METODO PARA GENERAR TROFOBLASTOS DE PRIMATE
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La biología celular moderna incluye una diversidad de técnicas para manipular diversas células de organismos vivos ín vi tro Son de ínteres particular una categoría de células conocidas como células pluripotenciales (hemocitoblastos o embriocitos indiferenciados ) Las células pluripotenciales son células no diferenciadas o células diferenciadas solo parcialmente que tienen la capacidad de diferenciarse en muchas lineas de células y tipos progenitores y maduros El termino "células pluripotenciales" se puede utilizar para referirse a un tipo de célula la cual es una progenitora de una linea celular de diferenciación en un organismo superior, tal como las células pluripotenciales hematopoyeticas , o puede referirse a células pluripotenciales totalmente no diferenciadas, las cuales, por lo menos en teoría, tienen la capacidad de diferenciarse en cualquiera de los tejidos del cuerpo Como mínimo, las células pluripotenciales son pluripotentes , lo que significa que tienen el potencial de diferenciarse en muchos tipos de células diferentes, y pueden ser totipotentes , lo que significa que tienen el potencial para diferenciarse en cualquier tipo de célula u organismo maduro de la especie Los cultivos de células pluripotenciales se han desarrollado REF 158616 de una diversidad de tipo de tejido y de muchos animales diferentes Recientemente se ha vuelto posible generar, cultivar y mantener cultivos de células pluripotenciales embnónicas de primate que incluyen células pluripotenciales embriónicas tanto de humano como de macaco (macaco de la india) macaca mulatta) ) Véanse, por ejemplo las patentes de E U A Nos 5,843,780 y 6,200,806 para Thompson Las células pluripotenciales embriónicas de primate son cultivos pluripotenciales generados de embriones que sobreviven indefinidamente en cultivo y demuestran la capacidad de diferenciarse en los tipos de tejido principales del cuerpo de un primate Las células pluripotenciales embriónicas de primate se pueden mantener indefinidamente en un estado no diferenciado en cultivo, o se puede permitir que inicien un proceso de diferenciación mediante el cual diversas de las células se comprometen (diferencian o asocian) a una o múltiples líneas de desarrollo Típicamente, la diferenciación de las células pluripotenciales en tipo de tejido diferentes comienza con la creación de cuerpos embrioides, lo que provoca que las células pluripotenciales en el cuerpo embriónico comiencen a diferenciarse en diversos tipos de células Un tipo más diferenciado de célula humana de interés científico y de investigación son los trofoblastos humanos Un trofoblasto es una célula la cual es un precursor de las células que participan en la formación de la placenta humana Cuando un embrión comienza la diferenciación, en la etapa de un blastocito, las células en la masa celular interior se comprometen para formar las células las cuales se volverán el embrión, mientras que las células exteriores de los blastocitos se comprometen en participar en el desarrollo de la placenta Las células de trofoblastos se han aislado antes, pero ha sido difícil aislarlas y no han estado disponibles para investigación en cantidades significativas Se han creado líneas de células de trofoblastos de ratón a partir de blastocitos y trofoblastos posteriores a la implantación Se han creado líneas de células de trofoblastos humanos a partir de células placentarias transformadas pero las técnicas para crear cultivos de trofoblastos de primate a partir de células embriónicas o líneas de células pluripotenciales aún no se han reportado Aunque las células pluripotenciales embriónicas humanas se diferencian espontáneamente en muchos tipos de células diferenciadas, que incluyen a algunas células de trofoblastos, este fenómeno no ha generado la creación de cultivos útiles de células de trofoblastos De hecho, las células pluripotenciales embriónicas de ratón parecen carecer de la capacidad para diferenciarse en trofoblastos y por lo tanto el suministro de trofoblastos siempre ha sido extremadamente limitado Un suministro reabastecible de células de trofoblastos consistentes puede ser muy útil para muchas investigaciones farmacéuticas En particular, la exploración de medicamentos anticonceptivos que se dirigen a la implantación del embrión y sustancias terapéuticas que impiden los defectos de nacimiento relacionados con la placenta aún permanecen como temas de investigación científica que deben ser investigados con mayor facilidad con la condición de que esté disponible una fuente de trofoblastos de primate SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se resume en un método para inducir células pluripotenciales (hemocitoblastos o embriocitos indiferenciados) de primate para que se diferencien predominantemente en trofoblastos humanos, que incluye la etapa de cultivar las células pluripotenciales de primate en