WO2023021591A1 - 子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル - Google Patents

子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル Download PDF

Info

Publication number
WO2023021591A1
WO2023021591A1 PCT/JP2021/030100 JP2021030100W WO2023021591A1 WO 2023021591 A1 WO2023021591 A1 WO 2023021591A1 JP 2021030100 W JP2021030100 W JP 2021030100W WO 2023021591 A1 WO2023021591 A1 WO 2023021591A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
medium
endometrial
model
endometrium
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/030100
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆博 有馬
峻 柴田
寛明 岡江
Original Assignee
国立大学法人東北大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東北大学 filed Critical 国立大学法人東北大学
Priority to EP21954165.3A priority Critical patent/EP4390899A1/en
Priority to PCT/JP2021/030100 priority patent/WO2023021591A1/ja
Priority to JP2023542074A priority patent/JPWO2023021591A1/ja
Publication of WO2023021591A1 publication Critical patent/WO2023021591A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • G—PHYSICS
    • G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
    • G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
    • G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
    • G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
    • G09B23/30—Anatomical models
    • G09B23/34—Anatomical models with removable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/02—Coculture with; Conditioned medium produced by embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to an endometrium model, an endometrium model preparation method, and an endometrium implantation model.
  • the endometrium is an epithelial tissue that exists in the uterus and is a tissue necessary for the establishment of pregnancy.
  • the functional layer of the endometrium undergoes monthly cycles of regeneration, differentiation, and shedding.
  • the functional layer of the endometrium proliferates in an estrogen-dependent manner, regenerates the mucosa, and differentiates into a progesterone-dominant secretory phase.
  • the supraciliary luminal epithelium is implanted with a fertilized egg, providing the microenvironment essential for placentation.
  • Non-Patent Document 1 has a simple spherical structure, and is different from the endometrial structure of a living body in terms of spatial morphology. Also, embryo implantation cannot be simulated because the apical surface that receives the embryo is internal to the structure.
  • the present invention provides an endometrium model in which the apical surface of endometrial epithelial cells is exposed, a method for producing the endometrium model, and an endometrium implantation model using the endometrium model.
  • the challenge is to
  • the present invention includes the following aspects.
  • An endometrial model wherein at least a portion of the exposed endometrial epithelial cells form a continuous luminal and non-luminal structure.
  • [4] The endometrium model according to any one of [1] to [3], wherein part of the endometrial epithelial cells are present inside the gel.
  • [5] (a) a step of allowing endometrial epithelial cells to exist inside a gel containing a stromal extracellular matrix; and (b) a step of culturing the endometrial epithelial cells after step (a).
  • a method for producing an endometrium model comprising: [6] The method for producing an endometrium model according to [4], wherein the stromal extracellular matrix is type I collagen.
  • An endometrial implantation model comprising the endometrial model of any one of [1] to [4] and an embryonic cell.
  • an endometrium model in which the apical surface of endometrial epithelial cells is exposed a method for producing the endometrium model, and an endometrium implantation model using the endometrium model are provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of an endometrial implantation model
  • FIG. 2 shows bright-field phase-contrast microscopy images of endometrial models made using Matrigel or type I collagen gels. Immunostaining images of an endometrium model prepared using Matrigel or type I collagen gel are shown.
  • FIG. 4 shows an immunostained image of an endometrium model prepared using type I collagen gel.
  • FIG. Images of endometrial epithelial cells plated with Matrigel or type I collagen gel are shown.
  • 1 shows an endometrium implantation model produced by co-culturing an endometrium model produced using type I collagen gel and a blastocyst-like structure derived from ES cells.
  • 1 shows an endometrium implantation model produced by co-culturing an endometrium model produced using type I collagen gel and a blastocyst-like structure derived from TS cells.
  • the top image is a merged fluorescence microscope image that detected GFP, OCT4, SCD1, F-actin, and Hoechast. Merged in the lower image is an enlarged view of the boxed portion of the upper image.
  • GFP (TSC) in the lower image is a fluorescence microscope image in which GFP in the boxed portion of the upper image was detected.
  • SDC1 in the lower image is a fluorescence microscope image in which SDC1 in the squared portion of the upper image was detected.
  • the term “comprise” means that it may include elements other than the subject element.
  • the term “consist of” means containing no elements other than the subject element.
  • the term “consisting essentially of” means that it does not include constituent elements other than the subject constituent elements in a mode that exhibits a special function (such as a mode that completely loses the effect of the invention). means.
  • the word “comprise” includes aspects that "consist of” and aspects that "consist essentially of.”
  • the "cells” described herein can be isolated. “Isolated” means separated from the natural state. A "cell” as described herein can be an isolated cell.
  • Endometrial model A first aspect of the present disclosure is an endometrial model.
  • the endometrial model comprises a gel comprising a stromal extracellular matrix and endometrial epithelial cells.
  • at least a portion of said endometrial epithelial cells are exposed on the surface of said gel.
  • at least a portion of the endometrial epithelial cells exposed on the surface of the gel form a series of luminal and non-luminal structures.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an endometrium model of one embodiment.
  • the endometrium model 1 includes a gel 20 containing a stromal extracellular matrix and cell aggregates (10a, 10b) of endometrial epithelial cells.
  • the cell aggregates 10a are cell aggregates of endometrial epithelial cells exposed on the surface of the gel 20 containing the stromal extracellular matrix.
  • the cell aggregate 10b is a cell aggregate of endometrial epithelial cells present inside the gel 20 containing the stromal extracellular matrix.
  • the cell aggregate 10a is exposed on the surface of the gel 20 containing the interstitial extracellular matrix, and has a structure in which a luminal structure 11 and a non-luminal structure 12 are continuously formed.
  • a “luminal structure” refers to a structure in which endometrial epithelial cells are invaginated on the side of the gel 20 containing the interstitial extracellular matrix.
  • a “non-luminal structure” refers to a structure that is not a luminal structure. Examples of non-luminal structures include, for example, flattened membranous structures.
  • a structure "in which a luminal structure and a non-luminal structure are continuously formed" includes at least one luminal structure and at least one non-luminal structure, and the luminal structure and the non-luminal structure are connected.
  • the number of luminal structures 11 possessed by the cell aggregate 10a is not particularly limited. Depending on the size of the cell aggregate 10a, the cell aggregate 10a can have multiple luminal structures 11. FIG. When the cell aggregate 10a has a plurality of luminal structures 11, two luminal structures 11 are connected by a non-luminal structure 12. As shown in FIG.
  • the endometrial epithelial cells that make up the luminal structure 11 may express progesterone receptor (PGR).
  • PGR progesterone receptor
  • the luminal structure 11 may have functions similar to mature endometrial glandular epithelium.
  • the gel 20 containing the stromal extracellular matrix contains the stromal extracellular matrix.
  • a "stromal extracellular matrix” is an extracellular matrix that is predominantly present in the stroma.
  • stromal extracellular matrices include type I collagen, proteoglycans (versican, decorin, etc.), fibronectin, and the like. Among them, type I collagen is preferable as the stromal extracellular matrix.
  • the stromal extracellular matrix contained in the gel 20 containing the stromal extracellular matrix may be one type or two or more types.
  • the gel 20 containing the stromal extracellular matrix may contain other extracellular matrices in addition to the stromal extracellular matrix.
  • extracellular matrices include basement membrane extracellular matrices such as laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin; cartilage extracellular matrices such as hyaluronic acid, type II collagen, and link proteins. .
  • commercially available products such as Matrigel (registered trademark) may be used.
  • the other extracellular matrices may be of one type or two or more types.
  • the gel 20 containing the stromal extracellular matrix is 50% by volume or more, 55% by volume or more, 60% by volume or more, 65% by volume or more, 70% by volume or more, 75% by volume or more, or 80% by volume, based on the total gel volume. It preferably contains stromal extracellular matrix gel at vol % or more. The gel 20 containing the stromal extracellular matrix may be 100% by volume of the stromal extracellular matrix gel.
  • the endometrium model 1 can be maintained in culture medium or the like.
  • the medium is not particularly limited as long as it is a medium capable of maintaining the endometrium model 1.
  • Examples of the medium include a medium obtained by adding a growth factor, a ROCK inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor, a p38 MAPK inhibitor, a maturation inducer, etc. to a basal medium generally used for culturing animal cells.
  • basal media examples include Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, DMEM/F12 medium, Advanced DMEM/F12 medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Examples include Ham's F12 medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • DMEM/F12 Doulbecco's modified Eagle's Medium
  • DMEM/F12 medium examples include Ham's F12 medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • Preferred basal media include, for example, DMEM/F12.
  • the basal medium may contain serum (such as fetal bovine serum (FBS)) and/or serum substitutes, if necessary.
  • Serum replacements include, for example, albumin, transferrin, sodium selenite, ITS-X (Invitrogen), knockout serum replacement (KSR), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, Insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, etc.
  • the basal medium optionally contains lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax, non-essential amino acids, vitamins, growth It may contain components such as factors, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. These can be used in combination as appropriate.
  • basal medium for example, bovine serum albumin (BSA), ITS-X, L-ascorbic acid, and antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.) are added to the above basal medium (eg, DMEM/F12). media.
  • BSA bovine serum albumin
  • ITS-X ITS-X
  • L-ascorbic acid ITS-X
  • antibiotics penicillin, streptomycin, etc.
  • TS basal medium used in Examples described later.
  • growth factors include, but are not limited to, epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), bone morphogenic protein (BMP), and the like. .
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • BMP bone morphogenic protein
  • EGF binds to the EGF receptor (EGFR) present on the cell surface, induces EGF signaling, and acts as a mitogenic factor.
  • the organism from which EGF is derived is not particularly limited, but human EGF is preferred.
  • Human FGF may be recombinant produced by non-human cells.
  • a commercially available EGF can be used.
  • the concentration of EGF in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 5-200 ng/mL.
  • the concentration of EGF in the medium is preferably 10-150 ng/mL, more preferably 10-100 ng/mL, even more preferably 10-80 ng/mL, and particularly preferably 10-60 ng/mL.
  • FGF has a high affinity for heparan sulfate proteoglycans, forms a complex with heparan sulfate proteoglycans and the FGF receptor (FGFR) on the cell surface, induces FGF signaling, and acts as a mitogenic factor.
  • the organism from which FGF is derived is not particularly limited, but human FGF is preferred. Human FGF may be recombinant produced by non-human cells.
  • FGF2 also referred to as bFGF
  • a commercially available FGF can be used.
  • the concentration of FGF (eg, FGF2) in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 5-200 ng/mL.
  • the concentration of FGF (eg, FGF2) in the medium is preferably 10-150 ng/mL, more preferably 20-100 ng/mL, still more preferably 30-80 ng/mL, and particularly preferably 40-60 ng/mL.
  • the medium may contain heparin.
  • Heparin has the effect of promoting the activity of FGF.
  • Heparin is preferably in the form of a salt.
  • heparin salts include salts with alkali metals such as lithium, sodium and potassium; salts with alkaline earth metals such as calcium, barium and magnesium; salts with metals such as aluminum, zinc, copper and iron; ammonium salts; salts with organic bases; and salts with amino acids.
  • Commercially available heparin can be used.
  • the concentration of heparin in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.001-10 ⁇ g/mL.
  • BMP is a protein belonging to the transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ) superfamily, and controls cell death induction, cell differentiation, and the like.
  • Organisms from which BMPs are derived are not particularly limited, but human BMPs are preferred. Human BMPs may be recombinant produced by non-human cells.
  • BMP4 is preferred as the BMP.
  • a commercially available BMP can be used.
  • the concentration of BMP (eg, BMP4) in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 5-200 ng/mL.
  • the concentration of BMP (eg, BMP4) in the medium is preferably 10-150 ng/mL, more preferably 20-100 ng/mL, even more preferably 30-80 ng/mL, and particularly preferably 40-60 ng/mL.
  • ROCK (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase) inhibitor is a substance that inhibits the function of Rho-associated kinase.
  • ROCK inhibitors include trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide, 1-(5-isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine (1-(5-Isoquinolinylsulfonyl ) homopiperazine), or salts thereof.
  • ROCK inhibitors may be antisense nucleic acids against ROCK, siRNA, dominant negative mutants, expression vectors thereof, and the like.
  • Commercial products of trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide or a salt thereof include Y27632 ((R)-(+)-trans-N-(4-pyridyl)- 4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide.2HCl.H 2 O) and the like.
  • ROCK inhibitors may be used singly or in combination of two or more.
  • Y27632 is preferably used as the ROCK inhibitor.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1-50 ⁇ M, preferably 1-20 ⁇ M, more preferably 1-15 ⁇ M, and even more preferably 3-12 ⁇ M.
  • a GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the function of GSK3 ⁇ , such as kinase activity (eg, ability to phosphorylate ⁇ -catenin).
  • GSK3 ⁇ inhibitors include, for example, 6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl] Amino]nicotinonitrile, Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, CHIR98014, AR-A014418, CT99021, CT20026, SB216763, AR-A014418, Lithium, SB415286, TDZD-8, BIO, BIO-acetoxime, (5 -methyl-1H-pyrazol-3-yl)-(2-phenylquinazolin-4-yl)amine, pyridocarbazole-cyclopentadienylruthenium complex, TDZD-8 4-benzyl-2-methyl- 1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione, 2-thio(3-iodobenzyl)-5-(1-pyridyl
