632，再在避光条件下加入0.8mM VPA，充分混匀后分装至50mL离心管(40mL/管)，于-20℃保存，使用前将其置于4℃过夜解冻，解冻的培养基不用时4℃保存，有效期为2周。
MatrigelTM工作液的配制：在后续实施例中所用的无饲养层培养体系培养诱导多能干细胞及诱导型滋养层干细胞，所用的基质为Corning Matrigel Matrix(Corning公司)，按产品说明书的使用方法将Corning Matrigel Matrix(5mL)置于4℃过夜解冻，次日，在生物安全柜中，将解冻的Matrige置于冰上并充分混匀，分装至0.5mL EP管(280μL/管)制成母液，-20℃保存。使用之前4℃解冻，每50mL DMEM/F12中加280ml的Matrigel母液混匀即为工作液。
诱导型滋养层干细胞及诱导多能干细胞培养板准备：用于多能干细胞及诱导型滋养层干细胞培养的细胞培养板于细胞接种前准备，将准备好的培养板保存于培养箱中，使用有效期为3天。培养皿的准备步骤如下：
(1)Matrigel包被培养皿：在每个六孔板的孔中加入Matrigel工作液1mL，37℃放置1.5h以上，使基质均匀包被培养板底。
(2)换液：多能干细胞及人诱导型滋养层干细胞接种前，吸弃培养板中Matrigel，加入2mL mTeSR1培养基或上述细胞培养基，在培养箱中平衡至少一个小时后使用。
人诱导型滋养层干细胞消化酶的准备：在后续实施例中所用的人诱导型滋养层干细胞传代所用的消化酶TrypLE Express(Gibco)为商品化生成的细胞传代消化酶，于常温下保存。
冻存液的准备：在后续实施例中所用的人诱导滋层干细胞冻存液Cell Banker 2(ZENOAQ)为商品化生产的细胞冻存液，置于4℃冰箱中保存。
诱导型滋养层干细胞的制备：
胚胎干细胞及诱导多能干细胞进行滋养层干细胞转分化诱导的方法相同，以下具体步骤以胚胎干细胞株H1(H1 hESC)为例说明。
将人胚胎干细胞H1按每孔4×105个细胞接种于预铺了Matrigel的六孔板中；培养基为mTeSR1，37℃、5％CO2的培养箱中培养。待24h后，吸掉原mTeSR1培养基，用DMEM/F12洗一遍，加入新鲜配置的细胞培养基进行诱导转分化(时间点设置为D0，操作的流程图请参照附图1)，当细胞融合度达90％时，按1:3进行传代。
传代的方法为：准备好已铺Matrigel的六孔板，吸去Matrigel，加入新鲜的上述细胞培养基于37℃，5％CO2培养箱内预热及平衡。弃掉旧培养基，加入无Ca2+和Mg2+的PBS洗两次。每孔加入1mL 0.5mM EDTA，放入37℃培养箱中消化10min。
然后每孔中加入1mL上述细胞培养基，用移液器轻轻将细胞从孔皿上吹打下来，并转移到14mL离心管内，380×g离心1min；离心后，吸掉上清，加入上述细胞培养基，轻轻充分混匀后，按1:3比例接种至前述已预置了上述细胞培养基的新的六孔板内，轻轻振荡混匀后至于37℃，5％CO2培养箱中，即完成传代。
在D7-8时，培养板中出现滋养层干细胞类似的克隆结构，并随着天数生长范围扩大。在D10-12，用自制玻璃针及1mL移液枪将诱导型滋养层干细胞样克隆用机械方式挑取出来至新的预铺了Matrigel的六孔板中，培养基为上述细胞培养基，培养条件为37℃，5％CO2。
经过传代3次后，细胞经纯化为均匀一致的诱导型滋养层干细胞，生长迅速，进行鉴定及冻存等操作。
诱导型滋养层干细胞的维持和传代
在上述“诱导型滋养层干细胞的制备方法”步骤制备的人诱导型滋养层细胞生长到60％-90％时，即可进行传代，具体步骤如下(以六孔板为例)：
准备好已铺Matrigel的六孔板，吸去Matrigel，加入新鲜的上述细胞培养基于37℃，5％CO2培养箱内预热及平衡；弃掉旧培养基，加入无Ca2+和Mg2+的PBS洗两次；每孔加入1mL TrypLE消化酶，放入37℃培养箱中消化8-12min；每孔中加入1mL上述细胞培养基，用移液器将细胞从孔皿上吹打下来，并转移到14mL离心管内；380×g离心1min；离心后，吸掉上清，加入上述细胞培养基，充分混匀后按1：3的比例接种至已预置了上述细胞培养基的新的六孔板内，轻轻振荡混匀后至于37℃，5％CO2培养箱中，即完成传代。
