WO2020250438A1 - 胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞、およびその製造方法 - Google Patents

胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞、およびその製造方法 Download PDF

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medium
cell
placenta
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有馬　隆博
記緒 小林
寛明 岡江
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国立大学法人東北大学
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Definitions

  • the present invention relates to cells having the ability to differentiate into cells constituting the placenta, and a method for producing the same.
  • Trophoblast tissue is the main constituent of placental tissue.
  • Trophoblast stem cells are considered to be very useful for elucidating the differentiation control mechanism in trophoblast cells. Therefore, it is desired to establish a TS cell line that can be subcultured while maintaining an undifferentiated state.
  • Patent Document 1 The present inventors have developed a method for recovering CD49f antibody-positive cells from a cell suspension obtained from mammalian placental tissue and inducing differentiation into cells having characteristics similar to TS cells (TS-like cells).
  • Patent Document 1 the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, it is necessary to collect a cell suspension from placental tissue.
  • Non-Patent Document 2 attempts have been made to induce the differentiation of TS-like cells from ES cells (Non-Patent Document 2), but from the analysis results of gene expression patterns, DNA methylation patterns, etc., although they are similar to TS cells. Often not.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing TS-like cells from pluripotent stem cells and TS-like cells produced by the production method.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for producing cells capable of differentiating into cells constituting the placenta which include the following steps: (A) A step of culturing mammalian pluripotent stem cells in a medium containing bone-forming factor 4 (BMP4); and (b) Inhibiting growth factors and ROCK of cells obtained after the step (a). The step of culturing in a medium containing the agent.
  • BMP4 bone-forming factor 4
  • a method for producing cells capable of differentiating into cells constituting the placenta which include the following steps: (A') Introducing at least one gene selected from the group consisting of GATA2, GATA3, and TFAP2A into mammalian pluripotent stem cells; and (b) obtained after the step (a'). A step of culturing the cells in a medium containing a growth factor and a ROCK inhibitor. [8] The cells constituting the placenta according to [6] or [7], wherein the medium further contains at least one selected from the group consisting of an ALK5 inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor in the step (b). A method for producing cells having the ability to differentiate into.
  • a method for producing TS-like cells from pluripotent stem cells and TS-like cells produced by the production method are provided.
  • Optical micrographs of iPS cells and TS-like cells derived from iPS cells are shown.
  • the results of gene expression analysis of TS-like cells derived from iPS cells by introducing the GATA2 gene, GATA3 gene, or TFAP2A gene are shown.
  • the expression level of each gene in iPS cells was set to 1, the expression levels of TS cells and TS-like cells were corrected, and log2 (expression level) was calculated.
  • An immunostaining photograph of TS-like cells (ES-TS) induced by treatment with bone morphogenetic protein 4 (BMP4) of ES cells is shown.
  • the antigen of the antibody used for immunostaining is shown on the left side of the photograph.
  • ES-TS TS-like cells
  • ES-BMP4 TS-like cells
  • ES-BMP4 results of comparing the gene expression of TS-like cells (ES-TS) induced by BMP4 treatment of ES cells with TS cells, ES cells, and cells obtained by subjecting ES cells to conventional BMP4 treatment (ES-BMP4) are shown.
  • ES-BMP4 results of comparing the gene expression of TS-like cells (ES-TS) induced by BMP4 treatment of ES cells with TS cells, ES cells, and cells obtained by subjecting ES cells to conventional BMP4 treatment.
  • ES-BMP4 The correlation of gene expression in TS-like cells (ES-TS) induced by BMP4 treatment of ES cells, TS cells, ES cells, and cells obtained by subjecting ES cells to conventional BMP4 treatment
  • ES-TS DNA methylation patterns in TS-like cells
  • ES-BMP4 conventional BMP4 treatment
  • ES-BMP4 conventional BMP4 induced by BMP4 treatment of ES cells
  • the analysis result is shown.
  • the results of immunostaining with an anti-HLA-G antibody in the cells differentiated from TS-like cells (ES-TS) induced by BMP4 treatment of ES cells to syncytiotrophoblastic membrane cells (EVT) are shown.
  • ES-TS TS-like cells
  • EVT extravelulotrophic membrane cells
  • ES-TS_ST represents a cell differentiated from a TS-like cell into ST
  • TS_ST represents a cell differentiated from a TS cell into EVT.
  • the gene expression analysis results of BRDT and SOHLH2 in TS-like cells (ES-TS) induced by BMP4 treatment of ES cells, and TS cells and ES cells are shown.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably and refer to nucleotide polymers in which nucleotides are bound by phosphodiester bonds.
  • the "polynucleotide” and “nucleic acid” may be DNA, RNA, or may be composed of a combination of DNA and RNA.
  • polynucleotide and “nucleotide” may be polymers of natural nucleotides, and are at least one portion of a natural nucleotide and an unnatural nucleotide (an analog of a natural nucleotide, a base moiety, a sugar moiety, and a phosphate moiety. It may be a polymer with a nucleotide modified with (for example, a phosphorothioate skeleton) or a polymer of an unnatural nucleotide.
  • the base sequence of "polynucleotide” or “nucleic acid” is described by a generally accepted one-letter code unless otherwise specified.
  • nucleotide residues constituting the "polynucleotide” or “nucleic acid” may be simply described by adenine, thymine, cytosine, guanine, uracil, etc., or a one-letter code thereof.
  • the term "gene” refers to a polynucleotide that contains at least one open reading frame that encodes a particular protein.
  • the gene can contain both exons and introns.
  • polypeptide In the present specification, the terms “polypeptide”, “peptide” and “protein” are used interchangeably and refer to a polymer of amino acids bound by an amide bond.
  • the "polypeptide”, “peptide” or “protein” may be a polymer of natural amino acids, or may be a polymer of natural amino acids and unnatural amino acids (chemical analogs of natural amino acids, modified derivatives, etc.). It may be a polymer of unnatural amino acids. Unless otherwise specified, the amino acid sequence is described from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • the term “functionally linked” with respect to a polynucleotide means that the first base sequence is located sufficiently close to the second base sequence and the first base sequence is the second base sequence or It means that it can affect the controlled region of the second base sequence.
  • functionally ligating a polynucleotide to a promoter means that the polynucleotide is ligated to be expressed under the control of the promoter.
  • the term “expressible state” refers to a state in which the polynucleotide can be transcribed in the intracellular into which the polynucleotide has been introduced.
  • expression vector refers to a vector containing a target polynucleotide, which comprises a system that makes the target polynucleotide expressable in the cell into which the vector has been introduced.
  • the cells are derived from mammalian pluripotent stem cells and have the ability to differentiate into the cells constituting the placenta, which are negative for BRDT and positive for TP63.
  • the cells of this embodiment are TS-like cells having characteristics similar to TS cells. Like TS cells, TS-like cells have the ability to differentiate into cells that make up the placenta. Examples of cells constituting the placenta include extravillous cytotrophoblast (EVT) and syncytiotrophoblast (ST).
  • EVT extravillous cytotrophoblast
  • ST syncytiotrophoblast
  • Whether or not a cell has the ability to differentiate into EVT can be determined by culturing the cell under the conditions used as a condition for inducing differentiation into EVT and confirming whether or not the cell has differentiated into EVT.
  • Examples of the conditions for inducing differentiation into EVT include the conditions described in Examples described later.
  • HLA-G is a marker for EVT, and its expression is upregulated by differentiation of TS cells into EVT. Therefore, if the expression level of HLA-G is increased in the cells after culturing under the above conditions as compared with the cells before culturing under the above conditions, it is determined that the cells have differentiated into EVT. be able to.
  • Examples of the HLA-G include those registered under the GenBank accession number NM_001363567.1. Or NM_002127.5.
  • Whether or not a cell has the ability to differentiate into ST can be determined by culturing the cell under the conditions used as a condition for inducing differentiation into ST and confirming whether or not the cell has differentiated into ST.
  • Examples of the conditions for inducing differentiation into ST include the conditions described in Examples described later.
  • differentiation into ST can be induced as follows. Cells are seeded and cultured on a Collagen IV (Col IV) coated plate containing ST medium (see Examples). On the 3rd day after seeding, the cells are replaced with fresh ST medium and the cells are cultured for another 3 days.
  • CG ⁇ also known as CGB3 (chorionic gonadotropin subunit beta 3)
  • CGB3 chorionic gonadotropin subunit beta 3
  • CG ⁇ is a marker for ST, and its expression is upregulated by differentiation from TS cells to ST. Therefore, if the expression level of CG ⁇ is increased in the cells after culturing under the above conditions as compared with the cells before culturing under the above conditions, it can be determined that the cells have differentiated into ST. it can.
  • Examples of the human CG ⁇ NCBI Gene ID: 1082) include those registered under GenBank accession number NM_0007373.
  • the cells of the present embodiment are cells having characteristics similar to TS cells, but can be distinguished from natural TS cells in that they are negative for BRDT.
  • BRDT bromodomain testis associated
  • PEST sequence cluster of proline residue, glutamate residue, serine residue and threonine residue
  • NM_00124285.2 GenBank accession number NM_00124285.2, NM_00124286.2, NM_00124280.2, NM_00124288.2, NM_0012428100.2, NM_001726.4, or NM_207189.3.
  • the term "negative” as used with respect to a gene or protein means that the protein or protein encoded by the gene is substantially undetectable. “Substantially undetectable” means that it is not detected when ordinary protein detection means are used. As a usual protein detection means, for example, immunostaining using an antibody against the protein can be mentioned. Further, the mRNA may be detected instead of the protein, and if the mRNA is not substantially detected, the protein translated from the mRNA may be determined to be "negative". A commonly used method can be used for the measurement of mRNA. For example, examples of the method for measuring mRNA include a method using a next-generation sequencer, a quantitative real-time PCR method, and the like.
  • FPKM fragments per kilobase of exon per million reads mapped
  • FPKM 10 9 ⁇ X t / (l t N) [In the formula, X t indicates the number of short reads mapped to the transcript t. l t indicates the length (bp) of the transcript t. N indicates the total number of mapped short reads].
  • the term “positive” with respect to a gene or protein means that the protein or protein encoded by the gene is substantially detected.
  • substantially detected is meant that it can be detected using conventional protein detection means (eg, immunostaining).
  • the cells of this embodiment are cells derived from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells are cells having pluripotent differentiation, such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and stem cells thereof. Includes cells with pluripotent differentiation derived from.
  • the method for producing pluripotent stem cells is not particularly limited, and known methods can be used.
  • Cell lines of ES cells or iPS cells are also available from cell banks such as RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC).
  • the pluripotent stem cells are preferably ES cells or iPS cells.
  • the cells of the present embodiment are differentiated from pluripotent stem cells into TS-like cells by the method described in "[Method for producing cells having the ability to differentiate into cells constituting the placenta (TS-like cells)]" described later. It is an induced cell.
  • the pluripotent stem cell is a mammalian pluripotent stem cell.
  • the mammal is not particularly limited, and examples thereof include primates, rodents, and meats. Mammals are preferably primates. In addition, examples of primates include humans, chimpanzees, rhesus monkeys, marmosets, and the like, and humans are preferable.
  • the cells of the present embodiment have a characteristic similar to that of TS cells, that is, in addition to having the ability to differentiate into cells constituting the placenta, they are positive for TP63.
  • pluripotent stem cells and conventional TS-like cells are negative for TP63. Therefore, the cells of this embodiment are similar to TS cells in that they are TP63 positive and are distinguished from pluripotent stem cells and conventional TS-like cells.
  • Examples of the human TP63 include GenBank accession numbers NM_001114978.1. Examples thereof include those registered in NM_001329148.1, NM_0013929149.1, NM_00139291500.1, NM_001322964.1 or NM_003722.5.
  • the cells of this embodiment are preferably negative at least one selected from the group consisting of Oct4, Nanog, and Sox2.
  • the cells of this embodiment are more preferably negative for at least two of Oct4, Nanog, and Sox2, and even more preferably all three.
  • These genes are known as undifferentiated markers and are positive markers in pluripotent stem cells.
  • the cells of this embodiment can be distinguished from the pluripotent stem cells from which the cells of this embodiment are derived in that these genes are negative.
  • Examples of human Oct4 include those registered under GenBank accession numbers NM_001173531.2, NM_001285986.1, NM_0012859987.1, NM_002701.6, NM_203289.5, or Z11898. ..
  • Examples of the human Nanog include those registered with GenBank accession numbers NM_001297698.1, NM_024865.4, or AB093576.
  • Examples of human Sox2 include those registered under GenBank accession number NM_003106.4.
  • the cells of this embodiment are preferably positive at least one selected from the group consisting of GATA2, GATA3 and TFAP2A. In the cells of this embodiment, it is more preferable that two or more of GATA2, GATA3 and TFAP2A are positive, and it is further preferable that all three are positive.
  • These genes are markers for TS cells.
  • the fact that the cells of the present embodiment are positive for TP63 is an index that has acquired the same function as that of natural TS cells represented by the ability to differentiate into EVT and ST, and its origin. It is a feature that distinguishes it from the pluripotent stem cells that have become.
  • Examples of human GATA2 include those registered under GenBank accession numbers NM_00114566.1, NM_00114566.21, or NM_032638.4.
  • Examples of human GATA3 include those registered under GenBank accession number NM_0010022952 or NM_002051.2.
  • Examples of the human TFAP2A include those registered under GenBank accession numbers NM_001032280.2, NM_001042425.1, or NM_003220.3.
  • the cells of this embodiment are preferably positive for genes such as TFAP2C in addition to GATA2 and GATA3.
  • TFAP2C is also a marker for TS cells.
  • Examples of the human TFAP2C NCBI Gene ID: 7022
  • the cells of this embodiment are preferably SOHLH2 negative (or log 2 (FPKM + 1) ⁇ 1).
  • Examples of human SOHLH2 include those registered under GenBank accession number NM_001282147.1 or NM_017826.3.
  • the cells of the present embodiment preferably have a methylation rate of genomic DNA similar to that of TS cells. More specifically, the methylation rate of genomic DNA is preferably 60% or less, more preferably 55% or less, further preferably 50% or less, and 47% or less of the entire genome. Is particularly preferable. In pluripotent stem cells, the rate of methylation of genomic DNA is about 81% of the entire genome. On the other hand, in TS cells, the methylation rate of genomic DNA is about 45% of the entire genome. Therefore, the rate of methylation of genomic DNA is an indicator of similarity to TS cells. The lower limit of the methylation rate of genomic DNA is, for example, preferably 35% or more, more preferably 40% or more of the entire genome.
  • the range of the methylation rate of the genomic DNA is, for example, preferably 35 to 60%, more preferably 40 to 55%, and even more preferably 40 to 47% of the entire genome.
  • the rate of methylation of cellular genomic DNA can be measured by known methods. Such methods include, for example, Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS).
  • the ratio of DNA methylation in the promoter region of the ELF5 gene (chr11: 34513753-34514270 (transcription start point: chr11: 34513800)) is preferably 5% or less, preferably 3% or less. More preferably, it is more preferably 2% or less.
  • the rate of DNA methylation in the promoter region of the ELF5 gene is about 76%.
