JP2018532389A - ex vivoでの上皮細胞の増殖 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、2015年9月11日に出願され、「EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLS」との名称であり、Chengkang Zhangを発明者とし、管理番号PPG−2001−PV2として指定された米国仮特許出願第62/217,406の利益を主張する。本特許出願はまた、2016年2月12日に出願され、「EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLS」との名称であり、Chengkang Zhangを発明者とし、管理番号PPG−2001−PV3として指定された米国仮特許出願第62/294,896の利益を主張する。本特許出願はまた、2016年3月31日に出願され、「EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLS」との名称であり、Chengkang Zhangを発明者とし、管理番号PPG−2002−PVとして指定された米国仮特許出願第62/316,438の利益を主張する。前述の出願の内容全体は、全てのテキスト、表および図面を含め、全ての目的について、本明細書において参考として援用される。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2016年9月6日に作成された、前記ASCIIコピーは、PPG−2002−PC_SL.txtと名付けられ、12,134バイトのサイズである。
上皮細胞
細胞培養物
n=3.32×(log Y−log l)+X 方程式A
[式中、n=採取または継代する場合の、細胞培養物の最終的なPD数、Y=採取または継代時における細胞収量、l=細胞培養を始めるための接種物として使用される細胞数、およびX=継代培養を開始するのに使用される、元になる細胞培養物のPD数]
に提示する。
F=2n 方程式B
[式中、F=n回の集団倍加後における、細胞数の増大の倍数]
に提示する。例えば、1回の集団倍加の後で、細胞の数は2倍に増大し、2回の集団倍加の後で、細胞の数は4(22=4)倍に増大し、3回の集団倍加の後で、細胞の数は8(23=8)倍に増大するなど。よって、20回の集団倍加の後で、細胞の数は100万倍(220=1,048,576)を超えて増大し、30回の集団倍加の後で、細胞の数は10億倍(230=1,073,741,824)を超えて増大し、40回の集団倍加の後で、細胞の数は1兆倍(240=1,099,511,627,776)を超えて増大するなど。一部の実施形態では、細胞の集団を、少なくとも約2倍〜少なくとも約1兆倍に拡大するか、または拡大することが可能である。例えば、細胞の集団は、少なくとも約5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、100万倍、10億倍、または1兆倍に拡大することができる。特定の拡大倍数は、例えば、2日間、3日間、4日間、5日間、10日間、20日間、30日間、40日間、50日間、100日間、またはこれを超えるなど、培養におけるある特定の期間にわたり生じうる。
フィーダー細胞
培地および細胞培養物の組成
TGF−ベータ阻害剤
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール(hetercycloaryl)、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
置換アルキル基、置換アルコキシ基、置換アルカノイル基、置換アルコキシカルボニル基、置換シクロアルキル基、置換アリール基、置換シクロアリール基、置換複素環基、または置換ヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜6アルコキシ、C1〜6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む。
アルブミン
レチノイン酸シグナル伝達阻害剤
p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤
ミオシンII阻害剤
ROCK(Rho関連タンパク質キナーゼ)阻害剤
後続の環境
拡大された細胞の使用
(実施例1)
材料および方法
細胞の培養および集団倍加の決定
n=3.32×(log Y−log l)+X 方程式A
[式中、n=所与の継代培養の終了時における最終的なPD数、Y=採取時における細胞収量、l=継代培養を始めるための接種物として使用される細胞数、およびX=定量化する継代培養を開始するのに使用される接種物の倍加レベル]
に提示する。
製造元の指示書に従い、TRIzol(登録商標)Plus RNA Purification Kit(Life Technologies、12183−555)、およびPureLink(登録商標)RNA Mini Kit(Life Technologies、12183018A)を使用して、全RNAを調製した。供給元により提供されるプロトコールに従い、TaqMan(登録商標)RNA−to−CT(商標)1−Step Kit(Life Technologies、4392938)を使用して、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)の発現を決定するために、100ナノグラムの全RNAを使用した。使用されるhTERTプライマーおよびTaqman(登録商標)プローブは、以下の通り:フォワードプライマー:5’−TGACACCTCACCTCACCCAC−3’(配列番号7)、リバースプライマー:5’−CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC−3’(配列番号8)、およびTaqman(登録商標)プローブ:5’−ACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG−3’(配列番号9)であった。
(実施例2)
従来の細胞培養培地(すなわち、対照培養条件)中の上皮細胞の成長
(実施例3)
ALK5阻害剤の存在下における、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)の発現
(実施例4)
上皮細胞のプレーティング効率
(実施例5)
ALK5阻害剤、Rhoキナーゼ阻害剤、および他の化合物を含む化合物の、上皮細胞の増殖に対する効果
(実施例6)
ALK5阻害剤、Rhoキナーゼ阻害剤、および他の化合物を含む化合物の、上皮細胞の増殖に対する効果、ならびに他の特性についてのさらなる研究
(実施例7)
上皮細胞を増殖させるための、規定された培地組成物の同定
(実施例8)
上皮細胞の遺伝子発現プロファイル
培養物中の上皮細胞の特徴付け
1μMのA83−01および5μMのY−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で培養された、継代2回目のヒト気管支上皮細胞を、KSFM+A+Y条件から取り出し、Matrigel(登録商標)中に、単一細胞として包埋し、Clonetics(商標)B−ALI(商標)air−liquid interface medium(高カルシウムの分化培地、Lonza)中で、14日間培養した。図31は、ブロンコスフェアへと分化した気管支上皮細胞を示す。図31の上パネルは、低倍率(4X)で見た細胞を示し、図31の下パネルは、高倍率(20X)で見た細胞を示す。目視可能な管腔を伴う、大型のブロンコスフェアを、図31の下パネルに示す。
高カルシウム濃度への曝露後における、上皮細胞の特徴付け
上皮細胞培養物のさらなる特徴付け
異なる培地条件下で培養された上皮細胞の拡大
アルブミンの存在下で培養した上皮細胞
(実施例11)
実施形態の例
a)無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、分化上皮細胞を培養するステップと;
b)(a)で培養中に、分化上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
a)無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、前静止上皮細胞を培養するステップと;
b)(a)で培養中に、前静止上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
a)無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、分化系列決定上皮細胞を培養するステップと;
b)(a)で培養中に、分化系列決定上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
a)フィーダー細胞フリーの条件下で、上皮細胞を培養するステップと;
b)(a)で培養中に、上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと;
c)(a)で培養中に、上皮細胞内のp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害するステップと
を含む方法。
a)無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、上皮細胞を培養するステップと;
b)(a)で培養中に、上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと;
c)(a)で培養中に、上皮細胞内のミオシンIIの活性を阻害するステップと
を含む方法。
a)フィーダー細胞フリーの条件下で、分化上皮細胞を培養するステップと;
b)分化上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップと;
c)分化上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む方法。
a)フィーダー細胞フリーの条件下で、前静止上皮細胞を培養するステップと;
b)前静止上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップと;