  • GSK3 ⁇ inhibitors may be antisense nucleic acids, siRNAs, dominant negative mutants against GSK3 ⁇ , expression vectors thereof, etc. 6-[[2-[[4 Commercially available products of -(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]nicotinonitrile include CHIR99021. GSK3 ⁇ inhibitors may be used singly or in combination of two or more. CHIR99021 is preferably used as the GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1-20 ⁇ M, preferably 0.2-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M, and 0.5-3 ⁇ M is more preferred.
  • a p38 MAPK inhibitor is a substance that inhibits the function of p38 MAPK (P38 mitogen-activated protein kinase).
  • Examples of p38 MAPK inhibitors include SB202190 (4-(4-fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole), SB203580 (4-[4-( 4-fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-1H-imidazol-5-yl]pyridine), VX702 (6-(N-carbamoyl-2,6-difluoroanilino)-2-( 2,4-difluorophenyl)pyridine-3-carboxamide), VX745 (5-(2,6-dichlorophenyl)-2-[2,4-difluorophenyl)thio]-6H-pyrimido[1,6-b] pyri
  • a maturation inducer is a factor that induces maturation of endometrial cells.
  • the maturation-inducing factor is not particularly limited as long as it can induce maturation of endometrial cells.
  • Maturation inducers include, for example, estrogen receptor ligands, progesterone receptor ligands, cyclic AMP (cAMP) or derivatives thereof, prolactin, placental lactogen, chorionic gonadotropin and the like.
  • Estrogen receptor ligands are substances that bind to the estrogen receptor. Examples of estrogen receptor ligands include estrone, estradiol, estriol and the like. Examples of estradiol include ⁇ -estradiol, 17 ⁇ -estradiol and the like. Estrogen receptor ligands may be used singly or in combination of two or more. Estrogen receptor ligand is preferably estradiol. The concentration of the estrogen receptor ligand in the medium is not particularly limited. .
  • a progesterone receptor ligand is a substance that binds to the progesterone receptor.
  • Progesterone receptor ligands include progesterone, medroxyprogesterone acetate and the like. Progesterone receptor ligands may be used singly or in combination of two or more. Medroxyprogesterone acetate is preferably used as the progesterone receptor ligand.
  • the concentration of progesterone or a derivative thereof in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 20 ⁇ M, preferably 0.2 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 5 ⁇ M, and 0.5 to 3 ⁇ M is even more preferred.
  • cAMP or derivatives thereof include 8-bromoadenosine-3′-5′-cyclic monophosphate (8-Br-cAMP), dibutyryl-cAMP, 8-CPT-2-Me-cAMP sodium salt (8-(4 -Chlorophenylthio)-2′-O-methyladenosine-3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt) and the like.
  • 8-Br-cAMP is preferably used as cAMP or a derivative thereof.
  • the concentration of cAMP or a derivative thereof in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 200 ⁇ M, preferably 1 to 150 ⁇ M, more preferably 10 to 100 ⁇ M, and even more preferably 20 to 80 ⁇ M.
  • Prolactin is a hormone secreted from prolactin-secreting cells in the anterior pituitary gland.
  • the organism from which prolactin is derived is not particularly limited, but human prolactin is preferred.
  • Human prolactin may be recombinant produced by non-human cells.
  • Commercially available prolactin can be used.
  • the concentration of prolactin in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 5-200 ng/mL.
  • the concentration of prolactin in the medium is preferably 10-150 ng/mL, more preferably 10-100 ng/mL, even more preferably 10-80 ng/mL, and particularly preferably 10-60 ng/mL.
  • Placental lactogen is a peptide hormone secreted from the placenta.
  • the organism from which the placental lactogen is derived is not particularly limited, but human placental lactogen is preferred.
  • the human placental lactogen may be recombinant produced by non-human cells.
  • a commercially available placental lactogen can be used.
  • the concentration of placental lactogen in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 5-200 ng/mL.
  • the concentration of the placental lactogen in the medium is preferably 10-150 ng/mL, more preferably 10-100 ng/mL, even more preferably 10-80 ng/mL, and particularly preferably 10-60 ng/mL.
  • Chorionic gonadotropin is a peptide hormone secreted from the trophoblast syncytium.
  • the organism from which chorionic gonadotropin is derived is not particularly limited, but human chorionic gonadotropin is preferred.
  • the human chorionic gonadotropin may be recombinant produced by non-human cells.
  • a commercially available chorionic gonadotropin can be used.
  • the concentration of chorionic gonadotropin in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.01-100 ⁇ g/mL.
  • the concentration of chorionic gonadotropin in the medium is preferably 0.05 to 50 ⁇ g/mL, more preferably 0.1 to 20 ⁇ g/mL, still more preferably 0.2 to 10 ⁇ g/mL, and 0.5 to 5 ⁇ g/mL. Especially preferred.
  • a basal medium for animal cells e.g., TS basal medium, etc.
  • a growth factor EGF, etc.
  • a ROCK inhibitor Y27632, etc.
  • a GSK3 ⁇ inhibitor CHR99021, etc.
  • media supplemented with p38 MAPK inhibitors SB202190, etc.
  • ECSY medium used in Examples described later.
  • further maturation-inducing factors prolactin, placental lactogen, chorionic gonadotropin, etc.
  • growth factors EGF, etc.
  • ROCK inhibitors Y27632, etc.
  • GSK3 ⁇ inhibitors CHR99021, etc.
  • p38 MAPK inhibitors SB202190, etc.
  • a basal medium for animal cells e.g., TS basal medium, etc.
  • maturation-inducing factors estradiol, medroxyprogesterone acetate, 8-Br-cAMP, prolactin, placental lactogen, chorionic gonadotropin, etc.
  • maturation-inducing factors estradiol, medroxyprogesterone acetate, 8-Br-cAMP, prolactin, placental lactogen, chorionic gonadotropin, etc.
  • Specific examples of such a medium include, for example, ECSY+EPC medium used in the Examples described later, human prolactin (e.g., 20 ng/mL), human placental lactogen (e.g., 20 ng/mL), human chorionic gonadotropin ( 1 ⁇ g/mL) (eg, ECSY+EPC+PLG medium).
  • the endometrium model of this embodiment has a structure in which endometrial epithelial cells are exposed on the gel surface. Furthermore, it has a luminal structure similar to the endometrial glandular epithelium. These structural features resemble the endometrium in vivo. Therefore, the endometrium model of this embodiment can be applied to drug screening and drug evaluation for diseases related to the endometrium (endometriosis, endometrial cancer, etc.). Also, since the apical surface of the endometrial epithelial cells is exposed, it is possible to simulate implantation. Therefore, it can be applied to elucidation of the mechanism of implantation or implantation failure, screening of therapeutic agents for implantation failure, and evaluation of therapeutic agents for implantation failure.
  • a second aspect of the present disclosure is a method of creating an endometrium model.
  • the method according to this aspect comprises the steps of (a) allowing endometrial epithelial cells to exist inside a gel containing a stromal extracellular matrix; and (b) culturing the endometrial epithelial cells. include.
  • step (a)> endometrial epithelial cells are present inside a gel containing a stromal extracellular matrix.
  • Endometrial epithelial cells may be isolated from endometrial epithelial tissue, or cultures of endometrial epithelial cells may be used.
  • a known method can be used to isolate endometrial epithelial tissue from endometrial tissue.
  • Decidua may be used as the endometrial epithelial tissue.
  • Endometrial epithelial cells can be isolated, for example, by separating the cells, using mechanical and/or enzymatic treatments as appropriate on the endometrial epithelial tissue. Mechanical treatments include cutting with a scalpel.
  • the enzymatic treatment includes treatment with a protease (eg, dispase, collagenase, etc.) having extracellular matrix degrading activity.
  • the endometrial epithelial cells can be collected using a strainer, filter, or the like.
  • the collected endometrial epithelial cells may be appropriately washed with a medium or the like.
  • the gel containing the interstitial extracellular matrix can be the same one as described above.
  • a gel containing a stromal extracellular matrix preferably contains type I collagen as the stromal extracellular matrix.
  • the method for allowing endometrial epithelial cells to exist inside the gel containing the stromal extracellular matrix is not particularly limited.
  • cells may be collected from a culture solution of endometrial epithelial cells by centrifugation or the like, and mixed with a gel containing a stromal extracellular matrix.
  • endometrial epithelial cells may be suspended in an appropriate medium to prepare a cell suspension, and the cell suspension may be injected into a gel containing a stromal extracellular matrix.
  • the number of endometrial epithelial cells to be seeded on the gel containing the stromal extracellular matrix is not particularly limited.
  • the number of seeded cells is, for example, 1 or more, 10 or more, 10 2 or more, 10 3 or more, 10 4 or more, 10 5 or more, 10 6 or more, 10 7 or more, 10 8 or more. , 10 9 or more, or 10 10 or more.
  • the upper limit of the number of seeded cells is not particularly limited. Examples include 10 20 or less, 10 15 or less, 10 14 or less, 10 13 or less, or 10 12 or less. The lower limit value and the upper limit value can be appropriately combined.
  • step (b) In step (b), the endometrial epithelial cells are cultured after step (a).
  • Cultivation may be performed by adding an appropriate medium to a gel containing a stromal extracellular matrix containing endometrial epithelial cells.
  • culture vessels include, but are not limited to, untreated well plates, untreated dishes, and the like.
  • the culture medium those listed above can be used. It is preferable to replace the medium appropriately during the culture.
  • the frequency of medium replacement is not particularly limited, but includes, for example, 2 to 3 times a week.
  • a maturation-inducing factor may be added to the medium as appropriate to promote the maturation of endometrial epithelial cells. For example, at the initial stage of culture, culture may be performed in a medium containing no maturation-inducing factor. Subsequently, the medium may be replaced with a maturation-inducing factor-containing medium and further cultured.
  • the culture period in a maturation factor-free medium is, for example, 1 day or longer, 2 days or longer, 3 days or longer, 4 days or longer, 5 days or longer, 6 days or longer, or 7 days or longer. is mentioned.
  • the upper limit of the culture period in a maturation factor-free medium is not particularly limited, but for example, 30 days or less, 25 days or less, 20 days or less, 15 days or less, 12 days or less, or 10 days. Examples include the following.
  • the lower limit value and the upper limit value can be appropriately combined.
  • the culture period in a maturation factor-containing medium is, for example, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, or 7 days or more. mentioned.
  • the upper limit of the culture period in a maturation factor-containing medium is not particularly limited, but for example, 30 days or less, 25 days or less, 20 days or less, 15 days or less, 12 days or less, 10 days or less is mentioned.
  • the lower limit value and the upper limit value can be appropriately combined.
  • the maturation-inducing factor is selected from the group consisting of estrogen receptor ligands, progesterone receptor ligands, cAMP or derivatives thereof, prolactin, placental lactogen, and chorionic gonadotropin.
  • a medium containing 3 or more, 4 or more, or 5 or more maturation-inducing additive factors may be used.
  • a medium containing all of estrogen receptor ligand, progesterone receptor ligand, cAMP or derivatives thereof, prolactin, placental lactogen, and chorionic gonadotropin eg, ECSY+EPC+PLG medium
  • ECSY+EPC+PLG medium ECSY+EPC+PLG medium
  • the endometrial epithelial cells inside the gel containing the stromal extracellular matrix migrate within the gel, and some cells reach the gel surface. Cells reaching the gel surface form a continuous structure of luminal and non-luminal structures on the gel surface. Culturing in the maturation-inducing factor-containing medium can be continued until the endometrial epithelial cells form the structure.
  • the culture conditions can be those generally used for culturing animal cells.
  • the culture temperature can be 32-40° C. (preferably 35-38° C., typically 37° C.) and the CO 2 concentration can be 2-5% (preferably 5%).
  • the endometrium model according to the first aspect can be produced.
  • a third aspect of the present disclosure is an endometrial implantation model.
  • the endometrial implantation model according to this aspect includes the endometrial model according to the first aspect and an embryonic cell.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an endometrial implantation model of one embodiment.
  • Endometrial implantation model 2 includes endometrial model 1 and embryonic cells 30 .
  • Embryonic cells 30 may or may not be implanted on the apical surface of the endometrium model 1 .
  • Embryonic cells refer to cells that can simulate implantation into the endometrium.
  • a fertilized egg travels through the fallopian tube and reaches the uterus.
  • a fertilized egg cleaves while moving through the fallopian tube, and becomes a blastocyst through a 2-cell stage embryo, a 4-cell stage embryo, an 8-cell stage embryo, and a morula.
  • the blastocyst reaches the uterus, it becomes an expanded blastocyst, the zona pellucida becomes thin, and the zona pellucida breaks to become a post-hatching blastocyst. After hatching, the blastocyst settles against the endometrium.
  • a blastocyst is composed of an inner cell mass, a blastocyst cavity, and a trophoblast, and trophoblast cells invade the endometrium to establish implantation.
  • Embryonic cells are typically cells that constitute an embryo, and may be any of fertilized eggs, 2-cell stage embryos, 4-cell stage embryos, 8-cell stage embryos, morulae, and blastocysts. .
  • the embryonic cell may be a cell isolated from an embryo as described above or a cell derived from said isolated cell.
  • Embryonic cells may be pluripotent stem cells or cells derived from pluripotent stem cells.
  • Embryonic cells may be cells isolated from the placenta or cells derived from said cells.
  • Embryonic cells include, for example, trophoblastic stem cells, cytotrophoblastic cells, extravillous trophoblastic cells, syncytial trophoblastic cells, pluripotent stem cells, and cells derived from these.
  • Trophoblast stem cells may be derived from blastocysts, may be derived from cytotrophoblast cells (CT cells), It may also be derived from a potential stem cell. Induction of TS cells from blastocysts can be performed by known methods. For example, mechanical and/or enzymatic treatments are optionally used on placental tissue to separate cells. Then, after culturing the cells in a medium that induces TS cells, TS cells are established using the expression of TS cell markers (GATA2-positive, GATA3-positive, TFAP2-positive, ELF5-positive, ZNF750-positive, CDX2-negative, etc.) as indicators. can be done.
  • TS cell markers GATA2-positive, GATA3-positive, TFAP2-positive, ELF5-positive, ZNF750-positive, CDX2-negative, etc.
  • a method for inducing TS cells from CT cells for example, the method described in Japanese Patent No. 6400832 can be used.
  • a method for inducing TS cells from pluripotent stem cells for example, the method described in International Publication No. 2020/250438 and the like can be used.
  • CT cells isolated from the placenta can be used. Isolation of CT cells from the placenta can be achieved, for example, by appropriately using mechanical and/or enzymatic treatments on the placental tissue to separate the cells and determine the expression of CT cell markers (CD49f-positive, E-cadherin-positive, etc.). As an indicator, CT cells can be isolated (Patent No. 6400832, Haider, S., et al., Stem Cell Reports 11, 537-551 (2016).)
