JP6891805B2 - 人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞の製造法 - Google Patents
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Description
合胞体栄養膜細胞(syncytiotrophoblast)は、胎盤絨毛において最も外側に位置し母体血と接触する細胞層を構成する。胎盤絨毛において合胞体栄養膜細胞の内側に存在する細胞性栄養膜細胞(cytotrophoblast)が分化し融合して、合胞体栄養膜細胞が形成される。
合胞体栄養膜細胞は、細胞性栄養膜細胞や血管内皮等と共に血液胎盤関門を構成する。合胞体栄養膜細胞は、血液胎盤関門において最も外側に存在し母体血に接する。合胞体栄養膜細胞は細胞間で密着結合を形成し、血液胎盤関門における物質の拡散透過を制限する。また、合胞体栄養膜細胞は、様々な種類の排出トランスポーター(例えば、MDR1)及び取り込みトランスポーター(例えば、GLUT1)を発現しており、これらのトランスポーターを介して物質の選択的な排出及び取込みが行われる。このように、合胞体栄養膜細胞は、母体と胎児間の物質移行の血液胎盤関門での制御に主要な役割を果たしている。
即ち、本発明は、
項1.ヒト多能性幹細胞を、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工栄養膜細胞の製造方法(以下、本発明製造方法1と記すこともある。);
項2.ヒト多能性幹細胞を、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞の製造方法(以下、本発明製造方法2と記すこともある。);
項3.培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に開始される、項1又は2に記載の製造方法;
項4.培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前から、GCM1 mRNAが発現する細胞が出現した後まで行われる、項1から3のいずれか1項に記載の製造方法;
項5.培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上との前記接触が、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地中での培養の全期間にわたって行われる、項1から4のいずれか1項に記載の製造方法;
項6.BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地が、BMPシグナル伝達活性化物質を含みFGFシグナル伝達活性化物質を含まない培地である項1から5のいずれか1項に記載の製造方法;
項7.BMPシグナル伝達活性化物質が、Bone Morphogenetic Protein 4である項1から6のいずれか1項に記載の製造方法;
項8.培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に、培養中の細胞にFGFシグナル伝達阻害物質をさらに接触させる、項1から7のいずれか1項に記載の製造方法;
項9.γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上が、γアミノ酪酸B受容体活性化物質と、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とである、項1から8のいずれか1項に記載の製造方法;
項10.γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上が、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質である、項1から9のいずれか1項に記載の製造方法;
項11.ヒト多能性幹細胞が、単一に分散された後、維持培養されたヒト多能性幹細胞である、項1から10のいずれか1項に記載の製造方法;
項12.多能性幹細胞が、胚性幹細胞(以下、ES細胞と記すことがある。)又は人工多能性幹細胞である、項1から11のいずれか1項に記載の製造方法;
項13.項1から12のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞;
項14.項1から12のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を含有するキット;
項15.項1から12のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質の該細胞に対する透過性を検定することを含む、被験物質の細胞層透過性検定方法;
項16.項1から12のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、毒性または薬効評価用試薬としての使用;
項17.項1から12のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、被験物質の毒性または薬効評価方法;
項18.項1から12のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を用いて当該細胞が関与する物質輸送またはホルモン分泌を調べることを含む、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析方法;及び
項19.項1から12のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析用試薬としての使用;
等を提供する。
このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターは、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition)」 Sambrook, J and Russell, D.W., ed., Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に代表的なものが記載されており、このようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
本発明において細胞の培養に用いられる培地には、必要に応じて、無調整又は未精製の血清が添加される。「血清」としては、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清、仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清等の哺乳動物の血清を挙げることができる。当該培地は、脂肪酸、脂質、アミノ酸(例えば、非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を更に含有してもよい。
例えば、「BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地」とは、外因性のBMPシグナル伝達活性化物質が添加された培地または外因性のBMPシグナル伝達活性化物質を含む培地である。「FGFシグナル伝達活性化物質を含まない培地」とは、外因性のFGFシグナル伝達活性化物質が添加されていない培地または外因性のFGFシグナル伝達活性化物質を含まない培地である。
ヒト多能性幹細胞を、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る工程を含む。
本発明製造方法2は、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞の製造方法であって、
ヒト多能性幹細胞を、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る工程を含む。
本発明における「ヒト多能性幹細胞」とは、ヒトの細胞由来の多能性幹細胞を意味する。例えば、ヒトの受精卵、クローン胚、生殖幹細胞もしくは組織内幹細胞等から樹立された多能性幹細胞、または、ヒトの体細胞から誘導された多能性幹細胞が挙げられる。
胚性幹細胞は、将来胎児などの胚体組織へと分化する細胞の集団である内部細胞塊より樹立された細胞であり、従来、胎盤などの胚体外組織へは分化しないと考えられてきた。しかし、近年、胚性幹細胞を特定の条件下で培養することにより、胎盤を含む胚体外組織へ分化させ得る可能性が示されるようになった。例えば、ヒトES細胞を、BMP4を添加した培地に接触させて培養を行うこと(Nature Biotechnology, 2002, 20, p1261-1264)により、将来胎盤などの胚体外組織へと分化する栄養外胚葉系列の細胞への分化が起こることが報告されている。
多能性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト幹細胞は、KnockOutTM Serum Replacement(以下、KSRと記すこともある。)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(以下、bFGFと記すこともある。)を用いて培養することにより維持できる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子(例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など)のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)やCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987−1997)等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム(Genome Systems製)やUniversal GenomeWalker Kits(CLONTECH製)などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993);バイオマニュアルシリーズ8,ジーンターゲッティング,ES細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社(1995);等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリA選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
本発明における「接着培養する」とは、細胞を培養器材等に接着した状態で培養することをいう。
本分化培養で用いられる培養器材としては、細胞の接着培養が可能なものであればその形状は特に限定されない。このような培養器材としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、セルカルチャーインサート、オーガンオンチップ等を挙げることができる。