c)前静止上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む方法。
a)フィーダー細胞フリーの条件下で、分化系列決定上皮細胞を培養するステップと;
b)分化系列決定上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップと;
c)分化系列決定上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む方法。
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、実施形態A16〜A18のいずれか1つによる方法。
b)上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む、実施形態A1〜A24.1のいずれか1つによる方法。
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜6アルコキシ、C1〜6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、実施形態B14またはB15による細胞培養培地。
b)(a)で培養中に、分化上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ex vivoで増殖させた上皮細胞の集団。
b)(a)で培養中に、前静止上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ex vivoで増殖させた上皮細胞の集団。
b)(a)で培養中に、分化系列決定上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ex vivoで増殖させた上皮細胞の集団。
b)(a)で培養中に、上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと;
c)(a)で培養中に、上皮細胞内のp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ex vivoで増殖させた上皮細胞の集団。
b)(a)で培養中に、上皮細胞内のTGF−ベータシグナル伝達を阻害するステップと;
c)(a)で培養中に、上皮細胞内のミオシンIIの活性を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ex vivoで増殖させた上皮細胞の集団。
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜6アルコキシ、C1〜6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、実施形態C16〜C18のいずれか1つによる上皮細胞。
分化組織に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、フィーダー細胞フリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
拡大培養条件が、集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
元になる上皮細胞集団が、拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;
元になる上皮細胞集団が、薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、
方法。
分化組織に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
拡大培養条件が、集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
元になる上皮細胞集団が、静止上皮細胞および/または前静止上皮細胞を含む、
方法。
拡大培養条件が、集団内の細胞骨格構造をモジュレートする第2の薬剤をさらに含み、
対照培養条件が、第1の薬剤および第2の薬剤を含まない、
実施形態E1による方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、1つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態E1〜E4のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5、およびTP63の1つまたは複数を発現する、実施形態E1〜E5のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、1つまたは複数の上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E6のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、Lgr5を発現しない、実施形態E1〜E7のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、1つまたは複数の多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E8のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4、およびSOX2の1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E9のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、1つまたは複数の最終分化上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E10のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPB、およびSFTPDの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E11のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、1つもしくは複数の胃上皮細胞マーカー、1つもしくは複数の腸上皮細胞マーカー、および/または1つもしくは複数の膵上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E12のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133の1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E13のいずれか1つによる方法。
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、静止上皮細胞および/または前静止上皮細胞含む、実施形態E1〜E14のいずれか1つによる方法。
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、実施形態F10からF11.1のいずれか1つに記載の方法。
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜6アルコキシ、C1〜6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、実施形態G7からG8.1のいずれか1つに記載の組成物。
例えば、本発明の実施形態において、以下の項目が提供される。
(項目1)
ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
(項目2)
ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
(項目3)
ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
(項目4)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記シグナル伝達阻害剤を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、項目2または3に記載の方法。
(項目5)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、項目2または3に記載の方法。
(項目6)
ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
(項目7)
ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
(項目8)
ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
(項目9)
ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
(項目10)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、項目1および6から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、項目1および6から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記元になる上皮細胞集団が、分化上皮細胞を含む、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記元になる上皮細胞集団が、静止上皮細胞および/または前静止上皮細胞を含む、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記元になる上皮細胞集団が、分化系列決定上皮細胞を含む、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記元になる上皮細胞集団および/または前記拡大された上皮細胞集団が、胚性幹細胞を含有しない、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する1つまたは複数の分子を含む、項目1および6から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするDNAおよび/またはRNAと相互作用する1つまたは複数の分子を含む、項目1および6から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、項目1および6から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のALK5阻害剤を含む、項目2から5および18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数の低分子ALK5阻害剤を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数のATP類似体を含む、項目19または20に記載の方法。