  • Syncytiotrophoblast cells may be isolated from the placenta or may be derived from TS cells. Isolation of ST cells from the placenta is, for example, using mechanical and/or enzymatic treatments on the placental tissue as appropriate to separate the cells and detect ST cell markers (Syndecan 1 (SDC1) positive, human chorionic gonadotropin (hCG ) positive, etc.) can be used as an index to isolate ST cells.
  • ST cell markers Syndecan 1 (SDC1) positive, human chorionic gonadotropin (hCG ) positive, etc.
  • Methods for inducing ST cells from TS cells include, for example, the methods described in International Publication No. 2020/250438 and the like.
  • Extravillous trophoblast cells may be isolated from placenta or may be derived from TS cells. Isolation of EVT cells from the placenta can be achieved, for example, by appropriately using mechanical and/or enzymatic treatment on the placental tissue to separate the cells, and using the expression of an EVT cell marker (such as HLA-G positive) as an index, EVT cells can be isolated. Methods for inducing EVT cells from TS cells include, for example, the methods described in International Publication No. 2020/250438.
  • Pluripotent stem cells are cells having pluripotency, and may be embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells). It may also be a cell having pluripotency induced from these stem cells.
  • a method for producing pluripotent stem cells is not particularly limited, and known methods can be used.
  • Cell lines of ES cells and iPS cells are also available from cell banks such as the RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC).
  • Pluripotent stem cells are preferably ES cells or iPS cells, more preferably ES cells.
  • Embryonic cells may form spheroids or organoids. Formation of spheroids or organoids from embryonic cells can be performed by known methods. For example, using a medium as described above (for example, a medium supplemented with a growth factor, a ROCK inhibitor, a GSK ⁇ inhibitor, and a p38 MAPK inhibitor in a basal medium), the embryo cells are cultured in suspension to obtain Spheroids or organoids can be produced.
  • a medium as described above for example, a medium supplemented with a growth factor, a ROCK inhibitor, a GSK ⁇ inhibitor, and a p38 MAPK inhibitor in a basal medium
  • the embryonic cell spheroids or organoids may be cell aggregates derived from TS cells.
  • cell aggregates can be induced by suspension culture of TS cells in TS medium (Okae et al Cell Stem Cell 2018).
  • the cell aggregate may contain one or more cells selected from the group consisting of TS cells, CT cells, ST cells, and EVT cells, and the group consisting of TS cells, CT cells, and ST cells. It may contain one or more selected cells.
  • the spheroids or organoids of embryonic cells may be blastocyst-like structures.
  • a blastocyst-like structure is a cell structure having a structure similar to that of a blastocyst derived from cells with pluripotency such as pluripotent stem cells.
  • Blastocyst-like structures can be induced by known methods (eg, Yu L, et al., Nature. 2021 Mar;591(7851):620-626.).
  • blastocyst-like structures can be obtained by culturing pluripotent stem cells using 5i/L/A medium, then HDM medium, and then TDM medium.
  • Naive type pluripotent stem cells may be used or primed type pluripotent stem cells may be used, but naive type pluripotent stem cells are preferably used.
  • An endometrial implantation model can be produced by co-culturing an endometrium model and embryonic cells.
  • the medium used for co-cultivation is not particularly limited, but in addition to the above-mentioned medium, IVC1 medium, IVC2 medium, etc. used in Examples can be mentioned.
  • a basal medium for animal cells for example, TS basal medium
  • a growth factor for example, TS basal medium
  • a ROCK inhibitor for example, Y27632, etc.
  • a GSK3 ⁇ inhibitor for example, a GSK3 ⁇ inhibitor
  • p38 MAPK Inhibitors SB202190 etc.
  • maturation-inducing factors estradiol, medroxyprogesterone acetate, 8-Br-cAMP etc.
  • a medium supplemented with a maturation-inducing factor such as prolactin, placental lactogen, or chorionic gonadotropin may be used as the co-culture medium.
  • a maturation-inducing factor such as prolactin, placental lactogen, or chorionic gonadotropin
  • growth factors EGF, etc.
  • ROCK inhibitors Y27632, etc.
  • GSK3 ⁇ inhibitors CHIR99021, etc.
  • p38 MAPK inhibitors SB202190, etc.
  • a basal medium for animal cells e.g., TS basal medium, etc.
  • maturation-inducing factors estradiol, medroxyprogesterone acetate, 8-Br-cAMP, prolactin, placental lactogen, chorionic gonadotropin, etc.
  • maturation-inducing factors eg, ECSY+EPC+PLG medium.
  • the co-culture medium includes a basal medium for animal cells (e.g., DMEM/F12 medium, Advanced DMEM/F12 medium, etc.), serum (FBS, etc.), serum substitutes (ITS-X, KSR, etc.), A medium containing amino acids (L-glutamine, N-acetyl-L-cysteine, etc.), organic acids (pyruvic acid, lactic acid, etc.), maturation inducers (estrogen receptor ligands, progesterone receptor ligands, etc.), etc. (for example, IVC1 medium, IVC2 medium, etc.).
  • a basal medium for animal cells e.g., DMEM/F12 medium, Advanced DMEM/F12 medium, etc.
  • serum FBS, etc.
  • serum substitutes ITS-X, KSR, etc.
  • a medium containing amino acids L-glutamine, N-acetyl-L-cysteine, etc.
  • organic acids pyruvic acid, lactic
  • co-cultivation may be performed in IVC1 medium for a predetermined period from the start of co-culture (e.g., half to three days, half to two days, or half to one day), and then co-cultured in IVC2 medium. .
  • the culture conditions can be those generally used for culturing animal cells.
  • a culture temperature of 32-40° C. (preferably 35-38° C., typically 37° C.) and a CO 2 concentration of 2-5% (preferably 5%) can be used.
  • the embryonic cell spheroids or organoids When embryonic cell spheroids or organoids are co-cultured with an endometrium model, the embryonic cell spheroids or organoids can be implanted on the apical surface of the endometrium model. In the implanted spheroids or organoids, the cells at the implantation site may be differentiated into SDC1-positive cells (eg, ST cells).
  • SDC1-positive cells eg, ST cells
  • the endometrium implantation model according to this aspect includes the endometrium model of the first aspect and embryonic cells, and therefore can simulate implantation into the endometrium. Therefore, the endometrial implantation model according to this aspect can be applied to elucidation of the mechanism of implantation or implantation failure, screening of drugs for implantation failure, and the like.
  • TS basal medium A TS basal medium was prepared by adding the following components to DMEM/F12 medium (FUJIFILM Wako). The concentrations given below are the final concentrations of each component in TS basal medium.
  • Bovine serum albumin (BSA) (FUJIFILM Wako) 0.15% Penicillin 5,000 units/mL Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 5,000 ⁇ g/mL ITS-X (FUJI FILM Wako) 1% KSR (Thermo Fisher Scientific) 1% L-ascorbic acid (FUJIFILM Wako) 0.2mM
  • ECSY medium ECSY medium was prepared by adding the following additive factors to TS basal medium. The concentrations given below are the final concentrations in ECSY medium.
  • ECSY + EPC medium ECSY+EPC medium was prepared by adding the following maturation-inducing additive factors to ECSY medium. The concentrations given below are the final concentrations in ECSY+EPC medium.
  • ECSY + EPC + PLG medium An ECSY+EPC+PLG medium was prepared by adding the following maturation-inducing additive factors to the ECSY+EPC medium. Concentrations shown below are final concentrations in ECSY+EPC+PLG medium.
  • a 5i/L/A medium was prepared by mixing the following components (heunissen, T. W. et al. Cell Stem Cell 15, 471-487 (2014).). Concentrations shown below are final concentrations in 5i/L/A medium.
  • HDM medium HDM medium was prepared by adding the following components to a 1:1 (v/v) mixed medium of DMEM/F12 medium and Neurobasal medium. The concentrations given below are the final concentrations in HDM medium. 1x N2 supplement 1x B27 supplement 1x GlutaMAX 1x Non-essential amino acids ⁇ -Mercaptoethanol 0.1 mM Penicillin-Streptomycin 0.5% bFGF (Peprotech) 20ng/mL Activin A (Peprotech) 20ng/mL CHIR99021 3 ⁇ M
  • TDM medium A TDM medium was prepared by adding the following components to a 1:1 (v/v) mixed medium of DMEM/F12 medium and Neurobasal medium. The concentrations given below are the final concentrations in TDM medium.
  • 0.5 ⁇ N2 supplement 0.5x B27 supplement ITS-X 0.5% 0.5x GlutaMAX 0.5 ⁇ Non-essential amino acids ⁇ -Mercaptoethanol 0.1 mM Knockout Serum Replacement (KSR, Gibco) 0.5% (v/v) FBS 0.1% BSA 50mg/mL Penicillin-Streptomycin 0.5% PD0325901 1 ⁇ M
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • PD0325901 1 ⁇ M
  • A83-01 0.5 ⁇ M SB590885 0.25 ⁇ M WH-4-023 0.5 ⁇ M IM-12 0.25 ⁇ M CHIR99021 1 ⁇ M SB431542 0.5 ⁇ M Recombinant human LIF 10ng/mL EGF 25ng/mL L-ascorbic
  • IVC1 medium IVC1 medium was prepared by adding the following components to Advanced DMEM/F12 medium (Gibco). The concentrations given below are the final concentrations in IVC1 medium.
  • IVC2 medium The following components were added to Advanced DMEM/F12 medium to prepare IVC2 medium. The concentrations given below are the final concentrations in IVC2 medium. KSR 30% (v/v) L-glutamine 2mM 1x ITS-X ⁇ -oestradiol 8nM Progesterone 200ng/mL N-acetyl-L-cysteine 25 ⁇ M Sodium lactate 0.22% (v/v) Sodium pyruvate 1mM Y27632 10 ⁇ M
  • TS medium A TS medium was prepared by adding the following components to a TS basal medium. The concentrations shown below are the final concentrations of each component in TS medium.
  • Y27632 (FUJIFILM Wako) 2.5 ⁇ M EGF (FUJIFILM Wako) 25ng/mL VPA (FUJI FILM Wako) 0.8 mM A83-01 (FUJIFILM Wako) 5 ⁇ M CHIR99021 (FUJIFILM Wako) 2 ⁇ M
  • Endometrial epithelial cells were isolated by the following procedure. 1. Decidua were isolated manually using tweezers under a stereomicroscope. 2. The decidua were washed with wash medium (RPM 1640). 3. The decidua were transferred to a new dish and cut into 0.5-1 mm 3 with a scalpel. 4. Enzymes (dispase/collagenase) were added and allowed to react with shaking at 37° C. for 1-2 hours. 5. Medium was added to neutralize. 6. Pass through a 100 ⁇ m filter one to several times to trap cells on the filter.
  • Endometrial epithelial cells were prepared by the following procedure. 1. The endometrial epithelial cells captured on the 100 ⁇ m filter in ⁇ Isolation of Endometrial Epithelial Cells> 6 were collected by inverting the 100 ⁇ m filter and washing with washing medium (RPM1640). Centrifuge at 2.500 g for 5 minutes. 3. The supernatant was discarded, 1 mL of Advanced DMEM/F-12 (Thermo Fisher Scientific) was added, and the cells were suspended by pipetting. 4. The cell suspension was transferred to a new 1.5 mL tube and centrifuged at 500 g for 5 minutes. 5.
  • FIG. 3 shows a bright-field phase-contrast microscope image of the endometrium model.
  • endometrial epithelial cells formed spherical structures inside Matrigel. Endometrial epithelial cells remained within the Matrigel and were not exposed on the gel surface.
  • type I collagen gel the endometrial epithelial cells migrated to the surface of the gel without staying inside the type I collagen gel. Endometrial epithelial cells were exposed on the gel surface and contraction of the gel was observed.
  • Example 2 An endometrium model was prepared using Matrigel or type I collagen gel by the method described above. Next, a section of the endometrium model was prepared and subjected to immunostaining with an anti-Laminin antibody and Hoechst staining. FIG. 4 shows an immunostained image of the endometrium model section.
  • the endometrial epithelial cells were wrapped with Laminin and were not exposed on the gel surface.
  • endometrial epithelial cells were confirmed to be exposed on the gel surface (arrow).
  • Example 3 An endometrium model was prepared using type I collagen gel in the same manner as described above, except that the ECSY+EPC medium was replaced with the ECSY+EPC+PLG medium. Sections of the endometrium model were then prepared and subjected to immunostaining with anti-EpCAM antibody or anti-PGR antibody, F-actin staining with phalloidin, and Hoechst staining.
  • EpCAM is an epithelial cell marker and is widely expressed in epithelial cells.
  • F-actin is a structural protein of the cytoskeleton.
  • PGR is a progesterone receptor and an indicator of hormone sensitivity.
  • Fig. 5 shows an immunostained image of the endometrial model section.
  • luminal and non-luminal structures were continuously formed.
  • PGR was expressed in luminal structures, confirming their hormone sensitivity.
  • the luminal structure had a similar structure to the glandular epithelium of the endometrium.
  • FIG. 6 shows a phase-contrast microscope image (Phase) of endometrial cells on day 3 of planar culture and an image stained with Rhodamine B (Rhocamine B). Endometrial cells grew in colonies when plated on Matrigel. On the other hand, it was confirmed that the endometrial cells dispersed and radially migrated when cultured on a plane using type I collagen gel. These results indicated that migration of endometrial cells was promoted on the surface of type I collagen gel.
  • Example 5 In order to simulate the implantation of embryonic cells into the endometrium model, a co-culture test of ES cells (transferred from Umezawa Laboratory, National Center for Child Health and Development) or TS cells and the endometrium model was conducted. . TS cells that were genetically modified to express EGFP (EGFP-TS cells) were used.
  • ES cells were induced to blastocyst-like structures (blastoids) and co-cultured with an endometrium model (Yu L et al Nature 2021). Induction to blastocyst-like structures was performed as follows. Naive ES cells were seeded in 256-well microwells made of agarose at 25 to 50 cells/well. After overnight culture in 5i/L/A medium, the medium was changed to HDM medium. Three days after starting the culture in the HDM medium, the medium was changed to the TDM medium. Thereafter, the culture was continued in the HDM medium while exchanging the medium once every two days. Approximately 10 to 12 days after seeding the ES cells, the cells that formed blastocyst-like structures were collected using a mouth pipette and subjected to co-culture with the endometrium model.
  • TS cells were cultured in suspension in TS medium (Okae et al Cell Stem Cell 2018) using Petri dishes for 3 days to form aggregates. This aggregate was subjected to co-culture with an endometrium model.
  • An endometrium model was prepared using type I collagen gel by the above method. Then, ES cells or EGFP-TS cells were co-cultured with the endometrial model to prepare an endometrial implantation model. IVC1 medium and IVC2 medium were used for the co-culture medium. Co-cultivation was performed using IVC1 medium from the start of co-cultivation to the first day. On the second day from the start of co-cultivation, the medium was changed to IVC2 medium, and co-culture was carried out in IVC2 medium. Sections of the endometrial implantation model were prepared on the 5th day from the start of co-culture.
  • OCT4 is an undifferentiated marker and is expressed in undifferentiated cells.
  • SDC1 is an ST cell marker.
  • FIG. 7 shows an immunostained image of a section of an implantation model using ES cells.
  • FIG. 8 shows an immunostained image of a section of an implantation model using EGFP-TS cells. From FIGS. 7 and 8, it was confirmed that ES cells or EGFP-TS cells adhered to the surface of the endometrium model. For both ES cells and TS cells, the expression of SDC1 was confirmed in the cells of the implantation site in contact with the endometrium model. From this, it was considered that the cells in the implantation site were differentiated into ST cells. These results indicate that the endometrium model prepared by the above method can be used to simulate the implantation of embryonic cells.
  • an endometrium model in which the apical surface of endometrial epithelial cells is exposed a method for producing the endometrium model, and an endometrium implantation model using the endometrium model are provided.