好ましい培養器材としては、細胞接着性の培養器材を挙げることができる。細胞接着性の培養器材としては、例えば、細胞との接着性を向上させる目的で培養面が人工的に処理された細胞培養器材を挙げることができる。細胞との接着性を向上させるための処理としては、例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理が挙げられる。コーティングに用いられる細胞外マトリクス等としては、基底膜成分として市販されている商品(例えばMatrigelTM;ベクトン・ディッキンソン社製)や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子(例えばI型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど)等が挙げられる。細胞は、例えば、器材の底面、側面、底面の裏面(例えば、着脱式セルカルチャーインサートのカップの裏面)等に接着させることができ、浮遊状態でなければ、接着箇所は特に限定されない。
BMPシグナル伝達活性化物質の濃度は、ヒト多能性幹細胞の栄養膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばBMP4は、培地中の濃度が約1ng/mlから約1000ng/ml、好ましくは約10ng/mlから約300ng/ml、より好ましくは約100ng/mlとなるように培地に添加する。
FGFシグナル伝達活性化物質としては、FGFにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質を挙げることができる。FGFシグナル伝達活性化物質としては、例えば、FGFファミリーに属する蛋白(例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子)やFGF類似物質(例えば、SUN 11602)等が挙げられる。
単一に分散された細胞とは、細胞塊(コロニー)の状態ではなく、単一細胞の状態にまで分散処理された細胞を意味する。細胞を単一に分散する方法としては、細胞塊を細胞分散試薬で処理する方法等が挙げられる。例えば、トリプシン−EDTA、もしくは、TrypLE Express(Life Technologies)等のトリプシン代替物等により酵素処理する方法、または、酵素を含まない細胞分散試薬で処理した後、ピペッティングする方法等が挙げられる。細胞へのダメージが小さい方法が好ましい。
単一に分散されたヒト多能性幹細胞を、一定期間、未分化状態のまま維持培養した後、本分化培養に供する。単一に分散されたヒト多能性幹細胞の維持培養開始時の細胞濃度は、例えば、96穴培養プレートの1ウェルあたり、約5×102細胞から約1×104細胞、好ましくは約7.5×102細胞から約3×103細胞、より好ましくは約1×103細胞から約2×103細胞とする。維持培養の方法としては、多能性幹細胞を未分化状態のまま培養するために通常用いられる培地中で、ヒト多能性幹細胞を接着培養する方法を挙げることができる。例えば、単一に分散され播種されたヒト多能性幹細胞が培養器材に接着して増殖を開始した後、約100個程度の細胞からなる細胞塊が形成されるまでの間に、維持培養を終了させ本分化培養を開始させる。好ましくは約50個程度、より好ましくは約20個程度の細胞からなる細胞塊が形成されるまでの間に、本分化培養を開始させる。維持培養の具体的な日数は、培養する細胞の種類や状態、培地の成分、および培養条件等によって異なるが、例えば、約1日間から約3日間が挙げられる。
例えば、ヒト多能性幹細胞のコロニーを、細胞分散試薬等を用いて単一に分散した後、接着培養用の96穴培養プレートに1ウェルあたり約1.5×103細胞となるように培地に懸濁して播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養する。その際の培地には、例えば、20% KSR等を含むDMEM/F−12培地でマウス線維芽細胞(以下、MEFと記すことがある。)を一晩培養した上清に、bFGFを10ng/ml 、Y-27632を20μMとなるように添加した培地を用いる。例えば、維持培養開始から2日後に、培地を上述のようなBMPシグナル伝達活性化物質を含む培地に交換して、本分化培養を開始する。
GCM1 mRNAを発現する細胞が本分化培養の培養物中に出現しているか否かは、培養系内に存在する細胞がGCM1 mRNAを含むか否かを、通常の生化学的手法を用いて測定することにより確認することができる。具体的には、培養系内に存在する細胞からtotal RNAを抽出して逆転写反応を行い、GCM1 mRNAを検出可能なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行うことにより、GCM1 mRNAの発現有無を調べることができる。後述する実施例1に記載されるように、GFPをコードする塩基配列がGCM1遺伝子座にノックインされたヒト多能性幹細胞を用いた場合は、GFPが発する蛍光を検出することにより、GCM1 mRNAの発現を確認することができる。例えば、培養系内に存在する細胞から、通常の生化学的手法によりGCM1 mRNAが検出されたら、GCM1 mRNAを発現する細胞が本分化培養の培養物中に出現していると判断する。GCM1 mRNAを発現する細胞が本分化培養の培養物中に出現するタイミングが、あらかじめ判っている場合には、上記のような確認操作を行わずに、所定のタイミングで上記細胞と上記物質との接触を行えばよい。
本分化培養の「培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前」の期間は、培養する細胞の種類や状態、培地の成分、および培養条件等によって異なるが、例えば、本分化培養の開始から2日間から3日間以内を挙げることができる。例えば、本分化培養の開始と同時に、または、開始から2日間から3日間以内に、上記細胞と上記物質との接触を開始する。当該接触は、1日間程度で終了してもよいが、2日間以上継続して行われることが好ましい。
PPARγ活性化物質は、例えばS26948の場合では、培地中の濃度が約10nMから約10μM、好ましくは約100nMから約1μMとなるように培地に添加する。
RXR活性化物質は、例えばSR 11237の場合では、培地中の濃度が約1nMから約1μM、好ましくは約10nMから約100nMとなるように培地に添加する。
RAR活性化物質は、例えばレチノイン酸の場合では、培地中の濃度が約0.1nMから約100nM、好ましくは約1nMから約10nMの濃度となるように培地に添加する。
FGFシグナル伝達阻害物質は、例えばPD173074の場合では、約1nMから約10μM、好ましくは約0.1μMから約3μMの濃度となるように培地に添加する。
本発明製造方法においては、目的とする細胞、すなわち栄養膜細胞又は合胞体栄養膜細胞、の出現が培養物中に認められるまで、適宜培地交換を行いながら本分化培養を継続し、目的とする細胞を含む培養物を得る。目的とする細胞が培養物中に出現するタイミングが、あらかじめ判っている場合には、後述のような確認操作を行わずに、所定のタイミングで所望の細胞を含む培養物を得ればよい。
合胞体栄養膜細胞への分化は、マーカー遺伝子の発現を通常の生化学的手法を用いて測定することによっても確認が可能である。マーカー遺伝子の発現を測定する方法としては、例えば、細胞を含む培養物からtotal RNAを抽出して逆転写反応を行い、得られたDNAを鋳型としてリアルタイムPCRを行うことによりマーカー遺伝子の発現有無又はその程度を調べる方法や、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体を用いて細胞を免疫染色することにより、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の発現有無又はその程度を調べる方法を挙げることができる。
合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子としては、GCM1遺伝子、Syncytin1遺伝子、CGA遺伝子、CGB遺伝子、CSH1遺伝子、HOPX遺伝子、TFAP2A遺伝子等が挙げられる。
胎盤組織の障害に基づく疾患としては、妊娠高血圧腎症(preeclampsia)、妊娠高血圧(gestational hypertension)、加重型妊娠高血圧腎症(superimposed preeclampsia)及び子癇(eclampsia)等を含む妊娠高血圧症候群(PIH)、子宮内胎児発育遅延(IUGR)、絨毛癌、胞状奇胎、奇胎妊娠等が挙げられる。
合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子の1つであるGCM1遺伝子座にGFPをコードする塩基配列がノックインされたヒトES細胞株を以下のように作製した。
ヒトES細胞株 KhES−1(京都大学より入手)のゲノムDNA上のGCM1遺伝子における翻訳開始点の15塩基上流から、翻訳開始点の20塩基下流までの塩基配列(配列番号1に示される塩基配列;TGGCCTGACCTTATCatggaaCCTGACGACTTTGAT)を標的とするZinc Finger Nuclease(ZFN)をコードするmRNAをSigma-Aldrich社から購入した。AcGFP遺伝子(タカラバイオ)及びネオマイシン耐性遺伝子を含むノックインベクターを作製した。単一に分散したヒトES細胞株 KhES−1に、エレクトロポレーション法により、上記ZFNをコードするmRNAと作製したノックインベクターとを共導入し、前記導入処理後の細胞をマイトマイシンC(Sigma-Aldrich)処理したネオマイシン耐性マウス線維芽細胞(オリエンタル酵母)上へ播種した。播種翌日から培地中にG418(ナカライテスク)を添加し、薬剤選択を行った。得られた耐性クローンのコロニーをピックアップして培養を続け、PCR法により、GCM1コード領域における開始コドン直後にAcGFPをコードする塩基配列が対立遺伝子座の一方にのみノックインされた細胞を選別した。選別された細胞を、以下、GCM1−GFPノックインヒトES細胞と記す。
(1)GCM1−GFPノックインヒトES細胞の調製
実施例1にて作製されたGCM1−GFPノックインヒトES細胞を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」、「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に倣い、マイトマイシンC処理したマウス線維芽細胞(リプロセル)上に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、DMEM/F12培地(Sigma-Aldrich)に、20% KnockOutTM Serum Replacement(KSR、Invitrogen)、0.1mM nonessential amino acids(NEAA、Invitrogen)、2mM L-glutamine(Sigma-Aldrich)、及び0.1mM 2−メルカプトエタノール(Wako)が添加された培地(以下、hES培地と記す。)に、bFGF(Wako)を10ng/ml添加して用いた。
維持培養されたGCM1−GFPノックインヒトES細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、リン酸緩衝食塩水(PBS、Invitrogen)で2回洗浄した後、0.25% トリプシン(Invitrogen)、1mg/ml collagenaseIV(Invitrogen)、20% KSR、及び1mM CaCl2(ナカライテスク)が添加されたPBSを当該ディッシュに添加し、37℃、2% CO2条件下で5分間インキュベートした。前記ディッシュにhES培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離(1000rpm、3分間)を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に、Y-27632(Wako)を20μM添加したhES培地を添加して細胞塊を懸濁した後、得られた細胞塊懸濁液を0.1%ゼラチン(Sigma-Aldrich)でコートしたセルカルチャーディッシュ(BD Falcon)上に播種し、37℃、2% CO2条件下で1.5時間乃至2時間インキュベートした。ディッシュに接着していないGCM1−GFPノックインヒトES細胞塊を培地とともに回収することにより、MEFが含まれないGCM1−GFPノックインヒトES細胞塊の懸濁液を得た(当該操作を、以下、MEF除去操作と記すことがある。)。