(項目22)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤の少なくとも1つが、式A:
[式中、
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R 1 、R 2 、およびR 3 は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R 4 、R 5 、およびR 6 は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、項目19から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、項目19から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号1もしくは配列番号2と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、項目24または25に記載の方法。
(項目27)
前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目1および10から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤、p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤、およびミオシンII阻害剤の1つまたは複数を含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ1(ROCK 1)阻害剤およびRho関連タンパク質キナーゼ2(ROCK 2)阻害剤から選択される、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
前記1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100塩酸塩、HA1077、およびGSK−429286から選択される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、PAK1阻害剤、PAK2阻害剤、PAK3阻害剤、およびPAK4阻害剤から選択される、項目28から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤が、IPA3を含む、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記ミオシンII阻害剤が、1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、項目28から34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、ブレビスタチンを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目1、2、3、および10から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、項目6から9および38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記拡大培養条件が、前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目1、6、8、および10から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、項目7、9、および41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、項目3に記載の方法。
(項目44)
前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストが、BMS−453およびBMS−195614の1つまたは複数を含む、項目42または43に記載の方法。
(項目45)
前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを各々、マイクロモル未満の濃度で使用する、項目42から44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記拡大培養条件が、300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目1、2、3、および10から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記拡大培養条件が、100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目1、2、3、および10から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記規定されたゼノフリー基本培地が、300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目6から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記規定されたゼノフリー基本培地が、100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目6から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記拡大培養条件が、1つまたは複数の成長因子を含む、項目1、2、3、および10から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
1つまたは複数の成長因子が、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、項目6から9および52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記拡大培養条件が、異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、項目1から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、30回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目1から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、50回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目1から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、80回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目1から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、100回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目1から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記元になる上皮細胞集団が、基底上皮細胞を含む、項目1から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記元になる上皮細胞集団および/または前記拡大された上皮細胞集団が、1つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、項目1から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
連続的に増殖する上皮幹細胞、および/またはin vivoで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団を選択するステップを含まない、項目1から60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記元になる上皮細胞集団が、連続的に増殖する上皮幹細胞を含まず、かつ/またはin vivoで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団に由来する細胞を含まない、項目1から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
ex vivoで拡大した上皮細胞の集団を単離するステップをさらに含む、項目1から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
ex vivoで拡大した上皮細胞の集団を、細胞バンクで貯蔵するステップをさらに含む、項目1から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
項目1から64のいずれか一項に記載の方法により作製される、ex vivoで拡大した上皮細胞の集団。
(項目66)
遺伝子改変細胞を作製するための、項目65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目67)
対象のための1つまたは複数の候補処置を同定するための、項目65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目68)