presencia de un factor proteínico inductor de trofoblastos La presente invención también se relaciona con cultivos uniformes de células de trofoblastos de primate generadas por el método que se describe aquí La presente invención también se desarrolla con un método para probar agentes sobre células placentarias en las cuales los agentes están expuestos a cultivos de trofoblastos, como se describe aquí Un objetivo de la presente invención es permitir la creación de cultivos de trofoblastos casi puros de una manera uniforme, consistente y reproducible Una característica de la presente invención es que se describe por primera vez un método conocido para generar que las células pluripotenciales de primate en cultivo se diferencian de manera repetida, directa, individual y en sincronía, predominantemente en una línea de células compromet ida Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se volverán evidentes ante la siguiente especificación BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una ilustración gráfica de la secreción de hormonas por células de trofoblastos cultivadas de acuerdo con la presente invención DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se fundamente en una observación Se ha encontrado por los inventores que algunas factores proteínicos provocarán que las células pluripotenciales embnónicas de primate se diferencien directamente en células de trofoblastos Las células de trofoblastos son estables y muestran la totalidad de las características celulares de las células precursoras placentarias Dado que la creación y cultivo de células pluripotenciales embnónicas de primate y humano se ha estandarizado y se ha vuelto reproducible fácilmente, esta observación posibilita por primera vez la creación de una clase principal de un tipo de célula único (células de trofoblasto) directamente a partir de una fuente de células pluripotenciales de humano o de otro primate sin la creación intermedia de un cuerpo embrioide Se ha encontrado aquí que los factores proteínicos que provocan diferenciación directa de las células pluripotenciales embriónicas de primate ha células de trofoblasto incluyen a la proteína 4 -morfogénica ósea (BMP4 por sus siglas en inglés) así como los factores proteínicos relacionados tales como BMP2 , B P7 y el factor 5 de crecimiento y diferenciación (GDF5, por sus siglas en inglés) Tal factor se denomina en la presente como factor inductor de trofoblastos La disponibilidad de células de trofoblastos humanos y de otros primates en cantidades reproducibles posibilita muchos estudios de investigación respecto al comportamiento de las células placentarias Ahora es posible tener un suministro reproducible inagotable de células precursoras placentarias En particular, se considera que los cultivos de células de trofoblastos se pueden utilizar para estudios de reacciones químicas para establecer un modelo del comportamiento de las células placentarias para uso en las pruebas a medicamentos, tanto para toxicología general así como para efectos específicos sobre células placenta ias Por ejemplo, los agentes los cuales pueden inhibir la implantación de un embrión fertilizado en un útero, es decir, agentes anticonceptivos, se pueden investigar al observar los efectos de los agentes putativos sobre los cultivos de células de trofoblastos Esta descripción incluye datos que muestran que las células pluripotenciales de humano y otro primate se pueden transformar directamente en células de trofoblastos por tratamiento con un factor proteínico único Como se utiliza en la presente, las células pluripotenciales de primate se refieren a células no diferenciadas de humano o de otro primate los cuales son, por lo menos en parte, pluripotentes Las células pluripotenciales utilizadas en los ejemplos siguientes se originan de embriones de humano y de macaco (macaco de la india (macaca mulatta) ) y por lo tanto se conocen como células pluripotenciales embriónicas de primate Las células pluripotenciales embriónicas son células pluripotenciales derivadas de humanos en alguna etapa de desarrollo El método que se describe en la presente, no obstante, es igualmente aplicable a células pluripotenciales humanas derivadas de otros orígenes, que incluyen células de línea de germinales embriónicas y células pluripotenciales aisladas de cuerpo de primates maduros Nótese el hecho de que las células plu ipotenciales humanas se di erenciarán en células de trofoblastos resulta inesperado en base con la experiencia con las células pluripotenciales de ratón Los esfuerzos por derivar tejido del trofectodermo de células pluripotenciales a ratón mediante manipulación del ambiente de cultivo externo hasta ahora no ha tenido éxito y cuando se forman en quimeras con embriones preimplantación intactos, las células pluripotenciales de ratón raramente contribuyen a los trofoblastos La incapacidad de las células pluripotenciales embnónicas de ratón de formar células de trofoblastos