(2)GCM1−GFPノックインヒトES細胞の合胞体栄養膜細胞への分化誘導
上記のようにして調製されたGCM1−GFPノックインヒトES細胞塊をTrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を96穴培養プレート1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、MEFをhES培地で一晩培養した上清(以下、MEF−CMと記す。)に、10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。維持培養開始から2日後に、上記培地を、10% FBS(コーニング)、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin(Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク)、及び3ng/ml BMP4(R&D) が添加されたDMEM/F−12培地(以下、基礎分化培地Aと記す。)、または、基礎分化培地Aに、0.1% DMSO(Sigma-Aldrich)、1μM S26948(PPARγ agonist、Tocris Bioscience) 、1μM GW 1929(PPARγ agonist、Tocris Bioscience)、1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator、Tocris Bioscience)、1μM SR 11237(RXR agonist、Tocris Bioscience)、もしくは1nM レチノイン酸(RAR agonist、Sigma-Aldrich)のいずれかが添加された分化培地に置換し、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、それぞれ同じ組成の分化培地への培地交換を行った。各分化培地の組成を表1に記す。S26948、GW 1929、CGP 7930及びSR 11237は各々1mMとなるように、レチノイン酸は10mMとなるように、各々DMSOに溶解させ、各DMSO溶液を基礎分化培地Aへ添加した。
実施例2の(1)に記載の方法に倣って、KhES−1細胞を維持培養した後、MEF除去操作に付した。MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を96穴培養プレート1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。維持培養開始から2日後に、上記培地を、10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin 、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、および300nM PD 173074(FGFシグナル伝達阻害物質、Sigma-Aldrich)が添加されたDMEM/F12培地(以下、基礎分化培地Bと記す。);基礎分化培地Bに、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、10μM GW 1929(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)もしくは1nM レチノイン酸(RAR agonist)のいずれかが添加された分化培地;基礎分化培地Bに、0.1μM S26948、0.1μM CGP 7930および10nM SR 11237が添加された分化培地;基礎分化培地Bに、0.1μM S26948、0.1μM CGP 7930および1nM レチノイン酸が添加された分化培地;基礎分化培地Bに、0.1μM S26948、0.1μM CGP 7930、10nM SR 11237および1nM レチノイン酸が添加された分化培地;または、基礎分化培地Bに、10μM GW 1929、0.1μM CGP 7930、10nM SR 11237および1nM レチノイン酸が添加された分化培地に置換し、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への培地交換を行った。各分化培地の組成を、表2に記す。S26948、GW 1929、CGP 7930及びSR 11237は、各々100mMとなるように、レチノイン酸は10mMとなるように、各々DMSOに溶解させ、各DMSO溶液を基礎分化培地Bへ添加した。
KhES−1細胞を実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。
一方、MEF除去操作を行ったKhES−1細胞塊を、1000μlフィルターチップ(日本ジェネティクス)を用いて10回乃至20回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を1ウェルあたり約1.5×103細胞乃至約4×103細胞相当となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。
上記いずれの細胞播種条件においても、維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)、および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行い、更に2日間培養した。
比較例として、上記の2種の条件で播種したKhES−1細胞をそれぞれ、上記と同様に維持培養し、維持培養開始から2日後に、MEF−CMに、10ng/ml BMP4、1μM A83-01(アクチビンシグナル伝達阻害物質Wako)および0.1μM PD 173074(FGFシグナル伝達阻害物質)を添加した分化培地(非特許文献2に記載)への培地交換を行って(この時をday 0とする。)、その後3日間培養し、同じ組成の分化培地への培地交換を行って更に2日間培養した。培養は37℃、5% CO2条件下で行った。
分化を誘導しない対照として、上記の2種の条件で播種したKhES−1細胞をそれぞれ、上記と同様に維持培養し、維持培養開始から2日後に、MEF−CMに4ng/ml bFGFを添加した培地への培地交換を行って(この時をday 0とする。)、その後3日間培養し、同じ組成の培地への培地交換を行って更に2日間培養した。培養は37℃、2% CO2条件下で行った。
播種条件とday 0以後に用いた培地の組成を、表3に記す。
実施例1で作製されたGCM1−GFPノックインヒトES細胞を実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
(1)本発明製造例
本発明の製造例として、MEF除去操作を行ったGCM1−GFPノックインヒトES細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
(2)比較製造例
比較製造例として、MEF除去操作を行ったGCM1−GFPノックインヒトES細胞の塊を、1000μlフィルターチップ(日本ジェネティクス)を用いて10回乃至20回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を1ウェルあたり約1.5×103細胞乃至約4×103細胞相当となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、MEF−CMに、10ng/ml BMP4、 1μM A83-01および0.1μM PD 173074を添加した分化培地(非特許文献2に記載)への培地交換を行って、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、同じ組成の分化培地への培地交換を行った。
(3)細胞観察
分化培地を用いた培養の5日目に、細胞をPBSにて2回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒドを用いて15分間固定した。前記細胞を0.3% トライトンX−100(Wako)を添加したPBSを用いて5分間膜透過処理したのち、細胞をPBSにて3回洗浄した。次いで、前記細胞を3% BSAにより1時間乃至2時間ブロッキングした後、5μg/ml chicken anti-GFP antibody(Abcam), 2μg/ml goat anti-chicken IgG antibody Alexa 488(Life technologies)および1μg/ml Hoechst 33342 (同仁化学)を用いて免疫染色した。得られた染色試料の免疫染色像を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図4に示す。
比較製造例では、GCM1遺伝子が発現したことを示すGFP陽性細胞が5割程度しか認められなかった(図4A)のに対し、本発明の製造例では、9割程度がGFP陽性細胞であった(図4B)。さらに、本発明の製造例では、合胞体性栄養膜細胞の特徴である融合した細胞様の形態が観察された(図4B)。
KhES−1細胞を実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
(1)本発明製造例
本発明の製造例として、MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
(2)比較製造例
比較例として、MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、1000μlフィルターチップ(日本ジェネティクス)を用いて10回乃至20回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を1ウェルあたり約1.5×103細胞乃至約4×103細胞相当となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、MEF−CMに、10ng/ml BMP4、 1μM A83-01および0.1μM PD 173074を添加した分化培地(非特許文献2に記載)への培地交換を行って(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、同じ組成の分化培地への培地交換を行った。
(3)対照(未分化維持培養)
分化を誘導しない対照として、MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、1000μlフィルターチップ(日本ジェネティクス)を用いて10回乃至20回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を1ウェルあたり約1.5×103細胞乃至約4×103細胞相当となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、MEF−CMに4ng/ml bFGFを添加した培地への培地交換を行って(この時をday 0とする。)、その後3日間培養し、同じ組成の培地への培地交換を行って更に2日間培養した。培養は37℃、2% CO2条件下で行った。