本实施例中，诱导型滋养层干细胞于24小时换液一次，48小时-72小时传代一次。
诱导型滋养层干细胞的冷冻保存
在上述维持和传代步骤制备的诱导型滋养层干细胞的细胞融合度达到80％左右时，即可进行冷冻保存操作，具体包括：
将诱导型滋养层干细胞从培养板中消化下来，吸去离心上清，在离心管内细胞团内加入1mL冻存液，用吸管轻轻吹打均匀；然后将细胞分装至冻存管内，每管1mL，标记名称代数及时间；将装有细胞的冻存管放入程序冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜；24小时后从程序冻存盒中取出放入液氮容器内。
诱导型滋养层干细胞的解冻复苏
本实施例中诱导型滋养层干细胞从液氮容器内取出复苏的具体步骤如下。
从液氮容器中取出冻存管，浸入37℃水浴锅中，同时轻轻振荡以加快融化；待大部分已融化，可见少许冰晶时，在生物安全柜内打开盖子，吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍的mTeSR1培养基，混匀；380×g离心1min后吸掉上清，加入mTeSR1培养基，计数后铺入六孔板内，每孔内接种细胞10万个。
验证例1
对实施例提供的诱导型滋养层干细胞进行鉴定。
1.采用实施例提供的“诱导型滋养层干细胞的制备”方法，设置6组试验例，试验例1～6分别采用细胞培养基将H1 hESCs、HN10 hESCs、hTSUE005-iPS、hTShAMC-iPS、hTShAMC002-iPS以及hTShAMC004-iPS转化为诱导型滋养层干细胞。
制备后，经过传代3次，对得到的诱导型滋养层干细胞进行鉴定，诱导型滋养层干细胞的鉴定结果请参照附图2。
验证例2
免疫荧光染色鉴定。
采用实施例提供的细胞培养基和制备方法将H1 hESCs和HN10 hESCs转化为诱导型滋养层干细胞。然后将得到诱导型滋养层干细胞爬片置于十二孔板内，用MatrigelTM包被细胞爬片。
将诱导滋养层干细胞按照实施例的传代方法传代至此十二孔板中，生长3天后用于免疫荧光染色，免疫荧光染色的具体步骤如下。
染色前，弃旧培养基，用1ml PBS洗涤3次，加入0.5ml 4％多聚甲醛，室温固定30min。然后弃固定液，1ml PBS洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；摇晃后加入0.5ml通透液(0.2％Triton-X100在PBS中的溶液)，室温通透30min；通透后，弃通透液，用1ml PBST洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；随后加入0.5ml封闭液(10％山羊血清、5％BSA in PBST)，室温封闭1小时。
封闭后，弃封闭液，在十二孔板内加入0.5ml一抗(该一抗包括：兔抗GATA3 IgG，Abcam，ab19857；小鼠抗KRT7 IgG，Abcam，ab16287；小鼠抗TP63 IgG,Millipore，MAB4360；以及小鼠抗TEAD4 Igg，Millipore，MAB4381)，用比十二孔板稍小的封口膜覆盖液面，4℃湿盒避光处理1小时。弃一抗，1ml PBST洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min。
然后在十二孔板内加入0.5ml二抗(该二抗包括：山羊抗兔IgM Alexa Flour488，Invitrogen，A11008；山羊抗小鼠IgM Dylight 488，GeneTex，GTX76752；以及山羊抗小鼠IgG Alexa Flour&reg 488，Abcam，ab150117)，室温湿盒避光孵育处理1小时。弃二抗，1mlPBST洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；加入0.5ml DAPI，湿盒避光处理5min。
弃DAPI染液，用0.5ml PBS避光洗涤2次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；加入新的PBS 0.5ml，于奥林巴斯倒置显微镜下观察拍照记录，或者用封片剂处理制成玻片观察并保存。以便检测解冻后经传代培养的iPSC克隆的多能性标志物表达情况。