  • the rate of DNA methylation in the promoter region of the ELF5 gene is about 1.7% of the entire genome. Therefore, the rate of DNA methylation in the promoter region of the ELF5 gene is an indicator of similarity to TS cells.
  • the lower limit of the ratio of DNA methylation in the promoter region of the ELF5 gene is, for example, more than 0%, more preferably 0.5% or more, and even more preferably 0.8% or more.
  • the range of the ratio of DNA methylation in the promoter region of the ELF5 gene is, for example, preferably more than 0% and 5% or less, more preferably 0.5 to 3%, and 0.8 to 2%. It is more preferable to have.
  • Examples of the human ELF5 include those registered under GenBank accession numbers NM_001243080.1, NM_001243081.1, NM_001422.3, or NM_198381.1.
  • the ratio of DNA methylation in the promoter region of the DNMT1 gene is preferably 20% or less, preferably 15% or less. More preferably, it is more preferably 10% or less.
  • the rate of DNA methylation in the promoter region of the DNMT1 gene is about 40%. Therefore, the rate of DNA methylation in the promoter region of the DNMT1 gene is an index for distinguishing between natural TS cells and cells of the present embodiment.
  • the lower limit of the ratio of DNA methylation in the promoter region of the DNMT1 gene is, for example, 1% or more, more preferably 3% or more, still more preferably 5% or more.
  • the range of the ratio of DNA methylation in the promoter region of the DNMT1 gene is, for example, preferably 1 to 20%, more preferably 3 to 20%, still more preferably 5 to 15%. It is particularly preferably 5 to 10%.
  • Examples of the human DNMT1 include those registered under GenBank accession numbers NM_001130823.3., NM_001318730.1, NM_0013187731, or NM_001379.3.
  • the ratio of DNA methylation in the promoter region of the ZFAT gene is preferably 50% or more, preferably 60% or more. More preferably, it is more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • the rate of DNA methylation in the promoter region of the ZFAT gene is about 40%. Therefore, the rate of DNA methylation in the promoter region of the ZFAT gene is an index for distinguishing between natural TS cells and cells of the present embodiment.
  • the upper limit of the ratio of DNA methylation in the promoter region of the ZFAT gene is, for example, 95% or less, more preferably 93% or less.
  • the range of the ratio of DNA methylation in the promoter region of the ZFAT gene is, for example, preferably 50 to 95%, more preferably 60 to 95%, still more preferably 70 to 95%. It is particularly preferably 80 to 93%.
  • Examples of the human ZFAT include those registered under GenBank accession numbers NM_0010299393.3, NM_0011670583.2., NM_001174157.1, NM_001174158.1, NM_001289394.1, or NM_020863.4. Can be mentioned.
  • the ratio of DNA methylation in the promoter region of the ELF5 gene, the promoter region of the DNMT1 gene, and the promoter region of the ZFAT gene can be measured by a known method.
  • Such methods include, for example, bisulfite sequencing and whole genome bisulfite sequencing (WGBS).
  • the present invention provides a method for producing cells capable of differentiating into cells constituting the placenta.
  • the cell obtained by the production method of the present embodiment is the TS-like cell of the above-described embodiment.
  • the manufacturing method of this embodiment includes the following steps: (A) The step of culturing mammalian pluripotent stem cells in a medium containing bone-forming factor 4; and (b) the cells obtained after the step (a) containing a growth factor and a ROCK inhibitor. The step of culturing in a medium.
  • Step (a) is a step of culturing mammalian pluripotent stem cells in a medium containing bone-forming factor 4 (BMP4).
  • BMP4 bone-forming factor 4
  • Examples of the mammalian pluripotent stem cells used in this step include those similar to those exemplified in the above-mentioned "[Cells capable of differentiating into cells constituting the placenta (TS-like cells)]". Mammals are preferably primates, preferably humans. Pluripotent stem cells are preferably ES cells or iPS cells.
  • the medium used in this step is a medium containing BMP4.
  • the medium can be prepared, for example, by adding BMP4 to a basal medium that is generally used for culturing animal cells.
  • the basal medium include Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, DMEM / F12 medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, and ⁇ MEM medium. , RPMI1640 medium, Fisher's medium, and a mixed medium thereof.
  • DMEM / F12 is mentioned as a preferable basal medium.
  • the concentration of BMP4 in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 100 ng / mL, preferably 20 to 80 ng / mL, more preferably 30 to 70 ng / mL, and further 40 to 60 ng / mL. preferable.
  • BMP4 In addition to BMP4, other components may be added to the basal medium, if necessary.
  • Other ingredients include, for example, albumin, transferase, sodium selenate, ITS-X (Invitrogen), Knockout Serum Replacement (KSR); FBS serum substitute during ES cell culture), N2 supplements. (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol and one or more serum substitutes.
  • Other preferred components include KSR, Glutamax, non-essential amino acids, 2-mercaptomethanol, and antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.).
  • Specific examples of the preferred medium include the BMP4 medium described in Examples.
  • the culture temperature in this step can be a temperature generally used for culturing animal cells.
  • the culture temperature can be, for example, 32 to 40 ° C, preferably 35 to 38 ° C.
  • the CO 2 concentration in the culture is not particularly limited, but is preferably about 2 to 5%, more preferably 5%.
  • the culture time in this step is not particularly limited, but can be, for example, 1 to 5 days (for example, 24-120 hours), preferably 2 to 4 days (for example, 48 to 96 hours), and 3 days (for example, 50 hours). ⁇ 80 hours) is more preferable.
  • the medium is preferably changed every 20 to 30 hours (for example, 24 hours).
  • Step (b) is a step of culturing the cells obtained after the step (a) in a medium containing a growth factor and a ROCK inhibitor.
  • the medium used in this step is a medium containing a growth factor and a ROCK inhibitor.
  • the medium can be prepared, for example, by adding a growth factor and a ROCK inhibitor to a basal medium, which is a medium generally used for culturing animal cells.
  • a basal medium which is a medium generally used for culturing animal cells.
  • the basal medium include those similar to those mentioned in the step (a).
  • DMEM / F12 is mentioned as a preferable basal medium.
  • the growth factor is not particularly limited, and examples thereof include epidermal growth factor (EGF), insulin, transforming growth factor (TGF), and the like. As these growth factors, various commercially available ones can be used. Among them, EGF is preferable as the growth factor.
  • the concentration of the growth factor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 100 ng / mL, preferably 20 to 80 ng / mL, more preferably 30 to 70 ng / mL, and further 40 to 60 ng / mL. preferable.
  • Examples thereof include antisense nucleic acids against ROCK, siRNA, dominant negative mutants, and expression vectors thereof.
  • Y27632 ((R)-(+)-trans-N- (4-pyridyl)- 4- (1-aminoethyl) -cyclohexanecarboxamide ⁇ 2HCl ⁇ H 2 O) and the like.
  • ROCK inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination. It is preferable to use Y27632 as the ROCK inhibitor.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 50 ⁇ M, preferably 1 to 20 ⁇ M, more preferably 1 to 10 ⁇ M, still more preferably 3 to 8 ⁇ M.
  • the medium used in this step preferably contains at least one selected from the group consisting of ALK5 inhibitors and GSK3 ⁇ inhibitors, in addition to growth factors and ROCK inhibitors.
  • the ALK5 inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of ALK5.
  • Examples of the ALK5 inhibitor include 4- [4- (1,3-benzodioxole-5-yl) -5- (2-pyridyl) -1H-imidazol-2-yl] benzamide or a salt thereof. Can be mentioned.
  • A83-01 (3- (6-Methylpyridin-2-yl) -N-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide), 2- (3- (6-methylpyridine-2-yl))
  • Low molecular weight inhibitors such as -1H-pyrazole-4-yl) -1,5-naphthalene, Wnt3a / BIO, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604, SB-505124, and pyrimidine derivatives.
  • antisense nucleic acids against ALK5, siRNA, dominant negative mutants, expression vectors thereof and the like can be mentioned.
  • Examples of commercially available products of 4- [4- (1,3-benzodioxole-5-yl) -5- (2-pyridyl) -1H-imidazol-2-yl] benzamide or a salt thereof include SB431542 and the like. Be done.
  • One type of ALK5 inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • SB431542 or A83-01 is preferably used, and both SB431542 and A83-01 are preferably used.
  • the concentration of the ALK5 inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 20 ⁇ M, preferably 0.2 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 5 ⁇ M, and 0.5 to 3 ⁇ M.
  • the concentration of SB431542 in the medium can be, for example, 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 0.2 to 5 ⁇ M, more preferably 0.5 to 3 ⁇ M, and 0. 7 to 2 ⁇ M is more preferable.
  • the concentration of A83-01 in the medium can be, for example, 0.1 to 5 ⁇ M, preferably 0.2 to 3 ⁇ M, more preferably 0.3 to 2 ⁇ M. It is preferable, and 0.3 to 1 ⁇ M is more preferable.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of GSK3 ⁇ .
  • Examples of the GSK3 ⁇ inhibitor include 6-[[2-[[4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) -2-pyrimidinyl] amino] ethyl].
  • Amino] Nicothinonitrile and the like can be mentioned.
  • Examples thereof include antisense nucleic acids against GSK3 ⁇ , siRNAs, dominant negative variants, and expression vectors thereof.
  • 6-[[2-[[4- (2,4-dichlorophenyl)- Examples of commercially available products of 5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) -2-pyrimidinyl] amino] ethyl] amino] nicotinonitrile include CHIR99021 and the like.
  • One GSK3 ⁇ inhibitor is used alone. It may be used in combination of two or more kinds. As the GSK3 ⁇ inhibitor, it is preferable to use CHIR99021.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 20 ⁇ M, preferably 0.2 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 5 ⁇ M, and 0.5 to 3 ⁇ M. Is even more preferable.
  • the medium used in this step may further contain a histone deacetylase (HDAC) inhibitor in addition to the above-mentioned components.
  • HDAC inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of HDAC.
  • HDAC inhibitors include small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), tricostatin A, sodium butyrate, MC1293, and M344.
  • VPA histone deacetylase
  • antisense nucleic acids against HDAC, siRNA, dominant negative mutants, expression vectors thereof and the like can be mentioned.
  • One type of HDAC inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination. It is preferable to use VPA as the HDAC inhibitor.
  • the concentration of the HDAC inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.01 to 10 mM, preferably 0.1 to 5 mM, more preferably 0.5 to 2 mM, and 0.5 to 1 mM. Is even more preferable.
  • other components may be added to the basal medium, if necessary.
  • Other components include, for example, serum (such as fetal bovine serum (FBS)) or albumin, transferase, sodium selenate, ITS-X (Invitrogen), knockout serum replenishment (KSR); ES cells.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin transferase, sodium selenate, ITS-X (Invitrogen), knockout serum replenishment (KSR); ES cells.
  • FBS serum substitute during cell culture N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, etc.
  • FBS fetal bovine serum
  • B27 supplement Invitrogen
  • Other preferred components include FBS, bovine serum albumin (BSA), ITS-X, L-ascorbic acid, 2-mercaptomethanol, and antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.).
  • Specific examples of the preferred medium include the TS medium described in Examples.
  • the culture temperature in this step can be a temperature generally used for culturing animal cells.
  • the culture temperature can be, for example, 32 to 40 ° C, preferably 35 to 38 ° C.
  • the CO 2 concentration in the culture is not particularly limited, but is preferably about 2 to 5%, more preferably 5%.
  • the culture time in this step is not particularly limited, but can be, for example, 7 days or more, preferably 14 days or more, more preferably 21 days or more, still more preferably 28 days or more.
  • the upper limit of the culture time is not particularly limited.
  • the cells after the step (a) can be detached from the culture plate using trypsin or a trypsin substitute (such as TrypLE) and seeded on the culture plate containing the medium in this step.
  • the manufacturing method of this embodiment includes the following steps: (A') Introducing at least one gene selected from the group consisting of GATA2, GATA3, and TFAP2A into mammalian pluripotent stem cells; and (b) obtained after the step (a'). A step of culturing the cells in a medium containing a growth factor and a ROCK inhibitor.
  • Step (a') is a step of introducing at least one gene selected from the group consisting of GATA2, GATA3, and TFAP2A into mammalian pluripotent stem cells.
  • Examples of the mammalian pluripotent stem cells used in this step include those similar to those exemplified in the above-mentioned "[Cells capable of differentiating into cells constituting the placenta (TS-like cells)]". Mammals are preferably primates, preferably humans. Pluripotent stem cells are preferably ES cells or iPS cells.
  • the gene to be introduced into mammalian pluripotent stem cells is at least one gene selected from the group consisting of GATA2, GATA3, and TFAP2A.
  • GATA2, GATA3, and TFAP2A One of these genes may be introduced alone, or two or more of these genes may be introduced in combination.
  • one of the genes of GATA2, GATA3, and TFAP2A is introduced.
  • the organism from which the GATA2 gene, GATA3 gene, and TFAP2A gene are derived is preferably the same as the organism from which the pluripotent stem cells are derived.
  • the human GATA2 gene when human pluripotent stem cells are used, the human GATA2 gene, It is preferable to use the GATA3 gene and the TFAP2A gene.
  • the base sequences of the human GATA2 gene, GATA3 gene, and TFAP2A gene include those described in the above-mentioned "[Cells capable of differentiating into cells constituting the placenta (TS-like cells)]".
  • the nucleotide sequence information of these genes possessed by other mammals can be obtained from a known database such as GenBank.
  • the GATA2, GATA3, and TFAP2A genes are not limited to wild-type, but contain mutations (either deletion, substitution, insertion, or addition) as long as they have the ability to induce TS-like cells. There may be.
  • "Inducibility to TS-like cells” means that the gene is introduced into pluripotent stem cells and the pluripotent stem cells are subjected to the above-mentioned step (b) to obtain the above-mentioned "[Differentiation into cells constituting the placenta".
  • a capable cell (TS-like cell)]] means a function of inducing differentiation into a TS-like cell having the properties described in.
  • GATA2 gene examples include the following (A) to (G).
  • GATA2 gene examples include the following (A) to (G).
  • (B) Wild-type GATA2 protein, GATA3 protein, or TFAP2A protein eg, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (GATA2), SEQ ID NO: 2 (GATA3), or SEQ ID NO: 6 (TFAP2A)).
  • C In the amino acid sequence of wild-type GATA2 protein, GATA3 protein, or TFAP2A protein (eg, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (GATA2), SEQ ID NO: 2 (GATA3), or SEQ ID NO: 6 (TFAP2A)).
  • a polynucleotide that encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated and has an ability to induce TS-like cells (D) With the amino acid sequence of wild-type GATA2 protein, GATA3 protein, or TFAP2A protein (eg, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (GATA2), SEQ ID NO: 2 (GATA3), or SEQ ID NO: 6 (TFAP2A)).
  • GATA2 wild-type GATA2 protein
  • GATA3 protein eg, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (GATA2), SEQ ID NO: 2 (GATA3), or SEQ ID NO: 6 (TFAP2A)
  • E Wild-type GATA2 gene, GATA3 gene, or TFAP2A gene (eg, a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (GATA2), SEQ ID NO: 1 (GATA3), or SEQ ID NO: 5 (TFAP2A))
  • GATA2 GATA2
  • GATA3 GATA3
  • TFAP2A SEQ ID NO: 5
  • Wild-type GATA2 gene, GATA3 gene, or TFAP2A gene eg, a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (GATA2), SEQ ID NO: 1 (GATA3), or SEQ ID NO: 5 (TFAP2A)
  • GATA2A a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (GATA2), SEQ ID NO: 1 (GATA3), or SEQ ID NO: 5 (TFAP2A)
  • GATA2A a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 70% or more sequence identity and having an ability to induce TS-like cells.
  • G Wild-type GATA2 gene, GATA3 gene, or TFAP2A gene (eg, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (GATA2), SEQ ID NO: 1 (GATA3), or SEQ ID NO: 5 (TFAP2A))
  • GATA2 GATA2 gene
  • GATA3 GATA3 gene
  • TFAP2A SEQ ID NO: 5
  • the "mutation” may be any of deletion, substitution, addition, and insertion, and may be a combination thereof.
  • the above (C) and “plurality” are not particularly limited, but for example, 2 to 30 are exemplified, 2 to 20 are preferable, 2 to 10 are more preferable, and 2 to 5 are further preferable. Three or three are particularly preferred.
  • the "plurality” is not particularly limited, but for example, 2 to 60 are exemplified, 2 to 50 are preferable, 2 to 40 or 2 to 30 are more preferable, and 2 to 20 are preferable.
  • the number or 2 to 10 is more preferable, and 2 to 5 or 2 or 3 is particularly preferable.
  • sequence identity is not particularly limited as long as it is 70% or more, but it is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and 95% or more. It is more preferable to have.
  • sequence identity between amino acid sequences or nucleotide sequences two amino acid sequences or nucleotide sequences are juxtaposed with a gap in the portion corresponding to insertion and deletion so that the corresponding amino acids or nucleotides match most. , Determined as the ratio of matching amino acids or nucleotides to the entire amino acid sequence or nucleotide sequence excluding gaps in the resulting alignment.
  • sequence identity between amino acid sequences or nucleotide sequences can be determined by using various homology search software known in the art.
  • the value of sequence identity of an amino acid sequence or nucleotide sequence can be obtained by calculation based on the alignment obtained by the known homology search software BLASTP.
  • the “stringent condition” includes, for example, the condition described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). For example, 6 ⁇ SSC (composition of 20 ⁇ SSC: 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution (composition of 100 ⁇ Denhardt solution: 2% by mass bovine serum albumin, 2% by mass). Incubate at 42-70 ° C.
  • hybridization buffer consisting of Ficol (2% by weight polyvinylpyrrolidone), 0.5% by weight SDS, 0.1 mg / mL salmon sperm DNA, and 50% formamide.
  • the conditions for hybridization are exemplified by performing the above.
  • the washing buffer used for washing after incubation include a 1 ⁇ SSC solution containing 0.1% by mass SDS, and more preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1% by mass SDS.
  • the degenerate codons used are those having a high codon usage frequency in the mammalian pluripotent stem cells to be used.
  • codons frequently used in human cells are used. That is, it is preferably optimized for human codons.
  • the method for introducing the gene into pluripotent stem cells is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the gene can be cloned into an expression vector that can be expressed in a target pluripotent stem cell and introduced into the pluripotent stem cell.
  • the expression vector preferably contains a promoter that controls the expression of the gene in addition to the gene.
  • the promoter is located upstream of the gene so as to control the expression of the gene, and the gene is functionally linked to the promoter.
  • promoters include SR ⁇ promoter, SV40 early promoter, retrovirus LTR, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (laus sarcoma virus) promoter, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, EF1 ⁇ promoter, and metallothioneine. Examples include promoters and heat shock promoters.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • a CAG promoter including a cytomegalovirus enhancer, a chicken ⁇ -actin promoter and a poly A signal site of the ⁇ -globin gene
  • CAG promoter including a cytomegalovirus enhancer, a chicken ⁇ -actin promoter and a poly A signal site of the ⁇ -globin gene
  • the expression vector may optionally contain an enhancer, a poly A addition signal, a marker gene, a replication origin, a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication, and the like.
  • the above-mentioned marker gene refers to a gene that enables selection and selection of cells by introducing the marker gene into cells.
  • Specific examples of the above marker genes include drug resistance genes, fluorescent protein genes, luciferase genes, color-developing enzyme genes and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Specific examples of the above drug resistance genes include neomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, canamycin resistance gene, zeosin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene and the like.
  • Specific examples of the above-mentioned fluorescent protein gene include a green fluorescent protein (GFP) gene, a yellow fluorescent protein (YFP) gene, a red fluorescent protein (RFP) gene and the like.
  • Specific examples of the above-mentioned luminescent enzyme gene include a luciferase gene and the like.
  • Specific examples of the above-mentioned color-developing enzyme gene include ⁇ -galactosidase gene, ⁇ -glucuronidase gene, alkaline phosphatase gene and the like.
  • the type of expression vector is not particularly limited, and a known expression vector can be used.
  • Examples of the expression vector include an episomal vector, an artificial chromosome vector, a plasmid vector, a viral vector and the like.
  • the episomal vector examples include a vector containing a sequence required for autonomous replication derived from EBV, SV40, etc. as a vector element.
  • the vector elements required for autonomous replication are a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication.
  • the replication origin oriP In the case of the EBNA-1 gene and SV40, the replication origin ori and the SV40LT gene can be mentioned.
  • the artificial chromosome vector examples include a YAC (Yeast artificial chromosome) vector, a BAC (Bacterial artificial chromosome) vector, and a PAC (P1-derived artificial chromosome) vector.
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC Bacillus chromosome
  • PAC P1-derived artificial chromosome
  • the plasmid vector is not particularly limited as long as it is a plasmid vector that can be expressed in pluripotent stem cells to be introduced.
  • Examples of the plasmid vector for animal cell expression include pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like.
  • Viral vectors include retrovirus (including lentivirus) vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, Sendai virus vector, herpesvirus vector, vaccinia virus vector, poxvirus vector, poliovirus vector, sylvis virus vector, and Rabdo. Examples thereof include a virus vector, a paramixovirus vector, and an orthomixovirus vector.
  • the method for introducing the expression vector into pluripotent stem cells is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of expression vector.
  • Examples of the method for introducing the expression vector into pluripotent stem cells include a lipofection method, a microinjection method, a DEAE dextran method, a gene gun method, an electroporation method, and a calcium phosphate method.
  • examples of the method for infecting pluripotent stem cells include the polybrene method.
  • the expression vector containing the gene contains an antibiotic resistance gene as a selection marker
  • the expression vector is introduced by introducing the expression vector and then culturing the cells in a medium containing an antibiotic corresponding to the antibiotic resistance gene. It is possible to efficiently select the cells.
  • Step (b) The step (b) is the same as the step (b) of the first embodiment.
  • the production method of the present embodiment it is possible to induce differentiation of pluripotent stem cells into TS-like cells having the ability to differentiate into cells constituting the placenta.
  • the TS-like cells obtained by the production method of the present embodiment can be used as research materials for basic research such as early development of mammals and placental function analysis. It can also be used to elucidate the pathophysiology of diseases caused by placental abnormalities and to develop treatment methods. Furthermore, it can be expected to be applied to reproductive medicine and regenerative medicine.
  • TS cell lines were cultured according to the methods previously described (Okae, H., Toh, H., Sato, T. et al. Cell Stem Cell 22, 50-63 e56, doi: 10.1016 / j.stem. 2017.11 .004 (2016).).
  • TS cell lines were cultured in TS medium containing 5 ⁇ g / mL Col IV (354233; Corning, Corning, NY). The cells were cultured in 5% CO 2 at 37 ° C., and the culture medium was changed after 2 days.
  • the TS medium was prepared by adding the following components to DMEM / F12 (048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan).
  • Human ES cell lines (SEES1,4,6) and iPS cell lines (Nipps-B2) were prepared according to the manufacturer's protocol with ES medium [35 ng / ml FGF2 (064-05381; Fujifilm Wako) and 10 ⁇ M Y-27632 ( In hPSC medium delta (197-17571; Fujifilm Wako)] supplemented with Fujifilm Wako), the cells were cultured on Matrigel (354234; Corning). The colonies were dissociated and passaged by the action of TrypLE expressing enzyme (12604021; Thermo Fisher Scientific) at 37 ° C. for 5 minutes. Cells were cultured in 5% CO 2 at 37 ° C. One day later, the medium was replaced with an ES medium containing no Y-27632, and then the medium was replaced daily with an ES medium containing no Y-27632.
  • ES cells or iPS cells were seeded as a single cell monolayer (10,000 cells / cm 2 ) on a Matrigel-coated plate containing ES medium and cultured at 37 ° C. in 5% CO 2 .
  • BMP4 medium Keratin, C., Shaposhnikov, D., Rishko, V. et al. Proc Natl Acad Sci USA 114, E9579-E9588, doi: 10.1073 / pnas.1708341114 (2017).
  • Fresh BMP4 medium was applied every 24 hours.
  • the BMP4 medium was prepared by adding the following components to DMEM / F12 (048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan). 20% KnockOut Thermo Replacement (1082802 8; Thermo Fisher Scientific) 1% Glutamax (35050038; Thermo Fisher Scientific) 1% nonessential amino acids (1140050; Thermo Fisher Scientific) 0.1 mM 2-mercaptoethanol (21985023; Thermo Fisher Scientific) 1% Penicillin-Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 50 ng / mL BMP4 (020-18851; Fujifilm Wako)
  • the cDNA was cloned into a pLVSIN-EF1 ⁇ -based transfer vector using the In-Fusion® HD cloning kit (Takara Bio, Shiga, Japan).
  • the cDNA of GATA2, GATA3 or TFAP2A is codon-optimized (GATA2: SEQ ID NO: 1, 2, GATA3: SEQ ID NO: 3, 4, TFAP2A: SEQ ID NO: 5, 6), synthesized into a pLVSIN-EF1 ⁇ vector, and puromycin. Transferred to selectable wrench vector.
  • IPS cells were seeded as a single cell monolayer (100,000 cells / cm 2 ) on a Matrigel-coated plate containing ES medium. The medium was then replaced with lentivirus stock supplemented with 6 ⁇ g / mL polybrene (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO). From 24 hours after infection, cells were selected by culturing in 0.5-1.0 ⁇ g / mL puromycin for 2 days. After selection, iPS cells were seeded on a Col IV coated plate containing TS medium at a division ratio of 1:10, cultured in 5% CO 2 at 37 ° C., and passaged weekly.
  • the gene-introduced iPS cells were a heterogeneous population at the first passage, but after 4 passages, self-renewable TS-like colonies were obtained.
  • the transgenic iPS cells were then passaged weekly and periodically at a division ratio of 1: 5 to 1:10.
  • GATA3_F GCTAAACGACCCCTCCAAGATA (SEQ ID NO: 7)
  • GATA3_R TCATGCCTTACAGCTACCCAGA (SEQ ID NO: 8)
  • GATA2_F TCTGCACCCAGACCCTGA (SEQ ID NO: 9)
  • GATA2_R GGAGTGGTGTCGGCCTTC (SEQ ID NO: 10)
  • TFAP2A_F AGAGCCGCGATGTCCATACT (SEQ ID NO: 11)
  • TFAP2A_R AGCAGTAGCAGCAGCAGGAAG (SEQ ID NO: 12)
  • EVT extravillous cytotrophoblast
  • ST syncytiotrophoblast
  • the EVT medium was prepared by adding the following components to DMEM / F12 (048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan).
  • TS cells and TS-like cells were placed on a 2.5 ⁇ g / mL Col IV coated plate (Corning) containing ST medium at 10,000 cells / cell. Seeded at a density of cm 2 . The medium was changed 3 days after seeding and the cells were analyzed 6 days after seeding.
  • the ST medium was prepared by adding the following components to DMEM / F12 (048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan).
  • RNA sequencing Total RNA was extracted using RNeasy® mini-kit and RNase-free DNase (QIAGEN, Valencia, CA) and using TruSeq® Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA). And used to build the library according to the manufacturer's trademark. RNA integrity was evaluated using TapeStation 2200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). The Lineage values of all samples were above 9. The library was sequenced on the Illumina HiSeq 2500 platform (Illumina) with 101 bp paired-end reads. Reads were made using TopHat (Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L. et al.
  • WGBS Human Genome Bisulfite Sequencing: WGBS was performed using the sodium bisulfite post-adapter tagging (PBAT) method (Miura, F., Enomoto, Y., Dairiki, R. et al. Nucleic Acids Res 40, e136, doi: 10.1093 / nar / gks454 ( 2012).). Briefly, genomic DNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Genomic DNA supplemented with 0.5% (w / w) unmethylated ⁇ phage DNA (Promega, Madison, WI) was used for library preparation according to the PBAT protocol.
  • PBAT sodium bisulfite post-adapter tagging
  • PBAT Concentrations of PBAT products were quantified using the KAPA Library Quantization Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA) for the Illumina platform.
  • the PBAT library was sequenced on Illumina HiSeq 1500 (Illumina) with HCS v2.0.5 and RTA v1.17.20 with 101 bp single-end reads. Reads were aligned to the reference genome using Bismark (Krueger, F. & Andrews, S.R. Bismark: Bioinformatics 27, 1571-1572, doi: 10.1093 / bioinformatics / btr167 (2011).).
  • the methylation level of each cytosine (UCSC hg38) was calculated using the Bismark methylation extractor. For each CpG site, the methylation levels were calculated by combining reads from both strands. The methylation level of CpG covered by 5 or more reads was analyzed.
  • RNA was prepared using RNeasy mini Kit and RNase-free DNase (QIAGEN). First-strand cDNA was synthesized from total RNA using PrimeScript® II (Takara Bio), and StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) and SYBR Premix ExTaq II. was used to perform a real-time PCR reaction. The amount of target mRNA was determined using the ⁇ Ct method with GAPDH as an internal standard.
  • OCT4_F GCTCGAGAAGGATGTGGTCC (SEQ ID NO: 13)
  • OCT4_R CGTTGTGCATAGTCGCTGCT (SEQ ID NO: 14)
  • NANOG_F GCAGAAGGCCTCAGCACTA (SEQ ID NO: 15)
  • NANOG_R AGGTTCCAGTCGGGGTCA (SEQ ID NO: 16)
  • GATA2_F TCAAGCCCAAGCCGAAGAC (SEQ ID NO: 17)
  • GATA2_R CACAGGCGGTTGCAGACAG (SEQ ID NO: 18)
  • GATA3_F CTCATTAAGCCCAAGCGAAG (SEQ ID NO: 19)
  • GATA3_R TCTGACAGTTTCGCACAGGAC (SEQ ID NO: 20)
  • TFAP2A_F AACATGCTCCTGGCTACAAAA (SEQ ID NO: 21)
  • TFAP2A_R AGGGGAGATC
  • Genomic DNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Genomic DNA treatment with sodium bisulfite was performed using EZ DNA methylation-Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA). PCR was performed using TaKaRa EpiTaq HS (Takara Bio). The PCR product was purified and cloned into a pGEM-T vector (Promega). Sequencing of individual clones was performed by Eurofins Genomics (Tokyo, Japan). On average, 20 clones were sequenced for each sample.
  • ELF5_BSF TGATGGATATTGAATTGATTTAAAAGGTA (SEQ ID NO: 25)
  • ELF5_BSR CAATAAAAAATAAAAAACACTATAACCTTAT (SEQ ID NO: 26)
  • the primary antibodies used are: PE-conjugated anti-HLA-G (Novus Biologicals, Littleton, CO; 1: 100 dilution), PE-conjugated anti-SDC1 (# 130-119-840, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; 1: 100 dilution) anti-GATA3 (# 5852, Cell Signaling, Danvers, MA; 1: 100 dilution) anti-TFAP2C (# sc-12762, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX; 1: 100 dilution) anti-hCG (# IS508, Dako, Hamburg, Germany; 1:10 dilution) anti-OCT4 (# 4439, Cell Signaling; 1: 100 dilution)
  • TS-like cells derived from iPS cells were induced to differentiate from iPS cells according to the method described in "(Induction of differentiation into TS-like cells via BMP4 signaling)”. As a result, TS-like cells having a morphology similar to that of TS cells were obtained (see FIG. 1). In addition, TS cells were induced to differentiate from iPS cells according to the method described in "(Induction of differentiation into TS-like cells by gene transfer)".
  • FIG. 1 shows TS-like cells obtained by introducing the GATA3 gene into iPS cells as a representative example.
  • FIG. 2 shows the relative expression level when the expression level in iPS cells is log2 (1).
  • the TS-like cells obtained by introducing any of the genes had similar gene expression to the TS cells.
  • OCT4 and NANOG which are marker genes of iPS cells, was also suppressed, which was similar to that of TS cells.
  • TS-like cells derived from ES cells TS-like cells were induced to differentiate from ES cells according to the method described in "(Induction of differentiation into TS-like cells via BMP4 signaling)". As a result, TS-like cells having a morphology similar to that of TS cells were obtained.
  • ES-TS represents TS-like cells derived from ES cells (the same applies to the following figures).
  • TS-like cells derived from ES cells had a more similar gene expression mode to TS cells than ES cells.
  • TS-like cells Gene expression analysis of TS-like cells was performed and compared with ES cells, cells obtained by treating ES cells with BMP4 by a conventional method (cells cultured in BMP4 medium for 72 hours), and TS cells. The results are shown in FIGS. 4A and 4B.
  • "ES-BMP4" represents a cell obtained by subjecting ES cells to BMP4 treatment by a conventional method (the same applies to the following figures).
  • TS-like cells derived from ES cells were more similar in gene expression mode to TS cells than ES cells.
  • TS-like cells the expression of NANOG, Oct4 and SOX2 was negative, and the expression of GATA3, GATA2, TFAP2C, TFAP2A and TP63 was positive.
  • cells treated with BMP4 by the conventional method still had high expression of ES cell-specific transcription factors.
  • the expression of TS cell-specific transcription factors was lower than that of TS-like cells and ES cells.
  • TP63 whose expression was confirmed in TS cells and TS-like cells, was negative in cells treated with BMP4 by the conventional method, as in ES cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the correlation of gene expression of TS cells, TS-like cells (ES-TS), ES cells, and ES cells treated with BMP4 by a conventional method (ES-BMP4 cells). It can be confirmed that the TS-like cells have a high correlation with the TS cells. On the other hand, the cells treated with BMP4 by the conventional method had a higher correlation with ES cells than TS cells.
  • FIG. 6 shows the analysis result of 10 Mb in chromosome 21.
  • TS-like cells derived from ES cells had a more similar DNA methylation pattern to TS cells than ES cells.
  • the methylation rate of the entire genome was about 81%, but in TS-like cells, the methylation rate was reduced to about 45%, which was about the same as that of TS cells.
  • the cells treated with BMP4 by the conventional method had a similar methylation pattern to ES cells.
  • ELF5 DNA methylation analysis of ELF5
  • DNA methylation analysis was performed on TS-like cells, ES cells, and TS cells for the promoter region of the ELF5 gene (chr11: 34513753-34514270 (transcription start point: chr11: 34513800)).
  • ELF5 is a gene that has been reported to be hypomethylated in the placenta (Hemberger M, et al., Hum Mol Genet. 2010 Jun 15; 19 (12): 2456-67.). The result is shown in FIG. As shown in FIG. 7, the TS-like cells had a methylation rate of 1.0%, which was similar to the methylation rate of TS cells.
  • TS-like cell differentiation test The TS-like cells and TS cells were subjected to a differentiation test into EVT or ST according to the method described in "(Differentiation into EVT or ST)" above. Expression analysis of HLA-G, which is a marker of EVT, and hCG, which is a marker of ST, was performed on the differentiated cells.
  • FIGS. 8A and 8B show the results of the differentiation test into EVT.
  • FIG. 8A shows the results of immunostaining of cells differentiated from TS-like cells to EVT using an anti-HLA-G antibody (PE-conjugated antibody-HLA-G).
  • FIG. 8B shows the results of comparing the expression levels of HLA-G in each cell.
  • "ES-TS_EVT” represents a cell differentiated from a TS-like cell into an EVT
  • TS_EVT represents a cell differentiated from a TS cell into an EVT (the same applies to FIG. 9B).
  • the expression of HLA-G was increased in the cells differentiated from TS-like cells to EVT, as in the cells differentiated from TS cells to EVT. From this result, it was confirmed that TS-like cells can differentiate into EVT in the same manner as TS cells.
  • FIGS. 9A and 9B show the results of the differentiation test into ST.
  • FIG. 9A shows the results of immunostaining of cells differentiated from TS-like cells to ST using an anti-hCG antibody (anti-hCG).
  • FIG. 9B shows the results of comparing the expression levels of hCG in each cell.
  • FIGS. 9A and 9BB the expression of hCG was increased in the cells differentiated from TS-like cells into ST, as in the cells differentiated from TS cells into ST. From this result, it was confirmed that TS-like cells can differentiate into ST in the same manner as TS cells.
  • TS-like cells had a lower methylation rate in the DMNT1 gene than TS cells.
  • TS-like cells had a higher methylation rate in the ZFAT gene than TS cells.
  • TS-like cells from pluripotent stem cells and TS-like cells produced by the production method are provided.
  • the TS-like cells provided by the present invention can be used for early developmental studies in mammals and placental function analysis studies. It can also be applied to regenerative medicine.

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Abstract

多能性幹細胞から誘導された、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞であって、ＢＲＤＴが陰性であり、ＴＰ６３が陽性である、細胞。また、以下の工程を含む、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法：（ａ）哺乳動物の多能性幹細胞を、骨形成因子４を含有する培地で培養する工程；および（ｂ）前記工程（ａ）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程。

Description

胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞、およびその製造方法
　本発明は、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞、およびその製造方法に関する。
　胎盤組織は、栄養膜組織（トロホブラスト）が主要な構成成分である。栄養膜細胞における分化制御機構の解明には栄養膜幹細胞（ＴＳ細胞）が非常に有益であると考えられる。そのため、未分化状態を維持したまま継代培養することができるＴＳ細胞株の樹立が望まれている。
　本発明者らは、哺乳動物の胎盤組織から得た細胞懸濁液から、ＣＤ４９ｆ抗体陽性細胞を回収し、ＴＳ細胞に類似した特徴を有する細胞（ＴＳ様細胞）に分化誘導する方法を開発している（特許文献１）。しかしながら、特許文献１及び非特許文献１に記載の方法では、胎盤組織から細胞懸濁液を採取する必要がある。
　一方、ＥＳ細胞からＴＳ様細胞を分化誘導する試みも行われているが（非特許文献２）、遺伝子発現パターンやＤＮＡメチル化パターン等を解析結果から、ＴＳ細胞に類似しているとはいえない場合が多い。
特許第６４００８３２号公報
Okae H, et al., Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 2018 Jan;22:50-63. Gamage TK, et al., Stem cell insights into human trophoblast lineage differentiation. Hum Reprod Update. 2016 Dec;23(1):77-103.
　上記のように、現在、多能性幹細胞からＴＳ様細胞を分化誘導する試みは成功しておらず、多能性幹細胞からＴＳ様細胞を分化誘導する方法の開発が望まれている。
　そこで、本発明は、多能性幹細胞からＴＳ様細胞を製造する方法、および前記製造方法により製造されるＴＳ様細胞を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］哺乳動物の多能性幹細胞から誘導された、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞であって、ＢＲＤＴが陰性であり、ＴＰ６３が陽性である、細胞。
［２］Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２からなる群より選択される少なくとも１種が陰性である、［１］に記載の細胞。
［３］ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種が陽性である、［１］または［２］に記載の細胞。
［４］ゲノムＤＮＡのメチル化の割合がゲノム全体の６０％以下である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の細胞。
［５］胎盤を構成する細胞が、絨毛外栄養膜細胞または合胞体栄養膜細胞である、［１］～［４］のいずれか一つに記載の細胞。
［６］以下の工程を含む、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法：
　（ａ）哺乳動物の多能性幹細胞を、骨形成因子４（ＢＭＰ４）を含有する培地で培養する工程；および
　（ｂ）前記工程（ａ）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程。
［７］以下の工程を含む、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法：
　（ａ’）哺乳動物の多能性幹細胞に、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を導入する工程；および
　（ｂ）前記工程（ａ’）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程。
［８］前記工程（ｂ）において培地が、さらにＡＬＫ５阻害剤、およびＧＳＫ３β阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、［６］または［７］に記載の胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法。
　本発明によれば、多能性幹細胞からＴＳ様細胞を製造する方法、および前記製造方法により製造されるＴＳ様細胞が提供される。
ｉＰＳ細胞、およびｉＰＳ細胞から誘導したＴＳ様細胞の光学顕微鏡写真を示す。 ＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、又はＴＦＡＰ２Ａ遺伝子の導入によりｉＰＳ細胞から誘導したＴＳ様細胞の遺伝子発現解析の結果を示す。ｉＰＳ細胞における各遺伝子の発現量を１として、ＴＳ細胞およびＴＳ様細胞の発現量を補正し、ｌｏｇ２（発現量）を計算した。ｉＰＳ細胞における各遺伝子の発現量は、ｌｏｇ２（１）＝０である。 ＥＳ細胞の骨形成因子４（Bone Morphogenetic Protein 4：BMP4）処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）の免疫染色写真を示す。写真の左側に、免疫染色に用いた抗体の抗原を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）の遺伝子発現を、ＴＳ細胞、ＥＳ細胞、およびＥＳ細胞に従来のＢＭＰ４処理を行った細胞（ＥＳ－ＢＭＰ４）と比較した結果を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）の遺伝子発現を、ＴＳ細胞、ＥＳ細胞、およびＥＳ細胞に従来のＢＭＰ４処理を行った細胞（ＥＳ－ＢＭＰ４）と比較した結果を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、ＴＳ細胞、ＥＳ細胞、およびＥＳ細胞に従来のＢＭＰ４処理を行った細胞（ＥＳ－ＢＭＰ４）における遺伝子発現の相関を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、ＴＳ細胞、ＥＳ細胞、およびＥＳ細胞に従来のＢＭＰ４処理を行った細胞（ＥＳ－ＢＭＰ４）におけるＤＮＡメチル化パターンの解析結果を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、ＴＳ細胞、ＥＳ細胞、およびＥＳ細胞に従来のＢＭＰ４処理を行った細胞（ＥＳ－ＢＭＰ４）における、ＥＬＦ５遺伝子のＤＮＡメチル化パターンの解析結果を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）から絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）への分化を行った細胞における抗ＨＬＡ－Ｇ抗体による免疫染色結果を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、およびＴＳ細胞について、絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）への分化試験を行った結果を示す。各細胞で、ＨＬＡ－Ｇの発現量を比較した結果を示す。「ＥＳ－ＴＳ＿ＥＶＴ」は、ＴＳ様細胞からＥＶＴに分化させた細胞を表し、「ＴＳ＿ＥＶＴ」は、ＴＳ細胞からＥＶＴに分化させた細胞を表す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）から合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）への分化を行った細胞における、抗ｈＣＧ抗体による免疫染色結果を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、およびＴＳ細胞について、合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）への分化試験を行った結果を示す。各細胞で、ｈＣＧの発現量を比較した結果を示す。「ＥＳ－ＴＳ＿ＳＴ」は、ＴＳ様細胞からＳＴに分化させた細胞を表し、「ＴＳ＿ＳＴ」は、ＴＳ細胞からＥＶＴに分化させた細胞を表す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、ＴＳ細胞、ＥＳ細胞、およびＥＳ細胞に従来のＢＭＰ４処理を行った細胞（ＥＳ－ＢＭＰ４）における、ＤＮＭＴ１及びＺＦＡＴのＤＮＡメチル化解析結果を示す。 ＥＳ細胞のＢＭＰ４処理により誘導したＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、およびＴＳ細胞、ＥＳ細胞における、ＢＲＤＴおよびＳＯＨＬＨ２の遺伝子発現解析結果を示す。
