JP5636192B2 - 糖尿病の診断のためのヒト膵臓β細胞株 - Google Patents
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Description
我々は、成熟ラット膵臓β細胞のマスター細胞バッチの増幅を最大にするために検討を続け、ヒト膵臓β細胞のマスター細胞バッチを製造するために上記方法を適用することを試みた。残念ながら、現在、ヒト細胞を用いたインスリノーマの形成は、ラット未熟膵臓に同じウイルスを感染させた場合に観察されるものと異なり、移植後に何ら観察されていない。さらに、感染させた細胞を解離させ培養した場合、ヒト細胞株を作製することができなかった。
これらのβ細胞は、診断のためのマスター細胞バッチを形成するヒトβ細胞株を作製し、無限に増幅させるのに使用されている。これはまた、糖尿病の治療におけるβ細胞の臨床的使用への展望を開くものでもある。
a)未熟(未分化、immature) なヒト膵臓に、i)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT 抗原を発現するレンチウイルスベクターとii) インスリンプロモーターの制御下でhTert を発現するレンチウイルスベクターとを、またはiii)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT 抗原とhTert の両方を発現するレンチウイルスベクターを形質導入または同時形質導入し、
b) a) で得られる形質導入した未熟膵臓を、ヒトを除く重症複合免疫不全 (scid) の動物の腎臓被膜 (kidney capsule) 中に導入し、
c)形質導入した未熟膵臓細胞にインスリノーマ様の構造を発生させ、ここでインスリノーマ様の構造の未熟ヒト膵臓細胞はインスリン産生β細胞に分化しており、
d)工程c)で得られるインスリノーマ様構造体を微細切断 (micro-dissection) し、その細胞を解離させ (そして場合によりインスリンプロモーターの制御下で抗生物質耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入し) 、
e)工程d)で得られる細胞を、ヒトを除く新たなscid動物の腎臓被膜中に継代移植し、
f)工程e)で継代移植した細胞にインスリノーマ様構造を発生および再生させ、ここで、新たに発生したインスリノーマ様構造物はインスリン産生膵臓β細胞に豊み、
g)工程f)で得られるインスリノーマ様構造を微細切断し、それらの細胞を解離させ、そして集め、
h)場合により、工程g)で得られる細胞を新たなscid動物の腎臓被膜に継代移植し、インスリン産生膵臓β細胞をさらに富化し増幅させ、場合により工程f)、g)およびh)を、適切な量のインスリン産生膵臓β細胞が得られるまで繰り返す。
−カルボキシペプチダーゼ-A陰性、
−転写因子Pdx1陽性
−転写因子MafA陽性
−プロコンバーターゼ Pcsk1陽性
−グルコース輸送体Glut2 の発現
−カリウムチャンネルのサブユニットをコードするKcnj11およびAbcc8 の発現
−亜鉛輸送体Znt8 (Slc30a8)の発現
−インスリンの発現。
さらに別の態様では、上記方法は糖尿病の細胞治療のためのマスター細胞バンクの確立に関する。ここで、この方法は、細胞の脱不死化のための工程をさらに含む。言い換えると、上記レンチウイルスベクターを可逆的または条件的不死化を可能にするように作製する。これに関し、インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT 、hTERT および抗生物質耐性導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターにおいて、少なくとも1つのLox P 部位を導入する。好ましくは、本発明のベクターはSV40ラージT およびhTERT 導入遺伝子が2つのLox P 部位の間にあるように作製する。これらの導入遺伝子は、β細胞中でCre リコンビナーゼを発現させることにより除去される。例えば、上記方法で得られる細胞を、Cre リコンビナーゼを発現するベクターまたはプラスミドで形質導入して、逆転を生じさせる。当業者はこれらの導入遺伝子を除去するためにFRT/FLP 系を選択してもよいことは当然である。不死化した細胞を逆転するための方法はWO 01/38548 に記載されている。
本発明はまた、糖尿病治療のための候補医薬を試験またはスクリーニングするための、上で説明したin vitro診断のための、および糖尿病の細胞治療のための、前記細胞の使用にも関する。
「有効量」とは、有利なまたは望ましい臨床結果を発揮するのに十分な量である。有効量、例えば105 〜109 の細胞を1または2回以上の適用で投与できるが、1回の投与で十分であるのが好ましい。本発明の目的にとって、膵臓β細胞の幹細胞前躯体の有効量は、膵臓の機能の1または2以上を回復しうる分化した膵臓細胞を産生するのに十分な量である。比較的多数の膵臓細胞、例えば109 超の細胞の導入により迅速に回復が生じることを意図する。さらに、より少ない膵臓細胞を導入した場合でも、膵臓細胞がin vivo で増殖可能であれば機能が回復するであろうことも意図する。このように膵臓細胞の「有効量」は、1個と少ない膵臓細胞でも十分な時間、膵臓の全部または一部を再生することを可能にすることによって得られる。好ましくは、個体に投与する有効量は、約101 膵臓細胞より多く、約102 〜約1015膵臓細胞が好ましく、約103 〜1012膵臓細胞がより好ましい。治療の観点からは、膵臓細胞の「有効量」は糖尿病のような膵臓の疾患を改善し、軽減し、安定化し、逆転させ、進行を遅らせ、または延ばすことができる量である。
単一、複数回、連続または間欠投与を行うことができる。膵臓細胞は、膵臓、腹腔、腎臓、肝臓、腹腔動脈、門脈または脾臓を含む複数の異なる部位のいずれにもに導入できるが、これらに限定されない。好ましくは、膵臓細胞を個体の膵臓に入れる。
(DNA 作製物および組換えレンチウイルス産物)
レンチウイルス作製物のバックボーン、pTRIP は既に報告されている (Zennou et al.,2000) 。レンチウイルスベクターpTRIP ΔU3.RIP405-eGFPはラットインスリンII遺伝子プロモーター (RIP)の制御下でeGFPを発現する (Castaing et al.,2005b)。インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原またはネオマイシン耐性遺伝子をそれぞれ発現させるために、新規なレンチウイルスベクターpTRIP ΔU3.RIP405-ラージTおよびpTRIP ΔU3.RIP405-NEO を作製した。まず、pTRIP ΔU3.RIP405-eGFPからeGFPカセットを、BamHI およびKpnI切断により除去した。BamHI およびKpnI付着末端を有するリンカー、GATCGCCCCGGGCGGGATCCGGTAC を、線状化したプラスミドに連結して、インスリンプロモーターの下流に5'から3'の方向にSmaI、BamHI およびKpnIユニーククローニング部位を有するpTRIP ΔU3.RIP405-リンカーを生じさせた。SV40ラージT抗原の全コード領域を含むBamHI 挿入物 (B.Thorens より供与) をBamHI 線状化pTRIP ΔU3.RIP405-リンカーに連結した。ネオマイシン耐性遺伝子の完全なコード領域を、以下のプライマーを用いてPCRによりpcDNA 3 プラスミド (Invitrogen) から増幅した:BamHI-Neo センス:5'gaggaggatccCGCATGATTGAACAAGATGG 3'およびKpnI-Neoアンチセンス:5'cccaaggtaccCGCTCAGAAGAACTCGTCAAG 3' 。得られたPCR産物をBamHI およびKpnIの両者で消化し、BamHI,KpnI線状化pTRIP ΔU3.RIP405-リンカーに連結した。PCR誘発突然変異を排除するために、ネオマイシン耐性コード領域の全体を配列決定した。ラットインスリンプロモーター (RIP)の制御下にヒトテロメラーゼ逆転写酵素 (hTERT)を発現する新規なレンチウイルスベクターpTRIP ΔU3.RIP405 hTERT を作製した。まず、RIP 405 bp断片を、pTRIP ΔU3.RIP405-eGFPのMluI BamHI消化により精製し、MluI、 BamHIおよびXbaIポリリンカーを含むからのpTrip ベクターに挿入した。得られたベクターをXbaIで線状化し、先にSIN-PGK hTERT ベクター (B.Thorens より供与) の消化により精製しておいた完全hTERT コード配列を含む3497 bp XbaI断片をクローニングするのに用いた。VSV 糖蛋白質-Ga をコードするp8.7 encapsidation (キャプシドに包まれた) プラスミド (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)(Zufferey et al., 1997) 、pHCMV-G および既報のpTRIP ΔU3組換えベクター (Zennou et al., 2000)での293T細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクターのストックを製造した。上清を、超遠心分離の前にDNAae I (Roche Diagnostic)で処理し、得られたペレットをPBS に再懸濁し、等分し、使用まで-80 ℃で凍結した。p24 キャプシド蛋白質の量をHIV-1 p24 ELISA 抗原アッセイ (Bechman Coulter)により測定した。全感染をp24 キャプシド蛋白質定量に対して正規化した。
妊娠したWistarラットをJanvier (CERJ, Le Genest, フランス) から得た。動物の取り扱いはすべてFrench Animal Care Committeeの指針に従って行った。交尾後の翌朝を胎児日数 (embryonic day) 0.5 (E0.5) とした。妊娠期間E13.5 日における妊娠雌ラットを頸部脱臼により致死させた。
ヒト膵臓を、フランスの法律および我々の機関の指針に従って、発生8〜10週での吸引による妊娠の選択的中絶後直ちに得た胎児組織断片から抽出した。温虚血は30分未満続いた。妊娠期間は、最終月経時からの期間、超音波検査により測定した頭殿長および手と足の形態をもとに決定した。
組換えレンチウイルスをラット未熟膵臓上皮に感染させるために使用した。pTrip ΔU3.RIP405-eGFPまたはpTRIP ΔU3.RIP405-ラージTのいずれかのp24 1μgを、10%熱不活性化ウシ胎仔血清含有HEPES (10mM)、L-グルタミン (2mM) 、非必須アミノ酸 (Invitrogen) およびペニシリン (100 ユニット/mL) −ストレプトマイシン (100 μg/mL) を加えた最終量45μL のRPMI 1640 培地中でプレインキュベーションを行った。ウイルス感染効率を上げるために、培地にDEAE- デキストランを最終濃度20μg/mLとなるように加えた。37℃で15分間プレインキュベーションした後、ウイルス溶液を10の膵臓上皮を含むヘペス緩衝化食塩水 (HBSS, Invitrogen) に加えた。感染2時間後、組織を培地中で2回洗浄し、既報 (Miralles et al., 1998)のようにして3次元コラーゲンゲル中で一晩増殖させた。次の日に上皮をコラーゲンマトリックスから除き、既報 (Castaing et al., 2005b) のようにして重症複合免疫不全 (scid) マウスに移植するのに用いた。
部分的に除去された(depleted)ヒト膵臓に、37℃において1時間、最小容積200 μL で、p24 蛋白質2μgに対応する量のウイルスを感染させた。感染培地の組成は次の通りである:10%熱不活性化ウシ胎仔血清 (FCS)、非必須アミノ酸 (Gibco)、1%P/S (Gibco) 、および10μg/mLのDEAEデキストランを加えたRPMI 1640 培地 (Gibco)。感染培地を、膵臓外植体に加える前にウイルスと共に37℃で15分間プレインキュベーションする。感染の最後に、無ウイルス培地 800μL を外植体に加え、一晩37℃で静置する。次の日、外植体をscidマウスの腎臓被膜下に移植する (Castaing et al., 2005b; Castaing et al., 2001)。
雄のscidマウス (Charles River Laboratories, L'arbresle, フランス) をアイソレーターに入れた。
移植3カ月後にscidマウスを頸部脱臼により致死させ、移植物を滅菌室に入れ、秤量した。次いで移植物を50mgの切片に切断した。マイクロシザーを用いて、組織の各切片を独立に可能な限り細かく切断し、37℃で20分間、HBSS 500μL 中の200 ユニットのIV型コラゲナーゼ (Worthington)で処理した。次いで消化した組織を集め、2000rpm で10分間遠心分離した。得られたペレットを、DMEM (Invitrogen) 、15%熱不活性化ウシ胎仔血清、0.5 % 2- メルカプトエタノール (Merck)およびペニシリン (100 ユニット/mL) −ストレプトマイシン (100 μg/mL) を含む培地に再懸濁した。21、22、25、27および30ゲージの針を連続的に通過させることにより1mL注射器中で機械的に解離させた。解離した細胞を2000rpm で10分間遠心分離した。次いで細胞ペレットを最初の組織50mgにつき300 μL 量の培地中に再懸濁した。
次に、解離させた細胞懸濁液300 μL を、細胞播種の前日に調製したポリ-L- リシン/ラミニン被覆した1.5cm2培養ウェルに播種した。簡単に述べると、培養皿を滅菌水中で調製した100 μg/mLポリ-L- リシン (Sigma)溶液で被覆し、3時間静置した。次いで、この溶液を、RPMI (Invitrogen) 培地中に調製した10μg/mLラミニン (Sigma)溶液で置換し、一晩静置した。次いでラミニンを細胞播種の直前に除去した。細胞破砕物のほとんどを捨てるために、懸濁液を37℃で15分間ウェル中に静置した。非沈降細胞および細胞破砕物を含む培地を次いで除去し、新たな被覆ウェルに播種し、新鮮培地を最初のウェルに加えた。
培養での増殖が可能で、SV40ラージT、hTERT およびネオマイシン耐性遺伝子がゲノムに組み込まれたβ細胞を得るために、4つの異なる方法を用いた (図8) 。
増殖性β細胞集団に対応する移植物の高度血管化領域を微細切断した。この集団を2段階方法においてさらに解離させた:まず、化学的についで機械的に。化学的解離の前に各集団を20〜30mgの切片に分割し、各切片を、37℃で30分間HBSS (Gibco)500 μL 中のコラゲナーゼIV型 (Worthington)200 ユニットで処理する前にメスを用いて切断した。次いで消化物を4000rpm で15分間遠心分離し、細胞を100 %熱不活性化FCS 中に再懸濁した。機械的解離は、小さい集団または個々の細胞のみが得られるまで0.8 〜0.4mm 直径の針に数回、細胞懸濁液を通すことからなった。次いで細胞を4000rpm で15分間遠心分離し、熱不活性化FCS 中に再懸濁し計測した。
外植体に感染させるために、既報の操作を用いて細胞を懸濁液中で感染させた。感染後、細胞を4000rpm で15分間遠心分離し、次いで適宜培地で洗浄し、被覆シャーレ中に播種した。継代移植のために、遠心分離工程の後、細胞をマトリゲル10μL に再懸濁し、重合のために37℃で15分間小さいシリコンの筒中に入れて、上記のように (Castaing et al., 2005b) してscidマウスに移植した。
ヒトβ細胞株を樹立し、次の培地を用いて増殖させた:5.5 mM D- グルコース (Invitrogen) 、2%BSA フラクションV 無脂肪酸 (Roche)、10mMニコチンアミド (Sigma)、50μM 2-メルカプトエタノール (Sigma)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) (Invitrogen) 、5.5 μg/mLヒトトランスフェリン (Sigma)および6.7 ng/mL亜セレン酸ナトリウムを含むDMEM。細胞を次のようにして被覆した培養平板上で増殖させた。Engelbreth-Holm-Swarm マウス肉腫からのマトリゲルをDMEN中で1/100 に希釈し、2.5 μg/mLのフィブロネクチン (Sigma)および1%P/S を加えた。この被覆用溶液を培養平板の上に加え、5%CO2 飽和雰囲気中37℃で1時間インキュベーションする。次いで、被覆用培地を除去し、細胞を直接播種する。細胞を37℃で5分間トリプシンEDTA (Sigma)に通す。
移植物を上記のようにして解離させる。250000細胞/cm2 を被覆平板に播種し、3日後細胞を1/2 希釈で継代培養する。継代2〜9代目の間では細胞を2/3 希釈で、次の6回の継代では3/4 希釈で継代し、最後に細胞を週に1回1/2 希釈で増殖させる。細胞は90%熱不活性化ウシ胎仔血清および10%DMSO中に凍結しうる。
致死の2時間前、移植されたマウスに、0.9 % apyrogen NaCl溶液中に新たに調製した2mg/mL BrdU 溶液0.5mL を腹腔内注射した。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)中に新たに調製した4%パラホルムアルデヒド (PFA)の心臓内灌流により組織固定を行った。次いで、種々の後固定操作を適用した。パラフィン切片上での免疫検定に対しては、灌流組織を水中に調製した3.7 %ホルムアルデヒド中で6〜7時間、後固定し、次いで脱水しパラフィンに包埋した。4μm の切断を行い、インスリン/Pdx1およびインスリン/BrdUの両者について免疫蛍光共検出に用いた。凍結切片については、灌流組織を4%PFA 中で2時間、後固定し、PBS 中に調製した15%ショ糖中で48時間凍結保護した。ついで組織をPBS 中に調製した7%ゼラチン、15%ショ糖に包埋し、イソペンタン中-50 ℃で凍結し、10μm 切断を行った。この組織をインスリン/SV40ラージT抗原の免疫蛍光共検出に用いた。in situ ハイブリダイゼーションについては、24時間の後固定の後、上記のようにして凍結切断を行った。
免疫蛍光染色を以下の抗体を用いて既報 (Duvillie et al., Diabetes 2003) のようにして行った:ウサギ抗Pdx1ポリクローナル抗体 (1/1000, (Duvillie et al.,2003)) ;モルモット抗インスリン抗体 (1/400, DakoCytomation, Trapped, フランス) ;ウサギ抗インスリン抗体 (1/200, Diasorin);マウス抗BrdU (1/2, Amersham);マウス抗SV40ラージT (1/50, Calbiochem) およびマウス抗Ki67 (1/400)。蛍光二次抗体は、フルオレセイン抗ウサギ抗体 (1/200, Jackson Immunoresearch Laboratories) ;フルオレセイン抗マウス抗体 (1/200,Immunotech, マルセイユ) およびテキサスレッド抗モルモット抗体 (1/200, Jackson Immunoresearch Laboratories) であった。
12mmのカバーガラス片を1.5cm2培養ウェル中でポリ-L- リシン/ラミニンにより被覆した。1.2 ×105 のRYAS41細胞を播種し、5日間培養した。固定の2時間前に、0.9 %NaCl中に調製した10μM BrdU溶液を培地に添加した。次いで、培地を除去し、細胞を、インスリン/SV40ラージT抗原二重検出に対して10分間、またはインスリン/pdx1およびインスリン/BrdU二重検出に対しては1時間、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)中に新たに調製した4%パラホルムアルデヒド (PFA)中で固定した。免疫蛍光染色は製造者の指示に従って行った。最初の抗血清は、マウス抗SV40ラージT抗原モノクローナル抗体 (1/50, Calbiochem, Merck Biosciences,サンディエゴ、CA) 、モルモット抗インスリンポリクローナル抗体 (1/400, DakoCytomation, Trappes, フランス) 、ウサギ抗Pdx1ポリクローナル抗体。(1/1000, (Duvillie et al.,2003))およびマウス抗BrdU (1/2, Amersham Biosciences, Uppsala, スウェーデン) を含む。蛍光二次抗体は、フルオレセイン抗ウサギ抗体 (1/200, Jackson Immunoresearch Laboratories) ;フルオレセイン抗マウス抗体 (1/200,Immunotech, マルセイユ) およびテキサスレッド抗モルモット抗体 (1/200, Jackson Immunoresearch Laboratories) であった。
低温in situ ハイブリダイゼーションを既報 (Castaing et al., 2001)のようにして行った。プロインスリン・プローブを既報 (Basmaciogullari et al.,2000)のようにして作製した。プラスミドを線状化し、ジゴキシゲニン-UTP (digoxygenin-UTP)(Roche diagnostic)の存在下で、T3 RNAポリメラーゼ (Promega)によるアンチセンス・リボプローブの合成のための鋳型として用いた。比色による表示を、ジゴキシゲニン-UTPに対して5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリルホスフェート (Promega)およびニトロブルーテトラゾリン (Promega)を用いて行った。in situ ハイブリダイゼーション後、BrdUの導入を免疫組織化学的分析により可視化した。切片を室温において45分間、0.25%ゼラチン (PGT)および0.1 %Triton X-100を加えたPBS 中の2N HCl で処理し、次いで1%Triton X-100を加えたPGT 中に希釈した抗BrdU抗体 (1:500; Becton Dickinson)と共にインキュベーションした。二次抗体 (ビオチニル化抗マウス免疫グロブリンG; 1:200; Vector) を切片に適用し、ストレプトアビジン−ビオチン−HRP 複合体 (vector) での増幅の後に、過酸化水素 (DAB revelation kit; Vector) の存在下でジアミノベンジジンを用いることによって検出した。
写真を、蛍光顕微鏡 (Leica; Leitz, Rockleigh, NJ)を用い、冷却したthree-chip charge coupled-device camera (Hmamatsu C5810; Hamamatsu, Middlesx, NJ) を用いてデジタル化するか、あるいはAxioskop顕微鏡 (Zeiss)およびcolor vision degital camera (Donpisha)を用いて撮影した。
全 RNAを、Quiagen RNeasy microkit (Quiagen) を用いてE17 ラットの膵臓、肺およびRyas 41 から分離した。cDNAをSuperscript (Invitrogen)を用いて調製し、assay-on demand kit およびABI Prism 7300 sequence detector (両者ともApplied Biosystems, フォスター市、Ca) を用いて、製造者の指示に従って定量的リアルタイムRT-PCRを行った。
RYAS41ラット細胞株およびH537ヒト細胞株の糖尿病マウスの血糖を調節する能力を測定するために、scidマウスにクエン酸塩緩衝液中に新たに調製したストレプトゾトシン (STZ; 250 mg/体重kg; Sigma-Aldrich)を注射した。ストレプトゾトシンはβ細胞を破壊することが知られている。グルコース濃度を、携帯用グルコースメーター (GlucoMen,A. Menarini diagnostics, フィレンツェ, イタリア) を用いて、尾静脈から採取した血液において測定した。STZ 注射の2日後、4g/l より高い血中グルコース濃度を有するマウスに、RYAS41移植の前に血糖を正常化するために、3週間持続するインスリンカプセル (Sustained Release Insulin Implants; LinShin, Scarborough, カナダ) を皮下に埋め込んだ。STZ 処置の16日後か、あるいはSTZ 処置の22日後に、以下の操作を用いて106 個のRYAS41細胞および106 個のH537細胞をそれぞれ処置マウスに移植した。簡単に述べると、細胞を採取し、4℃で10分間遠心分離した。次に、細胞ペレットを12μL の氷冷マトリゲル(BD Bioscience) 中に再懸濁し、滴量 (drop) をシリコンの筒に入れ、37℃で静置して重合させた。次いで、細胞を含む筒をSTZ 処置マウスの腎臓被膜下に入れた。宿主マウスにおける血糖値の正常化に対するRYAS41およびH537移植物の寄与を確認するために、実験の最後に片側腎摘出により移植物を除去した。
16時間の絶食の後、基準血糖値(g/L) をOne Touch Ultra glucose meter およびOne Touch test strips (Life Scan Johnson and Johnson) を用いてマウスからの尾静脈血において測定した。滅菌NaCl 0.9%中のグルコース (2mgデキストロース/体重g) を腹腔内に注射し、血糖値を注射の15、30、60および120 分後に測定した。
H212移植物を液体窒素中で凍結し、4μm 切断を行い、10個のウェルテフロンスライド (Menzel GmbH)上に置いた。糖尿病患者および対照からの系列希釈 (1/2 〜1/100)を0.5 % BSA を含有するPBS 1X中の組織切片上で室温において25分間インキュベーションした。次いでスライドを0.5 % BSA を含有するPBS 1X中で10分間3回洗浄し、次にFITC結合ウサギ抗ヒトIgG (1/100, DAKO) と共にインキュベーションした。3回洗浄後、スライドをfluoromount (DAKO)に載せ、蛍光顕微鏡 (Leica)で観察する。
H301移植物から蛋白質抽出物を調製した。簡単に述べると、H410移植物を、氷冷Tris 20mM pH8.0, NaCl 20mM, triton X-100 0.1%中でfast prep bio 101 ホモジナイザー (Biorad) を用いて40秒サイクル2回で均質化した。懸濁液を15000 g、30分間の遠心分離により清澄化した。蛋白質の量をBradford法 (Bioead) で測定した。蛋白質抽出物20μgを10%ポリアクリルアミド SDS PAGE 上で分離し、次いでニトロセルロース膜 (Amsersham)に移した。得られたブロットを、0.1 %Tween 20および5%低脂肪乳を含むPBS 1X中で1時間飽和させた。次いで、対照および糖尿病患者からの血清の1/50希釈を飽和溶液中のブロットと共に4℃で一晩インキュベーションし、PBS-Tween 中で2回洗浄した。ブロットをHRP 結合抗ヒトIgG (1/10000) と共に2時間インキュベーションし、ECL 染色を製造者の指示に従って行った。
PBS 1X中1.5 μg/mLに希釈されたヒトH301蛋白質抽出物 (上記のようにして調製) で、96ウエルプレート (平底) を4℃において一晩被覆する。ウエルを5%低脂肪乳を含むPBS 1Xで2時間飽和させた。対照および糖尿病患者からの血清の系列希釈をウエルにおいて4℃で一晩、飽和溶液中でインキュベーションする。ウエルをPBS 1X中で3回洗浄し、次いでHRP 結合抗ヒトIgG の希釈物 (1/5000) と共に室温で1.5 時間インキュベーションする。PBS 1X中でさらに2回洗浄した後、室温において1.5 時間の間TMB 緩衝液 (Sigma)中で比色反応を開始させ、次いで色の濃さを450nm においてマイクロプレート分光光度計で測定する。
我々は先に、インスリンプロモーターの制御下でeGFPを発現する組換えレンチウイルスによる膵前駆細胞(pancreatic progenitor) の形質導入によって、成熟インスリン産生細胞を安定に改変させることができることを実証した(Castaing et al., 2005b)。本研究において、我々は、かかる手法が、インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現する組換えレンチウイルスによる膵前駆細胞の形質導入によってラットまたはヒトβ細胞株を作製するのに使用できるか否かを問うた。まず、β細胞におけるSV40ラージT抗原発現を制限するように設計されたレンチウイルスベクターを構築した。インスリンプロモーターの405 bp断片の制御下にSV40ラージT抗原(pTRIPΔU3.RIP405-SV40ラージT) またはeGFP(pTRIPΔU3.RIP405-eGFP) のいずれかを発現する水疱性口内炎ウイルス(VSV)G- 糖タンパク質によりシュードタイプ化した組換えレンチウイルスベクター(pTRIPΔU3) を作製した。
膵β細胞株を樹立するために、移植片を取り出し、解離させ、インスリンプロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を発現するウイルスでさらに感染させた。これによって、G418の存在下での培養によりインスリン転写細胞のさらなる選択が可能となった。このプロトコルは図3Aに詳述されている。この手法を用いて、異なる種々の細胞株を樹立させ、その中の1つRYAS41をさらに分析した。図3Bに示すように、RYAS41細胞は、インスリンおよびSV40ラージT抗原を発現した。それらはまた、核転写因子Pdx1も発現し、BrdUを取り込むそれらの能力に基づいて増殖する。我々は次いでRYAS41細胞の分化の段階を分析した。この目的で、RYAS41細胞とE17 の膵臓もしくは肺との比較を行った。まず、Ngn3およびPax4の2種類の転写因子の発現を分析したが、それらは膵前駆細胞では発現されたが(Apelqvist et al., 1999; Sosa-Pineda et al., 1997)、成熟β細胞では不存在であるか(Apelqvist et al., 1999)または非常に低濃度で発現された(Brun et al., 2004) 。表1 に示すように、RYAS41細胞はNgn3を発現せず、Pax4を極めて低濃度で発現した。
表1:E17 膵臓および肺と比較したRYAS41における遺伝子発現
CT(閾値サイクル) 値はシクロフィリンに対して正規化し、試験した遺伝子の全てを発現するE17 ラット膵臓と比べた増加倍率で示す。
我々は、インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現する組換えレンチウイルスをヒト胎児膵臓に感染させた。この組織を次いで免疫不全Scidマウスの腎嚢下に移植した。移植から4〜6カ月後に移植組織を取り出し、それらの発達を分析した。この目的で、組織を薄く切断し、免疫組織化学により分析した。非感染膵臓について既に示されているように(Castaing et al., 2001) 、感染膵臓からインスリン陽性細胞が発生し、膵島様(islet-like)構造物を形成していた (図4A, E)。これらの組織では、2種類の膵島様構造物を見ることができた。一部の膵島はSV40ラージT抗原を発現する細胞を含んでおり、別の膵島はこのマーカーに対して陰性の染色結果を与えた (図4B, F)。興味深いことに、SV40ラージT抗原の発現は感染ヒト膵臓のインスリン陽性細胞だけにもっぱら認められ、SV40ラージT抗原の発現を制御するのに用いられたラット・インスリンプロモーターの特異性がさらに実証された (図4B, C)。最後に、感染組織から発生したSV40ラージT抗原を発現する膵島様構造物のサイズは、非感染組織から発生したものより大きいことも我々は認めた。これは、SV40ラージT抗原を発現するβ細胞と、しない細胞の増殖状態に相関していた。具体的には、SV40ラージT抗原陰性β細胞はKi67に対して陰性染色であったが、SV40ラージT抗原陽性β細胞はKi67に対して陽性染色であった (図4D, H)。
我々はまず、インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現するレンチウイルスをヒト胎児膵臓に感染させた。10〜12カ月後、インスリノーマ様構造物を発生した膵臓にミクロ切片を切り取り、解離し、インスリンプロモーターの制御下でhTert を発現するレンチウイルスを感染させ、これを新たなscidマウスに継代移植(sub-transplant)した。このような条件下で、さらに6カ月後に、インスリノーマ様構造物が発生したことを我々は見出した。興味深いことに、このような条件下では、移植片全体が増殖性のインスリン陽性細胞を含んでいた( 図5)。カルボキシペプチダーゼA に対して陽性に染まる腺房細胞はこのような継代移植片(sub-grafts)では検出されなかった。総合すると、このことは、この継代移植片手法を用いて継代的に膵組織を感染させることができることを示す。さらに、この手法は、組織をβ細胞で富化し、β細胞の均質集団を作製するのに極めて有用である。最後に、この手法はScidマウス中にヒトを維持する方法となる。
ヒト膵β細胞株を樹立するために、3種類の導入遺伝子SV40ラージT抗原およびhTERT のいずれかを含有する継代移植片を取り出し、解離させた。RYAS41ラット細胞株を誘導するのに用いたプロトコルとは異なり、均質インスリン発現性細胞集団を増幅させるにはG418選択が必要ないことを我々は見出した。均質細胞を増殖させるには継代移植法による増幅で十分であると思われ、混入が稀な(rare contaminating)非β細胞は培養時に生存しなかったようである。
遺伝子プロファイリング (輪郭決定) のために、誘導された全ての細胞株の代表であるヒトβ細胞株H522を使用した。H523から調製されたcDNAを成人ヒト膵島からのそれと定量的RT-PCRにより比較した (表2)。
CT(閾値サイクル) 値はシクロフィリンに対して正規化し、試験した遺伝子の全てを発現するヒト成熟膵島と比べた増加倍率で示す。
RYAS41細胞が機能的であるか否かを明らかにするため、β細胞に対して毒性であることが既知の薬剤ストレプトゾトシン(STZ) をscidマウスに注射した。2日後、マウスは高血糖になり、正常血糖を維持するためインスリンカプセルを皮下埋め込みした。STZ 感染から16日後、半数のマウス(n=7) に106 のRYAS41を移植し、残り7 匹は対照として使用した。38日目に、埋め込まれたカプセルによるインスリン分泌が尽き、移植を受けなかったマウスの血糖値が上昇し、実験の最後 (72日) まで高いままであった。他方、移植を受けたマウスの血糖値は正常範囲のままであった (図7 ) 。ストレプトゾトシンを注射し、組織移植を受けたマウスにおける血糖の調節が実際に移植細胞によるものであることを実証するために、片方の腎摘出を行って移植片を除去し、血糖濃度を監視した。図7 に示すように、66日目での片腎摘出による移植片の除去後は、ストレプトゾトシン処置したマウスでは、血糖が移植された細胞によりコントロールされていたことを表している。
ラットRYAS41細胞株について上述したのと同様の実験を行った。要約すると、scidマウスにストレプトゾトシンを注射し、注射から2日後にマウスは高血糖となり、正常血糖を維持するためにインスリンカプセルを皮下埋め込みした。22日後、10匹のマウスに106 のH357細胞を移植し、4匹のマウスは対照として残した。図11A に示すように、移植から2週間後に対照マウスの血糖値は増大し高いままであったのに対し、移植したマウスの血糖値は正常であった。片腎摘出による移植片の除去後に認められた急激な血糖値上昇は、移植したヒト細胞により血糖値がコントロールされていたことを実証している (図11B)。
いくつかの主張が1型糖尿病の原因が自己免疫であることに賛成している。他の具体的な特徴として、自己抗体の存在が何十年も強力な主張であった(Bottazzo et al., 1974) 。このため、臨床医は1型糖尿病の証拠としてこれらの自己抗体の存在を使用してきた。いくつかの方法が使用されてきた。1つのやり方では、β細胞全体に対する抗体を検出する(Palmer 1993) 。この方法は特異的抗原の供給源としてヒト膵臓を使用し、間接免疫蛍光により、膵島細胞自己抗体( 即ち、ICA)の存在を証明することができる。これらの自己抗体は抗原特異的ではないが、β細胞の特定の成分だけを認識した。この方法は抗体測定の標準となり、例えば、1型糖尿病患者の親族の集団における糖尿病の危険度を予測するために高い値のICA を実証するような使われ方をしてきた。高力価のICA の存在は、この者の糖尿病の危険性が高いことを予測する。この方法は基準法であるが、その利用はこのICA 測定を日常的に実施するのに十分なヒト膵臓を得ることの困難性により制限されてきた。
我々が発生させたヒト腫瘍組織は、ヒトβ細胞に非常に類似した性質を示すβ細胞を含んでいる。他の特性として、それらはヒトβ細胞に特有のいくつかの遺伝子およびタンパク質を含んでいる。これに関して、この組織は抗膵島細胞自己抗体測定の方法を実施するためのβ細胞およびβ細胞含有組織の新たな供給源となる。従って、上に規定された細胞は、例えば、下記の方法を用いた糖尿病の診断に有用である。
図13A に見られるように、1型糖尿病患者の血清を腫瘍H212から得られた組織切片上でインキュベーションすると、明るい蛍光が観察される。この蛍光は、該切片を正常血清と共にインキュベーションした場合には得られなかった。
タンパク質抽出物をH301腫瘍から作製した。これらのタンパク質をSDS PAGE上で分離し、ニトロセルロース膜上に移した。図13B に見られるように、正常血清で観察されるのとは異なり、最近気づかれた1型糖尿病の患者の血清をインキュベーションすると、いくつかのバンドが観察された:2つのバンドはGAD およびIA2 の分子量( それぞれ65および37) に相当する。
腫瘍H301からのタンパク質抽出物を使用して、ELISA プレートを作製した。対照被験者および最近気づかれた糖尿病患者である26名の患者からの血清によりELISA 試験を実施した。これらの患者は、従来のヒト全膵臓による間接免疫蛍光法を使用すると全員がICA 陽性であった。この26名の患者の一団の中で、25名がELISA 法で陽性であり、この方法の感度を実証した (図13C)。
Claims (20)
- 下記工程を含む、ヒト膵臓β細胞またはヒトβ細胞腫瘍を調製する方法:
a)未熟(immature)ヒト膵臓に、i)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現するレンチウイルスベクターとii)インスリンプロモーターの制御下でhTertを発現するレンチウイルスベクターとを、またはiii)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原とhTertの両方を発現するレンチウイルスベクターを形質導入または同時形質導入し、
b) a)で得られる形質導入した未熟膵臓を、ヒトを除く重症複合免疫不全(scid)の動物の腎臓被膜中に導入し、
c)形質導入した未熟膵臓細胞にインスリノーマ様の構造を発生させ、ここでインスリノーマ様の構造の未熟ヒト膵臓細胞はインスリン産生膵臓β細胞に分化しており、
d)工程c)で得られるインスリノーマ様構造体を微細切断し、その細胞を解離させ、そして場合によりインスリンプロモーターの制御下で抗生物質耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入し、
e)工程d)で得られる細胞を、ヒトを除く新たなscid動物の腎臓被膜中に継代移植し、
f)工程e)で継代移植した細胞にインスリノーマ様構造を発生および再生させ、ここで、新たに発生したインスリノーマ様構造物はインスリン産生膵臓β細胞に富み、
g)工程f)で得られるインスリノーマ様構造物を微細切断し、それらの細胞を解離させ、そして集め、
h)場合により、工程g)で得られる細胞を新たなscid動物の腎臓被膜に継代移植し、インスリン産生膵臓β細胞をさらに富化し増幅させ、場合により工程f)、g)およびh)を、適切な量のインスリン産生膵臓β細胞が得られるまで繰り返す。 - 膵臓細胞をscidマウスに移植および継代移植する、請求項1記載の方法。
- 抗生物質耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項1または2記載の方法。
- 工程h)で得られるヒト膵臓β細胞を集めて、均質な細胞集団を形成させ、場合により該集団を、ヒト機能性β細胞株を樹立するためにin vitro培養することをさらに含む、請求項1〜3のいずれかの項記載の方法。
- SV40ラージT、hTERTおよび抗生物質耐性導入遺伝子を除去することを含む脱不死化工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれかの項記載の方法。
- 非ヒト動物への移植後にin vivoで、またはin vitroで、糖尿病治療用の候補薬剤を試験し、そしてスクリーニングするために、ヒト機能性膵臓β細胞を調製するための請求項1〜5のいずれかの項記載の方法。
- 患者を1型または2型糖尿病に分類することを可能にするin vitro診断のために、大量のヒト機能性膵臓β細胞または大量のβ細胞腫瘍を調製するための請求項1〜5のいずれかの項記載の方法。
- ヒト機能性膵臓β細胞をin vitroで培養し、インスリン分泌を調節しうる化合物をスクリーニングするための細胞株の確立のための、請求項4〜7のいずれかの項記載の方法。
- 細胞の脱不死化のための工程をさらに含む、糖尿病の細胞治療のためのマスター細胞バンクの確立のための、請求項1〜5のいずれかの項記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターを可逆的または条件的不死化を可能にするように作製する、糖尿病の細胞治療用のマスター細胞バンクの確立のための、請求項1〜5のいずれかの項記載の方法。
- レンチウイルスベクターが少なくとも1つのLox P部位を含み、前記導入遺伝子がCreリコンビナーゼと反応させることより除去される、請求項10記載の方法。
- レンチウイルスベクターが少なくとも1つのFRT部位を含み、前記導入遺伝子がFLPリコンビナーゼと反応させることより除去される、請求項10記載の方法。
- SV40ラージTを発現するレンチウイルスベクター、およびhTERTを発現するレンチウイルスベクターが、部位特異的組換えの部位が両ベクターで異なる場合、Lox PまたはFLP部位をさらに含む、請求項10記載の方法。
- ネガティブ選択工程をCreまたはFLPリコンビナーゼの作用の後に行い、不死化遺伝子SV40ラージTおよびhTERT、並びに抗生物質耐性遺伝子が除去された細胞のみを選択する、請求項11〜13のいずれかの項記載の方法。
- レンチウイルスベクターが、少なくとも1つのネガティブ選択マーカー遺伝子を含む、請求項11〜13のいずれかの項記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかの項記載の方法でβ細胞腫瘍もしくは膵臓β細胞を調製し、該β細胞腫瘍もしくは膵臓β細胞または該細胞からの蛋白質抽出物を固体支持体に結合または吸着させ、そして個体の血清と反応させ、1型または2型糖尿病に特異的な各種表面抗原に対する自己抗体の存在または不在を検出することを含む、糖尿病のin vitro診断のための1型または2型糖尿病に特異的な各種表面抗原に対する自己抗体の検出方法。
- 請求項1〜5のいずれかの項記載の方法でヒト膵臓β細胞を調製し、該細胞からの蛋白質抽出物を、個体の血清と反応させ、糖尿病に関連する各種の表面抗原に対する自己抗体を、イムノブロットまたはドットブロットにより検出することを含む、糖尿病に関連する自己抗体を同定する方法。
- 請求項1〜5のいずれかの項記載の方法でβ細胞腫瘍を調製し、該β細胞腫瘍の組織切片に患者および対照からの血清を添加し、そして標識抗ヒトIgGと共にインキュベーションして、該患者の血清中に糖尿病に関連する自己抗体が存在するか否かを明らかにすることを含み、ここで自己抗体の存在は糖尿病の指標となる、請求項16記載の検出方法。
- 請求項1〜5のいずれかの項記載の方法でヒト膵臓β細胞を調製し、該ヒト膵臓β細胞の蛋白質抽出物を患者の血清と共にインキュベーションして、ウェスタンブロットを実施することを含み、ここで該患者の血清中に糖尿病に関連する自己抗体が存在するか否かが、標識抗ヒトIgGによって明らかにされ、ここで自己抗体の存在は糖尿病の指標となる、糖尿病のin vitro診断のための自己抗体の検出方法。
- 請求項1〜5のいずれかの項記載の方法でヒト膵臓β細胞を調製し、該細胞からの蛋白質抽出物でウエルプレートを被覆し、患者および対照の血清と共にインキュベーションするELISA試験を含み、ここで該患者の血清中に糖尿病に関連する自己抗体が存在するか否かが、標識抗ヒトIgGによって明らかにされ、ここで自己抗体の存在は糖尿病の指標となる、糖尿病のin vitro診断のための自己抗体の検出方法。
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