対象における1つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、項目65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目69)
対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、項目65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目70)
i)培養された上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
(項目71)
i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
(項目72)
i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
(項目73)
規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
(項目74)
規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
(項目75)
規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
(項目76)
規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
(項目77)
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する1つまたは複数の分子を含む、項目70および73から76のいずれか一項に記載の組成物。
(項目78)
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするDNAおよび/またはRNAと相互作用する1つまたは複数の分子を含む、項目70および73から76のいずれか一項に記載の組成物。
(項目79)
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、項目70および73から76のいずれか一項に記載の組成物。
(項目80)
前記1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のALK5阻害剤を含む、項目71、72、または79に記載の組成物。
(項目81)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数の低分子ALK5阻害剤を含む、項目80に記載の組成物。
(項目82)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数のATP類似体を含む、項目80または81に記載の組成物。
(項目83)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤の少なくとも1つが、式A:
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R 1 、R 2 、およびR 3 は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R 4 、R 5 、およびR 6 は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜6アルコキシ、C1〜6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、項目80から82のいずれか一項に記載の組成物。
(項目84)
前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、項目80から83のいずれか一項に記載の組成物。
(項目85)
前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号1もしくは配列番号2と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、項目70から84のいずれか一項に記載の組成物。
(項目86)
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、項目85に記載の組成物。
(項目87)
前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、項目85または86に記載の組成物。
(項目88)
前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目70および77から87のいずれか一項に記載の組成物。
(項目89)
細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤、p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤、およびミオシンII阻害剤の1つまたは複数を含む、項目88に記載の組成物。
(項目90)
前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ1(ROCK 1)阻害剤およびRho関連タンパク質キナーゼ2(ROCK 2)阻害剤から選択される、項目89に記載の組成物。
(項目91)
前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、項目89または90に記載の組成物。
(項目92)
前記1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100塩酸塩、HA1077、およびGSK−429286から選択される、項目91に記載の組成物。
(項目93)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、PAK1阻害剤、PAK2阻害剤、PAK3阻害剤、およびPAK4阻害剤から選択される、項目89から92のいずれか一項に記載の組成物。
(項目94)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤を含む、項目93に記載の組成物。
(項目95)
前記1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤が、IPA3を含む、項目94に記載の組成物。
(項目96)
前記ミオシンII阻害剤が、1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、項目89から95のいずれか一項に記載の組成物。
(項目97)
前記1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、項目96に記載の組成物。
(項目98)
前記1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、ブレビスタチンを含む、項目97に記載の組成物。
(項目99)
前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目70、71、72、および73から98のいずれか一項に記載の組成物。
(項目100)
細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、項目73から76および99のいずれか一項に記載の組成物。
(項目101)
前記1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、項目100に記載の組成物。
(項目102)
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目70、73、75、および77から101のいずれか一項に記載の組成物。
(項目103)
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、項目74、76、および102のいずれか一項に記載の組成物。
(項目104)
前記1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、項目72に記載の組成物。
(項目105)
前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストが、BMS−453およびBMS−195614の1つまたは複数を含む、項目103または104に記載の組成物。
(項目106)
前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストが各々、マイクロモル未満の濃度で存在する、項目103から105のいずれか一項に記載の組成物。
(項目107)
300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目70、71、72、および77から106のいずれか一項に記載の組成物。
(項目108)
100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目70、71、72、および77から106のいずれか一項に記載の組成物。
(項目109)
前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、項目108に記載の組成物。
(項目110)
前記規定されたゼノフリー基本培地が、300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目73から76のいずれか一項に記載の組成物。
(項目111)
前記規定されたゼノフリー基本培地が、100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、項目73から76のいずれか一項に記載の組成物。
(項目112)
前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、項目111に記載の組成物。
(項目113)
前記拡大培養条件が、1つまたは複数の成長因子を含む、項目70、71、72、および77から112のいずれか一項に記載の組成物。
(項目114)
1つまたは複数の成長因子が、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、項目73から76および113のいずれか一項に記載の組成物。