［定義］
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、塩基配列は、５’側から３’側に向かって記載する。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。
　本明細書において、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
　本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互に互換的に使用され、アミド結合によって結合したアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は、天然アミノ酸のポリマーであってもよく、天然アミノ酸と非天然アミノ酸（天然アミノ酸の化学的類似体、修飾誘導体等）とのポリマーであってもよく、非天然アミノ酸のポリマーであってもよい。特に明示しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載する。
　本明細書において、ポリヌクレオチドに関して用いる「機能的に連結」という用語は、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列又は第二の塩基配列の制御下の領域に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結するとは、当該ポリヌクレオチドが、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
　本明細書において、「発現可能な状態」という用語は、ポリヌクレオチドが導入された細胞内で、該ポリヌクレオチドが転写され得る状態にあることを指す。
　本明細書において、「発現ベクター」という用語は、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを指す。
[胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞（ＴＳ様細胞）]
　一実施形態において、哺乳動物の多能性幹細胞から誘導された、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞であって、ＢＲＤＴが陰性であり、ＴＰ６３が陽性である、細胞を提供する。
　本実施形態の細胞は、ＴＳ細胞に類似した特徴を有するＴＳ様細胞である。ＴＳ様細胞は、ＴＳ細胞と同様に、胎盤を構成する細胞への分化能を有する。胎盤を構成する細胞としては、例えば、絨毛外栄養膜細胞（extravillous cytotrophoblast：EVT）および合胞体栄養膜細胞（syncytiotrophoblast：ST）が挙げられる。
　細胞が、ＥＶＴへの分化能を有するか否かは、ＥＶＴへの分化誘導条件として用いられる条件で細胞を培養し、ＥＶＴに分化したかを確認することにより、判定することができる。ＥＶＴへの分化誘導条件としては、例えば、後述の実施例に記載の条件が挙げられる。具体的には、以下のようにＥＶＴへの分化誘導を行うことができる。
　ＥＶＴ培地（実施例参照）を含むＣｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ（Ｃｏｌ　ＩＶ）コーティングプレートに細胞を播種し、マトリゲルを培地体積の２％で添加して細胞を培養する。播種後３日目に、培地を、ＮＲＧ１を含まないＥＶＴ培地と交換し、マトリゲルを培地体積の０．５％で添加して、さらに培養する。播種後６日目に、培地を、ＮＲＧ１およびＫＳＲを含まないＥＶＴ培地と交換し、マトリゲルを培地体積の０．５％で添加して、さらに６～８日培養する。
　上記のようなＥＶＴへの分化誘導条件で培養した細胞が、ＥＶＴに分化したか否かは、顕微鏡での形態的な観察に加えて、ＨＬＡ－Ｇの発現上昇によっても確認することができる。ＨＬＡ－Ｇは、ＥＶＴのマーカーであり、ＴＳ細胞からＥＶＴへの分化により発現が上方制御される。したがって、上記条件での培養前の細胞と比較して、上記条件での培養後の細胞において、ＨＬＡ－Ｇの発現量が上昇している場合には、当該細胞はＥＶＴに分化したと判断することができる。
　ＨＬＡ－Ｇ（NCBI Gene ID：3135）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１３６３５６７．１、またはＮＭ＿００２１２７．５で登録されているもの等が挙げられる。
　細胞が、ＳＴへの分化能を有するか否かは、ＳＴへの分化誘導条件として用いられる条件で細胞を培養し、ＳＴに分化したかを確認することにより、判定することができる。ＳＴへの分化誘導条件としては、例えば、後述の実施例に記載の条件が挙げられる。具体的には、以下のようにＳＴへの分化誘導を行うことができる。
　ＳＴ培地（実施例参照）を含むＣｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ（Ｃｏｌ　ＩＶ）コーティングプレートに細胞を播種して細胞を培養する。播種後３日目に、新しいＳＴ培地に交換し、さらに３日細胞を培養する。
　上記のようなＳＴへの分化誘導条件で培養した細胞が、ＳＴに分化したか否かは、顕微鏡での形態的な観察に加えて、ＣＧβの発現上昇によっても確認することができる。ＣＧβ（別名：ＣＧＢ３（chorionic gonadotropin subunit beta 3））は、ＳＴのマーカーであり、ＴＳ細胞からＳＴへの分化により発現が上方制御される。したがって、上記条件での培養前の細胞と比較して、上記条件での培養後の細胞において、ＣＧβの発現量が上昇している場合には、当該細胞はＳＴに分化したと判断することができる。
　ヒトＣＧβ（NCBI Gene ID：1082）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７３７．３で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ＴＳ細胞に類似した特徴を有する細胞であるが、ＢＲＤＴが陰性である点で、天然のＴＳ細胞と区別できる。ＢＲＤＴ（bromodomain testis associated）は、２つのブロモドメインモチーフとＰＥＳＴ配列（プロリン残基、グルタミン酸残基、セリン残基及びスレオニン残基のクラスター）を有し、迅速なタンパク質分解を受けるタンパク質の特徴を有する。ヒトＢＲＤＴ（NCBI Gene ID：676）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２４２８０５．２、ＮＭ＿００１２４２８０６．２、ＮＭ＿００１２４２８０７．２、ＮＭ＿００１２４２８０８．２、ＮＭ＿００１２４２８１０．２、ＮＭ＿００１７２６．４、またはＮＭ＿２０７１８９．３で登録されているもの等が挙げられる。
　本願明細書において、遺伝子またはタンパク質に関して用いる「陰性」という用語は、当該タンパク質または当該遺伝子にコードされるタンパク質が、実質的に検出されないことを意味する。「実質的に検出されない」とは、通常のタンパク質検出手段を用いた場合に検出されないことを意味する。通常のタンパク質検出手段としては、例えば、当該タンパク質に対する抗体を用いた免疫染色が挙げられる。
　また、タンパク質の代わりに、ｍＲＮＡを検出してもよく、当該ｍＲＮＡが実質的に検出されない場合に当該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質が「陰性」であると判断してもよい。ｍＲＮＡの測定には、通常用いられる方法を用いることができる。例えば、ｍＲＮＡの測定方法としては、次世代シーケンサーを用いた方法、定量リアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。例えば、対象細胞から全ｍＲＮＡを抽出して次世代シーケンサーで解析し、対象ｍＲＮＡについてｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）の値が１未満（好ましくは０．５未満、より好ましくは０．１未満）の場合には、当該対象ｍＲＮＡから翻訳される対象タンパク質が陰性であるとすることができる。ＦＰＫＭ（fragments per kilobase of exon per million reads mapped）は次世代シークエンサを用いて得ることができる値であり、転写物ｔのＦＰＫＭは下記の式で求めることができる。
　ＦＰＫＭ＝１０９×Ｘｔ／（ｌｔＮ）
［式中、Ｘｔは転写物ｔにマッピングされたショートリードの本数を示す。ｌｔは転写物ｔの長さ（ｂｐ）を示す。Ｎはマッピングされたショートリードの総数を示す］。
　本願明細書において、遺伝子またはタンパク質に関して用いる「陽性」という用語は、当該タンパク質または当該遺伝子にコードされるタンパク質が、実質的に検出されることを意味する。「実質的に検出される」とは、通常のタンパク質検出手段（例えば、免疫染色）を用いた場合に検出可能であることを意味する。
　また、上記と同様に、対応するｍＲＮＡが、通常用いられる方法で検出される場合に当該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質が「陽性」であると判断してもよい。例えば、対象細胞から全ｍＲＮＡを抽出して次世代シーケンサーで解析し、対象ｍＲＮＡについてｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）の値が１以上（好ましくは０．５以上、より好ましくは０．１以上）の場合には、当該対象ｍＲＮＡから翻訳される対象タンパク質が陰性であるとすることができる。
　本実施形態の細胞は、多能性幹細胞から誘導された細胞である。「多能性幹細胞」とは、分化多能性を有する細胞であり、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）、及びこれらの幹細胞から誘導された分化多能性を有する細胞を包含する。多能性幹細胞の製造方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。また、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の細胞株は、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）等の細胞バンクからも入手可能である。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であることが好ましい。
　本実施形態の細胞は、多能性幹細胞から、後述の「[胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞（ＴＳ様細胞）の製造方法]」に記載の方法により、ＴＳ様細胞に分化誘導された細胞である。
　前記多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞である。前記哺乳動物としては、特に限定されず、例えば、霊長類、げっ歯類、食肉類等が挙げられる。哺乳動物は、好ましくは霊長類である。また、霊長類としては、例えば、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マーモセット等が挙げられ、好ましくはヒトである。
　本実施形態の細胞は、ＴＳ細胞と類似した特徴として、胎盤を構成する細胞への分化能を有することに加えて、ＴＰ６３が陽性であるという特徴を有する。一方、多能性幹細胞および従来法で誘導されたＴＳ様細胞では、ＴＰ６３が陰性である。したがって、本実施形態の細胞は、ＴＰ６３が陽性である点で、ＴＳ細胞と類似し、且つ多能性幹細胞および従来のＴＳ様細胞とは区別される。
　ヒトＴＰ６３（NCBI Gene ID：8626）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１１４９７８．１、ＮＭ＿００１１１４９７９．１、ＮＭ＿００１１１４９８０．１、ＮＭ＿００１１１４９８１．１、ＮＭ＿００１１１４９８２．１、ＮＭ＿００１３２９１４４．１、ＮＭ＿００１３２９１４５．１、ＮＭ＿００１３２９１４６．１、ＮＭ＿００１３２９１４８．１、ＮＭ＿００１３２９１４９．１、ＮＭ＿００１３２９１５０．１、ＮＭ＿００１３２９９６４．１、またはＮＭ＿００３７２２．５で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２からなる群より選択される少なくとも１種が陰性であることが好ましい。本実施形態の細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２の少なくとも２種が陰性であることがより好ましく、これら３種すべてが陰性であることがさらに好ましい。これらの遺伝子は、未分化マーカーとして知られるものであり、多能性幹細胞では陽性のマーカーである。本実施形態の細胞はこれらの遺伝子が陰性である点で、本実施形態の細胞の由来となった多能性幹細胞と区別できる。
　ヒトＯｃｔ４（NCBI Gene ID：5460）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１７３５３１．２、ＮＭ＿００１２８５９８６．１、ＮＭ＿００１２８５９８７．１、ＮＭ＿００２７０１．６、ＮＭ＿２０３２８９．５、またはＺ１１８９８で登録されているもの等が挙げられる。
　ヒトＮａｎｏｇ（NCBI Gene ID：79923）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２９７６９８．１、ＮＭ＿０２４８６５．４、またはＡＢ０９３５７６で登録されているもの等が挙げられる。
　ヒトＳｏｘ２（NCBI Gene ID：6657）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３１０６．４で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種が陽性であることが好ましい。本実施形態の細胞は、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３およびＴＦＡＰ２Ａの２つ以上が陽性であることがより好ましく、３つ全てが陽性であることがさらに好ましい。これらの遺伝子は、ＴＳ細胞のマーカーである。特に、本実施形態の細胞はＴＰ６３が陽性であることは、ＥＶＴやＳＴへの分化能に代表される天然のＴＳ細胞の機能と同様の機能を獲得した指標となることのほか、その由来となった多能性幹細胞と区別できる特徴である。
　ヒトＧＡＴＡ２（NCBI Gene ID：2624）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１４５６６１．１、ＮＭ＿００１１４５６６２．１、またはＮＭ＿０３２６３８．４で登録されているもの等が挙げられる。
　ヒトＧＡＴＡ３（NCBI Gene ID：2625）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００２２９５．２、またはＮＭ＿００２０５１．２で登録されているもの等が挙げられる。
　ヒトＴＦＡＰ２Ａ（NCBI Gene ID：7020）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３２２８０．２、ＮＭ＿００１０４２４２５．１、またはＮＭ＿００３２２０．３で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ＧＡＴＡ２およびＧＡＴＡ３に加えて、ＴＦＡＰ２Ｃ等の遺伝子が陽性であることが好ましい。ＴＦＡＰ２Ｃもまた、ＴＳ細胞のマーカーである。
　ヒトＴＦＡＰ２Ｃ（NCBI Gene ID：7022）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３２２２．４で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ＳＯＨＬＨ２が陰性（またはｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）＜１）であることが好ましい。
　ヒトＳＯＨＬＨ２（NCBI Gene ID：54937）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２８２１４７．１、またはＮＭ＿０１７８２６．３で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ゲノムＤＮＡのメチル化の割合がＴＳ細胞と同程度であることが好ましい。より具体的には、ゲノムＤＮＡのメチル化の割合が、ゲノム全体の６０％以下であることが好ましく、５５％以下であることがより好ましく、５０％以下であることがさらに好ましく、４７％以下であることが特に好ましい。
　多能性幹細胞においては、ゲノムＤＮＡのメチル化の割合はゲノム全体の約８１％である。一方、ＴＳ細胞においては、ゲノムＤＮＡのメチル化の割合はゲノム全体の約４５％である。したがって、ゲノムＤＮＡのメチル化の割合は、ＴＳ細胞に対する類似性を示す指標となる。
　ゲノムＤＮＡのメチル化の割合の下限としては、例えば、ゲノム全体の３５％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましい。ゲノムＤＮＡのメチル化の割合の範囲としては、例えば、ゲノム全体の３５～６０％であることが好ましく、４０～５５％であることがより好ましく、４０～４７％であることがさらに好ましい。
　細胞のゲノムＤＮＡのメチル化の割合は、公知の方法により測定することができる。そのような方法としては、例えば、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域（ｃｈｒ１１：３４５１３７５３－３４５１４２７０（転写開始点：ｃｈｒ１１：３４５１３８００））におけるＤＮＡメチル化の割合が、５％以下であることが好ましく、３％以下であることがより好ましく、２％以下であることがさらに好ましい。
　多能性幹細胞においては、ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合は約７６％である。一方、ＴＳ細胞においては、ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合はゲノム全体の約１．７％である。したがって、ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合は、ＴＳ細胞に対する類似性を示す指標となる。
　ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合の下限としては、例えば、０％超であり、０．５％以上であることがより好ましく、０．８％以上であることがさらに好ましい。ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合の範囲としては、例えば、０％超５％以下であることが好ましく、０．５～３％であることがより好ましく、０．８～２％であることがさらに好ましい。
　ヒトＥＬＦ５（NCBI Gene ID：2001）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２４３０８０．１、ＮＭ＿００１２４３０８１．１、ＮＭ＿００１４２２．３、またはＮＭ＿１９８３８１．１で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ＤＮＭＴ１遺伝子のプロモーター領域（ｃｈｒ１９：１０１９２８３０－１０１９５７３９（転写開始点：ｃｈｒ１９：１０１９５０５４））におけるＤＮＡメチル化の割合が、２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。
　天然のＴＳ細胞においては、ＤＮＭＴ１遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合は約４０％である。したがって、ＤＮＭＴ１遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合は、天然のＴＳ細胞と本実施形態の細胞とを区別する指標となる。
　ＤＮＭＴ１遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合の下限としては、例えば、１％以上であり、３％以上であることがより好ましく、５％以上であることがさらに好ましい。ＤＮＭＴ１遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合の範囲としては、例えば、１～２０％であることが好ましく、３～２０％であることがより好ましく、５～１５％であることがさらに好ましく、５～１０％であることが特に好ましい。
　ヒトＤＮＭＴ１（NCBI Gene ID：1786）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１３０８２３．３、ＮＭ＿００１３１８７３０．１、ＮＭ＿００１３１８７３１．１、またはＮＭ＿００１３７９．３で登録されているもの等が挙げられる。
　本実施形態の細胞は、ＺＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域（ｃｈｒ８：１３４６９４９８４－１３４６９７８７１（転写開始点：ｃｈｒ８：１３４６９６５５８））におけるＤＮＡメチル化の割合が、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。
　天然のＴＳ細胞においては、ＺＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合は約４０％である。したがって、ＺＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合は、天然のＴＳ細胞と本実施形態の細胞とを区別する指標となる。
　ＺＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合の上限としては、例えば、９５％以下であり、９３％以下であることがより好ましい。ＺＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合の範囲としては、例えば、５０～９５％であることが好ましく、６０～９５％であることがより好ましく、７０～９５％であることがさらに好ましく、８０～９３％であることが特に好ましい。
　ヒトＺＦＡＴ（NCBI Gene ID：57623）としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０２９９３９．３、ＮＭ＿００１１６７５８３．２、ＮＭ＿００１１７４１５７．１、ＮＭ＿００１１７４１５８．１、ＮＭ＿００１２８９３９４．１、またはＮＭ＿０２０８６３．４で登録されているもの等が挙げられる。
　ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域、ＤＮＭＴ１遺伝子のプロモーター領域、およびＺＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の割合は、公知の方法により測定することができる。そのような方法としては、例えば、バイサルファイトシーケンシング、及び全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（WGBS）が挙げられる。
[胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞（ＴＳ様細胞）の製造方法]
　１実施形態において、本発明は、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により得られる細胞は、前記実施形態のＴＳ様細胞である。
＜第１実施形態＞
　本実施形態の製造方法は、以下の工程を含む：
　（ａ）哺乳動物の多能性幹細胞を、骨形成因子４を含有する培地で培養する工程；および
　（ｂ）前記工程（ａ）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程。
（工程（ａ））
　工程（ａ）は、哺乳動物の多能性幹細胞を、骨形成因子４（ＢＭＰ４）を含有する培地で培養する工程である。
　本工程で用いる哺乳動物の多能性幹細胞としては、前記「［胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞（ＴＳ様細胞）］」で例示したものと同様のものが挙げられる。哺乳動物は、好ましくは霊長類であり、好ましくはヒトである。多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
　本工程で用いる培地は、ＢＭＰ４を含有する培地である。前記培地は、例えば、動物細胞の培養に一般的に用いられる培地を基礎培地に、ＢＭＰ４を添加することにより調製することができる。前記基礎培地としては、例えば、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地等が挙げられる。好ましい基礎培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
　ＢＭＰ４は、各種市販されているものを用いることができる。
　培地中のＢＭＰ４の濃度は、特に限定されないが、例えば、１０～１００ｎｇ／ｍＬとすることができ、２０～８０ｎｇ／ｍＬが好ましく、３０～７０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、４０～６０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
　前記基礎培地には、ＢＭＰ４に加えて、必要に応じて、他の成分を添加してもよい。他の成分としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ－Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）；ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物が挙げられる。また、例えば、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩類から選択される１つ以上の物質が挙げられる。好ましい他の成分としては、ＫＳＲ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、２－メルカプトメタノール、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）が挙げられる。
　好ましい培地の具体例としては、実施例に記載のＢＭＰ４培地が例示される。
　本工程における培養温度は、動物細胞の培養に一般的に用いられる温度とすることができる。培養温度は、例えば、３２～４０℃とすることができ、好ましくは３５～３８℃の範囲で適宜設定できる。
　培養におけるＣＯ２濃度は、特に限定されないが、約２～５％が好ましく、５％がより好ましい。
　本工程における培養時間は、特に限定されないが、例えば、１～５日（例えば２４～１２０時間）とすることができ、２～４日（例えば４８～９６時間）が好ましく、３日（例えば５０～８０時間）がより好ましい。
　本工程では、マトリゲルコーティングしたプレート上に、多能性幹細胞を単細胞単層として播種して培養を開始することが好ましい。また、培地は、２０～３０時間（例えば、２４時間）ごとに交換することが好ましい。
（工程（ｂ））
　工程（ｂ）は、前記工程（ａ）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程である。
　本工程で用いる培地は、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地である。前記培地は、例えば、動物細胞の培養に一般的に用いられる培地を基礎培地に、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を添加することにより調製することができる。前記基礎培地としては、前記工程（ａ）で挙げたものと同様のものが挙げられる。好ましい基礎培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
　成長因子としては、特に限定されないが、例えば、上皮成長因子（Epidermal Growth Factor：EGF）、インスリン、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor：TGF）等が挙げられる。これらの成長因子は、各種市販されているものを用いることができる。中でも、成長因子は、ＥＧＦが好ましい。
　培地中の成長因子の濃度は特に限定されないが、例えば、１０～１００ｎｇ／ｍＬとすることができ、２０～８０ｎｇ／ｍＬが好ましく、３０～７０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、４０～６０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
　ＲＯＣＫ（Rho associated coiled-coil containing protein kinase：Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤は、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を抑制できるものでれば特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、１－（５－イソキノリニルスルホニル）ホモピペラジン（1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine）、またはこれらの塩等が挙げられる。また、例えば、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、Ｈ－１１５２、およびＷｆ－５３６等の低分子阻害剤、並びにそれらの誘導体等が挙げられる。また、ＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクター等が挙げられる。
　ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩の市販品としては、Ｙ２７６３２（(R)-(+)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide・2HCl・H2O）等が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２を用いることが好ましい。
　培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～５０μＭとすることができ、１～２０μＭが好ましく、１～１０μＭがより好ましく、３～８μＭがさらに好ましい。
　本工程で用いる培地は、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤に加えて、ＡＬＫ５阻害剤、およびＧＳＫ３β阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有することが好ましい。
　ＡＬＫ５阻害剤としては、ＡＬＫ５の機能を抑制できるものであれば、特に限定されない。ＡＬＫ５阻害剤としては、例えば、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド又はその塩等が挙げられる。また、Ａ８３－０１（3-(6-Methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide）、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ、ＧＷ７８８３８８、ＳＭ１６、ＩＮ－１１３０、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５０５１２４、およびピリミジン誘導体等の低分子阻害剤が挙げられる。また、ＡＬＫ５に対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクター等が挙げられる。４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド又はその塩の市販品としては、ＳＢ４３１５４２等が挙げられる。ＡＬＫ５阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＢ４３１５４２またはＡ８３－０１を用いることが好ましく、ＳＢ４３１５４２およびＡ８３－０１の両方を用いることが好ましい。
　培地中のＡＬＫ５阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～２０μＭとすることができ、０．２～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましく、０．５～３μＭがさらに好ましい。ＡＬＫ５阻害剤としてＳＢ４３１５４２を用いる場合、ＳＢ４３１５４２の培地中の濃度としては、例えば、０．１～１０μＭとすることができ、０．２～５μＭが好ましく、０．５～３μＭがより好ましく、０．７～２μＭがさらに好ましい。ＡＬＫ５阻害剤としてＡ８３－０１を用いる場合、Ａ８３－０１の培地中の濃度としては、例えば、０．１～５μＭとすることができ、０．２～３μＭが好ましく、０．３～２μＭがより好ましく、０．３～１μＭがさらに好ましい。
　ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＧＳＫ３βの機能を抑制できるものであれば、特に限定されない。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル等が挙げられる。また、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ－Ａ０１４４１８、リチウム、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ－８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－（２－フェニルキナゾリン－４－イル）アミン、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム（ｃｙｃｌｏｐｅｎａｄｉｅｎｙｌｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）複合体、ＴＤＺＤ－８ ４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン、２－チオ（３－ヨードベンジル）－５－（１－ピリジル）－［１，３，４］－オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、ＡＲ－ＡＯ １４４－１８、３－（１－（３－ヒドロキシプロピル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］－４－ピラジン－２－イル－ピロール－２，５－ジオン；ＴＷＳｌ １９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３ Ｈ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２またはそのミリストイル化形態；２－クロロ－１－（４，５－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン、ＳＢ２１６７６３、およびＳＢ４１５２８６等の低分子阻害剤が挙げられる。また、ＧＳＫ３βに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクター等が挙げられる。６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリルの市販品としては、ＣＨＩＲ９９０２１等が挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を用いることが好ましい。
　培地中のＧＳＫ３β阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～２０μＭとすることができ、０．２～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましく、０．５～３μＭがさらに好ましい。
　本工程で用いる培地は、上記の成分に加えて、さらにヒストンデアセチラーゼ（Histone Deacetylase：HDAC）阻害剤を含有していてもよい。
　ＨＤＡＣ阻害剤としては、ＨＤＡＣの機能を抑制できるものであれば、特に限定されない。ＨＤＡＣ阻害剤としては、例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤が挙げられる。また、ＨＤＡＣに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクター等が挙げられる。ＨＤＡＣ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＨＤＡＣ阻害剤は、ＶＰＡを用いることが好ましい。
　培地中のＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１０ｍＭとすることができ、０．１～５ｍＭが好ましく、０．５～２ｍＭがより好ましく、０．５～１ｍＭがさらに好ましい。
　前記基礎培地には、上記成分に加えて、必要に応じて、他の成分を添加してもよい。他の成分としては、例えば、血清（牛胎児血清（ＦＢＳ）など）、あるいはアルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ－Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）；ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物が挙げられる。また、例えば、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩類から選択される１つ以上の物質が挙げられる。好ましい他の成分としては、ＦＢＳ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＩＴＳ－Ｘ、Ｌ－アスコルビン酸、２－メルカプトメタノール、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）が挙げられる。
　好ましい培地の具体例としては、実施例に記載のＴＳ培地が例示される。
　本工程における培養温度は、動物細胞の培養に一般的に用いられる温度とすることができる。培養温度は、例えば、３２～４０℃とすることができ、好ましくは３５～３８℃の範囲で適宜設定できる。
　培養におけるＣＯ２濃度は、特に限定されないが、約２～５％が好ましく、５％がより好ましい。
　本工程における培養時間は、特に限定されないが、例えば、７日以上とすることができ、１４日以上が好ましく、２１日以上がより好ましく、２８日以上がさらに好ましい。培養時間の上限は特に限定されない。前記工程（ａ）の後、本工程における培地で培養を行うことにより、ＴＳ様細胞を得ることができる。得られたＴＳ様細胞は、そのまま本工程における培地で継代培養することにより、未分化のまま維持することができる。
　本工程では、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ（Ｃｏｌ　ＩＶ）コーティングしたプレート上に、工程（ａ）後の細胞を播種して培養を開始することが好ましい。また、１週間（７日間）ごとに継代することが好ましい。工程（ａ）後の細胞は、トリプシンまたはトリプシン代替物（ＴｒｙｐＬＥなど）を用いて培養プレートから剥離し、本工程における培地を含む培養プレートに播種することができる。
＜第２実施形態＞
　本実施形態の製造方法は、以下の工程を含む：
　（ａ’）哺乳動物の多能性幹細胞に、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を導入する工程；および
　（ｂ）前記工程（ａ’）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程。
（工程（ａ’））
　工程（ａ’）は、哺乳動物の多能性幹細胞に、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を導入する工程である。
　本工程で用いる哺乳動物の多能性幹細胞としては、前記「［胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞（ＴＳ様細胞）］」で例示したものと同様のものが挙げられる。哺乳動物は、好ましくは霊長類であり、好ましくはヒトである。多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
　哺乳動物の多能性幹細胞に導入する遺伝子は、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子である。これらの遺伝子は、１種を単独で導入してもよく、２種以上を組み合わせて導入してもよい。好ましくは、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａのいずれか１種の遺伝子が導入される。
　ＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、およびＴＦＡＰ２Ａ遺伝子が由来する生物は、多能性幹細胞が由来する生物と同一であることが好ましい、例えば、ヒトの多能性幹細胞を用いる場合には、ヒトのＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、およびＴＦＡＰ２Ａ遺伝子を用いることが好ましい。ヒトのＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、およびＴＦＡＰ２Ａ遺伝子の塩基配列としては、前記「［胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞（ＴＳ様細胞）］」に記載したものが挙げられる。また、他の哺乳動物が有するこれらの遺伝子の塩基配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから得ることができる。
　ＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、およびＴＦＡＰ２Ａ遺伝子は、野生型のものに限定されず、ＴＳ様細胞への誘導能を有する限り、変異（欠失、置換、挿入、及び付加のいずれか）を含むものであってもよい。「ＴＳ様細胞への誘導能」とは、当該遺伝子を多能性幹細胞に導入し、前記工程（ｂ）を行うことにより、多能性幹細胞を、上記「［胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞（ＴＳ様細胞）］」で説明した性質を有するＴＳ様細胞への分化誘導する機能を意味する。
　本工程で使用可能なＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、またはＴＦＡＰ２Ａ遺伝子としては、例えば、以下の（Ａ）～（Ｇ）が挙げられる。
（Ａ）野生型のＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、またはＴＦＡＰ２Ａ遺伝子（例、配列番号３（ＧＡＴＡ２）、配列番号１（ＧＡＴＡ３）、又は配列番号５（ＴＦＡＰ２Ａ）で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｂ）野生型のＧＡＴＡ２タンパク質、ＧＡＴＡ３タンパク質、またはＴＦＡＰ２Ａタンパク質（例、配列番号４（ＧＡＴＡ２）、配列番号２（ＧＡＴＡ３）、又は配列番号６（ＴＦＡＰ２Ａ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｃ）野生型のＧＡＴＡ２タンパク質、ＧＡＴＡ３タンパク質、またはＴＦＡＰ２Ａタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号４（ＧＡＴＡ２）、配列番号２（ＧＡＴＡ３）、又は配列番号６（ＴＦＡＰ２Ａ）で表されるアミノ酸配列）において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、且つＴＳ様細胞への誘導能を有するポリヌクレオチド。
（Ｄ）野生型のＧＡＴＡ２タンパク質、ＧＡＴＡ３タンパク質、またはＴＦＡＰ２Ａタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号４（ＧＡＴＡ２）、配列番号２（ＧＡＴＡ３）、又は配列番号６（ＴＦＡＰ２Ａ）で表されるアミノ酸配列）と、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつＴＳ様細胞への誘導能を有するポリヌクレオチド。