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mathematical Analysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Algebra (AREA)
  • Computational Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mathematical Optimization (AREA)
  • Mathematical Physics (AREA)
  • Pure & Applied Mathematics (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • Educational Administration (AREA)
  • Educational Technology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

間質系細胞外マトリクスを含むゲルと、子宮内膜上皮細胞と、を含み、前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部が前記ゲルの表面に露出しており、前記ゲルの表面に露出する前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部が、管腔構造と非管腔構造とを連続して形成している、子宮内膜モデル。また、前記子宮内膜モデルの作製方法。また、前記子宮内膜モデルと、胚細胞と、を含む、子宮内膜着床モデル。

Description

子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル
　本発明は、子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデルに関する。
　子宮内膜は、子宮に存在する上皮組織であり、妊娠の成立に必要な組織である。ヒト成人の生殖期間中、子宮内膜の機能層は、再生、分化、及び脱落のサイクルを毎月繰り返す。月経後、子宮内膜の機能層は、エストロゲン依存的に増殖し、粘膜が再生し、プロゲステロン優性の分泌期に分化する。排卵後約７日目に、繊毛上の管腔上皮に受精卵が着床し、胎盤形成に不可欠な微小環境を提供する。
　近年、オルガノイドと呼ばれる生体内の組織構造に類似した三次元細胞構造体を作製し、生体内組織モデルとして使用する試みが行われている。子宮内膜においても、子宮内膜上皮細胞等を用いて、子宮内膜オルガノイドを作製した例が報告されている（非特許文献１）。
Margherita Y. Turco et al., Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology volume 19, 568-577 (2017)
　非特許文献１の子宮内膜オルガノイドは、単純な球構造で、空間的形態構造としては、生体の子宮内膜の構造とは異なっている。また、胚を受容する頂端面が構造の内部にあるため、胚の着床をシミュレートすることができない。
　そこで、本発明は、子宮内膜上皮細胞の頂端面が露出した、子宮内膜モデル、前記子宮内膜モデルの作製方法、及び前記子宮内膜モデルを用いた子宮内膜着床モデルを提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］間質系細胞外マトリクスを含むゲルと、子宮内膜上皮細胞と、を含み、前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部が前記ゲルの表面に露出しており、前記ゲルの表面に露出する前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部が、管腔構造と非管腔構造とを連続して形成している、子宮内膜モデル。
［２］前記非管腔構造が平坦な膜状構造である、［１］に記載の子宮内膜モデル。
［３］前記間質系細胞外マトリクスがＩ型コラーゲンである、［１］又は［２］に記載の子宮内膜モデル。
［４］前記子宮内膜上皮細胞の一部が前記ゲルの内部に存在する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の子宮内膜モデル。
［５］（ａ）間質系細胞外マトリクスを含むゲルの内部に、子宮内膜上皮細胞を存在させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）後、前記子宮内膜上皮細胞を培養する工程と、を含む、子宮内膜モデルの作製方法。
［６］前記間質系細胞外マトリクスがＩ型コラーゲンである、［４］に記載の子宮内膜モデルの作製方法。
［７］［１］～［４］のいずれか１つに記載の子宮内膜モデルと、胚細胞と、を含む、子宮内膜着床モデル。
［８］前記胚細胞が、栄養膜幹細胞、細胞性栄養膜細胞、絨毛外栄養膜細胞、合胞体性栄養膜細胞、多能性幹細胞、及びこれらから誘導される細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞を含む、［７］に記載の子宮内膜着床モデル。
［９］前記胚細胞がスフェロイド又はオルガノイドを形成している、［７］又は［８］に記載の子宮内膜着床モデル。
　本発明によれば、子宮内膜上皮細胞の頂端面が露出した、子宮内膜モデル、前記子宮内膜モデルの作製方法、及び前記子宮内膜モデルを用いた子宮内膜着床モデルが提供される。
子宮内膜モデルの一例を示す模式図である。 子宮内膜着床モデルの一例を示す模式図である。 Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＩ型コラーゲンゲルを用いて作製した子宮内膜モデルの明視野位相差顕微鏡画像を示す。 Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＩ型コラーゲンゲルを用いて作製した子宮内膜モデルの免疫染色画像を示す。 Ｉ型コラーゲンゲルを用いて作製した子宮内膜モデルの免疫染色画像を示す。 Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＩ型コラーゲンゲルを用いて平面培養した子宮内膜上皮細胞の画像を示す。 Ｉ型コラーゲンゲルを用いて作製した子宮内膜モデルとＥＳ細胞から誘導された胚盤胞様構造体とを共培養して作製した子宮内膜着床モデルを示す。 Ｉ型コラーゲンゲルを用いて作製した子宮内膜モデルとＴＳ細胞から誘導された胚盤胞様構造体とを共培養して作製した子宮内膜着床モデルを示す。上の画像は、ＧＦＰ、ＯＣＴ４、ＳＣＤ１、Ｆ－ａｃｔｉｎ、及びＨｏｅｃｈａｓｔを検出した蛍光顕微鏡画像をＭｅｒｇｅしたものである。下の画像のＭｅｒｇｅｄは、上の画像の四角で囲まれた部分の拡大図である。下の画像のＧＦＰ（ＴＳＣ）は、上の画像の四角で囲まれた部分のＧＦＰを検出した蛍光顕微鏡画像である。下の画像のＳＤＣ１は、上の画像の四角で囲まれた部分のＳＤＣ１を検出した蛍光顕微鏡画像である。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［定義］
　「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）態様を包含する。
　本明細書に記載される「細胞」は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態から分離された状態を意味する。本明細書に記載される「細胞」は、単離された細胞であり得る。
［子宮内膜モデル］
　本開示の第１の態様は、子宮内膜モデルである。一実施形態において、子宮内膜モデルは、間質系細胞外マトリクスを含むゲルと、子宮内膜上皮細胞と、を含む。一実施形態において、前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部は、前記ゲルの表面に露出している。一実施形態において、前記ゲルの表面に露出する前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部は、管腔構造と非管腔構造とを連続して形成している。
　図１は、一実施形態の子宮内膜モデルを示す模式図である。子宮内膜モデル１は、間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０と、子宮内膜上皮細胞の細胞集合体（１０ａ，１０ｂ）とを含んでいる。細胞集合体１０ａは、間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０の表面に露出する子宮内膜上皮細胞の細胞集合体である。細胞集合体１０ｂは、間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０の内部に存在する子宮内膜上皮細胞の細胞集合体である。
　細胞集合体１０ａは、間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０の表面に露出し、管腔構造１１と非管腔構造１２とが連続して形成される構造を有している。「管腔構造」とは、子宮内膜上皮細胞が間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０側に陥入した構造をさす。「非管腔構造」とは、管腔構造ではない構造をさす。非管腔構造の例としては、例えば、平坦な膜状構造が挙げられる。「管腔構造と非管腔構造が連続して形成される」構造とは、管腔構造と非管腔構造とを少なくとも各１個含み、管腔構造と非管腔構造とが連結されている構造をいう。
　細胞集合体１０ａが有する管腔構造１１の数は、特に限定されない。細胞集合体１０ａのサイズに応じて、細胞集合体１０ａは、複数の管腔構造１１を有し得る。細胞集合体１０ａが複数の管腔構造１１を有する場合、２つの管腔構造１１の間は非管腔構造１２により接続される。
　管腔構造１１を構成する子宮内膜上皮細胞は、プロゲステロン受容体（ＰＧＲ）を発現していてもよい。管腔構造１１は、成熟した子宮内膜腺上皮と類似の機能を有していてもよい。
　間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０は、間質系細胞外マトリクスを含んでいる。「間質系細胞外マトリクス」とは、間質に主に存在する細胞外マトリクスである。間質系細胞外マトリクスとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン（バーシカン、デコリン等）、フィブロネクチン等が挙げられる。中でも、間質系細胞外マトリクスとしては、Ｉ型コラーゲンが好ましい。間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０が含む間質系細胞外マトリクスは、１種でもよく、２種以上でもよい。
　間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０は、間質系細胞外マトリクスに加えて、他の細胞外マトリクスを含んでいてもよい。他の細胞外マトリクスとしては、例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等の基底膜系細胞外マトリクス；ヒアルロン酸、ＩＩ型コラーゲン、リンクタンパク質等の軟骨系細胞外マトリクス等が挙げられる。また、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）等の市販の製品を用いてもよい。間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０が他の細胞外マトリクスを含む場合は、他の細胞外マトリクスは、１種でもよく、２種以上でもよい。
　間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０は、全ゲル体積に対し、５０体積％以上、５５体積％以上、６０体積％以上、６５体積％以上、７０体積％以上、７５体積％以上、又は８０体積％以上の間質系細胞外マトリクスゲルを含むことが好ましい。間質系細胞外マトリクスを含むゲル２０は、間質系細胞外マトリクスゲル１００体積％であってもよい。
（子宮内膜モデルの維持培地）
　子宮内膜モデル１は、培地中等で維持することができる。培地は、子宮内膜モデル１を維持可能な培地であれば、特に限定されない。培地としては、例えば、動物細胞の培養に一般的に用いられる基礎培地に、成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤、成熟化誘導因子等を添加した培地が挙げられる。
≪基礎培地≫
　基礎培地としては、例えば、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられる。好ましい基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
　基礎培地は、必要に応じて、血清（牛胎児血清（ＦＢＳ）など）、及び／又は血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ－Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等が挙げられる。基礎培地は、必要に応じて、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の成分を含んでいてもよい。これらは、適宜組み合わせて用いることができる。
　基礎培地としては、例えば、上記のような基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＩＴＳ－Ｘ、Ｌ－アスコルビン酸、及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）を添加した培地が挙げられる。基礎培地の具体例としては、後述の実施例で用いられたＴＳ　ｂａｓａｌ培地が挙げられる。
≪成長因子≫
　成長因子としては、特に限定されないが、例えば、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）等が挙げられる。
　ＥＧＦは、細胞表面に存在するＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合してＥＧＦシグナル伝達を誘発し、分裂促進因子として作用する。ＥＧＦが由来する生物は、特に限定されないが、ヒトＥＧＦが好ましい。ヒトＦＧＦは、非ヒト細胞により生産された組換え体であってもよい。ＥＧＦは、市販のものを用いることができる。培地中のＥＧＦの濃度は、特に限定されないが、例えば、５～２００ｎｇ／ｍＬとすることができる。培地中のＥＧＦの濃度は、１０～１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０～８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、１０～６０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
　ＦＧＦは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対して高い親和性を有し、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと共に細胞表面のＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）と複合体を形成してＦＧＦシグナル伝達を誘発し、分裂促進因子として作用する。ＦＧＦが由来する生物は、特に限定されないが、ヒトＦＧＦが好ましい。ヒトＦＧＦは、非ヒト細胞により生産された組換え体であってもよい。ＦＧＦとしては、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦともいう）が好ましい。ＦＧＦは、市販のものを用いることができる。培地中のＦＧＦ（例えばＦＧＦ２）の濃度は、特に限定されないが、例えば、５～２００ｎｇ／ｍＬとすることができる。培地中のＦＧＦ（例えばＦＧＦ２）の濃度は、１０～１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２０～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、３０～８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、４０～６０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
　培地がＦＧＦを含む場合、培地はヘパリンを含んでいてもよい。ヘパリンは、ＦＧＦの活性を促進する作用を有する。ヘパリンは、塩の形態であることが好ましい。ヘパリンの塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄などの金属との塩；アンモニウム塩；有機塩基との塩；及びアミノ酸との塩等が挙げられる。ヘパリンは、市販のものを用いることができる。培地中のヘパリンの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１～１０μｇ／ｍＬとすることができる。培地中のヘパリンの濃度は、０．００５～５μｇ／ｍＬが好ましく、０．０１～３μｇ／ｍＬがより好ましく、０．０５～１μｇ／ｍＬがさらに好ましく、０．０７～０．５μｇ／ｍＬが特に好ましい。
　ＢＭＰは、トランスフォーミング増殖因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β：ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属するタンパク質であり、細胞死の誘導、細胞分化等を制御する。ＢＭＰが由来する生物は、特に限定されないが、ヒトＢＭＰが好ましい。ヒトＢＭＰは、非ヒト細胞により生産された組換え体であってもよい。ＢＭＰとしては、ＢＭＰ４が好ましい。ＢＭＰは、市販のものを用いることができる。培地中のＢＭＰ（例えばＢＭＰ４）の濃度は、特に限定されないが、例えば、５～２００ｎｇ／ｍＬとすることができる。培地中のＢＭＰ（例えばＢＭＰ４）の濃度は、１０～１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２０～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、３０～８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、４０～６０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
≪ＲＯＣＫ阻害剤≫
　ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ：Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤は、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する物質である。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、１－（５－イソキノリニルスルホニル）ホモピペラジン（１－（５－Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、またはこれらの塩等が挙げられる。また、例えば、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、Ｈ－１１５２、およびＷｆ－５３６等の低分子阻害剤、並びにそれらの誘導体等が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩の市販品としては、Ｙ２７６３２（（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ）等が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２を用いることが好ましい。
　培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～５０μＭとすることができ、１～２０μＭが好ましく、１～１５μＭがより好ましく、３～１２μＭがさらに好ましい。
≪ＧＳＫ３β阻害剤≫
　ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ）３β阻害剤は、ＧＳＫ３βの機能、例えば、キナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質である。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ－Ａ０１４４１８、リチウム、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ－８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－（２－フェニルキナゾリン－４－イル）アミン、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム（ｃｙｃｌｏｐｅｎａｄｉｅｎｙｌｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）複合体、ＴＤＺＤ－８　４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン、２－チオ（３－ヨードベンジル）－５－（１－ピリジル）－［１，３，４］－オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、ＡＲ－ＡＯ　１４４－１８、３－（１－（３－ヒドロキシプロピル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］－４－ピラジン－２－イル－ピロール－２，５－ジオン；ＴＷＳｌ　１９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３ Ｈ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２又はそのミリストイル化形態；２－クロロ－１－（４，５－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン、ＳＢ２１６７６３、及びＳＢ４１５２８６等の低分子阻害剤が挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＧＳＫ３βに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリルの市販品としては、ＣＨＩＲ９９０２１等が挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を用いることが好ましい。
　培地中のＧＳＫ３β阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～２０μＭとすることができ、０．２～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましく、０．５～３μＭがさらに好ましい。
≪ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤≫
　ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８　ＭＡＰＫ（Ｐ３８　ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）の機能を阻害する物質である。ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤としては、例えば、ＳＢ２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＳＢ２０３５８０（４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－［４－（メチルスルフィニル）フェニル］－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）、ＶＸ７０２（６－（Ｎ－カルバモイル－２，６－ジフルオロアニリノ）－２－（２，４－ジフルオロフェニル）ピリジン－３－カルボキシアミド）、ＶＸ７４５（５－（２，６－ジクロロフェニル）－２－［２，４－ジフルオロフェニル）チオ］－６Ｈ－ピリミド［１，６－ｂ］ピリダジン－６－ワン）、ＰＤ１６９３１６（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＲＯ４４０２２５７（６－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－２－｛［３－ヒドロキシ－１－（２－ヒドロキシエチル）プロピル］アミノ｝－８－メチルピリド［２，３－Ｄ］ピリミジン－７（８ｈ）－ワン）、ＢＩＲＢ７９６（１－［５－ｔｅｒｔ－ブチル－２－（４－メチルフェニル）ピラゾール－３－イル］－３－［４－（２－モルフォリン－４－イレトキシ）ナフタレン－１－イル］ウレア）等が挙げられる。ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８　ＭＡＰＫに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤は、ＳＢ２０２１９０を用いることが好ましい。
　培地中のｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～２０μＭとすることができ、０．２～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましく、０．５～３μＭがさらに好ましい。
≪成熟化誘導因子≫
　成熟化誘導因子は、子宮内膜細胞の成熟を誘導する因子である。成熟化誘導因子は、子宮内膜細胞の成熟を誘導可能な因子であれば、特に限定されない。成熟化誘導因子としては、例えば、エストロゲン受容体リガンド、プロゲステロン受容体リガンド、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）若しくはその誘導体、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、絨毛性ゴナドトロピン等が挙げられる。
　エストロゲン受容体リガンドは、エストロゲン受容体に結合する物質である。エストロゲン受容体リガンドとしては、例えば、エストロン、エストラジオール、エストリオール等が挙げられる。エストラジオールとしては、例えば、β－エストラジオール、１７β－エストラジオール等が挙げられる。エストロゲン受容体リガンドは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。エストロゲン受容体リガンドは、エストラジオールを用いることが好ましい。
　培地中のエストロゲン受容体リガンドの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～５０μＭとすることができ、０．５～３０μＭが好ましく、１～２０μＭがより好ましく、５～１５μＭがさらに好ましい。
　プロゲステロン受容体リガンドは、プロゲステロン受容体に結合する物質である。プロゲステロン受容体リガンドとしては、プロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン等が挙げられる。プロゲステロン受容体リガンドは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。プロゲステロン受容体リガンドは、酢酸メドロキシプロゲステロンを用いることが好ましい。
　培地中のプロゲステロン若しくはその誘導体の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～２０μＭとすることができ、０．２～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましく、０．５～３μＭがさらに好ましい。
　ｃＡＭＰ若しくはその誘導体としては、８－ブロモアデノシン－３’－５’－サイクリックモノホスフェート（８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ）、ジブチリル－ｃＡＭＰ、８－ＣＰＴ－２－Ｍｅ－ｃＡＭＰナトリウム塩（８－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）－２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ－３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）等が挙げられる。ｃＡＭＰ若しくはその誘導体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ｃＡＭＰ若しくはその誘導体は、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰを用いることが好ましい。
　培地中のｃＡＭＰ若しくはその誘導体の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～２００μＭとすることができ、１～１５０μＭが好ましく、１０～１００μＭがより好ましく、２０～８０μＭがさらに好ましい。
　プロラクチンは、脳下垂体前葉のプロラクチン分泌細胞から分泌されるホルモンである。プロラクチンが由来する生物は、特に限定されないが、ヒトプロラクチンが好ましい。ヒトプロラクチンは、非ヒト細胞により生産された組換え体であってもよい。プロラクチンは、市販のものを用いることができる。培地中のプロラクチンの濃度は、特に限定されないが、例えば、５～２００ｎｇ／ｍＬとすることができる。培地中のプロラクチンの濃度は、１０～１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０～８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、１０～６０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
　胎盤性ラクトゲンは、胎盤から分泌されるペプチドホルモンである。胎盤性ラクトゲンが由来する生物は、特に限定されないが、ヒト胎盤性ラクトゲンが好ましい。ヒト胎盤性ラクトゲンは、非ヒト細胞により生産された組換え体であってもよい。胎盤性ラクトゲンは、市販のものを用いることができる。培地中の胎盤性ラクトゲンの濃度は、特に限定されないが、例えば、５～２００ｎｇ／ｍＬとすることができる。培地中の胎盤性ラクトゲンの濃度は、１０～１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０～８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、１０～６０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
　絨毛性ゴナトドロピンは、栄養膜合胞体から分泌されるペプチドホルモンである。絨毛性ゴナトドロピンが由来する生物は、特に限定されないが、ヒト絨毛性ゴナトドロピンが好ましい。ヒト絨毛性ゴナトドロピンは、非ヒト細胞により生産された組換え体であってもよい。絨毛性ゴナトドロピンは、市販のものを用いることができる。培地中の絨毛性ゴナトドロピンの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１００μｇ／ｍＬとすることができる。培地中の絨毛性ゴナトドロピンの濃度は、０．０５～５０μｇ／ｍＬが好ましく、０．１～２０μｇ／ｍＬがより好ましく、０．２～１０μｇ／ｍＬがさらに好ましく、０．５～５μｇ／ｍＬが特に好ましい。
　子宮内膜モデルの維持培地としては、例えば、動物細胞用の基礎培地（例えば、ＴＳ　ｂａｓａｌ培地等）に、成長因子（ＥＧＦ等）、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２等）、ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１等）、及びｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０２１９０等）等を添加した培地が挙げられる。そのような培地の具体例としては、例えば、後述の実施例で用いたＥＣＳＹ培地が挙げられる。
　また、子宮内膜モデルの維持培地としては、例えば、動物細胞用の基礎培地（例えば、ＴＳ　ｂａｓａｌ培地等）に、成長因子（ＥＧＦ等）、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２等）、ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１等）、及びｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０２１９０等）、成熟化誘導因子（エストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ等）等を添加した培地が挙げられる。そのような培地の具体例としては、例えば、後述の実施例で用いたＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地が挙げられる。
　また、子宮内膜モデル中の子宮内膜上皮細胞のさらなる成熟を誘導する場合、上記のような維持培地に、さらなる成熟化誘導因子（プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、絨毛性ゴナドトロピン等）を添加してもよい。例えば、動物細胞用の基礎培地（例えば、ＴＳ　ｂａｓａｌ培地等）に、成長因子（ＥＧＦ等）、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２等）、ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１等）、及びｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０２１９０等）、成熟化誘導因子（エストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、絨毛性ゴナドトロピン等）等を添加した培地が挙げられる。そのような培地の具体例としては、例えば、後述の実施例で用いたＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地に、ヒトプロラクチン（例えば、２０ｎｇ／ｍＬ）、ヒト胎盤性ラクトゲン（例えば、２０ｎｇ／ｍＬ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（例えば、１μｇ／ｍＬ）を添加した培地（例えば、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ＋ＰＬＧ培地）が挙げられる。
　本態様の子宮内膜モデルは、子宮内膜上皮細胞がゲルの表面に露出した構造を有する。さらに、子宮内膜腺上皮に類似の管腔構造を有する。これらの構造的特徴は、生体の子宮内膜に類似している。そのため、本態様の子宮内膜モデルは、子宮内膜に関する疾患（子宮内膜症、子宮内膜がん等）の薬剤のスクリーニング、及び薬剤の評価に適用することができる。また、子宮内膜上皮細胞の頂端面が露出しているため、着床のシミュレートが可能である。そのため、着床機序又は着床不全の解明、着床不全治療薬のスクリーニング、及び着床不全治療薬の評価に適用することができる。
［子宮内膜モデルの作製方法］
　本開示の第２の態様は、子宮内膜モデルの作製方法である。本態様に係る方法は、（ａ）間質系細胞外マトリクスを含むゲルの内部に、子宮内膜上皮細胞を存在させる工程と、（ｂ）前記子宮内膜上皮細胞を培養する工程と、を含む。
＜工程（ａ）＞
　工程（ａ）では、間質系細胞外マトリクスを含むゲルの内部に、子宮内膜上皮細胞を存在させる。
（子宮内膜上皮細胞）
　子宮内膜上皮細胞は、子宮内膜上皮組織から単離してもよく、子宮内膜上皮細胞の培養株を用いてもよい。子宮内膜組織からの子宮内膜上皮組織からの単離方法は、公知の方法を用いることができる。子宮内膜上皮組織としては、脱落膜を用いてもよい。
　子宮内膜上皮細胞は、例えば、子宮内膜上皮組織に機械的及び／又は酵素的処理を適宜使用して、細胞を分離することにより、単離することができる。機械的処理としては、メスによる切断当が挙げられる。酵素処理としては、細胞外マトリクス分解活性を有するプロテアーゼ（例えば、ディスパーゼ、コラゲナーゼ等）による処理が挙げられる。子宮内膜上皮組織の機械的及び／又は酵素的処理の後、ストレーナー又はフィルター等を用いて子宮内膜上皮細胞を回収することができる。回収した子宮内膜上皮細胞は、適宜、培地等で洗浄してもよい。
　単離した子宮内膜上皮細胞は、適宜、氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ等を添加し、培養することにより、調製してもよい。Ｍａｔｒｉｇｅｌでの培養温度としては、例えば、３０～４０℃（例えば、３７℃）が挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、例えば、５分以上、１０分以上、又は１５分以上等が挙げられる。培養時間の上限は特に限定されないが、例えば、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下、又は２０分以下等が挙げられる。
　調製した子宮内膜上皮細胞は、ＥＣＳＹ培地等により維持することができる。
（間質系細胞外マトリクスを含むゲル）
　間質系細胞外マトリクスを含むゲルは、上記と同様のものを用いることができる。間質系細胞外マトリクスを含むゲルは、間質系細胞外マトリクスとしてＩ型コラーゲンを含むことが好ましい。
（子宮内膜上皮細胞の播種方法）
　間質系細胞外マトリクスを含むゲルの内部に、子宮内膜上皮細胞を存在させる方法は特に限定されない。例えば、子宮内膜上皮細胞の培養液から遠心分離等により細胞を回収し、間質系細胞外マトリクスを含むゲルと混合してもよい。あるいは、子宮内膜上皮細胞を適切な培地に懸濁して細胞懸濁液を調製し、間質系細胞外マトリクスを含むゲルに前記細胞懸濁液を注入してもよい。
　間質系細胞外マトリクスを含むゲルに播種する子宮内膜上皮細胞の細胞数は、特に限定されない。播種細胞数としては、例えば、１個以上、１０個以上、１０２個以上、１０３個以上、１０４個以上、１０５個以上、１０６個以上、１０７個以上、１０８個以上、１０９個以上、又は１０１０個以上等が挙げられる。播種細胞数の上限は、特に限定されない。例えば、１０２０個以下、１０１５個以下、１０１４個以下、１０１３個以下、又は１０１２個以下等が挙げられる。前記下限値と上限値は適宜組合せ可能である。
（工程（ｂ））
　工程（ｂ）では、前記工程（ａ）後、子宮内膜上皮細胞を培養する。
　間質系細胞外マトリクスを含むゲルの内部に子宮内膜上皮細胞を存在させた状態で培養を開始する。培養は、子宮内膜上皮細胞を含む間質系細胞外マトリクスを含むゲルに、適切な培地を添加して行ってもよい。培養容器としては、特に限定されないが、例えば、無処理ウェルプレート、無処理ディッシュ等が挙げられる。
　培地としては、上記で挙げたもの等を用いることができる。培養中、適宜培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は、特に限定されないが、例えば、１週間に２～３回が挙げられる。
　培地は、子宮内膜上皮細胞の成熟を促すために、適宜、成熟化誘導因子を添加してもよい。例えば、培養初期には、成熟化誘導因子非含有培地で培養してもよい。次いで、成熟化誘導因子含有培地に交換し、さら培養を行ってもよい。
　成熟化因子非含有培地（例えば、ＥＣＳＹ培地）での培養期間としては、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、又は７日以上等が挙げられる。成熟化因子非含有培地（例えば、ＥＣＳＹ培地）での培養期間の上限は、特に限定されないが、例えば、３０日以下、２５日以下、２０日以下、１５日以下、１２日以下、又は１０日以下等が挙げられる。前記下限値と上限値は適宜組合せ可能である。
　成熟化因子含有培地（例えば、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地）での培養期間としては、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、又は７日以上等が挙げられる。成熟化因子含有培地（例えば、ＥＣＳＹ培地）での培養期間の上限は、特に限定されないが、例えば、３０日以下、２５日以下、２０日以下、１５日以下、１２日以下、１０日以下等が挙げられる。前記下限値と上限値は適宜組合せ可能である。
　子宮内膜上皮細胞の成熟をさらに促す場合には、成熟化誘導因子として、エストロゲン受容体リガンド、プロゲステロン受容体リガンド、ｃＡＭＰ若しくはその誘導体、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、及び絨毛性ゴナドトロピンからなる群より選択される３種以上、４種以上、５種以上の成熟化誘導添加因子を含有する培地を用いてもよい。例えば、エストロゲン受容体リガンド、プロゲステロン受容体リガンド、ｃＡＭＰ若しくはその誘導体、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、及び絨毛性ゴナドトロピンの全てを含有する培地（例えば、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ＋ＰＬＧ培地）を用いてもよい。
　培養中、間質系細胞外マトリクスを含むゲルの内部の子宮内膜上皮細胞は、ゲル内を移動し、一部の細胞はゲル表面まで到達する。ゲル表面に到達した細胞は、ゲル表面で、管腔構造と非管腔構造とが連続する構造を形成する。成熟化誘導因子含有培地での培養は、子宮内膜上皮細胞が、前記構造を形成するまで継続することができる。
　培養条件は、動物細胞の培養に一般的に用いられる条件とすることができる。例えば、培養温度３２～４０℃（好ましくは３５～３８℃、典型的には３７℃）、ＣＯ２濃度２～５％（好ましくは５％）とすることができる。
　本態様の方法により、前記第１の態様にかかる子宮内膜モデルを作製することができる。
［子宮内膜着床モデル］
　本開示の第３の態様は、子宮内膜着床モデルである。本態様にかかる子宮内膜着床モデルは、前記第１の態様にかかる子宮内膜モデルと、胚細胞と、を含む。
　図２は、一実施形態の子宮内膜着床モデルを示す模式図である。子宮内膜着床モデル２は、子宮内膜モデル１と、胚細胞３０とを含んでいる。胚細胞３０は、子宮内膜モデル１の頂端面に着床していてもよく、着床していなくてもよい。
（胚細胞）
　「胚細胞」とは、子宮内膜に対する着床をシミュレートし得る細胞をいう。
　受精卵は、卵管内を移動して子宮内に到達する。受精卵は、卵管を移動する間に卵割し、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、及び桑実胚を経て、胚盤胞となる。子宮に到達した胚盤胞は、拡張胚盤胞となると透明帯が薄くなり、透明帯が破れて孵化後胚盤胞となる。孵化後胚盤胞は、子宮内膜に接して定着する。胚盤胞は、内細胞塊、胚盤胞腔、及び栄養膜から構成されており、栄養膜細胞が子宮内膜に侵襲して着床が成立する。胚細胞は、典型的には、胚を構成する細胞であり、受精卵、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚、及び胚盤胞のいずれであってもよい。胚細胞は、前記のような胚から単離された細胞であってもよく、前記単離細胞から誘導された細胞であってもよい。胚細胞は、多能性幹細胞であってもよく、多能性幹細胞から誘導された細胞であってもよい。胚細胞は、胎盤から単離された細胞であってもよく、前記細胞から誘導された細胞であってもよい。
　胚細胞としては、例えば、栄養膜幹細胞、細胞性栄養膜細胞、絨毛外栄養膜細胞、合胞体性栄養膜細胞、多能性幹細胞、及びこれらから誘導される細胞等が挙げられる。
　栄養膜幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）は、胚盤胞から誘導したものであってもよく、細胞性栄養膜細胞（ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌ：ＣＴ細胞）から誘導されたものであってもよく、多能性幹細胞から誘導されたものであってもよい。
　胚盤胞からのＴＳ細胞の誘導は公知の方法により行うことができる。例えば、胎盤組織に機械的及び／又は酵素的処理を適宜使用して、細胞を分離する。その後、ＴＳ細胞に誘導する培地で細胞を培養した後、ＴＳ細胞マーカー（ＧＡＴＡ２陽性、ＧＡＴＡ３陽性、ＴＦＡＰ２陽性、ＥＬＦ５陽性、ＺＮＦ７５０陽性、ＣＤＸ２陰性等）の発現を指標として、ＴＳ細胞を樹立することができる。
　ＣＴ細胞からＴＳ細胞を誘導する方法としては、例えば、特許第６４００８３２号に記載の方法を用いることができる。
　多能性幹細胞からＴＳ細胞を誘導する方法としては、例えば、国際公開第２０２０／２５０４３８号等に記載の方法等を用いることができる。
　ＣＴ細胞は、例えば、胎盤から単離したものを用いることができる。胎盤からのＣＴ細胞の単離は、例えば、胎盤組織に機械的及び／又は酵素的処理を適宜使用して、細胞を分離し、ＣＴ細胞マーカー（ＣＤ４９ｆ陽性、Ｅ－カドヘリン陽性等）の発現を指標として、ＣＴ細胞を単離することができる（特許第６４００８３２号公報、Haider, S., et al., Stem Cell Reports 11, 537-551 (2018).）
　合胞体性栄養膜細胞（ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌ：ＳＴ細胞）は、胎盤から単離したものであってもよく、ＴＳ細胞から誘導されたものであってもよい。胎盤からのＳＴ細胞の単離は、例えば、胎盤組織に機械的及び／又は酵素的処理を適宜使用して、細胞を分離し、ＳＴ細胞マーカー（Ｓｙｎｄｅｃａｎ　１（ＳＤＣ１）陽性、ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ（ｈＣＧ）陽性等）の発現を指標として、ＳＴ細胞を単離することができる。
　ＴＳ細胞からＳＴ細胞を誘導する方法としては、例えば、国際公開第２０２０／２５０４３８号等に記載の方法等が挙げられる。
　絨毛外栄養膜細胞（ｅｘｔｒａｖｉｌｌｏｕｓ　ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌ：ＥＶＴ細胞）は、胎盤から単離したものであってもよく、ＴＳ細胞から誘導されたものであってもよい。胎盤からのＥＶＴ細胞の単離は、例えば、胎盤組織に機械的及び／又は酵素的処理を適宜使用して、細胞を分離し、ＥＶＴ細胞マーカー（ＨＬＡ－Ｇ陽性等）の発現を指標として、ＥＶＴ細胞を単離することができる。
　ＴＳ細胞からＥＶＴ細胞を誘導する方法としては、例えば、国際公開第２０２０／２５０４３８号等に記載の方法等が挙げられる。
　多能性幹細胞は、分化多能性を有する細胞であり、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）であってもよく、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）であってもよく、これらの幹細胞から誘導された分化多能性を有する細胞であってもよい。多能性幹細胞の製造方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の細胞株は、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）等の細胞バンクからも入手可能である。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が好ましく、ＥＳ細胞がより好ましい。
　胚細胞は、スフェロイド又はオルガノイドを形成していてもよい。胚細胞からのスフェロイド又はオルガノイドの形成は、公知の方法により行うことができる。例えば、上述のような培地（例えば、基礎培地に、成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫβ阻害剤、ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤を添加した培地）を用いて、胚細胞を浮遊培養することにより、胚細胞のスフェロイド又はオルガノイドを作製することができる。
　胚細胞のスフェロイド又はオルガノイドは、ＴＳ細胞から誘導された細胞凝集体であってもよい。例えば、ＴＳ細胞を、ＴＳ培地（Okae et al Cell Stem Cell 2018）で浮遊培養することにより、細胞凝集体を誘導することができる。前記細胞凝集体は、ＴＳ細胞、ＣＴ細胞、ＳＴ細胞、及びＥＶＴ細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を含んでいてもよく、ＴＳ細胞、ＣＴ細胞、及びＳＴ細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を含んでいてもよい。
　胚細胞のスフェロイド又はオルガノイドは、胚盤胞様構造体であってもよい。胚盤胞様構造体は、多能性幹細胞等の分化多能性を有する細胞から誘導された胚盤胞に類似の構造を有する細胞構造体である。胚盤胞様構造体は、公知の方法により誘導することができる（例えば、Yu L, et al., Nature. 2021 Mar;591(7851):620-626.）。例えば、５ｉ／Ｌ／Ａ培地を用いて多能性幹細胞を培養し、次いでＨＤＭ培地で培養し、次いでＴＤＭ培地で培養することにより、胚盤胞様構造体を得ることができる。多能性幹細胞は、ナイーブ型を用いてもよく、プライム型を用いてもよいが、ナイーブ型を用いることが好ましい。
（子宮内膜着床モデルの作製）
　子宮内膜着床モデルは、子宮内膜モデルと、胚細胞を共培養することにより作製することができる。共培養に用いる培地は、特に限定されないが、上述の培地に加えて、実施例で用いたＩＶＣ１培地、ＩＶＣ２培地等が挙げられる。
　共培養の培地としては、例えば、動物細胞用の基礎培地（例えば、ＴＳ　ｂａｓａｌ培地）に、成長因子（ＥＧＦ等）、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２等）、ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１等）、及びｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０２１９０等）、成熟化誘導因子（エストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ等）等を添加した培地（例えば、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地）が挙げられる。
　あるいは、共培養の培地として、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、絨毛性ゴナドトロピン等の成熟化誘導因子さらに添加した培地を用いてもよい。例えば、動物細胞用の基礎培地（例えば、ＴＳ　ｂａｓａｌ培地等）に、成長因子（ＥＧＦ等）、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２等）、ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１等）、及びｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０２１９０等）、成熟化誘導因子（エストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、絨毛性ゴナドトロピン等）等を添加した培地（例えば、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ＋ＰＬＧ培地）が挙げられる。
　あるいは、共培養の培地としては、動物細胞用の基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地等）に、血清（ＦＢＳ等）、血清代替物（ＩＴＳ－Ｘ、ＫＳＲ等）、アミノ酸（Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン等）、有機酸（ピルビン酸、乳酸等）、成熟化誘導因子（エストロゲン受容体リガンド、プロゲステロン受容体リガンド等）等を添加した培地（例えば、ＩＶＣ１培地、ＩＶＣ２培地等）が挙げられる。例えば、共培養の開始から所定の期間（例えば、半日～３日、半日～２日、又は半日～１日等）はＩＶＣ１培地で共培養を行い、その後ＩＶＣ２培地で共培養を行ってもよい。
　培養条件は、動物細胞の培養に一般的に用いられる条件とすることができる。例えば、培養温度３２～４０℃（好ましくは３５～３８℃、典型的には３７℃）、ＣＯ２濃度２～５％（好ましくは５％）をとすることができる。
　胚細胞のスフェロイド又はオルガノイドを子宮内膜モデルと共培養すると、胚細胞のスフェロイド又はオルガノイドは、子宮内膜モデルの頂端面に着床することができる。着床したスフェロイド又はオルガノイドにおいて、着床部の細胞はＳＤＣ１陽性細胞（例えば、ＳＴ細胞）に分化していてもよい。
　本態様にかかる子宮内膜着床モデルは、前記第１の態様の子宮内膜モデルと胚細胞を含むため、子宮内膜への着床をシミュレートすることができる。そのため、本態様にかかる子宮内膜着床モデルは、着床又は着床不全の機序の解明、及び着床不全薬のスクリーニング等に適用することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜培地＞
（ＴＳ　ｂａｓａｌ培地）
　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）に、下記成分を添加してＴＳ　ｂａｓａｌ培地を作製した。下記に示す濃度は、ＴＳ　ｂａｓａｌ培地中での各成分の最終濃度である。
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　０．１５％
　ペニシリン　５，０００　ｕｎｉｔｓ／ｍＬ
　ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　５，０００μｇ／ｍＬ
　ＩＴＳ－Ｘ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　１％
　ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　１％
　Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　０．２ｍＭ
（ＥＣＳＹ培地）
　ＴＳ　ｂａｓａｌ培地に、下記の添加因子を添加して、ＥＣＳＹ培地を作製した。下記に示す濃度は、ＥＣＳＹ培地における最終濃度である。
　ヒトＥＧＦ、組換え体（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　　５０ｎｇ／ｍＬ
　ＣＨＩＲ９９０２１（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　　２μＭ
　ＳＢ２０２１９０（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　２μＭ
　Ｙ２７６３２（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　１０μＭ
（ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地）
　ＥＣＳＹ培地に、下記の成熟化誘導添加因子を添加して、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地を作製した。下記に示す濃度は、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地における最終濃度である。
　エストラジオール（ＳＩＧＭＡ）　１０μＭ
　メドロキシプロゲステロン酢酸エステル（ＭＰＡ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　２μＭ
　８－Ｂｒｏｍｏ－ｃＡＭＰ（ＳＩＧＭＡ）　５０μＭ
（ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ＋ＰＬＧ培地）
　ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地に、下記の成熟化誘導添加因子を添加して、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ＋ＰＬＧ培地を作製した。下記に示す濃度は、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ＋ＰＬＧ培地における最終濃度である。