concuerda con la teoría de que las células pluripotenciales embnónicas de ratón son similares en cuanto a su desarrollo al hectodermo primitivo, el cual se forma después de deslammación del endodermo primitivo de la masa callosa interna y el cual ya no contribuye a la línea de trofoblastos La capacidad de las células pluripotenciales embnónicas humanas para formar células de trofoblastos sugiere una diferencia básica entre el potencial de desarrollo de las células pluripotenciales embnónicas tanto de ratón como de humano Nótese que el método aquí involucra la aplicación del factor inductor de trofoblastos directamente a las células pluripotenciales en cultivo, sin ningún procedimiento intermedio normalmente asociado con la diferenciación de células pluripotenciales En particular, nótese que no hay una etapa de transición a cuerpos embrioides asociada con este método El procedimiento de diferenciación para células pluripotenciales cultivadas por otro medio generalmente no es uniforme en el sentido en el que normalmente resultan muchas líneas de células diferentes o tipos de células En contraste, el método que se describe aquí resulta en una diferenciación en masa de las células pluripotenciales a un tipo de célula diferenciado común, trofoblastos Para demostrar que la diferenciación dirigida de las células pluripotenciales en células de trofoblastos se debe a la influencia del factor inductor de trofoblastos, es posible inhibir la acción del factor inductor de trofoblastos y observar el resultado Si BMP4 es el factor inductor de trofoblastos, esta proteína se puede inhibir por el receptor BMP4 soluble o por la proteína antagoni zante , noggina Es decir, si uno cultiva células pluripotenciales de primate únicamente con BMP , el cultivo de células pluripotenciales mostrará una diferenciación dirigida a gran escala hacia los tipos de células de trofoblastos No obstante, si uno cultiva un cultivo de células pluripotenciales de primate similar con BMP4 y un inhibidor, tal como el receptor soluble de BMP4 o noggina, no se producirá la diferenciación a células de trofoblastos Las células pluripotenciales embriónicas humanas en cultivo tienen una morfología muy distintiva Las células son pequeñas, compactas y uniformes, tienen membranas celulares distintas y se agrupan en grupos La diferenciación de las células pluripotenciales en otros tipos de células es un proceso visible dado que las células pluripotenciales se vuelven más grandes y más difusas Los técnicos experimentados pueden reconocer, por la apariencia celular de 5 las células diferenciadas, muchos tipos de células En el caso de las células de trofoblastos , las células se vuelven más grandes y aplanadas y las membranas de las células se
^ vuelven difusas o invisibles No obstante, para suplementar el estado de las células de trofoblastos , se han llevado a
10 cabo varios estudios caracterizantes de las células Se llevó a cabo un estudio de expresión de gen utilizando microarreglos de ADN para examinar el patrón de expresión de
^ genes de las células También se examinó la secreción de hormonas placentarias por las células Los resultados
15 concuerdan con la identificación de estas células diferenciadas como células de trofoblastos Esto confirma que es correcta la identificación morfología de estas células EJEMPLOS La línea de células pluripotenciales embnónicas 20 humanas, Hl , se cultiva en una placa de plástico recubierto con MatrigelMR en un medio que se ha acondicionado en fibroblastos embriómcos de ratón (MEF, por sus siglas en inglés) y que se ha suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a 4 mg/ml La proteína morfogénica 25 ósea humana 4 (BMP4, por sus siglas en inglés) (R&D Systems, Mmneapolis, MN, también una fuente de otras proteínas recombmantes que se incluyen aquí) se aplicó a las células pluripotenciales a concentraciones de 1 , 10 y 100 ng/ml de medio de cultivo Las células pluripotenciales estaban constituidas como una monocapa y no estaban agregadas atrás en cuerpos embrioides Las células Hl después de que experimentaron un cambio morfológico, dependiente de la dosis y del tiempo, y se dispersaron, se volvieron planas, delgadas y se agrandaron o elongaron con sus núcleos volviéndose más pequeños Estos cambios concuerdan con la morfología de las células de trofoblastos Los cambios morfológicos comenzaron con las células en el borde de cada colonia y se dispersaron hacia adentro desde dichos bordes La morfología cambiante se volvió evidente en el día 2 para los cultivos tratados con 100 ng/ml de BMP4 , el día 3 ó 4 para cultivos tratados con 10 ng/ml y los días 4 a 5 para cultivos tratados con 1 ng/ml de BMP4 Se llevaron a cabo experimentos similares con otros miembros de la familia de la señal de proteína de BMP4 Las proteínas las cuales se ha demostrado que activan un efecto similar para provocar que las células pluripotenciales cambien a células de trofoblastos incluyen a BMP2 , BMP7 y factor 5 de