（Ｅ）野生型のＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、またはＴＦＡＰ２Ａ遺伝子（例、配列番号３（ＧＡＴＡ２）、配列番号１（ＧＡＴＡ３）、又は配列番号５（ＴＦＡＰ２Ａ）で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド）において、１又は複数個のヌクレオチドが変異したヌクレオチド配列からなり、且つＴＳ様細胞への誘導能を有するポリヌクレオチド。
（Ｆ）野生型のＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、またはＴＦＡＰ２Ａ遺伝子（例、配列番号３（ＧＡＴＡ２）、配列番号１（ＧＡＴＡ３）、又は配列番号５（ＴＦＡＰ２Ａ）で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド）と、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つＴＳ様細胞への誘導能を有するポリヌクレオチド。
（Ｇ）野生型のＧＡＴＡ２遺伝子、ＧＡＴＡ３遺伝子、またはＴＦＡＰ２Ａ遺伝子（例、配列番号３（ＧＡＴＡ２）、配列番号１（ＧＡＴＡ３）、又は配列番号５（ＴＦＡＰ２Ａ）で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＴＳ様細胞への誘導能を有するポリヌクレオチド。
　上記（Ｃ）及び（Ｅ）において、「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。
　上記（Ｃ）、「複数個」は、特に限定されないが、例えば、２～３０個が例示され、２～２０個が好ましく、２～１０個がより好ましく、２～５個がさらに好ましく、２個又は３個が特に好ましい。
　上記（Ｅ）において、「複数個」は、特に限定されないが、例えば、２～６０個が例示され、２～５０個が好ましく、２～４０個又は２～３０個がより好ましく、２～２０個又は２～１０個がさらに好ましく、２～５個又は２個若しくは３個が特に好ましい。
　上記（Ｄ）及び（Ｆ）において、配列同一性は、７０％以上である限り、特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。なお、アミノ酸配列同士又はヌクレオチド配列同士の配列同一性は、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を、対応するアミノ酸又はヌクレオチドが最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体又はヌクレオチド配列全体に対する一致したアミノ酸又はヌクレオチドの割合として求められる。アミノ酸配列同士又はヌクレオチド配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
　上記（Ｇ）において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載の条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が例示される。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液が挙げられる。
　上記（Ｂ）～（Ｅ）において、縮重コドンは、使用する哺乳動物の多能性幹細胞において、コドン使用頻度が高いものが用いられていることが好ましい。例えば、ヒトの多能性幹細胞に用いる場合には、ヒト細胞において使用頻度の高いコドンが用いられていることが好ましい。すなわち、ヒトコドンに最適化されていることが好ましい。
　多能性幹細胞への前記遺伝子の導入方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、前記遺伝子を、対象の多能性幹細胞で発現可能な発現ベクターにクローニングし、当該多能性幹細胞に導入することができる。
　発現ベクターは、前記遺伝子に加えて、前記遺伝子の発現を制御するプロモーターを含んでいることが好ましい。発現ベクターにおいて、当該プロモーターは、前記遺伝子の発現を制御するように前記遺伝子の上流に配置され、前記遺伝子はプロモーターに機能的に連結されている。
　プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。一例としては、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ－アクチンプロモーターとβ－グロビン遺伝子のポリＡシグナル部位を含む）を用いることができる。
　発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等を含んでいてもよい。上記のマーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。上記のマーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。上記の薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記の蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子などが挙げられる。上記の発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。上記の発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子等が挙げられる。
　発現ベクターの種類は、特に限定されず、公知の発現ベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
　エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、ＥＢＶにあっては複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ－１遺伝子、ＳＶ４０にあっては複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
　また、上記人工染色体ベクターとしては、ＹＡＣ（Yeast artificial chromosome）ベクター、ＢＡＣ（Bacterial artificial chromosome）ベクター、ＰＡＣ（P1-derived artificial chromosome）ベクター等が挙げられる。
　また、プラスミドベクターとしては、導入対象となる多能性幹細胞内で発現可能なプラスミドベクターであれば、限り特に限定されない。動物細胞発現用プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が挙げられる。
　ウイルスベクターとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。
　発現ベクターを多能性幹細胞に導入する方法は、特に限定されず、発現ベクターの種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの多能性幹細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。発現ベクターがウイルスベクターである場合には、ウイルスベクターを多能性幹細胞へ感染させる方法としては、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
　前記遺伝子を含む発現ベクターが、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を含む場合、発現ベクターを導入後に、当該抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を含む培地で細胞を培養することにより、発現ベクターが導入された細胞を効率よく選択することができる。
（工程（ｂ））
　工程（ｂ）は、前記第１実施形態の工程（ｂ）と同様である。
　本実施形態の製造方法により、多能性幹細胞から、胎盤を構成する細胞への分化能を有するＴＳ様細胞を分化誘導することができる。本実施形態の製造方法により得られるＴＳ様細胞は、哺乳動物の初期発生および胎盤機能解析等の基礎研究の研究材料として利用することができる。また、胎盤異常に起因する疾患の病態解明および治療方法の開発に利用することもできる。さらに、生殖医療や再生医療への応用も期待できる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料と方法］
（ＴＳ細胞の培養）
　ＴＳ細胞株を以前に記載された方法に従って培養した（Okae, H., Toh, H., Sato, T. et al. Cell Stem Cell 22, 50-63 e56, doi:10.1016/j.stem.2017.11.004 (2018).）。ＴＳ細胞株を、５μｇ／ｍＬのＣｏｌ　ＩＶ（354233; Corning, Corning, NY）を含むＴＳ培地で培養した。前記細胞を、５％　ＣＯ２中、３７℃で培養し、２日後に培養培地を交換した。
　ＴＳ培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan）に、下記成分を添加して調製した。
　０．１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（21985023; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）
　０．２％　ＦＢＳ（16141-079; Thermo Fisher Scientific）
　０．５％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（15140122; Thermo Fisher Scientific）
　０．３％　ＢＳＡ（017-22231; Fujifilm Wako）
　１％　ＩＴＳ－Ｘ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（094-06761; Fujifilm Wako）
　１．５μｇ／ｍｌ　Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（013-12061; Fujifilm Wako）
　５０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ（053-07871; Fujifilm Wako）
　２μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（038-23101; Fujifilm Wako）
　０．５μＭ　Ａ８３－０１（035-24113; Fujifilm Wako）
　１μＭ　ＳＢ４３１５４２（031-24291; Fujifilm Wako）
　０．８ｍＭ　ＶＰＡ（227-01071; Fujifilm Wako）
　５μＭ　Ｙ－２７６３２（036-24023; Fujifilm Wako）
（ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の培養）
　ヒトＥＳ細胞株（ＳＥＥＳ１，４，６）およびｉＰＳ細胞株（Ｎｉｐｓ－Ｂ２）を、製造元のプロトコルに従って、ＥＳ培地［３５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２(064-05381; Fujifilm Wako)および１０μＭのＹ－２７６３２(Fujifilm Wako)を添加したｈＰＳＣ　ｍｅｄｉｕｍ　ｄｅｌｔａ(197-17571; Fujifilm Wako)］中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（３５４２３４； Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。ＴｒｙｐＬＥ発現酵素（12604021; Thermo Fisher Scientific）を３７℃で５分間作用させてコロニーを解離し、継代した。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。１日後、Ｙ－２７６３２を含まないＥＳ培地に交換し、その後、毎日、Ｙ－２７６３２を含まないＥＳ培地で培地交換した。
（ＢＭＰ４シグナリングを介したＴＳ様細胞への分化誘導）
　ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、ＥＳ培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート上に、単細胞単層（１０，０００細胞／ｃｍ２）として播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。１日後、培地をＢＭＰ４培地（Krendl, C., Shaposhnikov, D., Rishko, V. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 114, E9579-E9588, doi:10.1073/pnas.1708341114 (2017).）に交換した。新鮮なＢＭＰ４培地を２４時間ごとに適用した。３日目に、ＴｒｙｐＬＥ（Thermo Fisher Scientific）を３７℃で、１３～１５分間、作用させて細胞を解離した。細胞を、１：２の分割比で、ＴＳ培地を含むＣｏｌ　ＩＶコーティングプレート上に播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で培養し、毎週継代を行った。ＢＭＰ４処理されたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、最初の継代では不均一な集団であったが、４回継代後に自己再生可能なＴＳ様コロニーが得られた。その後、ＢＭＰ４処理されたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、１：５～１：１０の分割比で、毎週、定期的に継代された。
　ＢＭＰ４培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan）に、下記成分を添加して調製した。
　２０％　ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（1082802 8; Thermo Fisher Scientific)
　１％　Ｇｌｕｔａｍａｘ（35050038; Thermo Fisher Scientific）
　１％　ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（1140050; Thermo Fisher Scientific）
　０．１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（21985023; Thermo Fisher Scientific）
　１％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Thermo Fisher Scientific）
　５０ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ４（020-18851; Fujifilm Wako）
（遺伝子導入によるＴＳ様細胞への分化誘導）
　ｃＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤクローニングキット（Takara Bio, Shiga, Japan）を使用することによって、ｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１αベースのトランスファーベクターにクローニングした。ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３またはＴＦＡＰ２ＡのｃＤＮＡをコドン最適化して（ＧＡＴＡ２：配列番号１，２、ＧＡＴＡ３：配列番号３，４、ＴＦＡＰ２Ａ：配列番号：５，６）、ｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１αベクター中に合成し、ピューロマイシン選択可能なレンチベクターに移した。ＥＳ培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート上に、ｉＰＳ細胞を単細胞単層（１００，０００細胞／ｃｍ２）として播種した。次いで、６μｇ／ｍＬのポリブレン（Sigma-Aldrich、St-Louis、MO）を添加したレンチウイルスストックに培地を交換した。感染の２４時間後から、細胞を、０．５～１．０μｇ／ｍＬピューロマイシン中で２日間培養することにより選択した。選択後、ｉＰＳ細胞を、ＴＳ培地を含むＣｏｌ　ＩＶコーティングプレートに、１：１０の分割比で播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で培養し、毎週継代を行った。遺伝子導入されたｉＰＳ細胞は、最初の継代では不均一な集団であったが、４回継代後に自己再生可能なＴＳ様コロニーが得られた。その後、遺伝子導入されたｉＰＳ細胞は、１：５～１：１０の分割比で、毎週、定期的に継代された。
　ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３およびＴＦＡＰ２Ａのクローニングに用いたプライマー（５’－３’）を以下に示す。「Ｆ」はフォワードプライマーを示し、「Ｒ」はリバースプライマーを示す（以下同様）。
　ＧＡＴＡ３＿Ｆ：ＧＣＴＡＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡ（配列番号７）
　ＧＡＴＡ３＿Ｒ：ＴＣＡＴＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＣＡＧＡ（配列番号８）
　ＧＡＴＡ２＿Ｆ：ＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡ（配列番号９）
　ＧＡＴＡ２＿Ｒ：ＧＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＧＧＣＣＴＴＣ（配列番号１０）
ＴＦＡＰ２Ａ＿Ｆ：ＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＣＴ（配列番号１１）
ＴＦＡＰ２Ａ＿Ｒ：ＡＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧ（配列番号１２）
（ＥＶＴまたはＳＴへの分化）
　絨毛外栄養膜細胞（extravillous cytotrophoblast：EVT）および合胞体栄養膜細胞（syncytiotrophoblast：ST）の分化誘導方法は以前に記載されている（Okae, H., Toh, H., Sato, T. et al. Cell Stem Cell 22, 50-63 e56, doi:10.1016/j.stem.2017.11.004 (2018).）。ＴＳ細胞またはＴＳ様細胞からＥＶＴ細胞への分化誘導のために、ＴＳ細胞およびＴＳ様細胞を、ＥＶＴ培地を含む１μｇ／ｍＬのＣｏｌ　ＩＶコーティングプレート（Corning）上に、８，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞を培地に播種した後、マトリゲル（Corning）を培地体積の２％で添加した。播種後３日目に、培地を、ＮＲＧ１（Cell Signaling）を含まないＥＶＴ培地と交換し、マトリゲル（Corning）を培地体積の０．５％で添加した。播種後６日目に、培地を、ＮＲＧ１（Cell Signaling）およびＫＳＲ（Thermo Fisher Scientific）を含まないＥＶＴ培地と交換し、マトリゲル（Corning）を培地体積の０．５％で添加した。前記培地交換後６～８日目に、細胞を分析した。
　ＥＶＴ培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan）に、下記成分を添加して調製した。
　０．５％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Thermo Fisher Scientific）
　０．３％　ＢＳＡ（Fujifilm Wako）
　１％　ＩＴＳ－Ｘ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Fujifilm Wako）
　１００　ｎｇ／ｍｌ　ＮＲＧ１（5218SC; Cell Signaling）
　７．５　μＭ　Ａ８３－０１（Fujifilm Wako）
　２．５　μＭ　Ｙ２７６３２（Fujifilm Wako）
　４％　ＫＳＲ（Thermo Fisher Scientific）
　ＴＳ細胞またはＴＳ様細胞からＳＴ細胞への分化誘導のために、ＴＳ細胞およびＴＳ様細胞を、ＳＴ培地を含む２．５μｇ／ｍＬのＣｏｌ　ＩＶコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地を播種後３日目に交換し、播種後６日目に細胞を分析した。
　ＳＴ培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（048-29785; Fujifilm Wako, Osaka, Japan）に、下記成分を添加して調製した。
　０．１　ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Thermo Fisher Scientific）
　０．５％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Thermo Fisher Scientific）
　０．３％　ＢＳＡ（Fujifilm Wako）
　１％　ＩＴＳ－Ｘ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Fujifilm Wako）
　２．５μＭ　Ｙ２７６３２（Fujifilm Wako）
　２μＭ　ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Fujifilm Wako）
　４％　ＫＳＲ（Thermo Fisher Scientific）
（ＲＮＡシーケンシング）