　ヒトプロラクチン、組換え体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）　２０ｎｇ／ｍＬ
　ヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）　２０ｎｇ／ｍＬ
　ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（ＳＩＧＭＡ）　１μｇ／ｍＬ
（５ｉ／Ｌ／Ａ培地）
　下記の成分を混合して、５ｉ／Ｌ／Ａ培地を作製した（heunissen, T. W. et al. Cell Stem Cell 15, 471-487 (2014).）。下記に示す濃度は、５ｉ／Ｌ／Ａ培地における最終濃度である。
　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　２５０ｍＬ
　Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　２５０ｍＬ
　Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　５ｍＬ
　Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　１０ｍＬ
　１×　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）
　１×　Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）
　β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）　０．１ｍＭ
　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）　０．５％
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）　５０ｍｇ／ｍＬ
　ＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）　１μＭ
　ＩＭ－１２（Ｅｎｚｏ）　０．５μＭ又は１μＭ
　ＳＢ５９０８８５（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）　０．５μＭ
　ＷＨ－４－０２３（Ａ　Ｃｈｅｍｔｅｋ）　１μＭ
　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＬＩＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）　２０ｎｇ／ｍＬ
　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）　１０ｎｇ／ｍＬ
（ＨＤＭ培地）
　１：１（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の混合培地に、下記成分を添加して、ＨＤＭ培地を作製した。下記に示す濃度は、ＨＤＭ培地における最終濃度である。
　１×　Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　１×　Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　１×　ＧｌｕｔａＭＡＸ
　１×　Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ
　β－メルカプトエタノール　０．１ｍＭ
　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　０．５％
　ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）　２０ｎｇ／ｍＬ
　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）　２０ｎｇ／ｍＬ
　ＣＨＩＲ９９０２１　３μＭ
（ＴＤＭ培地）
　１：１（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の混合培地に、下記成分を添加して、ＴＤＭ培地を作製した。下記に示す濃度は、ＴＤＭ培地における最終濃度である。
　０．５×　Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　０．５×　Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　ＩＴＳ－Ｘ　０．５％
　０．５×　ＧｌｕｔａＭＡＸ
　０．５×　Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ
　β－メルカプトエタノール　０．１　ｍＭ
　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ，Ｇｉｂｃｏ）　０．５％（ｖ／ｖ）
　ＦＢＳ　０．１％
　ＢＳＡ　５０ｍｇ／ｍＬ
　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　０．５％
　ＰＤ０３２５９０１　１μＭ
　Ａ８３－０１　０．５　μＭ
　ＳＢ５９０８８５　０．２５μＭ
　ＷＨ－４－０２３　０．５μＭ
　ＩＭ－１２　０．２５μＭ
　ＣＨＩＲ９９０２１　１μＭ
　ＳＢ４３１５４２　０．５μＭ
　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＬＩＦ　１０ｎｇ／ｍＬ
　ＥＧＦ　２５ｎｇ／ｍＬ
　Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　０．７５μｇ／ｍＬ
　ＶＰＡ　０．４ｍＭ
（ＩＶＣ１培地）
　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）に、下記成分を添加して、ＩＶＣ１培地を作製した。下記に示す濃度は、ＩＶＣ１培地における最終濃度である。
　ＦＢＳ　２０％（ｖ／ｖ）
　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）　２ｍＭ
　１×　ＩＴＳ－Ｘ
　β－ｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｓｉｇｍａ）　８ｎＭ
　Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ）　２００ｎｇ／ｍＬ
　Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）　２５μＭ
　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌａｃｔａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）　０．２２％（ｖ／ｖ）
　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）　１ｍＭ
　Ｙ２７６３２　１０μＭ
（ＩＶＣ２培地）
　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、下記成分を添加して、ＩＶＣ２培地を作製した。下記に示す濃度は、ＩＶＣ２培地における最終濃度である。
　ＫＳＲ　３０％（ｖ／ｖ）
　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　２ｍＭ
　１×　ＩＴＳ－Ｘ
　β－ｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ　８ｎＭ
　Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　２００ｎｇ／ｍＬ
　Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ　２５μＭ
　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌａｃｔａｔｅ　０．２２％（ｖ／ｖ）
　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ　１ｍＭ
　Ｙ２７６３２　１０μＭ
（ＴＳ培地）
　ＴＳ　ｂａｓａｌ培地に、下記成分を添加してＴＳ培地を作製した。下記に示す濃度は、ＴＳ培地中での各成分の最終濃度である。
　Ｙ２７６３２（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　２．５μＭ
　ＥＧＦ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　２５ｎｇ／ｍＬ
　ＶＰＡ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　０．８ｍＭ
　Ａ８３－０１（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　５μＭ
　ＣＨＩＲ９９０２１（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）　２μＭ
＜子宮内膜上皮細胞の単離＞
　下記手順により、子宮内膜上皮細胞を単離した。
１．実体顕微鏡下、ピンセットを用いて、手作業で脱落膜を単離した。
２．洗浄培地（ＲＰＭ１６４０）で脱落膜を洗浄した。
３．脱落膜を新しいディッシュに移し、メスで０．５～１ｍｍ３に切断した。
４．酵素（ディスパーゼ／コラゲナーゼ）を添加し、３７℃で、１～２時間、振盪しながら反応させた。
５．培地を添加して中和した。
６．１００μｍフィルターに１～数回通し、フィルター上に細胞を捕捉した。
＜子宮内膜上皮細胞の調製＞
　下記手順により、子宮内膜上皮細胞を調製した。
１．＜子宮内膜上皮細胞の単離＞の６で１００μｍフィルターに捕捉した子宮内膜上皮細胞を、１００μｍフィルターを反転させて、洗浄培地（ＲＰＭ１６４０）で洗浄することにより回収した。
２．５００ｇで５分間遠心分離した。
３．上清を捨て、１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、ピペッティングにより細胞を懸濁した。
４．細胞懸濁液を新しい１．５ｍＬチューブに移し、５００ｇで５分間、遠心分離した。
５．上清を捨て、ペレットの体積を見積もり、氷上で２～３分間タッピングした。
６．ペレット体積の約２０倍容量の氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（コーニング）を添加し、緩やかに数回ピペッティングした後、氷上に戻した。
７．３７℃に予め温めたｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ４８ウェルプレートに、２０μＬの細胞懸濁液を滴下した。
８．３７℃で１５分間以上インキュベートした。
９．２５０μＬのＥＣＳＹ培地を添加して、維持した。
＜子宮内膜モデルの作製＞
　下記手順により、子宮内膜モデルを作製した。
１．子宮内膜オルガノイドの維持培養液から培地を除去した。
２．０．５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ｃｏｌｄ）を添加し、２０回ピペッティングを行って、細胞を懸濁した。
３．５００ｇで、３分間遠心分離を行い、上清を除去した。
４．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（コーニング）及びＩ型コラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）　Ｔｙｐｅ　Ｉ－Ａ；新田ゼラチン）を添加した（Ｍａｔｒｉｇｅｌ／Ｉ型コラーゲン＝２０／８０（体積比））。また、コントロールには、Ｍａｔｒｉｇｅｌのみを添加した。
５．無処理４８ウェルプレートに、２０μＬの細胞含有ゲルを滴下し、３７℃で３０分間インキュベートした。
６．ＥＳＣＹ培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度で培養した。培養中、１週間に２～３回の頻度で培地交換を行った。
７．培養７日目に、ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地に交換した。
＜実施例１＞
　上記の方法で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＩ型コラーゲンゲルを用いて、子宮内膜モデルを作製した。図３に、子宮内膜モデルの明視野位相差顕微鏡画像を示す。
　Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いて培養した場合、子宮内膜上皮細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌの内部で球状構造を形成した。子宮内膜上皮細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に留まり、ゲル表面に露出することはなかった。
　Ｉ型コラーゲンゲルを用いて培養した場合、子宮内膜上皮細胞は、Ｉ型コラーゲンゲル内部に留まることなく、ゲル表面まで移動した。子宮内膜上皮細胞がゲル表面に露出し、ゲルの収縮が観察された。
＜実施例２＞
　上記の方法で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＩ型コラーゲンゲルを用いて、子宮内膜モデルを作製した。次いで、子宮内膜モデルの切片を作製し、抗Ｌａｍｉｎｉｎ抗体による免疫染色、及びＨｏｅｃｈｓｔ染色を行った。図４に、子宮内膜モデル切片の免疫染色画像を示す。
　Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いて培養した場合、子宮内膜上皮細胞は、Ｌａｍｉｎｉｎで包まれており、ゲル表面に露出することはなかった。
　Ｉ型コラーゲンゲルを用いて培養した場合、子宮内膜上皮細胞は、ゲル表面に露出していることが確認された（矢印）。
＜実施例３＞
　ＥＣＳＹ＋ＥＰＣ培地に替えてＥＣＳＹ＋ＥＰＣ＋ＰＬＧ培地を用いたこと以外は上記と同様の方法で、Ｉ型コラーゲンゲルを用いて、子宮内膜モデルを作製した。次いで、子宮内膜モデルの切片を作製し、抗ＥｐＣＡＭ抗体、又は抗ＰＧＲ抗体による免疫染色、ファロイジンによるＦ－ａｃｔｉｎ染色、及びＨｏｅｃｈｓｔ染色を行った。ＥｐＣＡＭは、上皮細胞マーカーであり、上皮細胞に広く発現する。Ｆ－ａｃｔｉｎは、細胞骨格の構造タンパク質である。ＰＧＲは、プロゲステロン受容体であり、ホルモン感受性の指標となる。
　図５に、子宮内膜モデル切片の免疫染色画像を示す。子宮内膜モデルでは、管腔構造と非管腔構造とが連続して形成されていた。管腔構造ではＰＧＲが発現しており、ホルモン感受性であることが確認された。管腔構造は、子宮内膜の腺上皮に類似した構造を有していた。
＜実施例４＞
　Ｉ型コラーゲンゲル又はＭａｔｒｉｇｅｌを用いて、子宮内膜細胞の平面培養を行った。図６に、平面培養３日目における子宮内膜細胞の位相差顕微鏡画像（Ｐｈａｓｅ）と、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂによる染色画像（Ｒｈｏｃａｍｉｎｅ　Ｂ）を示す。
　Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いて平面培養した場合、子宮内膜細胞は、コロニー状に増殖した。一方、Ｉ型コラーゲンゲルを用いて平面培養した場合、子宮内膜細胞は、分散して放射状に遊走していることが確認された。この結果から、Ｉ型コラーゲンゲルの表面では、子宮内膜細胞の遊走が促進されることが示された。
＜実施例５＞
　子宮内膜モデルへの胚細胞の着床をシミュレートするために、ＥＳ細胞（国立成育医療研究センター・梅澤研究室より譲渡）またはＴＳ細胞と、子宮内膜モデルとの共培養試験を行った。ＴＳ細胞は、ＥＧＦＰを発現するように遺伝子改変したＴＳ細胞（ＥＧＦＰ－ＴＳ細胞）を用いた。
　ＥＳ細胞は、胚盤胞様構造（ｂｌａｓｔｏｉｄ）への誘導を行い、子宮内膜モデルと共培養した（Yu L et al Nature 2021）。胚盤胞様構造への誘導は以下のように行った。アガロースで作製した２５６穴マイクロウェルに、２５～５０細胞／ウェルとなるように、ナイーブ型ＥＳ細胞を播種した。５ｉ／Ｌ／Ａ培地で一晩培養した後、ＨＤＭ培地に培地交換した。ＨＤＭ培地で培養を開始してから３日後に、ＴＤＭ培地に培地交換した。その後、２日１回の頻度で培地交換しながら、ＨＤＭ培地で培養を継続した。ＥＳ細胞を播種してから１０～１２日経過した頃に、マウスピペットを用いて、胚盤胞様構造を形成した細胞を採取し、子宮内膜モデルとの共培養に供した。
　ＴＳ細胞は、ペトリ皿を用いてＴＳ培地（Okae et al Cell Stem Cell 2018）にて浮遊培養を３日間行い、凝集体を形成させた。この凝集体を、子宮内膜モデルとの共培養に供した。
　上記の方法で、Ｉ型コラーゲンゲルを用いて、子宮内膜モデルを作製した。次いで、ＥＳ細胞またはＥＧＦＰ－ＴＳ細胞を前記子宮内膜モデルと共培養し、子宮内膜着床モデルを作製した。共培養の培地には、ＩＶＣ１培地およびＩＶＣ２培地を用いた。共培養開始から１日目まではＩＶＣ１培地を用いて共培養を行った。共培養開始から２日目にＩＶＣ２培地に培地交換し、ＩＶＣ２培地で共培養を行った。共培養開始から５日目に、子宮内膜着床モデルの切片を作製した。前記切片について、抗ＯＣＴ４抗体または抗ＳＤＣ１抗体による免疫染色、ファロイジンによるＦ－ａｃｔｉｎ染色、およびＨｏｅｃｈｓｔ染色を行った。ＯＣＴ４は、未分化マーカーであり、未分化細胞に発現する。ＳＤＣ１は、ＳＴ細胞マーカーである。
　図７に、ＥＳ細胞を用いた着床モデルの切片の免疫染色画像を示す。図８に、ＥＧＦＰ－ＴＳ細胞を用いた着床モデルの切片の免疫染色画像を示す。図７及び図８から、ＥＳ細胞またはＥＧＦＰ－ＴＳ細胞が、子宮内膜モデルの表面に付着していることが確認された。ＥＳ細胞及びＴＳ細胞のいずれも、子宮内膜モデルと接触する着床部の細胞においてＳＤＣ１の発現が確認された。このことから、着床部の細胞はＳＴ細胞に分化していると考えられた。これらの結果から、上記方法で作製した子宮内膜モデルを用いて、胚細胞の着床をシミュレートできることが示された。
　本発明によれば、子宮内膜上皮細胞の頂端面が露出した、子宮内膜モデル、前記子宮内膜モデルの作製方法、及び前記子宮内膜モデルを用いた子宮内膜着床モデルが提供される。
　以上、本発明の好ましい実施形態を説明および図示してきたが、これらは本発明を例示するものであり、限定的なものとみなされるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、追加、省略、置換、およびその他の変更を行うことができる。したがって、本発明は、前述の説明によって限定されるものとはみなされず、添付の請求項の範囲によってのみ限定される。
　１　　子宮内膜モデル
　２　　子宮内膜着床モデル
　１０ａ，１０ｂ　子宮内膜上皮細胞集合体
　１１　　管腔構造
　１２　　非管腔構造
　２０　　間質系細胞外マトリクスを含むゲル
　３０　　胚細胞

Claims (9)

  1. 　間質系細胞外マトリクスを含むゲルと、
    　子宮内膜上皮細胞と、を含み、
    　前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部が前記ゲルの表面に露出しており、
    　前記ゲルの表面に露出する前記子宮内膜上皮細胞の少なくとも一部が、管腔構造と非管腔構造とを連続して形成している、
    　子宮内膜モデル。
  2. 　前記非管腔構造が平坦な膜状構造である、請求項１に記載の子宮内膜モデル。
  3. 　前記間質系細胞外マトリクスがＩ型コラーゲンである、請求項１又は２に記載の子宮内膜モデル。
  4. 　前記子宮内膜上皮細胞の一部が前記ゲルの内部に存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の子宮内膜モデル。
  5. 　（ａ）間質系細胞外マトリクスを含むゲルの内部に、子宮内膜上皮細胞を存在させる工程と、
    　（ｂ）前記工程（ａ）後、前記子宮内膜上皮細胞を培養する工程と、
    　を含む、子宮内膜モデルの作製方法。
  6. 　前記間質系細胞外マトリクスがＩ型コラーゲンである、請求項４に記載の子宮内膜モデルの作製方法。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の子宮内膜モデルと、
    　胚細胞と、
    　を含む、子宮内膜着床モデル。
  8. 　前記胚細胞が、栄養膜幹細胞、細胞性栄養膜細胞、絨毛外栄養膜細胞、合胞体性栄養膜細胞、多能性幹細胞、及びこれらから誘導される細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞を含む、請求項７に記載の子宮内膜着床モデル。
  9. 　前記胚細胞がスフェロイド又はオルガノイドを形成している、請求項７又は８に記載の子宮内膜着床モデル。
PCT/JP2021/030100 2021-08-18 2021-08-18 子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル WO2023021591A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21954165.3A EP4390899A1 (en) 2021-08-18 2021-08-18 Endometrium model, method for producing endometrium model, and endometrial implantation model
PCT/JP2021/030100 WO2023021591A1 (ja) 2021-08-18 2021-08-18 子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル
JP2023542074A JPWO2023021591A1 (ja) 2021-08-18 2021-08-18

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2021/030100 WO2023021591A1 (ja) 2021-08-18 2021-08-18 子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023021591A1 true WO2023021591A1 (ja) 2023-02-23

Family

ID=85240218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/030100 WO2023021591A1 (ja) 2021-08-18 2021-08-18 子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4390899A1 (ja)
JP (1) JPWO2023021591A1 (ja)
WO (1) WO2023021591A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116751736A (zh) * 2023-07-18 2023-09-15 首都医科大学附属北京妇产医院 一种子宫内膜类器官培养基及其长期传代培养方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002142753A (ja) * 2000-11-15 2002-05-21 Bio Oriented Technol Res Advancement Inst 動物の受精卵の共培養担体及びこの担体を用いる動物の受精卵の培養方法
JP2013163646A (ja) * 2012-02-09 2013-08-22 Univ Of Tokyo 着床能改善用組成物、及びこれを含む医薬、食品または飲料
JP6400832B2 (ja) 2015-03-10 2018-10-03 国立大学法人東北大学 胎盤を構成する細胞への分化能を有する哺乳動物の未分化前駆細胞及びその製造方法
JP2019505214A (ja) * 2016-02-04 2019-02-28 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 統合された圧送、レベリングおよび感知を備えたモジュール式器官マイクロ生理学的システム
JP2019198267A (ja) * 2018-05-16 2019-11-21 国立大学法人横浜国立大学 細胞含有ハイドロゲル体及びその製造方法
JP2020130055A (ja) * 2019-02-20 2020-08-31 学校法人東京女子医科大学 子宮内膜様組織及びその製造方法
WO2020250438A1 (ja) 2019-06-14 2020-12-17 国立大学法人東北大学 胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞、およびその製造方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002142753A (ja) * 2000-11-15 2002-05-21 Bio Oriented Technol Res Advancement Inst 動物の受精卵の共培養担体及びこの担体を用いる動物の受精卵の培養方法
JP2013163646A (ja) * 2012-02-09 2013-08-22 Univ Of Tokyo 着床能改善用組成物、及びこれを含む医薬、食品または飲料
JP6400832B2 (ja) 2015-03-10 2018-10-03 国立大学法人東北大学 胎盤を構成する細胞への分化能を有する哺乳動物の未分化前駆細胞及びその製造方法
JP2019505214A (ja) * 2016-02-04 2019-02-28 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 統合された圧送、レベリングおよび感知を備えたモジュール式器官マイクロ生理学的システム
JP2019198267A (ja) * 2018-05-16 2019-11-21 国立大学法人横浜国立大学 細胞含有ハイドロゲル体及びその製造方法
JP2020130055A (ja) * 2019-02-20 2020-08-31 学校法人東京女子医科大学 子宮内膜様組織及びその製造方法
WO2020250438A1 (ja) 2019-06-14 2020-12-17 国立大学法人東北大学 胎盤を構成する細胞への分化能を有する細胞、およびその製造方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIDER, S. ET AL., STEM CELL REPORTS, vol. 11, 2018, pages 537 - 551
MARGHERITA Y. TURCO ET AL.: "Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium", NATURE CELL BIOLOGY, vol. 19, 2017, pages 568 - 577, XP055687061, DOI: 10.1038/ncb3516
MURUGANANDAN SHANMUGAM, FAN XIUJUN, DHAL SABITA, NAYAK NIHAR R.: "Development of A 3D Tissue Slice Culture Model for the Study of Human Endometrial Repair and Regeneration", BIOMOLECULES, vol. 10, no. 1, 1 January 2020 (2020-01-01), pages 1 - 14, XP093035984, DOI: 10.3390/biom10010136 *
OKAE ET AL., CELL STEM CELL, 2018
T. W. ET AL., CELL STEM CELL, vol. 15, 2014, pages 471 - 487
YU L ET AL., NATURE, 2021
YU L ET AL., NATURE, vol. 591, no. 7851, March 2021 (2021-03-01), pages 620 - 626

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116751736A (zh) * 2023-07-18 2023-09-15 首都医科大学附属北京妇产医院 一种子宫内膜类器官培养基及其长期传代培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4390899A1 (en) 2024-06-26
JPWO2023021591A1 (ja) 2023-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220186189A1 (en) Method for inducing differentiation of alveolar epithelial cells
US20210284968A1 (en) Method for inducing alveolar epithelial progenitor cells
JP6602288B2 (ja) 浮遊液中で内胚葉前駆細胞を培養するための方法および組成物
KR102598772B1 (ko) 상피 세포의 생체외 증식
JP2022025124A (ja) 乳房上皮幹細胞を増殖させるための培養培地
JP6495830B2 (ja) 毛様体周縁部様構造体の製造法
JP2018532389A (ja) ｅｘ ｖｉｖｏでの上皮細胞の増殖
CN111269885A (zh) 制备端脑或其前体组织的方法
CN106536718B (zh) 胰芽细胞的制造方法及含有胰芽细胞的胰疾病治疗剂
KR102316007B1 (ko) 피부 유래 전구 세포의 제작 방법
AU2017209742B2 (en) Differentiation induction from human pluripotent stem cells into hypothalamic neurons
JPWO2020022261A1 (ja) 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法
JPWO2019098349A1 (ja) 尿管芽様組織誘導方法
WO2015125926A1 (ja) 栄養膜幹細胞の樹立及び維持方法
US11959100B2 (en) Method for culture of cells
US20220313733A1 (en) Method for producing renal interstitial cell
JP2017108705A (ja) 心筋細胞の製造方法
JP7016185B2 (ja) 幹細胞由来涙腺組織の作製方法
WO2023021591A1 (ja) 子宮内膜モデル、子宮内膜モデルの作製方法、及び子宮内膜着床モデル
JP2016214138A (ja) 栄養膜外胚葉様構造体及びその製造方法
KR102183101B1 (ko) 폐상피세포 및 대식세포를 포함하는 폐포 오가노이드 제조 방법 및 이의 용도
KR20220069096A (ko) 요관아 선단부 세포의 단리 방법
RU2813532C1 (ru) Способ очистки кардиомиоцитов
CA2978870C (en) Method for inducing differentiation of alveolar epithelial cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21954165

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023542074

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2021954165

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021954165

Country of ref document: EP

Effective date: 20240318