由图3可知，根据本发明实施例所得到的诱导型滋养层干细胞经过GATA3、KRT7、TP63以及TEAD4免疫荧光染色，检测结果均为阳性表达。
验证例3
流失细胞术检测
取实施例提供的诱导型滋养层干细胞，吸去待处理细胞的原培养基，加入PBS洗一遍，再用0.5mM EDTA在37℃培养箱内消化数分钟，直至细胞分散，然后加上述细胞培养基终止消化。吹打细胞以确保细胞分散，并呈单细胞状态，400×g离心1min。
离心后弃上清，用流式缓冲液(包含2％FBS或BSA的PBS)将细胞重悬后转移到1.5ml的EP管，400×g离心1min。离心后弃上清，加200μl 1％多聚甲醛，于37℃固定10min。400×g离心1min，弃上清，用流式缓冲液洗1次，再400×g离心1min后弃上清，加入200μl在冰上预冷过的90％甲醇，再置冰上通透30min。通透后，400×g离心1min，再用流式缓冲液冲洗2次，弃上清。
用流式缓冲液以适当比例将一抗进行稀释。取50μl已稀释的一抗将细胞重悬后以37℃孵育30min。孵育时可轻弹细胞数次，以尽量减少细胞在EP管底部聚集，从而影响抗体的结合。孵育完成后，200×g离心5min后，用流式缓冲液洗2遍。
下述操作应避光条件下进行。
先将二抗用流式缓冲液以适当比例进行稀释。再用200μl已稀释的二抗将细胞进行重悬，于37℃孵育30min，孵育时也同样可轻弹细胞数次。孵育完成后，400×g离心1min后，用流式缓冲液洗1遍。去掉上清，加200-300μl流式缓冲液进行重悬，过滤，用流式细胞仪选择适宜波长进行分析。
由图4可知，根据本发明实施例所得到的诱导型滋养层干细胞经过流式细胞仪检测GATA3、KRT7及TFAP2C的表达，检测结果均为阳性高表达。
验证例4
核型分析。
采用实施例提供的细胞培养基和制备方法将H1 hESCs和HN10 hESCs转化为诱导型滋养层干细胞。
然后将制备得到的诱导型滋养层干细胞传代至在MatrigelTM包被的六孔板上，当六孔板两个孔的细胞密度达80％时，即可用于做核型分析，核型分析的具体操作步骤如下：
吸弃旧的培养液，更换2mL新鲜的mTeSR1TM培养基。滴入14ml(20μg/ml)的秋水仙胺(使最终工作浓度为：0.14mg/ml)处理3h。吸弃含有秋水仙胺的培养基，用2mL PBS洗涤2次，用1mL 0.25％胰酶-EDTA消化细胞1min。加入1mL含10％FBS的培养基终止消化，将细胞吹打下来(要求尽可能单个细胞)，转移至15ml离心管，按照1500rpm的转速离心5min。弃上清，留沉淀。向15ml离心管内加入37℃预温的低渗液0.075mM KCl 8ml，用滴管反复冲打分散细胞，置于37℃水浴箱中低渗处理12min。
向低渗的细胞悬液内缓慢加入2ml固定液(甲醇和乙酸按体积比3：1的比例混合)，轻轻混匀后置室温下固定3min后，按照1500rpm的转速离心5min。弃上清，留沉淀。沿管壁缓慢加入8ml固定液，轻轻混匀后放37℃水浴箱预固定30min，按照1500rpm的转速离心5min。弃上清，留下沉淀细胞，重新加固定液1ml(加固定液的量根据沉淀物的量和制片后细胞的分布情况调整)，混匀后液体成毛玻璃状，滴冰片，每块玻片2滴，过酒精灯干燥。
将制好的玻片置90℃烤箱中烘烤25min。取3个50ml立式染色缸(分别标记为染色缸Ⅰ、II和III)，置37℃水浴中预温30min。染色缸Ⅰ加入磷酸盐缓冲液49ml，1.25％胰酶1ml，混匀，用于细胞遗传消化显带，消化时间1min 20s。染色缸Ⅱ内加大约50ml生理盐水，用于漂洗。染色缸Ⅲ内加入双蒸水45ml，染色液两管，混匀，用于染片，染片时间4min。取出，用自来水冲洗，置烤箱中将玻片烤干，或自然晾干。
采用奥林巴斯正置显微镜观查：15-20个核型，并通过染色体自动扫片分析系统(蔡司MetaSystems)扫描分析。
检测结果如图4和5所示。
由图5和6可知，两株胚胎干细胞(H1和HN10)来源的人诱导滋养层干细胞培养第10代的核型正常，且具有典型的滋养干细胞特征：低表达HLA-I类分子、ELF5启动子低甲基化、高表达特异性microRNA。
验证例5
实施例中制备的诱导滋养层干细胞分化潜能检测。
实施例中人诱导型滋养层干细胞进行绒毛外细胞滋养层细胞分化，具体步骤如下：
将传代的诱导型滋养层干细胞接种到预铺Matrigel的六孔板内，每孔接种细胞4×105个培养基采用EVT(extravillous cytotrophoblast，绒毛外细胞滋养层)分化培养基#1；培养箱37℃，5％CO2。三天后，吸掉原培养基，改加EVT分化培养基#2；约第6-8天，收取细胞进行鉴定分析。
实施例中的诱导型滋养层干细胞进行合体滋养层细胞方向分化的具体步骤如下：
将传代的人诱导滋养层干细胞接种到预铺Matrigel的六孔板内，每孔接种细胞1×105个培养基采用STB(syncytiotrophoblast，合体滋养层细胞)分化培养基#1；培养箱37℃，5％CO2。三天后吸掉原培养基，继续换新鲜STB培养基进行分化培养；第6-7天，收取细胞进行鉴定分析。
鉴定结果请参照附图7和图8，由附图可知，来源于人胚胎干细胞的诱导型滋养层干细胞分化成滋养层亚型细胞(包括EVT和STB)，具有典型的形态学特征，表达相应的标志物HLA-G(EVT)和SDC1/HCG(STB)标志物。根据本发明实施例所得到的诱导型滋养层干细胞分化成滋养层亚型细胞(包括EVT和STB)的能力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，其包括采用细胞培养基将人多能干细胞培养为具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的诱导型滋养层干细胞；
所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞；
所述细胞培养基包括基础培养液，且所述细胞培养基中至少还含有以下组分：0.5～2.5μg/mL维生素C、20～70ng/mL表皮生长因子、1～5μM WNT通路激活剂、0.3～1.9μM TGF-β通路抑制剂、3～7μM ROCK通路抑制剂以及0.6～1.1mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞培养基中还包括以下一种或多种组分：0.5～1.5％胰岛素样转铁蛋白添加剂、0.05～0.15mMβ-巯基乙醇和0.1％～0.5％BSA；
优选地，所述细胞培养基还包括0.1～0.7％青链霉素混合液和/或0.1～0.4％FBS；
优选地，所述WNT通路的激活剂为CHIR99021；
优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y-27632；
优选地，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和/或SB431542；
优选地，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和SB431542，在所述细胞培养基中，A83-01的终浓度为0.3～0.7μM，SB431542的终浓度为0.8～1.2μM；
优选地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠；
优选地，所述基础培养液选自以下培养基中的至少一种：DMEM/F12、RPMI1640和HamsF-12。
3.根据权利要求2所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，所述亚型滋养层细胞包括绒毛外细胞滋养层细胞和/或合体滋养层细胞；
优选地，所述人胚胎干细胞包括H1 hESC和/或HN10 hESC；
优选地，所述诱导多能干细胞选自以下细胞中的至少一种：尿液细胞来源的iPS细胞UE005-iPS、绒毛外间充质细胞来源的iPS细胞hAMC-iPS、hAMC002-iPS以及hAMC004-iPS。
4.根据权利要求1～3任一项所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，采用细胞培养基培养时，人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞的接种密度为(1～9)×105个cell/mL；
优选地，所述制备方法包括将制备得到的诱导型滋养层干细胞进行传代培养；
优选地，所述传代培养的细胞融合度为90～100％；
优选地，当细胞融合度达到90～100％时，所述传代培养包括采用消化酶与细胞共孵育，以获得细胞溶液，所述消化酶为0.3～0.7mM EDTA；
优选地，所述传代培养的比例为1：(2～4)；
优选地，所述传代培养的培养基为所述细胞培养基；
优选地，将人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞在所述细胞培养基中培养前，所述制备方法包括：将人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞在干细胞培养基中36～38℃预培养22～26h；
优选地，所述干细胞培养基为mTeSR1培养基；
优选地，所述预培养在包被有Matrigel的培养皿中进行。
5.一种诱导型滋养层干细胞，其特征在于，其采用权利要求1～4任一项所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法制得。
6.如权利要求5所述的诱导型滋养层干细胞在制备用于胎盘发育障碍相关性疾病的药物中的应用；
优选地，所述胎盘发育障碍相关性疾病包括以下疾病中的至少一种：子痫前期、子痫、胎盘植入和胎儿生长受限。
7.如权利要求5所述的诱导型滋养层干细胞在用于研究胎盘发育过程中的调控网络中的应用；
优选地，所述调控网络包括转录因子、胞外信号、表观遗传修饰、代谢及细胞周期中的至少一种。
8.如权利要求5所述的诱导型滋养层干细胞在用于模拟早期胚胎合成或胚胎干细胞自组装中的应用。
9.一种细胞培养基在制备诱导型滋养层干细胞中的应用，其特征在于，所述制备诱导型滋养层干细胞包括：采用细胞培养基将人多能干细胞培养为具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的诱导型滋养层干细胞；
所述人多能干细胞包括胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞；
所述细胞培养基包括基础培养液，且所述细胞培养基中至少含有以下组分：0.5～2.5μg/mL维生素C、20～70ng/mL表皮生长因子、1～5μM WNT通路激活剂、0.3～1.9μM TGF-β通路抑制剂、3～7μMROCK通路抑制剂以及0.6～1.1mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
10.根据权利要求9所述的细胞培养基在制备诱导型滋养层干细胞中的应用，其特征在于，所述细胞培养基中还包括以下一种或多种组分：0.5～1.5％胰岛素样转铁蛋白添加剂、0.05～0.15mMβ-巯基乙醇和0.1％～0.5％BSA；
优选地，所述细胞培养基还包括0.1％～0.7％青链霉素混合液和/或0.1％～0.4％FBS；
优选地，所述WNT通路的激活剂为CHIR99021；
优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y-27632；
优选地，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和/或SB431542；
优选地，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和SB431542，在所述细胞培养基中，A83-01的终浓度为0.3～0.7μM，SB431542的终浓度为0.8～1.2μM；
优选地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠；
优选地，所述基础培养液选自以下培养基中的至少一种：DMEM/F12、RPMI1640和HamsF-12。
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