　全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットおよびＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（QIAGEN, Valencia, CA）を用いて抽出し、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｍＲＮＡ　ＬＴ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Illumina, San Diego, CA）を用いて、製造業者のプロトコルに従ってライブラリー構築に使用した。ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ　２２００（Agilent Technologies、Santa Clara、CA）を用いて、ＲＮＡの完全性を評価した。すべてのサンプルのＲＩＮｅ値は９を超えていた。ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＨｉＳｅｑ　２５００プラットフォーム（Illumina）で、１０１ｂｐのｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ　ｒｅａｄｓで、シーケンシングした。Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子アノテーション付きのＴｏｐＨａｔ（Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L. et al. Nat Protoc 7, 562-578, doi:10.1038/nprot.2012.016 (2012).）を用いて、リードを参照ゲノム（ＵＣＳＣ ｈｇ３８）に対して整列させた。女性の試料については、Ｙ染色体を参照ゲノムから除外した。Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子の発現レベル（ＦＰＫＭ）を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを使用して計算した（Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L. et al. Nat Protoc 7, 562-578, doi:10.1038/nprot.2012.016 (2012).）。偽常染色体領域のＸ連鎖遺伝子およびＹ連鎖遺伝子は分析から除外した。
（全ゲノムバイサルファイトシーケンシング：ＷＧＢＳ）
　ＷＧＢＳは、重亜硫酸ポストアダプタータギング（ＰＢＡＴ）法を用いて実施した（Miura, F., Enomoto, Y., Dairiki, R. et al. Nucleic Acids Res 40, e136, doi:10.1093/nar/gks454 (2012).）。簡潔に記載すると、ゲノムＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。０．５％（ｗ／ｗ）の非メチル化λファージＤＮＡ（Promega, Madison, WI）を添加したゲノムＤＮＡを、ＰＢＡＴプロトコルに従ってライブラリー調製に使用した。ＰＢＡＴ生成物の濃度は、イルミナプラットフォーム用のＫＡＰＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（KAPA Biosystems, Woburn, MA）を用いて定量した。ＰＢＡＴライブラリーは、ＨＣＳ　ｖ２．０．５およびＲＴＡ　ｖ１．１７．２０を備えたＩｌｌｕｍｉｎａ　ＨｉＳｅｑ　１５００（Illumina）で、１０１ｂｐのｓｉｎｇｌｅ－ｅｎｄ　ｒｅａｄｓでシーケンシングした。Ｂｉｓｍａｒｋ（Krueger, F. & Andrews, S. R. Bismark: Bioinformatics 27, 1571-1572, doi:10.1093/bioinformatics/btr167 (2011).）を用いて、リードを参照ゲノムに対して整列させた。各シトシンのメチル化レベル（ＵＣＳＣ　ｈｇ３８）を、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化エキストラクターを用いて計算した。各ＣｐＧサイトについて、両方の鎖からのリードを組み合わせてメチル化レベルを計算した。５回以上のリードでカバーされたＣｐＧのメチル化レベルを分析した。
（定量リアルタイムＰＣＲ解析）
　全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ＫｉｔおよびＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（QIAGEN）を用いて調製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＩＩ（Takara Bio）を用いて、全ＲＮＡからｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを合成し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems, Foster City, CA）およびＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Takara Bio）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。内部標準としてＧＡＰＤＨを用いたΔΔＣｔ法を使用して、標的ｍＲＮＡの量を決定した。
　定量リアルタイムＰＣＲ解析で用いたプライマー（５’－３’）を以下に示す。
　ＯＣＴ４＿Ｆ：ＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＣＣ（配列番号１３）
　ＯＣＴ４＿Ｒ：ＣＧＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴ（配列番号１４）
　ＮＡＮＯＧ＿Ｆ：ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＡ（配列番号１５）
　ＮＡＮＯＧ＿Ｒ：ＡＧＧＴＴＣＣＣＡＧＴＣＧＧＧＴＴＣＡ（配列番号１６）
　ＧＡＴＡ２＿Ｆ：ＴＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＧＡＡＧＡＣ（配列番号１７）
　ＧＡＴＡ２＿Ｒ：ＣＡＣＡＧＧＣＧＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧ（配列番号１８）
　ＧＡＴＡ３＿Ｆ：ＣＴＣＡＴＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＧＡＡＧ（配列番号１９）
　ＧＡＴＡ３＿Ｒ：ＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＧＣＡＣＡＧＧＡＣ（配列番号２０）
　ＴＦＡＰ２Ａ＿Ｆ：ＡＡＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡ（配列番号２１）
　ＴＦＡＰ２Ａ＿Ｒ：ＡＧＧＧＧＡＧＡＴＣＧＧＴＣＣＴＧＡ（配列番号２２）
　ＴＰ６３＿Ｆ：ＡＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡ（配列番号２３）
　ＴＰ６３＿Ｒ：ＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＴＡＣＧＴＴ（配列番号２４）
（バイサルファイトシーケンシング）
　ゲノムＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩処理は、ＥＺ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ　Ｋｉｔ（Zymo Research, Orange, CA）を使用して実施した。ＴａＫａＲａ　ＥｐｉＴａｑ　ＨＳ（Takara Bio）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を精製し、ｐＧＥＭ－Ｔベクター（Promega）にクローニングした。個々のクローンのシーケンシングは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Tokyo, Japan）によって行われた。平均して、各サンプルにつき２０クローンをシーケンシングした。
　バイサルファイトシーケンシングに用いたプライマー（５’－３’）を以下に示す。
　ＥＬＦ５＿ＢＳＦ：ＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡ(配列番号２５)
　ＥＬＦ５＿ＢＳＲ：ＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴ（配列番号２６）
（免疫染色）
　細胞を４％パラホルムアルデヒド（Fujifilm Wako）で１０分間固定し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Fujifilm Wako）で５分間透過処理し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。次に、細胞を、一次抗体ととともに、４℃で、一晩インキュベートした。二次抗体として、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８またはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５結合二次抗体（Cell Signaling）を使用した。核をヘキスト３３２５８で染色し、画像を蛍光顕微鏡（BZ-X710, Keyence, Osaka, Japan）で撮影した。
　使用した一次抗体は以下のとおりである：
　ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ＨＬＡ－Ｇ（Novus Biologicals, Littleton, CO; 1:100 dilution），
　ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ＳＤＣ１（#130-119-840, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; 1:100 dilution）
　ａｎｔｉ－ＧＡＴＡ３（#5852, Cell Signaling, Danvers, MA； 1:100 dilution）
　ａｎｔｉ－ＴＦＡＰ２Ｃ（#sc-12762, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX；　１：１００　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）
　ａｎｔｉ－ｈＣＧ（#IS508, Dako, Hamburg, Germany； 1:10 dilution）
　ａｎｔｉ－ＯＣＴ４（#4439, Cell Signaling； 1:100 dilution）
（グラフ作成）
　ＣｐＧシトシンのメチル化レベルは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）ソフトウェア（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ／）を用いて視覚化した。ヒートマップは、ｇｐｌｏｔｓパッケージのｈｅａｔｍａｐ．２機能を使用して作成され、棒グラフは、Ｒ（ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）のｇｇｐｌｏｔ２パッケージを使用して作成された。
［結果］
＜ｉＰＳ細胞から誘導されたＴＳ様細胞＞
（ｉＰＳ細胞からのＴＳ様細胞の作製）
　上記「（ＢＭＰ４シグナリングを介したＴＳ様細胞への分化誘導）」に記載の方法に従って、ｉＰＳ細胞からＴＳ様細胞を分化誘導した。その結果、ＴＳ細胞に形態が類似したＴＳ様細胞が得られた（図１参照）。
　また、上記「（遺伝子導入によるＴＳ様細胞への分化誘導）」に記載の方法に従って、ｉＰＳ細胞からＴＳ細胞を分化誘導した。その結果、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ２、およびＴＦＡＰ２Ａのいずれの遺伝子（ｃＤＮＡ）を導入した場合も、ＴＳ細胞に形態が類似したＴＳ様細胞が得られた（図１参照）。図１には、代表例として、ｉＰＳ細胞にＧＡＴＡ３遺伝子を導入して得られたＴＳ様細胞を示した。
（遺伝子発現解析）
　ｉＰＳ細胞に、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、又はＴＦＡＰ２Ａの遺伝子を導入して得られたＴＳ様細胞の遺伝子発現解析を行い、ＴＳ細胞と比較した。
　その結果を図２に示す。図２は、ｉＰＳ細胞における発現量をｌｏｇ２（１）としたときの相対発現量を示している。図２に示すように、いずれの遺伝子を導入して得られたＴＳ様細胞も、ＴＳ細胞と遺伝子発現が類似していた。また、ｉＰＳ細胞のマーカー遺伝子であるＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現も抑制されており、ＴＳ細胞と類似していた。
＜ＥＳ細胞から誘導されたＴＳ様細胞＞
（ＥＳ細胞からのＴＳ様細胞の作製）
　上記「（ＢＭＰ４シグナリングを介したＴＳ様細胞への分化誘導）」に記載の方法に従って、ＥＳ細胞からＴＳ様細胞を分化誘導した。その結果、ＴＳ細胞に形態が類似したＴＳ様細胞が得られた。
（免疫染色）
　抗ＯＣＴ４抗体（ａｎｔｉ－ＯＣＴ４）、抗ＴＦＡＰ２Ｃ抗体（ａｎｔｉ－ＴＦＡＰ２Ｃ）、及び抗ＧＡＴＡ３抗体（ａｎｔｉ－ＧＡＴＡ３）を用いて、ＴＳ様細胞、ＥＳ細胞、及びＴＳ細胞の免疫染色を行った。
　その結果を図３に示す。図中「ＥＳ－ＴＳ」は、ＥＳ細胞から誘導したＴＳ様細胞を表す（以下の図でも同様）。図３に示すように、ＥＳ細胞から誘導したＴＳ様細胞は、ＥＳ細胞よりもＴＳ細胞に遺伝子発現様式が類似していた。
（遺伝子発現解析）
　ＴＳ様細胞の遺伝子発現解析を行い、ＥＳ細胞、従来法でＥＳ細胞にＢＭＰ４処理を行った細胞（ＢＭＰ４培地で７２時間培養した細胞）、及びＴＳ細胞と比較した。
　その結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。図４Ａおよび図４Ｂ中、「ＥＳ－ＢＭＰ４」は、従来法でＥＳ細胞にＢＭＰ４処理を行った細胞を表す（以下の図でも同様）。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、ＥＳ細胞から誘導したＴＳ様細胞は、ＥＳ細胞よりもＴＳ細胞に遺伝子発現様式が類似していた。具体的には、ＴＳ様細胞では、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２の発現が陰性であり、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ２，ＴＦＡＰ２Ｃ、ＴＦＡＰ２ＡおよびＴＰ６３の発現が陽性であった。
　一方、従来法でＢＭＰ４処理を行った細胞は、ＥＳ細胞特異的な転写因子の発現が依然として高かった。また、ＴＳ細胞特異的な転写因子の発現は、ＴＳ様細胞及びＥＳ細胞よりも低かった。また、ＴＳ細胞およびＴＳ様細胞で発現が確認されたＴＰ６３は、従来法でＢＭＰ４処理を行った細胞では、ＥＳ細胞と同様に陰性であった。
　図５は、ＴＳ細胞、ＴＳ様細胞（ＥＳ－ＴＳ）、ＥＳ細胞、及び従来法でＢＭＰ４処理を行ったＥＳ細胞（ＥＳ－ＢＭＰ４細胞）の遺伝子発現の相関を示す図である。ＴＳ様細胞は、ＴＳ細胞と相関が高いことが確認できる。一方、従来法でＢＭＰ４処理を行った細胞は、ＴＳ細胞よりもＥＳ細胞と相関が高かった。
（ＤＮＡメチル化パターンの解析）
　ＴＳ様細胞のＤＮＡメチル化パターンの解析を行い、ＥＳ細胞、従来法でＥＳ細胞にＢＭＰ４処理を行った細胞、及びＴＳ細胞と比較した。
　その結果を図６に示す。図６は、２１番染色体中の１０Ｍｂの解析結果である。図６に示すように、ＥＳ細胞から誘導したＴＳ様細胞は、ＥＳ細胞よりもＴＳ細胞にＤＮＡメチル化パターンが類似していた。ＥＳ細胞では、ゲノム全体のメチル化割合は約８１％であるが、ＴＳ様細胞ではメチル化割合は約４５％に低下しており、ＴＳ細胞と同程度であった。
　一方、従来法でＢＭＰ４処理を行った細胞は、ＥＳ細胞にメチル化パターンが類似していた。
（ＥＬＦ５のＤＮＡメチル化解析）
　ＥＬＦ５遺伝子のプロモーター領域（ｃｈｒ１１：３４５１３７５３－３４５１４２７０（転写開始点：ｃｈｒ１１：３４５１３８００））について、ＴＳ様細胞、ＥＳ細胞、及びＴＳ細胞において、ＤＮＡメチル化解析を行った。ＥＬＦ５は、胎盤で低メチル化されることが報告されている遺伝子である（Hemberger M, et al., Hum Mol Genet. 2010 Jun 15;19(12):2456-67.）。
　その結果を図７に示す。図７に示すように、ＴＳ様細胞は、メチル化割合が１．０％であり、ＴＳ細胞のメチル化割合と類似していた。
　一方、従来法でＥＳ細胞にＢＭＰ４処理を行った細胞におけるＥＬＦ５のメチル化割合は、２９．５％との報告例がある（Lee CQ, et al., Stem Cell Rep. 2016 6:257-272.）。このことから、ＴＳ様細胞は、ＥＬＦ５のＤＮＡメチル化割合に関して、従来法でＢＭＰ４処理を行った細胞よりも、はるかにＴＳ細胞に近いことが確認できる。
（ＴＳ様細胞の分化試験）
　ＴＳ様細胞、及びＴＳ細胞について、上記「（ＥＶＴまたはＳＴへの分化）」に記載の方法に従い、ＥＶＴまたはＳＴへの分化試験を行った。分化させた細胞について、ＥＶＴのマーカーであるＨＬＡ－Ｇ、及びＳＴのマーカーであるｈＣＧの発現解析を行った。
　ＥＶＴへの分化試験の結果を図８Ａおよび図８Ｂに示す。図８Ａは、ＴＳ様細胞からＥＶＴへの分化を行った細胞を、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ＨＬＡ－Ｇ）を用いて免疫染色を行った結果である。また、図８Ｂは、各細胞で、ＨＬＡ－Ｇの発現量を比較した結果を示す。図８Ｂ中、「ＥＳ－ＴＳ＿ＥＶＴ」は、ＴＳ様細胞からＥＶＴに分化させた細胞を表し、「ＴＳ＿ＥＶＴ」は、ＴＳ細胞からＥＶＴに分化させた細胞を表す（図９Ｂでも同様）。
　図８Ａ及び図８Ｂに示すように、ＴＳ様細胞からＥＶＴに分化させた細胞は、ＴＳ細胞からＥＶＴに分化させた細胞と同様に、ＨＬＡ－Ｇの発現が上昇した。この結果から、ＴＳ様細胞は、ＴＳ細胞と同様に、ＥＶＴに分化できることが確認された。
　ＳＴへの分化試験の結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。図９Ａは、ＴＳ様細胞からＳＴへの分化を行った細胞を、抗ｈＣＧ抗体（ａｎｔｉ－ｈＣＧ）を用いて免疫染色を行った結果である。また、図９Ｂは、各細胞で、ｈＣＧの発現量を比較した結果を示す。
　図９Ａ及び図９ＢＢに示すように、ＴＳ様細胞からＳＴに分化させた細胞は、ＴＳ細胞からＳＴに分化させた細胞と同様に、ｈＣＧの発現が上昇した。この結果から、ＴＳ様細胞は、ＴＳ細胞と同様に、ＳＴに分化できることが確認された。
（ＤＮＭＴ１及びＺＦＡＴのＤＮＡメチル化解析）
　ＤＮＭＴ１遺伝子のプロモーター領域（ＤＮＭＴ１遺伝子の転写開始点（ｃｈｒ１９：１０１９２８３０－１０１９５７３９（転写開始点：ｃｈｒ１９：１０１９５０５４））及びＺＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域（ｃｈｒ８：１３４６９４９８４－１３４６９７８７１（転写開始点：ｃｈｒ８：１３４６９６５５８））について、ＴＳ様細胞、ＥＳ細胞、及びＴＳ細胞において、ＤＮＡメチル化解析を行った。これらの領域は、胎盤特異的にメチル化されることが知られている領域（germline differentially methylated regions：gDMRs）である。
　その結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＴＳ様細胞は、ＤＭＮＴ１遺伝子において、メチル化割合がＴＳ細胞よりも低かった。また、ＴＳ様細胞は、ＺＦＡＴ遺伝子において、メチル化割合が、ＴＳ細胞よりも高かった。これらの結果は、ＴＳ様細胞が、これらの遺伝子のメチル化パターンについては、ＴＳ細胞とは異なる特徴を有することを示している。
（ＢＲＤＴおよびＳＯＨＬＨ２の遺伝子発現解析）
　ＴＳ様細胞、ＴＳ細胞、及びＥＳ細胞において、ＢＲＤＴ遺伝子及びＳＯＨＬＨ２遺伝子の発現解析を行った。
　その結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＴＳ様細胞では、ＴＳ細胞とは異なり、ＢＲＤＴ遺伝子及びＳＯＨＬＨ２の発現はほとんど確認されなかった。これらの結果は、ＴＳ様細胞が、これらの遺伝子の発現については、ＴＳ細胞とは異なる特徴を有することを示している。
　本発明によれば、多能性幹細胞からＴＳ様細胞を製造する方法、及び前記製造方法により製造されるＴＳ様細胞が提供される。本発明により提供されるＴＳ様細胞は、哺乳動物の初期発生研究や胎盤機能解析研究に利用することができる。また、再生医療への応用も可能である。

Claims (8)

  1. 　哺乳動物の多能性幹細胞から誘導された、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞であって、ＢＲＤＴが陰性であり、ＴＰ６３が陽性である、細胞。
  2. 　Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２からなる群より選択される少なくとも１種が陰性である、請求項１に記載の細胞。
  3. 　ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種が陽性である、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. 　ゲノムＤＮＡのメチル化の割合がゲノム全体の６０％以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
  5. 　胎盤を構成する細胞が、絨毛外栄養膜細胞または合胞体栄養膜細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞。
  6. 　以下の工程を含む、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法：
    　（ａ）哺乳動物の多能性幹細胞を、骨形成因子４を含有する培地で培養する工程；および
    　（ｂ）前記工程（ａ）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程。
  7. 　以下の工程を含む、胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法：
    　（ａ’）哺乳動物の多能性幹細胞に、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、およびＴＦＡＰ２Ａからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を導入する工程；および
    　（ｂ）前記工程（ａ’）の後に得られた細胞を、成長因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程。
  8. 　前記工程（ｂ）における培地が、さらにＡＬＫ５阻害剤、およびＧＳＫ３β阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項６又は７に記載の胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞の製造方法。
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