(項目115)
異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、項目70から114のいずれか一項に記載の組成物。
Claims (115)
- ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。 - ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。 - ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。 - 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記シグナル伝達阻害剤を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、請求項2または3に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、請求項2または3に記載の方法。
- ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。 - ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。 - ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。 - ex vivoで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地;前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。 - 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、請求項1および6から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、25回またはこれを超える集団倍加が可能であり;前記元になる上皮細胞集団が、前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、20回を超えない集団倍加が可能である、請求項1および6から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、分化上皮細胞を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、静止上皮細胞および/または前静止上皮細胞を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、分化系列決定上皮細胞を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団および/または前記拡大された上皮細胞集団が、胚性幹細胞を含有しない、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する1つまたは複数の分子を含む、請求項1および6から15のいずれか一項に記載の方法。
- テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするDNAおよび/またはRNAと相互作用する1つまたは複数の分子を含む、請求項1および6から15のいずれか一項に記載の方法。
- テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、請求項1および6から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のALK5阻害剤を含む、請求項2から5および18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数の低分子ALK5阻害剤を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数のATP類似体を含む、請求項19または20に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のALK5阻害剤の少なくとも1つが、式A:
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、請求項19から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号1もしくは配列番号2と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、請求項24に記載の方法。
- 前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、請求項24または25に記載の方法。
- 前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項1および10から26のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤、p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤、およびミオシンII阻害剤の1つまたは複数を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ1(ROCK 1)阻害剤およびRho関連タンパク質キナーゼ2(ROCK 2)阻害剤から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100塩酸塩、HA1077、およびGSK−429286から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、PAK1阻害剤、PAK2阻害剤、PAK3阻害剤、およびPAK4阻害剤から選択される、請求項28から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤が、IPA3を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記ミオシンII阻害剤が、1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、請求項28から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、ブレビスタチンを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項1、2、3、および10から37のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、請求項6から9および38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記拡大培養条件が、前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項1、6、8、および10から40のいずれか一項に記載の方法。
- レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、請求項7、9、および41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストが、BMS−453およびBMS−195614の1つまたは複数を含む、請求項42または43に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを各々、マイクロモル未満の濃度で使用する、請求項42から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拡大培養条件が、300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項1、2、3、および10から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拡大培養条件が、100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項1、2、3、および10から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、請求項47に記載の方法。
- 前記規定されたゼノフリー基本培地が、300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記規定されたゼノフリー基本培地が、100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、請求項50に記載の方法。
- 前記拡大培養条件が、1つまたは複数の成長因子を含む、請求項1、2、3、および10から51のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の成長因子が、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、請求項6から9および52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拡大培養条件が、異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、請求項1から53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、30回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、50回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、80回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、100回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、基底上皮細胞を含む、請求項1から58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団および/または前記拡大された上皮細胞集団が、1つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、請求項1から59のいずれか一項に記載の方法。