(4)遺伝子発現解析
day 0から5日目に、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III(Invitrogen)を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe(Applied biosystems)およびTaqMan Fast advanced master mix(Applied biosystems)を用いたリアルタイムPCRにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子として知られるGCM1遺伝子、Syncytin遺伝子、HOPX遺伝子、TFAP2A遺伝子およびCGA遺伝子、ならびに、合胞体栄養膜細胞とは異なる系列の胎盤系細胞である絨毛外栄養膜細胞のマーカー遺伝子として知られるHLA−G遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、上記各合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子のmRNA発現量、HLA−G遺伝子のmRNA発現量およびハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCRにより測定した。上記各合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子のmRNA量をGAPDH遺伝子のmRNA量で除して得られる値を当該合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子mRNA量の補正値とし、比較製造例((2)に記載)で得られた細胞における合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子mRNA量補正値を1として、本発明製造例((1)に記載)または対照((3)に記載)で得られた細胞における合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子mRNA量補正値を相対発現量として示した。HLA−G遺伝子のmRNA量についても、同様のデータ処理を行い、相対発現量として示した。上記の細胞培養からmRNA量の測定までを3回反復して実施した。結果を図5に示す。図5において、対照(未分化維持培養)の細胞における相対発現量を白棒グラフで、比較例の細胞における相対発現量を灰色棒グラフで、本発明製造例の細胞における相対発現量を黒棒グラフで示す。相対発現量の標準誤差をエラーバーで示す。比較製造例の相対発現量に対して統計的に有意に差がある相対発現量にアスタリスクを付す(**はP値0.001以上0.01未満を、***はP値0.001未満を意味する)。本発明製造例で得られた細胞では、比較製造例で得られた細胞と比べて、各合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子の相対発現量が5倍から20倍有意に増加し(図5A)、絨毛外栄養膜細胞マーカー遺伝子の相対発現量が約4割に減少していた(図5B)。
この結果から、本発明製造方法により、ヒトES細胞から、合胞体栄養膜細胞を高効率に製造可能であることが示された。
KhES−1細胞を実施例2の(1)に記載の方法に倣って維持培養した後、MEF除去操作に付した。MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、MEF−CMに、10g/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いた。
(1)対照
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、及び300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に置換し(この時を分化培養のday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で5日間培養した(Control)。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
(2)本発明製造例
維持培養開始から2日後に、基礎分化培地B、又は、基礎分化培地Bに0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地(以下、分化培地Bと記すことがある。)への置換を行い(この時を分化培養のday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で5日間培養した。
維持培養開始から2日後に基礎分化培地Bへの培地置換を行ったウェルの一部については、基礎分化培地Bを用いた培養開始から1、2、3または4日目に、分化培地Bへの置換を行い、5日目まで培養を継続した。
維持培養開始から2日後に分化培地Bへの培地置換を行ったウェルの一部については、分化培地Bを用いた培養開始から1、2、3または4日目に、基礎分化培地Bへの置換を行い、5日目まで培養を継続した。
すなわち、分化培養0日から5日、分化培養2日から5日、分化培養3日から5日、もしくは分化培養4日から5日(図6A)、分化培養0日から2日、分化培養0日から3日、分化培養0日から4日、もしくは分化培養0日から5日(図6B)、または、分化培養0日から1日、分化培養1日から5日、もしくは分化培養0日から5日(図6C)の期間は、分化培地Bを用いて培養し、その他の期間は基礎分化培地Bを用いて培養した。
いずれの場合も、分化培養3日目からは、PD 173074を含まないこと以外は上記と同じ組成の培地を用いた。
(3)遺伝子発現解析
分化培養5日目に、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III(Invitrogen)を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe(Applied biosystems)およびTaqMan Fast advanced master mix(Applied biosystems)を用いたリアルタイムPCRにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるGCM1遺伝子及びSyncytin遺伝子の発現量を調べた。GCM1遺伝子、Syncytin遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCRにより測定した。Syncytin遺伝子のmRNA量をGAPDH遺伝子のmRNA量で除して得られる値をSyncytin遺伝子mRNA量の補正値とし、対照((1)に記載)で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子mRNA量補正値を1として、本発明製造例((2)に記載)で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子mRNA量補正値を相対発現量として示した。GCM1遺伝子のmRNA量についても、同様のデータ処理を行い、相対発現量として示した。結果を図6に示す。図6において、本発明製造例を、分化培地Bでの培養期間(日)で特定して示し、GCM1遺伝子の相対発現量を灰色棒グラフで、Syncytin遺伝子の相対発現量を黒棒グラフで示す。
分化培養開始から2日目以降に、分化培地Bでの培養を開始した場合、基礎分化培地Bのみで5日間培養した場合(Control)と比べて、合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子であるGCM1遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量の大きな増加は認められなかった(図6A:2−5、3−5及び4−5)。分化培養2日目より前に分化培地Bでの培養を開始した場合、Controlと比べて、GCM1遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量が2倍以上増加し、分化培養5日目より前に基礎分化培地Bへ置換しても、GCM1遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量がControlよりも高かった(図6B及びC)。5日間の分化培養の全期間において、基礎分化培地BにPPARγ agonistであるS26948、GABABR positive allosteric modulatorであるCGP 7930、RXR agonistであるSR 11237およびRAR agonistであるレチノイン酸を含む分化培地(分化培地B)で培養した場合、Controlと比べ、GCM1遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量が2倍乃至4倍程度増加した(図6A、B及びC)。
KhES−1細胞を、実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF、20μM Y−27632を添加した培地を用いた。維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、 100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し(この時を分化培養のday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で5日間培養した。分化培養3日目に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の培地への交換を行った。
分化培養0、1、2、3、4および5日目に、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III(Invitrogen)を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe(Applied biosystems)およびTaqMan Fast advanced master mix(Applied biosystems)を用いたリアルタイムPCRにより、栄養膜細胞マーカーKRT7遺伝子、ならびに、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるGCM1遺伝子及びSyncytin遺伝子の発現量を調べた。KRT7遺伝子、GCM1遺伝子、Syncytin遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCRにより測定した。Syncytin遺伝子のmRNA量をGAPDH遺伝子のmRNA量で除して得られる値をSyncytin遺伝子mRNA量の補正値とし、分化培養5日目で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子mRNA量補正値を1として、分化培養0、1、2、3又は4日目で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子mRNA量補正値を相対発現量として示した。KRT7遺伝子及びGCM1遺伝子のmRNA量についても、同様のデータ処理を行い、相対発現量として示した。結果を図7に示す。図7において、KRT7遺伝子の相対発現量を白色棒グラフで、GCM1遺伝子の相対発現量を灰色棒グラフで、Syncytin遺伝子の相対発現量を黒棒グラフで示す。