crecimiento y diferenciación (GDF5, por sus siglas en inglés) Se ha encontrado que otras proteínas, incluyendo miembros de la superfamilia TGF, tales como TGF ß 1 y activina, no activan este mismo cambio morfológico en células pluripotenciales Se observaron cambios morfológicos similares en líneas de células pluripotenciales embriónicas de macaco Rhesus tratadas con BMP4 , BMP2 , BMP7 y GDF5 El cambio en la morfología de las células pluripotenciales tratadas con el factor inductor de trofoblastos es consistente con los cambios morfológicos que se presentan en el desarrollo de un embrión en donde algunas de las células se comprometen (se asocian o diferencian) en una línea que resulta en la placenta Además de los cambios morfológicos, las células comienzan a expresar factores de transcripción GATA2 y GATA3 así como los genes de gonadatrofina coriónica, a y ß, la totalidad de los cuales se expresan en trofoblastos creados por otros medios Las células producen grandes cantidades de hormonas placentarias e incluyen gonadatrofinas coriónicas, estradiol y progesterona Las células continúan secretando estas hormonas de manera indefinida La citometría de flujo de las células demuestra que las células son, por lo menos de manera predominante, CG ß positivas También se llevaron a cabo experimentos en los cuales se agregaron antagonistas de los factores de la familia de BMP al cultivo y al mismo tiempo como factor proteínico Se encontró que si se agregaba un receptor BMP soluble (a 100 ng/ml) de la proteína antagonizante de BMP noggma (a 300 ng/ml) al cultivo, al mismo tiempo que BMP4 , se evitaba por completo el cambio morfológico de las células pluripotenciales Esto demuestra la especificidad del efecto del factor proteínico activante Se llevaron a cabo experimentos similares en otras líneas de células pluripotenciales , denominadas H9, con un resultado similar en la producción de células de trofoblastos Además, se llevaron a cabo experimentos similares en células Hl cultivadas en ausencia de bFGF, lo que sugiere que el efecto es universal para las células plu ipotenciales humanas de diversos donadores y que no depende de la presencia de bFGF Para investigar adicionalmente el carácter de los trofoblastos, se utilizaron microarreglos de ADNc para analizar genes que expresan de manera diferenciada en células tratadas con BMP4 y células Hl no diferenciadas, no tratadas De los 43,000 genes de ADNc examinados en los arreglos, un grupo de únicamente 19 clones, que representan 14 genes, se encontraban activados fuertemente durante todos los puntos de tiempo examinados De estos 14 genes, once habían sido caracterizados previamente como relacionados con el desarrollo de trofoblastos o placenta Muchos de estos genes codifican para factores de transcripción, tales como el factor de transcripción AP-2 (TFAP2, por sus siglas en inglés), la caja homeótica msh (homeobox) homólogo 2 (MSX2, por sus siglas en inglés) , un supresor de señalización de citocina 3 (SSI3, por sus siglas en inglés), las proteínas de unión GATA 2 y 3 (GATA 2 y GATA 3) un motivo 1 YPRW con relación con la parte oradora de spli (HEY1, por sus siglas en inglés) Al día 7 de tratamiento con BMP4 , también se observó un incremento notable en la expresión de ARNm de muchos genes que se sabe se expresan en trofoblastos o placenta, tales como los genes que codifican para las subunidades CG-OÍ y CG-ß, hormona lutemizante a y factor de crecimiento placentario También se llevó a cabo RT-PCR para observar la expresión incrementada de marcadores de trofoblastos, que incluyen CG-ß, células de neuroglía perdidas- 1 (GC 1, por sus siglas en inglés) , la molécula de HLA clase I no clásica HLA-G1 y CD9 La totalidad de los 10 clones más activados, que representan 8 genes en el análisis de microarreglo, con una excepción, codifican para proteínas o péptidos previamente relacionados con los genes que se expresan en células de trofoblastos En contraste, después de 7 días de tratamiento con BMP4 , los transcritos de varios genes altamente expresados en células pluripotentes habían declinado, tales como aquellos que codifican para el dominio POU, clase 5, factor de transcripción 1 (P0U5F1, también conocido como OCT4) , y el factor de transcripción inversa de telomerasa (TERT, por sus siglas en inglés) Para confirmar adicionalmente el carácter de estas células, se examinó la cantidad de hormonas placentarias CG, estradiol y progesterona secretadas al medio por estas células Las células Hl tratadas con BMP4 mostraron concentraciones notablemente más elevadas de cada hormona en comparación con células no diferenciadas o células diferenciadas en medio no acondicionado La figura 1 ilustra el curso en el tiempo en el incremento de estas hormonas en las células expuestas a BMP4 (CM+BMP4) en comparación con células sin BMP4 (CM) y células a las que se les permitió diferenciarse en medio no condicionado (UM) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención