CN101218342A - 细胞滋养层干细胞 - Google Patents
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Abstract
我们公开了衍生自胚胎干细胞的细胞滋养层干细胞、它们向血管内细胞滋养层细胞的分化及其用途。
Description
本发明涉及衍生自胚胎干细胞的细胞滋养层干细胞及其用途。
在哺乳动物发育期间，直至胚泡形成时组成胚胎一部分的那些细胞被称为全能的(例如每个细胞具有形成完整胚胎和支持所述胚胎的生长和发育所需的全部细胞的发育潜能)。在胚泡形成期间，包含内细胞群的细胞被称为多能的(例如每个细胞具有形成不同组织的发育潜能)。
胚胎干细胞(即具有多能性特征的那些)可能主要衍生自两个胚胎来源。从内细胞群分离的细胞被称为胚胎干(ES)细胞。在实验室小鼠中，能够从分离自交配后8.5-12.5天的胚胎的肠系膜或生殖脊的原始生殖细胞的培养物衍生类似的细胞。这些最终会分化成为生殖细胞且被称为胚胎生殖细胞(EG细胞)。这些多能性细胞类型中的每一种在分化成为不同细胞类型方面具有相似的发育潜能，但行为上的可能不同(例如关于印记)使得这些细胞彼此区别。WO96/22362描述了可以确定可能允许人ES/EG细胞在培养物中建群的条件的指示，通过参考的方式将其并入。该申请描述了使得灵长类ES细胞能够连续增殖的细胞系和生长条件，该灵长类ES细胞展现与具有多能性特征的干细胞相关的多种特征或标志物。
在人类植入中，细胞滋养层干细胞(CTB)的连续增殖使得胚胎能够快速侵入子宫内膜基质并建立血绒膜胎盘。细胞滋养层向侵入性血管内表型的早期分化对于促进母胎免疫耐受和重建子宫血管起关键作用，并且异常发育与严重妊娠并发症相关，该并发症包括反复性流产、先兆子痫(妊娠高血压)和胎儿生长受限(1-3)。对这个过程的了解甚少，因为出于伦理和实践的考虑使用人类组织的研究被严格限制。
在小鼠中，分离自植入前和植入后胚胎的滋养层干细胞能够在培养物中无限传代且具有沿滋养层谱系分化的能力(4)。然而，尚未实现从植入前胚泡衍生人滋养层干细胞，可能是由于这些物种之间早期胚胎发育的不同(5)。
因此我们使用人胚胎干细胞(HESC)作为获得滋养层干细胞群的途径。尽管HESC在培养物中自发分化成为滋养层样细胞(5，6)，当补充骨形态发生蛋白4时(7)或者当Oct 4下调节时(8)，这些细胞终分化且显示有限的增殖能力。当HESC聚集形成胚胎样体(EB)时，滋养层分化能够进一步发展，但其余HESC及培养中由于自发分化产生的其它类型的细胞混淆了来自这些制备物的发现。
我们公开这些分离的滋养层样细胞的分离及它们在细胞培养中的保持。我们还公开这些分离的滋养层样细胞在调节免疫系统尤其是在组织工程中的用途。
组织工程或移植在临床和美容外科学的许多领域中具有可能用途。更具体地，组织工程涉及替换和/或恢复和/或修复受损的和/或有病的组织以使组织和/或器官还原至有功能状态。例如，并且非限制性的，组织工程在提供皮肤移植物以修复创伤中有用，该创伤是挫伤、或烧伤、或组织由于静脉或糖尿病性溃疡不能愈合的结果。此外，组织工程还用在：替换诸如关节炎的退行性疾病中的关节；由于各种环境原因(例如吸烟、节食)和/或先天性心脏病造成损伤而替换冠状动脉，包括替换动脉/心脏瓣膜；修复胃溃疡；替换骨组织，由诸如骨质疏松症的疾病导致需要进行该替换；替换肌肉和神经，由于神经肌肉疾病或伤害造成的损伤导致需要进行该替换。此外，多年来器官移植已经是替换损伤和/或患病器官的确立的外科技术。心脏、肺、肾、肝、骨髓和例如心脏和肺的双器官移植的替换是相对普通的过程。
然而，在组织工程和器官移植中成功建立组织移植物或器官移植的主要困难是宿主对供体组织或器官的排斥。
根据本发明的方面，提供分离的细胞滋养层干细胞，其中所述干细胞表达HLA-G和HLA I类抗原。
在本发明的优选实施方案中，所述干细胞是单个核细胞。
在本发明的其它优选实施方案中，所述干细胞表达至少一种选自细胞角蛋白7、阶段特异性胚胎抗原1、人胎盘催乳素、尾型同源框(caudal related homeobox)、波形蛋白和Cd9的干细胞标志物。
在本发明的其它优选实施方案中，所述干细胞是从灵长类，优选人中分离的。
在本发明的优选实施方案中，所述干细胞不是全能性细胞。
在本发明的优选实施方案中，所述干细胞是经遗传修饰的。
对本领域技术人员来说显而易见的是，可以通过标准方法遗传修饰细胞滋养层干细胞，该方法使得能够通过载体核酸或直接转染裸核酸将核酸引入至细胞中。或者，可以首先修饰胚胎干细胞并且通过本文公开的方法衍生遗传修饰的细胞滋养层干细胞。会将期望的遗传工程化的性状与编码标记基因的核酸一起转染人胚胎干细胞或细胞滋养层干细胞以允许筛选或鉴别，该标记基因例如绿色荧光蛋白。
根据本发明的其它方面，提供用于组织工程的包含细胞滋养层干细胞的组合物。
根据本发明的其它方面，提供包含本发明的细胞滋养层干细胞的培养物，该培养物装在细胞培养容器中。
根据本发明的其它方面，提供包含本发明的细胞滋养层干细胞及基于胶原的细胞支持基质的球状体。
在本发明的优选实施方案中，所述球状体中的细胞滋养层干细胞表达至少一种金属蛋白酶，优选金属蛋白酶2。
根据本发明的方面，提供衍生人细胞滋养层干细胞的方法，包括选择性富集表达HLA-G和HLA I类抗原的细胞滋养层干细胞。
根据本发明的其它方面，提供从胚胎干细胞衍生人细胞滋养层干细胞方法，包括步骤：
i)在细胞培养容器中形成包含细胞滋养层细胞的胚胎样体；
ii)鉴别那些产生高于约500m I.U./ml绒毛膜促性腺激素的胚胎样体培养物；
iii)在来自成纤维细胞饲养细胞的条件培养基中培养(ii)中鉴别的胚胎样体；
iv)合并那些产生高于约500m I.U./ml绒毛膜促性腺激素的胚胎样体并分散所述胚胎样体；以及
v)重复(iv)直至基本上所有的胚胎样体均产生高水平的绒毛膜促性腺激素。
“容器”被定义为适于容纳上述细胞培养物的任何装置。通常，这类容器的例子是培养皿、细胞培养瓶或锥形瓶、多孔培养皿。
在本发明的优选方法中，所述条件培养基包含成纤维细胞生长因子4和肝素。
根据本发明的其它方面，提供通过培养本发明的细胞滋养层干细胞产生的用过的培养基。
根据本发明的其它方面，提供产生血管内细胞滋养层细胞的方法，包括步骤：
i)提供细胞滋养层干细胞的制备物；
ii)从所述制备物中筛选表达HLA-G和血小板内皮细胞粘附分子1的细胞群。
在本发明的优选方法中，所述细胞还表达血管性血友病因子(VonWillebrand Factor)。
根据本发明的其它方面，提供通过本发明方法获得的或可获得的血管内细胞滋养层细胞。
在本发明的优选方法中，在高氧张力下，优选至少5％CO2下培养所述制备物。
根据本发明的其它方面，提供用于包含细胞滋养层干细胞的球状体形成的体外方法，包括：
i)提供细胞培养容器，该容器含有：
a)本发明的细胞滋养层干细胞；
b)细胞培养基；以及
ii)提供促进所述球状体中所述细胞滋养层干细胞的生长和分化的条件。
根据本发明的其它方面，提供通过培养包含本发明的细胞滋养层干细胞的球状体产生的用过的培养基。
根据本发明的其它方面，提供用于鉴定与细胞滋养层干细胞分化相关的基因的方法，包括步骤：
i)提供包含至少一种本发明的细胞滋养层干细胞的制备物；
ii)从所述细胞制备物中提取核酸；
iii)将所述提取的核酸与核酸阵列接触；以及
iv)检测表明所述核酸在所述核酸阵列上与结合伙伴相结合的信号。
优选地，所述方法包括另外的步骤：
i)整理由所述核酸与所述结合伙伴结合产生的信号；
ii)将整理的信号转换为可分析数据的形式；以及任选地
iii)提供已分析数据的输出。
在本发明的其它优选方法中，所述方法包括比较从不同个体分离的不同细胞滋养层干细胞群产生的阵列信号。
根据本发明的其它方面，提供用于制备包含细胞滋养层干细胞特异性基因表达产物的文库的方法，包括步骤：
i)提供包含至少一种本发明的细胞滋养层干细胞的制备物；
ii)从所述细胞制备物中提取核酸；
iii)从包含在所述提取的核酸中的核糖核酸制备cDNA；以及
iv)将(iii)中形成的cDNA连接到载体中。
在本发明的优选方法中，所述载体是基于噬菌体的载体。
根据本发明的其它方面，提供分析细胞滋养层干细胞的侵入特性的体外方法，包括步骤：
i)提供本发明的球状体和子宫内膜组织；以及
ii)监测细胞滋养层细胞对于所述子宫内膜组织的侵入表型。
根据本发明的其它方面，提供鉴定调节内皮细胞的血管生成活性的试剂的方法，包括步骤：
i)提供本发明的血管内细胞滋养层细胞的制备物和待测试的试剂；
ii)确定该试剂对所述血管内细胞滋养层细胞的增殖和/或运动力的作用或没有作用。
在本发明的优选方法中，所述试剂是拮抗剂(例如抗血管生成剂)。
在本发明的其它方法中，所述试剂是激动剂(例如促血管生成剂)。
血管生成，即从存在的血管床发育新血管，是复杂的多步过程，包括细胞外基质组分的降解以及随后内皮细胞的迁移、细胞分裂和分化以形成管并最终形成新血管。病理条件例如肿瘤细胞生长、非癌性条件例如新生血管性青光眼、炎症、糖尿病性肾病、视网膜病变、类风湿关节炎、炎性肠病(例如Crohn病、溃疡性结肠炎)和银屑病涉及血管生成。目前用于血管生成分析的内皮细胞系是称为“HuDMECS”的商业化的内皮细胞。本发明提供用于血管生成研究的新模型内皮细胞系。
根据本发明的方面，提供细胞滋养层细胞或衍生自细胞滋养层细胞的细胞在制备用于免疫系统调节的细胞组合物中的用途。
根据本发明的其它方面，提供细胞滋养层细胞或衍生自细胞滋养层细胞的细胞在制备用于调节移植治疗中的细胞/组织排斥的细胞组合物中的用途。
在本发明的优选实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，优选人类细胞。
根据本发明的其它方面，提供组合物，其包含分离的哺乳动物细胞滋养层细胞或衍生自细胞滋养层细胞的细胞，以及至少一种另外的分离的并非哺乳动物细胞滋养层细胞的哺乳动物细胞。
在本发明的优选实施方案中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
在本发明的其它优选实施方案中，所述细胞选自上皮角质细胞表皮角质形成细胞、成纤维细胞(例如皮肤、角膜；肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝)、上皮细胞(例如角膜、皮肤、角膜；肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝)、神经元胶质细胞或神经细胞、肝细胞星形细胞、间充质细胞、肌细胞(心肌细胞或肌管细胞)、肾细胞、血细胞(例如CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、胰岛β细胞或内皮细胞。
在本发明的优选实施方案中，所述细胞是胰岛β细胞。
在本发明的其它优选实施方案中，所述哺乳动物细胞是干细胞。
在本发明的优选实施方案中，所述干细胞选自造血干细胞、神经干细胞、骨干细胞、肌干细胞、间充质干细胞、上皮干细胞(衍生自诸如皮肤、胃肠粘膜、肾、膀胱、乳腺、子宫、前列腺和诸如垂体的内分泌腺的器官)、内胚层干细胞(衍生自诸如肝、胰、肺和血管的器官)、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞。
在本发明的优选实施方案中，所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞。
在本发明的其它优选实施方案中，所述哺乳动物细胞和所述细胞滋养层细胞是自体的。
优选地，所述胚胎干细胞/胚胎生殖细胞对所述细胞滋养层细胞来说是自体的。
在本发明的其它优选实施方案中，所述组合物包含其它试剂，其中所述试剂是免疫抑制剂。
根据本发明的其它方面，提供媒介物(vehicle)，所述媒介物包括哺乳动物细胞滋养层细胞或衍生自细胞滋养层细胞的细胞，以及至少一种另外的分离的并非哺乳动物细胞滋养层细胞的哺乳动物细胞。
媒介物被定义为细胞可以附着和增殖的任何结构。例子包括假体、植入物、基质、支架、纱布、绷带、硬膏、生物可降解基质和聚合物膜。基质材料可以是合成的或天然存在的，且可以是长期存在的或生物可降解的。
根据本发明的其它方面，提供调节移植治疗中细胞/组织排斥的方法，包括：
i)将细胞滋养层细胞或衍生自细胞滋养层细胞的细胞以及至少一种其它哺乳动物细胞手术插入动物中；以及任选地
ii)监测该动物的免疫状态作为接受或不接受所述哺乳动物细胞的衡量。
在本发明的优选方法中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
在本发明的其它优选方法中，所述细胞选自表皮角质形成细胞、成纤维细胞(例如皮肤、角膜；肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝)、上皮细胞(例如角膜、皮肤、角膜；肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝)、神经元胶质细胞或神经细胞、肝细胞星形细胞、间充质细胞、肌细胞(心肌细胞或肌管细胞)、肾细胞、血细胞(例如CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、胰岛β细胞或内皮细胞。
在本发明的其它优选方法中，所述细胞是胰岛β细胞。
在本发明的优选方法中，所述哺乳动物细胞是干细胞。
在本发明的优选方法中，所述干细胞选自造血干细胞、神经干细胞、骨干细胞、肌干细胞、间充质干细胞、上皮干细胞(衍生自诸如皮肤、胃肠粘膜、肾、膀胱、乳腺、子宫、前列腺和诸如垂体的内分泌腺的器官)、内胚层干细胞(衍生自诸如肝、胰、肺和血管的器官)、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞。
在本发明的优选方法中，所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞。
在本发明的其它优选方法中，所述哺乳动物细胞和所述细胞滋养层细胞是自体的。
根据本发明的其它方面，提供分离的嵌合细胞，其中所述细胞是第一细胞或其部分和第二细胞融合的产物，该第一细胞是表达HLA-G和HLA I类抗原的细胞滋养层细胞，其中所述第一和第二细胞衍生自同一物种。
促进细胞融合的方法为本领域公知(Kennett，R.H.(1979).CellFusion in：Cell Culture，Methods in Enzymology(细胞融合：细胞培养，酶学方法).(Jakoby，W.B.和Pastan，LH.编辑)Academic Press San Diego，58，345-359，通过参考的方式整体并入)。还公知通过将细胞的细胞质(其中细胞核被去除)和选定的完整细胞融合以形成所谓的胞质杂种可以形成细胞杂种(Ege，T.Zeuthen，J.Ringertz，N.R.(1973).Cell fusionwith enucleated cytoplasms(使用去核细胞质的细胞融合).Nobel，23，189-194；Veomett，G.Prescott，D.M.Shay，J.Porter，K.R.(1974).Reconstruction of mammalian cells from nuclear and cytoplasmiccomponents separated by treatment with cytocholasin B(从通过细胞松弛素B处理分离的细胞核和细胞质组分重建哺乳动物细胞).Proc NatAcad Sci，71，1999-2002；Wright，W.E.and Hayflick L.(1975).Use ofbiochemical lesions for selection of human cells with hybrid cytoplasms(使用生化损伤选择具有杂种细胞质的人细胞).Proc.Nat.Acad.Sci(USA).72，1812-1816，通过参考的方式将它们整体并入)。这使得能够研究核-胞质相互作用，尤其是细胞质决定子(determinant)对核基因表达的影响。多年来已知经选择的对培养物中细胞的化学处理能够导致细胞排出细胞核，导致形成分开的细胞核和细胞质部分，分别称为核质和胞质。这些亚细胞组分已被用于融合实验。例如，有可能从一个细胞产生细胞质并将该胞质与选定的细胞融合以形成细胞质杂交种或胞质杂种。此外，还可能将核质或细胞与选定的细胞融合以形成细胞核杂交种。细胞核在有丝分裂期间核膜破裂后融合，且在胞质分裂后重建以形成多倍体或非整倍体核。Duran C，Talley PJ，Walsh J，Pigott C，Morton IE，and Andrews PW.Hybrids of pluripotent and nullipotenthuman embryonal carcinoma cells：partial retention of a pluripotentphenotype(多能和无能人胚胎性癌的杂交种：多能表型的部分保留).MJ Cancer.2001 Aug 1；93(3)：324-32描述了胚胎干细胞的融合，通过参考的方式将它们并入。
在本发明的优选实施方案中，所述嵌合细胞包含衍生自细胞滋养层细胞的胞质部分和衍生自非细胞滋养层细胞的细胞的细胞核。
在本发明的其它优选实施方案中，所述嵌合细胞包含衍生自细胞滋养层细胞的细胞核及衍生自非细胞滋养层细胞的细胞的胞质部分。
在本发明的优选实施方案中，所述第一和第二细胞是人类细胞。
在本发明的其它优选实施方案中，所述第二细胞选自表皮角质形成细胞、成纤维细胞(例如皮肤、角膜、肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝)、上皮细胞(例如角膜、皮肤、角膜、肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝)、神经元胶质细胞或神经细胞、肝细胞星形细胞、间充质细胞、肌细胞(心肌细胞或肌管细胞)、肾细胞、血细胞(例如CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、胰岛β细胞或内皮细胞。
根据本发明的其它方面，提供包含本发明嵌合细胞的细胞培养物。
根据本发明的其它方面，提供产生嵌合细胞方法，包括步骤：
i)形成包含第一细胞和第二细胞的制备物，该第一细胞是表达HLA-G和HLA I类抗原的细胞滋养层细胞，其中所述第一和第二细胞衍生自同一物种；以及
ii)提供条件，其中所述第一和第二细胞融合形成嵌合细胞。
根据本发明的其它方面，提供本发明嵌合细胞在制备调节移植治疗中细胞/组织排斥的细胞组合物中的用途。
根据本发明的其它方面，提供治疗会从移植治疗受益的状态的方法，包括给予本发明的嵌合细胞。
贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含”和“含有”及诸如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”的词语的变体指“包括但不限于”，且不旨在(且不)排除其它部分、添加物、组分、整体或步骤。
贯穿本说明书的描述和权利要求，除非上下文另有要求，则单数包括复数。具体地，当使用不定冠词时，说明书应当被理解为指复数以及单数，除非上下文另有要求。
在本发明特定方面、实施方案或实例中描述的特征、整体、特性、化合物、化学部分或基团应被理解为适用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实例，除非与它们不相容。
参考以下附图描述本发明的实施方案，该描述仅为示例性的：
图1说明人CTBS细胞系的衍生和最初特征；(A)96孔中含有单一胚胎样体的培养基中hCGβ浓度的柱状图。(B)无饲养细胞的“TS”培养物中的贴壁上皮CTBS细胞。标尺均为20μm。(C)与(B)相同的培养物中的贴壁多核合胞体滋养层。(D)&(E)相差和紫外(UV)光下的贴壁CTBS细胞，显示细胞角蛋白(绿)和hCGβ(红/橙)的免疫定位(核，蓝色)。(F)&(G)相差和UV下的与贴壁多核合胞体融合的单CTBS细胞。单细胞主要为细胞角蛋白+且合胞体主要为hCGβ+。(H)贴壁GFP-合胞滋养层(相差和UV)以及(I)单独的UV(T)。插图：低倍的GFP-滋养层小泡；
图2说明TS细胞的RT-PCR和FACS分析。(A)未分化的HESC(H7)和CTBS 1和CTBS 2细胞系的基因表达(RT-PCR)。(B)早期培养物中CTBS2的FACS分析谱(未显示CTBS1的相似数据)。部分细胞表达非典型HLA-G(峰A)，而大部分表达I类HLA的所有形式。用于FACs分析的细胞的相差和免疫荧光表明HLA-G染色。标尺＝20μm；
图3说明CTBS细胞系在“TS”条件培养基中向血管内细胞的分化。A)CTBS1细胞系的单个贴壁细胞滋养层的相差显微照片。B)培养1-2周后的(A)中的细胞。长条状聚集体显示典型的内皮样形态。(C)培养瓶的暗视野低倍显微照片。D)血管内细胞聚集体的相差显示HLA-G(E)和PECAM-1(F)共表达。(G)邻近血管内细胞的多核“巨人”的相差。E)E钙粘着蛋白的免疫定位在巨细胞中比在血管内细胞中强很多；以及
图4说明细胞外基质和子宫内膜共培养物中的CTBS球状体。(A)在Matrigel中培养5天后，CTBS球状体(CTBS1细胞系)具有合胞体的微绒毛突出。插图(i)和(ii)：更高倍放大的相差和免疫染色，显示合胞体床中的细胞角蛋白(绿)和hCGβ(红)。标尺＝100μm.(B)来自与子宫内膜细胞共培养中的CTBS1聚集体的定时影片(参见补充信息)的图像；标尺＝150μm。全部黑色箭头均表示小泡迁移的方向。(1)，白色箭头表明侵入性细胞滋养层长出物；(4和5)，白色箭头表明基质侵蚀位点；(4)插图(i)和(ii)，侵蚀位点边缘的更高倍放大，显示相差和MMP-2的免疫定位。(C)与子宫内膜基共培养的CTBS-GFP细胞；标尺＝20μm。
材料和方法
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
聚合酶链式反应(PCR)技术被用来鉴定表征细胞类型的遗传标志物。在37℃下、在含有1.25mM dNTPs的40μl反应体系中用MMLV逆转录酶(Promega)用1μg寡聚dT(oligo-dT)引物逆转录总RNA(2μg)。在50μl反应体系中用1μl cDNA进行PCR，该反应体系含有引物各15pmol、0.2mM dNTPs和1单位的Taq聚合酶(Promega)。所用引物的序列及这些反应的条件如下：
β-actin-F：5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′；
β-actin-R：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′(60℃退火，x 23循环)。
Oct4-F：5′-CGACCATCTGCCGCTTTGAG-3′；
Oct4-R：5′-CCCCCTGTCCCCCATTCCTA-3′(60℃退火，x23循环)。
Sox2-F：5′-CCCCCGGCGGCAATAGCA-3′；
Sox2-R：5′-TCGGCGCCGGGGAGATACAT-3′(60℃退火，x38循环)。
FGF4-F：5′-CTACAACGCCTACGAGTCCTACA-3′；
FGF4-R：5′-GTTGCACCAGAAAAGTCAGAGTTG-3′(56℃退火，x40循环)。
Nanog-F：5′-GCCTCAGCACCTACCTACCC-3′
Nanog-R：5′-GGTTGCATGTTCATGGAGTAG-3′(60退火及x30循环)。
Eomes-F：5′-TCACCCCAACAGAGCGAAGAGG-3′；
Eomes-R：5′-AGAGATTTGATGGAAGGGGGTGTC-3′(57℃退火，x35循环)。
Cdx2-F：5′-CCTCCGCTGGGCTTCATTCC-3′；
Cdx2-R：5′-TGGGGGTTCTGCAGTCTTTGGTC-3′(60℃退火，x35循环)；
HLA-G-F：5′-GCGGCTACTACAACCAGAGC-3′；
HLA-G-R：5′-GCACATGGCACGTGTATCTC-3′(55℃退火，x26循环)。
CD9-F：5′-TTGGACTATGGCTCCGATTC-3′；
CD9-R：5′-GATGGCATCAGGACAGGACT-3′(55℃退火，x26循环).
CK7-F：5′-ACAGAGCTGCAGTCCCAGAT-3′；
CK7-R：5′-GTAGGTGGCGATCTCGATGT-3′(55℃退火，x26循环)。
荧光活化的细胞分选(FACS)
通过使用胰蛋白酶-EDTA将CTBS细胞解离成单个细胞来制备用于细胞分选的滋养层细胞。将细胞以5×106/ml悬浮在含有40％正常山羊血清的FACS缓冲液中以在冰上封闭20分钟。将90μl的细胞悬浮液分配到FACS试管中并加入10μl的G233(HLA-G的TS标志物)和W6/32 HLA I类对照。含有NaN3的G233(小鼠IgG2a)由剑桥大学的Dr Ashley King提供。将细胞在冰上孵育30分钟。孵育后，洗涤两次，然后用抗小鼠多价免疫球蛋白FITC结合物在冰上标记30分钟。再次洗涤细胞并重新悬浮在300μl缓冲液中。
测定细胞培养物中hCGβ的浓度
使用夹心法酶免疫测定试剂盒(Cat.#EIA-1469，DRG Diagnostics)测定hCGβ的浓度。用100μl抗hCG酶偶联物在室温下孵育标准和样品30分钟，然后洗涤5次。第二次孵育使用100μl底物溶液进行10分钟，加入50μl终止溶液终止孵育。使用微量酶标仪在450±10nm处读取吸光度。从标准曲线确定样品中以m I.U./ml表示的hCGβ的浓度。
eGFP在HESC中的组成型表达
通过使用XhoI和NotI从pEGFP-1(Clontech)中切出eGFP并插入到pCAG载体中构建pCAG-GFP表达载体16。H7细胞以6孔板每孔2×105的等量被接种到Matrigel上。第二天按照制造商的说明用ExGen500(Fermentas)转染它们。然后将DNA/NaCl Exgen混合物直接加入到孔中的正常培养基中。在280g离心该板5分钟并放回培养箱中。第二天用含有嘌呤霉素(1μg/ml)的hES生长培养基更换所述培养基。2-3周后挑出活的集落。
子宫内膜-CTBS球状体共培养
在完全符合伦理及患者知情下，从接受子宫切除术的女性获得黄体期子宫内膜活检组织。使用以前描述的方法24分离子宫内膜上皮和基质细胞。制备物被包埋到膜插入物上的Matrigel中，并且在开始与CTBS的共培养前用孕酮预激24小时。在单层共培养中，CTBS球状体被培养在培养孔中基质或上皮细胞的融合层上。共培养物被保持在500μl的条件TS培养基或不含血清的HES培养基中至多6天。
定时显微镜技术
在湿润的生理舱(physiological chamber)中、在37℃、在含有5％CO2的空气中(DigitalPixel Ltd)在倒置显微镜下连续观察贴壁CTBS培养物或CTBS-子宫内膜共培养物至多3天。初步实验表明保持在这些条件下的细胞的存活力与标准培养箱没有区别。使用Simple PCI软件(C-Imaging)鉴定并编程感兴趣的区域(ROI)用于分析，该软件控制xyz上的扫描、透射光和图像捕获。按常规鉴定20个ROI，每15分钟拍照。
1.贴壁多核TS细胞的影片显示细胞融合
2.共培养中附着的且在子宫内膜基质细胞上迁移的TS小泡的影片，且显示侵蚀位点。
实施例1
首先，我们制备含有滋养层的EB，使用正常核型的HESCs(H7和H14)，使用血清替代培养基通过标准实验方案保持和传代(8，9)。在培养皿中、在含5％CO2的空气中通过在不含碱性成纤维细胞生长因子的ES培养基中聚集单个HESC(用1mg/ml胶原酶IV解离)来制备EB。在第5天，将EB逐一转移至96孔培养板的孔中，并且在如前所述(10)对部分培养基进行ELISA之前再培养3天。在大多数孔中检测到HCGβ(4×96孔板)，但仅有3.8％的孔的激素浓度高于500m I.U./ml(图1A)。这些孔中的EB具有等同的大小和形态，表明hCGβ的任何增加很可能主要归因于滋养层细胞比例而非细胞总数更高。
实施例2
为了筛选CTBS细胞，使表现高hCGβ分泌的EB经历若干轮选择性富集，该富集通过在包含来自补充有成纤维细胞生长因子4(FGF4)和肝素的成纤维细胞饲养细胞的条件培养基的“TS”培养基中培养。TS培养基促进鼠滋养层干细胞从胚胎外外胚层的分化(4)。合并那些保持hCGβ高水平分泌的EB，将它们分散并允许形成新的EB，并且连续重复此富集方案三轮直至所有的EB均显示稳定的高hCGβ分泌。分散EB(0.25％胰蛋白酶-EDTA)，然后允许单个细胞在不含饲养细胞的TS培养基中在贴壁培养中增殖。不含bFGF的HES培养基中EB的对照培养物只展现基础hCGβ水平，表明滋养层分化很少。最初，产生具有不同增殖的四个细胞系，其中两个保持持续增殖的能力超过30代(来自H7 HESC的CTBS1和来自H14 HESC的CTBS2)且形成具有单个和多个核细胞的上皮样细胞集落(图1B)。还使用相同的方法产生另一CTBS细胞系(CTBS-GFP1)，但其来自具有增强绿色荧光蛋白eGFP(11)的组成型表达的H7 HESC(图1H和1I)。如通过对细胞角蛋白和hCGβ的免疫染色所确定的，每一细胞系的连续增殖与单个核细胞滋养层群的持续性(与合胞体形成相关)有关(图1D-G)。通过每5天进行常规细胞传代保持细胞增殖，因为这抑制终分化。当聚集CTBS细胞并将其返回含有HES培养基的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞时，它们不能返回到或产生具有除滋养层之外的多能发育能力的HESC集落或EB。这表明在细胞系中缺乏残存的HESC，以及如在小鼠中显示的一样，CTBS细胞的发育能力很可能受限(10)。
实施例3
我们对全(pan)滋养层标志物细胞角蛋白7(12，13)、阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1，4)和人胎盘催乳素(hPL，14)的免疫定位证实了细胞系的滋养层表型。此外，使用HESC和滋养层标志物基因的引物序列进行逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)。与HESC相比，在衍生的细胞系中缺乏Oct 4、Sox2、FGF4、Nanog的mRNA表达，而滋养层相关mRNA Cdx2(尾型同源框)、Ck7、HLA-G和Cd9则上调节或保持(图2A)。后两个为在胎盘形成期间侵入子宫基质(蜕膜)的绒毛外细胞滋养层的已知标志物(15)。出乎意料地，小鼠植入后早期滋养层的标志物eomesodermin(eomes)在HESC中强烈表达，但在CTBS细胞系中微弱表达或缺乏(图2A)。若干报道已经强调了小鼠和人ESC之间的区别(4，16)，包括eomesodermin在HESC中表达但不在小鼠ES细胞中表达(16)。此外，某些细胞滋养层标志物在HESC原种培养物中的表达可能与向细胞滋养层谱系的自发分化有关。我们之前显示滋养外胚层标志物在这些培养物中的表达主要发生在SSEA(-)和SSEA1(+)细胞亚群中，这与它们在HESC的分化衍生物中表达而不在HESC本身中表达相一致(4，16)。
实施例4
为进一步评价滋养层细胞的亚型，通过荧光活化的细胞分选(FACS)和免疫定位测定了I类组织相容性HLA(全(pan)HLA抗体W6/32)和HLA-G(抗体G233)抗原的相比较的细胞表面表达(14、15和17)。大部分细胞(～90％)表达HLA I类组织相容性抗原，与绒毛外滋养层一致(4，15)(图2B)。也在头三月胎盘的锚定绒毛外细胞滋养层(14，15)中特异表达的非典型HLA I类抗原HLA-G(18)的表达在大部分细胞中相对较弱，但在小部分细胞中(～10％)显示强的免疫反应性(图2B和C)。某些细胞表达波形蛋白，可能表明间质CTB(14)。在T25锥形瓶中延长培养一周或更长后，HLA-G+细胞部分明显增加(＞90％)。这些细胞显示与来自头三月人胎盘组织的分化中细胞滋养层培养物相似的区别内皮细胞形态(15)，且类似来自灵长类胚胎干细胞的内皮形态分化(19，20)。然而，值得注意地，所述细胞共表达HLA-G和血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)，此二者均为侵入性血管内(内皮样)CTB的标志物(3，21；图3)。E-钙粘着蛋白的免疫定位在血管内细胞上微弱，但在此阶段中也存在的相对小部分多核细胞中(＜5％)较强，且与在发育胎盘的基质中发现的合胞巨人细胞相当。
实施例5
为测定CTB细胞的功能能力，我们首先研究了绒毛细胞滋养层的细胞-细胞融合形成的非增殖性、合胞滋养层的形成(1)。通过倒置显微镜，在小舱中、37℃下、含5％CO2的空气中通过连续定时记录，CTBS1的贴壁细胞培养物中合胞体的自发生成监测细胞多至3天。贴壁细胞显示由细胞的伪足样扩展促进的跨培养皿的渐进迁移。当细胞偶尔会聚时，它们融合形成hCGβ和Ck7阳性但I类HLA阴性的多细胞合胞体滋养层细胞(图1G)。通过数字定时显微镜技术明确地捕获了此细胞融合。
实施例6
然后，我们通过采用三维球状体培养研究了CTBS细胞系的侵入植入潜能。已显示此技术保持头三月胎盘组织的绒毛外CTB表型(22)。在短暂胰蛋白酶消化和在非贴壁培养中孵育5-10天后，从融合单层产生CTBS细胞的聚集体。当在细胞外基质(Matrigel)滴中培养时，这些CTBS球状体聚集体发育出特征长出物，其表达hCGβ和细胞角蛋白(图4Ai和4A ii)。hCG受体在侵入性细胞滋养层上表达，并且在EB向滋养层分化中也报道了类似的观察(15)。经过用详细描述的方案制备的初级人子宫内膜组织(黄体期)的进一步培养(23)，CTBS聚集体附着到上皮细胞和基质细胞上。值得注意地，如定时显微镜技术所示(图4B)，含有基质细胞培养物的CTBS球状体显示特征环状迁移移动且显现极性长出物，从该长出物发展出血管内细胞。共培养约24-36小时后，这些滋养层长出物为基质的细胞外基质的侵蚀的位点(补充信息，影片2)。这通过滋养层小泡的快速回缩鉴定(图4B，2-5)，该回缩由于基质细胞下面的细胞外基质的分解。在体外人胚泡和基质细胞共培养中观察到类似的滋养层侵入过程(24)。侵蚀位点由表达基质金属蛋白酶2(明胶酶A，图4b4，i和ii)的绒毛外(HLA-G+)滋养层表征，基质金属蛋白酶2最近被鉴定为与人细胞滋养层的头三月侵入能力相关的关键酶(25)且其活性在患有先兆子痫的女性中改变(26)。在培养物中含有子宫内膜基质的单一GFP滋养层细胞显示类似的反应。
这些CTBS细胞系是首次衍生自HESC且独立保持的独特的多能祖干细胞系。使用适当分泌标志物然后通过再生EB进行多轮富集来筛选存活EB的方法在原理上可以用来衍生多种其它细胞类型。之前已经显示克隆衍生的HESC保持全部多能性和增殖(27)，表明CTBS细胞从同质HESC群发育而来，而非多能(即ES和TS)前体。因此，我们的发现与小鼠不同，在小鼠中可以从胚胎外外胚层获得滋养层细胞，但不能从没有条件基因表达的鼠ESC获得(28)。
我们首次衍生了人细胞滋养层干细胞系。这些细胞系与永生化的胎盘系不同，因为它们具有分化成若干细胞滋养层亚型的能力，包括终分化为血管内细胞。因此细胞培养物严格模拟体外植入过程且代表诸如先兆子痫的胎盘功能障碍的重要的新模型。高效产生血管内细胞滋养层还提供将这些细胞用于生殖医学的前景。它们的假血管生成和侵入性特征可能用于多种与子宫无关但与血管生成和血管重建相关的细胞疗法中，特别因为HLA-G(17)和吲哚胺2，3双加氧酶(29，30)的表达赋予细胞对免疫排斥的天然耐受。
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Claims (64)
1.分离的细胞滋养层干细胞，其中所述干细胞表达HLA-G和HLA I类抗原。
2.根据权利要求1所述的干细胞，其中所述干细胞是单个核的。
3.根据权利要求1或2所述的干细胞，其中所述干细胞表达至少一种选自细胞角蛋白7、阶段特异性胚胎抗原1、人胎盘催乳素、尾型同源框、波形蛋白和Cd9的干细胞标志物。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的干细胞，其中所述干细胞分离自灵长类。
5.根据权利要求4所述的干细胞，其中所述灵长类是人。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的干细胞，其中所述干细胞是经遗传修饰的。
7.包含权利要求1-6中任一权利要求所述的干细胞的用于组织工程的组合物。
8.包含权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞的培养物，其中所述培养物装在细胞培养容器中。
9.包含权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞和基于胶原的细胞支持基质的球状体。
10.根据权利要求9所述的球状体，其中所述组织分离自灵长类。
11.根据权利要求10所述的球状体，其中所述灵长类是人。
13.根据权利要求9-11中任一权利要求所述的球状体，其中所述球状体中的所述细胞滋养层干细胞表达至少一种金属蛋白酶。
14.根据权利要求13所述的球状体，其中所述金属蛋白酶是金属蛋白酶2。
15.衍生人细胞滋养层干细胞的方法，包括选择性富集表达HLA-G和HLA I类抗原的细胞滋养层干细胞。
16.从胚胎干细胞衍生人细胞滋养层干细胞方法，包括步骤：
i)在细胞培养容器中形成包含细胞滋养层细胞的胚胎样体；
ii)鉴别那些产生高于约500m I.U./ml绒毛膜促性腺激素的胚胎样体培养物；
iii)在来自成纤维细胞饲养细胞的条件培养基中培养(ii)中鉴别的胚胎样体；
iv)合并那些产生高于约500m I.U./ml绒毛膜促性腺激素的胚胎样体并分散所述胚胎样体；以及
v)重复(iv)直至基本上所有的胚胎样体产生高水平的绒毛膜促性腺激素。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述条件培养基包含成纤维细胞生长因子4和肝素。
18.通过培养权利要求15-17中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞而产生的用过的培养基。
19.产生血管内细胞滋养层细胞的方法，包括步骤：
i)提供权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞的制备物；
ii)从所述制备物中筛选表达HLA-G和血小板内皮细胞粘附分子1的细胞群。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的选出的细胞还表达血管性血友病因子。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中在高氧张力，优选至少5％CO2下培养所述制备物。
22.通过权利要求19-21中任一权利要求所述的方法获得的或可获得的血管内细胞滋养层细胞。
23.用于形成包含细胞滋养层干细胞的球状体的体外方法，包括：
i)提供细胞培养容器，该容器含有：
a)权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞；
b)细胞培养基；以及
ii)提供促进所述球状体中所述细胞滋养层干细胞的生长和分化的条件。
24.通过培养权利要求23所述的包含细胞滋养层干细胞的球状体而产生的用过的培养基。
25.用于鉴定与细胞滋养层干细胞分化相关的基因的方法，包括步骤：
i)提供包含至少一种权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞的制备物；
ii)从所述细胞制备物中提取核酸；
iii)将所述提取的核酸与核酸阵列接触；以及
iv)检测表明所述核酸在所述核酸阵列上与结合伙伴相结合的信号。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法包括另外的步骤：
i)整理由所述核酸与所述结合伙伴结合产生的信号；
ii)将整理的信号转换为可分析数据的形式；以及任选地
iii)提供已分析数据的输出。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述方法包括比较从不同个体分离的不同细胞滋养层干细胞群产生的阵列信号。
28.用于制备包含细胞滋养层干细胞特异性基因表达产物的文库的方法，包括步骤：
i)提供包含至少一种权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞的制备物；
ii)从所述细胞制备物中提取核酸；
iii)从包含在所述提取的核酸中的核糖核酸制备cDNA；以及
iv)将(iii)中形成的cDNA连接到载体中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述载体是基于噬菌体的载体。
30.分析细胞滋养层干细胞的侵入特性的体外方法，包括步骤：
i)提供权利要求9-14中任一权利要求所述的球状体和子宫内膜组织；以及
ii)监测细胞滋养层细胞对于所述子宫内膜组织的侵入表型。
31.鉴定调节内皮细胞的血管生成活性的试剂的方法，包括步骤：
i)提供权利要求22所述的血管内细胞滋养层细胞的制备物和待测试的试剂；
ii)确定该试剂对所述血管内细胞滋养层细胞的增殖和/或运动力的作用或没有作用。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述试剂是拮抗剂。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述试剂是激动剂。
34.权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞或衍生自权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层细胞的细胞在制备用于免疫系统调节的细胞组合物中的用途。
35.权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞或衍生自权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞的细胞在制备用于调节移植治疗中的细胞/组织排斥的细胞组合物中的用途。
36.根据权利要求34或35所述的用途，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述细胞是人类细胞。
38.组合物，其包含分离的哺乳动物细胞滋养层干细胞或衍生自细胞滋养层干细胞的细胞，以及至少一种另外的分离的并非哺乳动物细胞滋养层干细胞的哺乳动物细胞。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞选自表皮角质形成细胞、成纤维细胞、上皮细胞、神经元胶质细胞、神经细胞、肝细胞星形细胞、间充质细胞、肌细胞、肾细胞、血细胞、胰岛β细胞或内皮细胞。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述细胞是胰岛β细胞。
42.根据权利要求39所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述干细胞选自造血干细胞、神经干细胞、骨干细胞、肌干细胞、间充质干细胞、上皮干细胞、内胚层干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞。
45.根据权利要求38-44中任一权利要求所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞和所述细胞滋养层干细胞是自体的。
46.根据权利要求38-44中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含其它试剂，其中所述试剂是免疫抑制剂。
47.媒介物，其中所述媒介物包括权利要求1-6中任一权利要求所述的哺乳动物细胞滋养层干细胞或衍生自权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞的细胞，以及至少一种另外的分离的并非哺乳动物细胞滋养层干细胞的哺乳动物细胞。
48.调节移植治疗中细胞/组织排斥的方法，包括：
i)将权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞或衍生自权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞的细胞以及至少一种其它哺乳动物细胞手术插入动物中；以及任选地
ii)监测该动物的免疫状态作为接受或不接受所述哺乳动物细胞的衡量。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述细胞选自表皮角质形成细胞、成纤维细胞、上皮细胞、神经元胶质细胞或神经细胞、肝细胞星形细胞、间充质细胞、肌细胞、肾细胞、血细胞、胰岛β细胞或内皮细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞是胰岛β细胞。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述干细胞选自造血干细胞、神经干细胞、骨干细胞、肌干细胞、间充质干细胞、表皮干细胞、内胚层干细胞、多能胚胎干细胞、多能胚胎生殖细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞。
55.根据权利要求48-54中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物细胞和所述细胞滋养层细胞是自体的。
56.分离的嵌合细胞，其中所述细胞是第一细胞或其部分和第二细胞融合的产物，该第一细胞是权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞，其中所述第一和第二细胞衍生自同一物种。
57.根据权利要求56所述的嵌合细胞，其中所述嵌合细胞包含衍生自细胞滋养层干细胞的胞质部分和衍生自非细胞滋养层细胞的细胞的细胞核。
58.根据权利要求56所述的嵌合细胞，其中所述嵌合细胞包含衍生自细胞滋养层干细胞的细胞核及衍生自非细胞滋养层细胞的细胞的胞质部分。
59.根据权利要求56-58中任一权利要求所述的嵌合细胞，其中所述第一和第二细胞是人类细胞。
60.根据权利要求56-59中任一权利要求所述的嵌合细胞，其中所述第二细胞选自表皮角质形成细胞、成纤维细胞、上皮细胞、神经元胶质细胞或神经细胞、肝细胞星形细胞、间充质细胞、肌细胞、肾细胞、血细胞、胰岛β细胞或内皮细胞。
61.包含权利要求56-60中任一权利要求所述的嵌合细胞的细胞培养物。
62.产生嵌合细胞方法，包括步骤：
i)形成包含第一细胞和第二细胞的制备物，该第一细胞是权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞滋养层干细胞，其中所述第一和第二细胞衍生自同一物种；以及
ii)提供其中所述第一和第二细胞融合形成嵌合细胞的条件。
63.权利要求56-60中任一权利要求所述的嵌合细胞在制备调节移植治疗中细胞/组织排斥的细胞组合物中的用途。
64.治疗会从移植治疗受益的状态的方法，包括给予权利要求56-60中任一权利要求所述的嵌合细胞。
65.分离的细胞滋养层干细胞，其中所述干细胞表达HLA-G抗原。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080709 |