分化培養0日目では、KRT7遺伝子、GCM1遺伝子及びSyncytin遺伝子のすべての発現が検出されなかった。KRT7遺伝子の発現量は、分化培養1日目から検出され、分化培養5日目に最も高くなった。GCM1遺伝子の発現量は、分化培養2日目から増加し、分化培養4日目に最も高くなった。Syncytin遺伝子の発現量は、分化培養3日目から増加し、分化培養5日目に最も高くなった。
実施例7において、GCM1遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量がControlよりも増加した「分化培養2日目より前に分化培地Bでの培養を開始した場合」の「分化培養2日目より前」の時期は、「培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前」の時期に相当することが示唆された。
実施例1で作製されたGCM1−GFPノックインヒトES細胞を、実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
MEF除去操作を行ったGCM1−GFPノックインヒトES細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、及び300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、レチノイン酸(RAR agonist) を1nM、10nM、100nM、もしくは1000nMとなるように添加した分化培地;または、基礎分化培地BにDMSOを0.01%の濃度になるように添加した分化培地に交換し、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の培地への交換を行った。
分化培地を用いた培養の5日目に、細胞をPBS(Invitrogen)にて2回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒド(Wako)を用いて15分間固定を実施した。前記細胞を0.3% トライトンX−100(Wako)を添加したPBSを用いて5分間膜透過処理したのち、細胞をPBSにて3回洗浄した。次いで、前記細胞を3% BSAにより1時間乃至2時間ブロッキングした後、5μg/ml chicken anti-GFP antibody(Abcam)、2μg/ml goat anti-chicken IgG antibody Alexa 488(Life technologies)および1μg/ml Hoechst 33342 (同仁化学)を用いて免疫染色した。得られた染色試料について、全自動イメージアナライザーArrayscan(Thermo Scientific)を用いてGFP陽性細胞の割合を定量した。上記の細胞培養からGFP陽性細胞の測定までを3回反復して実施した。結果を図8に示す。GFP陽性細胞の割合の標準誤差をエラーバーで示す。
1nMまたは10nMのレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合は、レチノイン酸が添加されていない分化培地を用いた場合(Control)と比べて、GFP陽性細胞の割合が10%前後増加した。一方、100nM以上のレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合は、Controlと比べてGFP陽性細胞の割合が10%以上減少した。
KhES−1細胞を、実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin及び100μg/ml streptomycinが添加されたDMEM/F12培地(以下、基礎培地Cと記す。);基礎培地Cに1nMもしくは1000nM レチノイン酸が添加された培地;基礎培地Cに100ng/ml BMP4が添加された分化培地;基礎培地Cに100ng/ml BMP4及び1nMレチノイン酸が添加された分化培地;または、基礎培地Cに100ng/ml BMP4及び1000nMレチノイン酸が添加された分化培地に置換し(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、同じ組成の培地への交換を行い、更に2日間培養した。
day 0から5日目に、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III(Invitrogen)を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe(Applied biosystems)およびTaqMan Fast advanced master mix(Applied biosystems)を用いたリアルタイムPCRにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるSyncytin遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、Syncytin遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCRにより測定した。Syncytin遺伝子のmRNA量をGAPDH遺伝子のmRNA量で除して得られる値を、Syncytin遺伝子の相対発現量として示した。結果を図9に示す。図9のAには、BMP4が添加されていない培地を用いた場合の結果を示し、図9のBには、100ng/ml BMP4が添加された分化培地を用いた場合の結果を示す。
BMP4非存在下では、1000nMのレチノイン酸が添加された培地を用いた場合に、レチノイン酸が添加されていない培地を用いた場合と比べて、Syncytin遺伝子の相対発現量がわずかに増加した(図9A)。一方、100ng/ml BMP4 存在下では、レチノイン酸が添加されていない培地を用いた場合と比べて、1nMのレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合にはSyncytin遺伝子の相対発現量が増加し、1000nMのレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合にはSyncytin遺伝子の相対発現量が減少した(図9B)。
ヒトES細胞を実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付す。
MEF除去操作を行ったヒトES細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレートに播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養する。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いる。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換して(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で1日間乃至2日間培養し、上記ヒトES細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る。得られる培養物について、必要に応じて、Cytokeratin7をコードするmRNAを発現し、SyncytinをコードするmRNAを発現していない細胞の存在を確認する。
上記培養で得られた細胞をセルカルチャーインサート(Corning、Cat.3470、メンブレン孔サイズ0.4μm)上で、37℃、5% CO2条件下に1日間乃至4日間培養する。培地には、基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地を用いる。day 0から3日目以降は、PD 173074を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地を用いる。必要に応じて、上記ヒトES細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の出現を確認する。
「Poulsen, M. et al. Toxicology in Vitro 2009, 23, 1380-1386」等に記載の胎盤透過性試験方法を参考に被験物質の透過性試験を行う。
上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値(Ω)をMillicell ERS-2(Millipore)を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積(cm2)を掛けた値である経上皮電気抵抗(TEER、Ω・cm2)を求める。TEER値が35以上となるタイトジャンクションを形成した細胞層を透過性試験に用いる。
インサート内およびマルチプルウェルプレート内の培地をHanks’ Balanced Salt Solution(HBSS)(no phenol red、ライフテクノロジーズ)に置換し、37℃ 5% CO2条件下で30分間乃至45分間インキュベートする。インサート内(アピカル側)の培地を被験物質を含んだHBSSに置換し、70rpmで攪拌しながら37℃、0%乃至5% CO2条件下で培養する。30分、60分、90分および120分後にマルチプルウェルプレート内から培地100μlを採取し、同量のHBSSを添加する。マルチプルウェルプレート内の培地中の被験物質を蛍光プレートリーダー(PerkinElmer)やLC−MS等を用いて定量することによって、上記細胞層における被験物質の透過性を評価する。
ヒトiPS細胞201B7株(京都大学iPS研究所より入手)を、実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付す。
MEF除去操作を行ったヒトiPS細胞の塊を。TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養する。その際の培地には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いる。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)もしくは1nM レチノイン酸(RAR agonist)のいずれかが添加された分化培地;または、0.1μM S26948、0.1μM CGP 7930、10nM SR 11237および1nM レチノイン酸(RAR agonist)からなる群より選ばれる2種以上が添加された分化培地に置換して(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で1日間乃至2日間培養し、上記ヒトiPS細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る。得られる培養物について、必要に応じて、Cytokeratin7をコードするmRNAを発現し、SyncytinをコードするmRNAを発現していない細胞の存在を確認する。
上記分化培地を用いたday 0からの培養を継続し、上記ヒトiPS細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る。day 0から3日目以降は、PD 173074を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地を用いる。
KhES−1細胞を実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
MEF除去操作を行ったKhES−1細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1枚あたり1.5×105細胞となるように10mlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした100mmセルカルチャーディッシュ(BD Falcon)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、20μM Y-27632を添加した基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換して(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で2日間培養し、KhES−1細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得た。
上記培養で得られた細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、PBSで2回洗浄した後、2mg/ml collagenaseIV(Invitrogen)及び20μg/ml DNaseI(Roche)が添加されたPBSを当該ディッシュに添加し、37℃、5% CO2条件下で5分間インキュベートした。前記ディッシュにTrypLE Express(Life Technologies)をさらに添加し、37℃、5% CO2条件下で5分間インキュベートした。前記ディッシュに、10% FBS(コーニング)、2mM L-glutamine、及び100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin(Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク)が添加されたDMEM/F−12培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離(1000rpm、5分間)を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) 、1nM レチノイン酸(RAR agonist)、2μM Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK(Promega)、10ng/ml HGF(R&D)および、10μM SB203580(p38 MAPK inhibitor、Abcam)を添加した分化培地(以下、基礎分化培地Cと記す。)を添加して細胞を懸濁した後、得られた細胞懸濁液を0.1%ゼラチン(Sigma-Aldrich)でコートしたセルカルチャーインサート(Corning、Cat.3470、メンブレン孔サイズ0.4μm)上に播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。培地には、基礎分化培地C培地を用いた。前記セルカルチャーインサートへの播種の1日後に、SB203580を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地に置換し、37℃、5% CO2条件下で培養した。
セルカルチャーインサートへの播種の2日後に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値(Ω)をMillicell ERS-2(Millipore)を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積(cm2)を掛けた値である経上皮電気抵抗(TEER、Ω・cm2)を求めた。TEER値が250以上となるタイトジャンクションを形成した細胞層を透過性試験に用いた。
インサート内およびマルチプルウェルプレート内の培地をHanks’ Balanced Salt Solution(HBSS)(no phenol red、ライフテクノロジーズ)に置換し、37℃ 5% CO2条件下で30分間乃至45分間インキュベートした。インサート内(アピカル側)の培地を被験物質を含んだHBSSに置換し、300rpmで攪拌しながら37℃条件下で培養した。
被験物質の添加120分後に、マルチプルウェルプレート内から透過した被験物質を含むHBSS100μlを採取し、同量のHBSSを添加した。マルチプルウェルプレート内の培地中の被験物質をLC−MSを用いて定量することによって、上記細胞層における被験物質の透過性を評価した。各被験物質の透過量を、アンチピリンの透過量で除して得られる値をin vitro相対的透過量として表4に示した。満期胎盤を用いた胎盤潅流法による透過性試験から得られた各被験物質の相対的透過量を、「Li, H. et al. Arch. Toxicol. 2013, 87, 1661-1669」より抜粋し、ex vivo相対的透過量(文献値)として表4に示した。
この結果から、本発明製造方法により製造した細胞を用いることによって、胎盤細胞における被験物質の細胞層透過性を検定可能であることが示された。
ヒトiPS細胞201B7株(京都大学iPS研究所より入手)を、実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
(1)本発明製造例
本発明の製造例として、MEF除去操作を行ったヒトiPS細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、20μM Y−27632を添加した基礎培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日目後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
(2)比較製造例
比較例として、MEF除去操作を行った201B7細胞の塊を、1000μlフィルターチップ(日本ジェネティクス)を用いて10回乃至20回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を1ウェルあたり約1.5×103細胞乃至約4×103細胞相当となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、MEF−CMに、10ng/ml BMP4、 1μM A83-01および0.1μM PD 173074を添加した分化培地(非特許文献2に記載)への培地交換を行って(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、同じ組成の分化培地への培地交換を行った。
(3)対照(未分化維持培養)
分化を誘導しない対照として、MEF除去操作を行った201B7細胞の塊を、1000μlフィルターチップ(日本ジェネティクス)を用いて10回乃至20回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を1ウェルあたり約1.5×103細胞乃至約4×103細胞相当となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、MEF−CMに4ng/ml bFGFを添加した培地への培地交換を行って(この時をday 0とする。)、その後3日間培養し、同じ組成の培地への培地交換を行って更に2日間培養した。培養は37℃、2% CO2条件下で行った。
(4)遺伝子発現解析
day 0から6日目(day 6)に、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III(Invitrogen)を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe(Applied biosystems)およびTaqMan Fast advanced master mix(Applied biosystems)を用いたリアルタイムPCRにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子として知られるSyncytin遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、Syncytin遺伝子のmRNA発現量およびハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCRにより測定した。Syncytin遺伝子のmRNA量をGAPDH遺伝子のmRNA量で除して得られる値をSyncytin遺伝子mRNA量の補正値とし、比較製造例((2)に記載)で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子mRNA量補正値を1として、本発明製造例((1)に記載)または対照((3)に記載)で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子mRNA量補正値を相対発現量として示した。結果を図11に示す。図11において、対照(未分化維持培養)の細胞における相対発現量を白棒グラフで、比較例の細胞における相対発現量を灰色棒グラフで、本発明製造例の細胞における相対発現量を黒棒グラフで示す。本発明製造例で得られた細胞では、比較製造例で得られた細胞と比べて、Syncytin遺伝子の相対発現量が約3.7倍増加していた(図11)。
この結果から、本発明製造方法により、ヒトiPS細胞から、合胞体栄養膜細胞を高効率に製造可能であることが示された。
ヒトiPS細胞201B7株を実施例2の(1)に記載の方法に倣って、維持培養した後、MEF除去操作に付した。
MEF除去操作を行った201B7細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1枚あたり1.5×105細胞となるように10mlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした100mmセルカルチャーディッシュ(BD Falcon)に播種し、37℃、2%CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに10ng/ml bFGF及び20μM Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、20μM Y-27632を添加した基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換して(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で2日間培養し、201B7細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得た。
上記培養で得られた細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、PBSで2回洗浄した後、2mg/ml collagenaseIV(Invitrogen)及び20μg/ml DNaseI(Roche)が添加されたPBSを当該ディッシュに添加し、37℃、5% CO2条件下で5分間インキュベートした。前記ディッシュにTrypLE Express(Life Technologies)をさらに添加し、37℃、5% CO2条件下で5分間インキュベートした。前記ディッシュに10% FBS(コーニング)、2mM L-glutamine、及び100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin(Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク)が添加されたDMEM/F−12培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離(1000rpm、5分間)を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に基礎分化培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4 、および300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist) 、1nM レチノイン酸(RAR agonist)、2μM Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK(Promega)、10ng/ml HGF(R&D)および、10μM SB203580(p38 MAPK inhibitor、Abcam)を添加した分化培地(以下、基礎分化培地Cと記す。)を添加して細胞を懸濁した後、、得られた細胞懸濁液を0.1%ゼラチン(Sigma-Aldrich)でコートしたセルカルチャーインサート(Corning、Cat.3470、メンブレン孔サイズ0.4μm)上に播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。培地には、基礎分化培地Cを用いた。前記セルカルチャーインサートへの播種の1日後に、培地を、SB203580を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地に置換し、37℃、5% CO2条件下で培養した。
セルカルチャーインサートへの播種の4日後に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値(Ω)をMillicell ERS-2(Millipore)を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積(cm2)を掛けた値である経上皮電気抵抗(TEER、Ω・cm2)を求めた。TEER値が250以上となるタイトジャンクションを形成した細胞層を透過性試験に用いた。
インサート内およびマルチプルウェルプレート内の培地をHanks’ Balanced Salt Solution(HBSS)(no phenol red、ライフテクノロジーズ)に置換し、37℃ 5% CO2条件下で30分間乃至45分間インキュベートした。インサート内(アピカル側)の培地を被験物質を含んだHBSSに置換し、300rpmで攪拌しながら37℃条件下で培養した。
被験物質の添加120分後にマルチプルウェルプレート内から被験物質を含んだHBSS100μlを採取し、同量のHBSSを添加した。マルチプルウェルプレート内の培地中の被験物質をLC−MSを用いて定量することによって、上記細胞層における被験物質の透過性を評価した。各被験物質の透過量を、アンチピリンの透過量で除して得られる値をin vitro相対的透過量として表5に示した。満期胎盤を用いた胎盤潅流法による透過性試験から得られた各被験物質の相対的透過量を、「Li, H. et al. Arch. Toxicol. 2013, 87, 1661-1669」より抜粋し、ex vivo相対的透過量(文献値)として表5に示した。
この結果から、本発明製造方法によりヒトiPS細胞から製造した細胞を用いることによって、胎盤細胞における被験物質の細胞層透過性を検定可能であることが示された。
(1)ヒトES細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造と経上皮抵抗測定
KhES−1細胞を実施例13に記載の方法に倣って、栄養膜細胞へと分化させ、セルカルチャーインサート上に再播種し、37℃、5% CO2条件下で2日間培養した。同条件で6ウェルの培養を行った。
セルカルチャーインサートへの播種の2日後に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値(Ω)をMillicell ERS-2(Millipore)を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積(cm2)を掛けた値である経上皮電気抵抗(TEER、Ω・cm2)を求めた。結果を図13Aに示す。図13Aにおいて、TEER値の標準偏差をエラーバーで示す。ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞は、453と高い抵抗値を示した。
(2)ヒト絨毛癌細胞株の培養と経上皮抵抗測定
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞(ヒューマンサイエンス振興財団より入手)を、100mmセルカルチャーディッシュ上に播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。同条件で6ウェルの培養を行った。その際の培地には、DMEM/F12培地(Sigma-Aldrich)に、10% FBS(コーニング)、2mM L-glutamine、および100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin(Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク)が添加された培地(以下、BeWo培地と記す。)を用いた。
前記BeWo細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、リン酸緩衝食塩水(PBS、Invitrogen)で2回洗浄した後、0.25%トリプシン-EDTA溶液(ナカライテスク)を当該ディッシュに添加し、37℃、5% CO2条件下で2分間インキュベートした。前記ディッシュにBeWo培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離(1000rpm、3分間)を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に、BeWo培地を添加して懸濁した。得られた細胞を、1ウェルあたり2.5×104細胞となるように200μlの培地に懸濁して、コラーゲンI(Cellmatrix type I-C、新田ゼラチン)でコートしたセルカルチャーインサート上に播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。2日ごとにBeWo培地への培地交換を行った。
セルカルチャーインサートへの播種から14日目に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値(Ω)をMillicell ERS-2(Millipore)を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積(cm2)を掛けた値である経上皮電気抵抗(TEER、Ω・cm2)を求めた。結果を図13Bに示す。図13Bにおいて、TEER値の標準偏差をエラーバーで示す。BeWo細胞のTEER値は25であり、ヒトES細胞から製造した細胞と比べ低い抵抗値であった。
(1)ヒトES細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造
MEF除去操作を行ったヒトES細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。分化培地を用いた培養の4日目(day 4)に、細胞をPBSにて2回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒドを用いて15分間固定した。
(2)ヒト絨毛癌細胞株の培養
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞(ヒューマンサイエンス振興財団より入手)を、96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)上に播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。その際の培地には、BeWo培地を用いた。播種後1日目に、細胞をPBSにて2回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒドを用いて15分間固定した。
(3)細胞観察
(1)および(2)で固定した細胞を3% BSAにより1時間乃至2時間ブロッキングした後、4μg/ml mouse anti-Mdr1 antibody(Santa Cruz Biotechnology), 2μg/ml donky anti-mouse IgG antibody Alexa 488(Life technologies)および1μg/ml Hoechst 33342 (同仁化学)を用いて免疫染色した。得られた染色試料の免疫染色像を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図14に示す。
BeWo細胞では、ヒト合胞体栄養膜細胞に発現することが知られている薬物排出トランスポーターMdr1遺伝子が発現したことを示す緑色蛍光が認められなかった(図14A)。一方、ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞では、8割程度の細胞が緑色蛍光を示した(図14B)。
(1)ヒトES細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造
MEF除去操作を行ったヒトES細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり1.5×103細胞となるように150μlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした96穴培養プレート(エッジプレート、Nunc)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、基礎培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行い、更に2日間培養した。day 5に、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。
(2)ヒト絨毛癌細胞株の培養
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞(ヒューマンサイエンス振興財団より入手)を、100mmセルカルチャーディッシュ上に播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。その際の培地には、BeWo培地を用いた。播種後3日目に、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。
(3)遺伝子発現解析
(1)および(2)で得られたtotal RNA、並びにHuman Placenta Total RNA(タカラバイオ)を、SuperScript III(Invitrogen)を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe(Applied biosystems)およびTaqMan Fast advanced master mix(Applied biosystems)を用いたリアルタイムPCRにより、薬物排出トランスポーターであるBCRP遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、BCRP遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCRにより測定した。BCRP遺伝子のmRNA量をGAPDH遺伝子のmRNA量で除して得られる値を、BCRP遺伝子mRNA量の補正値とし、Human Placenta Total RNAにおけるBCRP遺伝子mRNA量補正値を1として、ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞またはBeWo細胞におけるBCRP遺伝子mRNA量補正値を相対発現量として示した。結果を図15に示す。図15において、BeWo細胞の相対発現量を白色棒グラフで、ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞の相対発現量を灰色棒グラフで、Human Placenta Total RNAの相対発現量を黒棒グラフで示す。
BeWo細胞ではBCRP遺伝子mRNA発現量が、Human Placenta Total RNAにおけるBCRP遺伝子mRNA発現量の約0.25倍であった。一方、本発明製造例で得られた細胞ではBCRP遺伝子mRNA発現量が、Human Placenta Total RNAにおけるBCRP遺伝子mRNA発現量の約1.06倍であった。
(1)ヒトES細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造
MEF除去操作を行ったヒトES細胞の塊を、TrypLE Express(Life Technologies)を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を1ウェルあたり2.5×104細胞となるように1.5mlの培地に懸濁して、20倍希釈したマトリゲル(Growth Factor Reduced、BD Biosciences)でコートした6穴培養プレート(BD Falcon)に播種し、37℃、2% CO2条件下で維持培養した。維持培養には、MEF−CMに、10ng/ml bFGF及び20μM Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から2日後に、上記培地を、20μM Y−27632を添加した基礎培地B(10% FBS、2mM L-glutamine、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、100ng/ml BMP4、300nM PD 173074が添加されたDMEM/F12培地)に、0.1μM S26948(PPARγ agonist)、0.1μM CGP 7930(GABABR positive allosteric modulator)、10nM SR 11237(RXR agonist)および1nM レチノイン酸(RAR agonist)を添加した分化培地に置換し(この時をday 0とする。)、37℃、5% CO2条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行い、更に2日間培養した。
(2)ヒト絨毛癌細胞株の培養
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞(ヒューマンサイエンス振興財団より入手)を、6穴培養プレート(BD Falcon)上に播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。その際の培地には、BeWo培地を用いた。
(3)トランスポーター基質の取込み実験
(1)および(2)で得られた細胞を、PBSにて1回洗浄した後、0.1% DMSO(Sigma-Aldrich)または100μM ベラパミル(MDR1阻害剤、Sigma-Aldrich)が添加されたHBSS(ライフテクノロジーズ)を添加し、37℃、5% CO2条件下でインキュベートした。各条件につき3ウェルずつを用いて培養した。30分後、1μM カルセインAM(MDR1基質、同仁化学)をさらに添加した以外は同じ組成のHBSSに置換し、37℃、5% CO2条件下でインキュベートした。60分後、氷冷したPBSにて1回洗浄した後、0.2% トライトンX−100(Wako)を含む0.2N NaOH(ナカライテスク)を添加し、37℃、5% CO2条件下で一晩インキュベートし、細胞溶解液を得た。
(4)トランスポーター機能の解析
(3)で得た細胞溶解液に含まれるカルセインの蛍光強度を、蛍光プレートリーダーにより調べた。(3)で得た細胞溶解液のタンパク濃度を、BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)により調べた。上記細胞溶解液のカルセイン蛍光強度の値を当該細胞溶解液のタンパク濃度で除して得られる値を、カルセイン蛍光強度の補正値とし、DMSO添加条件でのカルセイン蛍光強度の補正値を1として、ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞またはBeWo細胞におけるカルセイン蛍光強度の補正値を相対値として示した。結果を図16に示す。相対値の標準偏差をエラーバーで示す。DMSO添加例の蛍光強度相対値に対して統計的に有意に差がある蛍光強度相対値にアスタリスクを付す(***はP値0.001未満を意味する)。BeWo細胞では、DMSO添加例と比べて、ベラパミル添加例で蛍光強度相対値が約1.5倍増加したが有意な変化ではなかった(図16A)。ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞では、DMSO添加例と比べて、ベラパミル添加例で蛍光強度相対値が約2.7倍有意に増加した(図16B)。
非蛍光性のカルセインAMは細胞の膜を容易に透過し、細胞質で細胞内エステラーゼにより膜不透過で緑色蛍光を示すカルセインへと加水分解される。カルセインはMDR1基質であり、MDR1により細胞外へと排出されている。MDR1阻害剤であるベラパミルによって細胞内カルセイン濃度が増加することは、細胞膜上に機能的なMDR1が発現していることを意味することから、実施例17からヒト絨毛癌細胞株と比べて、ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞が機能的なトランスポーターをより多く持つことが示唆された。
実施例14から17の結果から、本発明製造法によりヒトES細胞から製造した細胞を用いることによって、ヒト絨毛癌細胞株と比べて、被験物質の胎盤細胞層透過性をより精緻に検定可能であることが示唆された。
Claims (19)
- ヒト多能性幹細胞を、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工栄養膜細胞の製造方法。 - ヒト多能性幹細胞を、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞の製造方法。 - 培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に開始される、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前から、GCM1 mRNAが発現する細胞が出現した後まで行われる、請求項1から3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 培養中の細胞と、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上との前記接触が、BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地中での培養の全期間にわたって行われる、請求項1から4のいずれか1項に記載の製造方法。
- BMPシグナル伝達活性化物質を含む培地が、BMPシグナル伝達活性化物質を含みFGFシグナル伝達活性化物質を含まない培地である請求項1から5のいずれか1項に記載の製造方法。
- BMPシグナル伝達活性化物質が、Bone Morphogenetic Protein 4である請求項1から6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に、培養中の細胞にFGFシグナル伝達阻害物質をさらに接触させる、請求項1から7のいずれか1項に記載の製造方法。
- γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上が、γアミノ酪酸B受容体活性化物質と、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とである、請求項1から8のいずれか1項に記載の製造方法。
- γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上が、γアミノ酪酸B受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドX受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質である、請求項1から9のいずれか1項に記載の製造方法。
- ヒト多能性幹細胞が、単一に分散された後、維持培養されたヒト多能性幹細胞である、請求項1から10のいずれか1項に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、請求項1から11のいずれか1項に記載の製造方法。
- 人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞であって、細胞層を形成する場合の経上皮電気抵抗値が250Ω・cm 2 以上である人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞。
- 請求項13に記載の人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を含有するキット。
- 請求項13に記載の人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質の該細胞に対する透過性を検定することを含む、被験物質の細胞層透過性検定方法。
- 請求項13に記載の人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、毒性または薬効評価用試薬としての使用。
- 請求項13に記載の人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、被験物質の毒性または薬効評価方法。
- 請求項13に記載の人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を用いた、当該細胞が関与する物質輸送またはホルモン分泌を調べる方法。
- 請求項13に記載の人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、物質輸送またはホルモン分泌を調べる試薬としての使用。
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