- 連続的に増殖する上皮幹細胞、および/またはin vivoで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団を選択するステップを含まない、請求項1から60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記元になる上皮細胞集団が、連続的に増殖する上皮幹細胞を含まず、かつ/またはin vivoで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団に由来する細胞を含まない、請求項1から61のいずれか一項に記載の方法。
- ex vivoで拡大した上皮細胞の集団を単離するステップをさらに含む、請求項1から62のいずれか一項に記載の方法。
- ex vivoで拡大した上皮細胞の集団を、細胞バンクで貯蔵するステップをさらに含む、請求項1から63のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から64のいずれか一項に記載の方法により作製される、ex vivoで拡大した上皮細胞の集団。
- 遺伝子改変細胞を作製するための、請求項65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
- 対象のための1つまたは複数の候補処置を同定するための、請求項65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
- 対象における1つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、請求項65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
- 対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、請求項65に記載のex vivoで拡大した上皮細胞の集団の使用。
- i)培養された上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
- i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
- i)1つまたは複数の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにii)1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
- 規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
- 規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
- 規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
- 規定されたゼノフリー基本培地;培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または前記集団内の形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤;1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分;1つまたは複数の成長因子;前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤;および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
- テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する1つまたは複数の分子を含む、請求項70および73から76のいずれか一項に記載の組成物。
- テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするDNAおよび/またはRNAと相互作用する1つまたは複数の分子を含む、請求項70および73から76のいずれか一項に記載の組成物。
- テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ/または形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、請求項70および73から76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のTGF−ベータシグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のALK5阻害剤を含む、請求項71、72、または79に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数の低分子ALK5阻害剤を含む、請求項80に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、1つまたは複数のATP類似体を含む、請求項80または81に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のALK5阻害剤の少なくとも1つが、式A:
X、Y、およびZは独立に、N、C、およびOから選択され;
R1、R2、およびR3は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5、およびR6は独立に、水素、C1〜C10アルキル、置換C1〜C10アルキル、C1〜C10アルコキシ、置換C1〜C10アルコキシ、C1〜C6アルカノイル、C1〜C6アルコキシカルボニル、置換C1〜C6アルカノイル、置換C1〜C6アルコキシカルボニル、C3〜C9シクロアルキル、置換C3〜C9シクロアルキル、C5〜C10アリール、置換C5〜C10アリール、C5〜C10シクロアリール、置換C5〜C10シクロアリール、C5〜C9複素環、置換C5〜C9複素環、C5〜C9ヘテロシクロアリール、置換C5〜C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換C3〜C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5〜C10アリール)、−リンカー−(置換C5〜C10アリール)、−リンカー−(C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C10シクロアリール)、−リンカー−(C5〜C9複素環)、−リンカー−(置換C5〜C9複素環)、−リンカー−(C5〜C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換C5〜C9ヘテロシクロアリール)から選択され;
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1〜C10アルキル、ヒドロキシル、C1〜C10アルキレン、C1〜C6アルコキシ、C3〜C9シクロアルキル、C5〜C9複素環、C1〜6アルコキシ、C1〜6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである]
の構造を含む、請求項80から82のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記1つまたは複数のALK5阻害剤が、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、請求項80から83のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号1もしくは配列番号2と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、請求項70から84のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、請求項85に記載の組成物。
- 前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン(rHA)である、請求項85または86に記載の組成物。
- 前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項70および77から87のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞骨格構造をモジュレートする1つまたは複数の薬剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤、p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤、およびミオシンII阻害剤の1つまたは複数を含む、請求項88に記載の組成物。
- 前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Rho関連タンパク質キナーゼ1(ROCK 1)阻害剤およびRho関連タンパク質キナーゼ2(ROCK 2)阻害剤から選択される、請求項89に記載の組成物。
- 前記Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、請求項89または90に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の低分子Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100塩酸塩、HA1077、およびGSK−429286から選択される、請求項91に記載の組成物。
- 前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、PAK1阻害剤、PAK2阻害剤、PAK3阻害剤、およびPAK4阻害剤から選択される、請求項89から92のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記p21活性化キナーゼ(PAK)阻害剤が、1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤を含む、請求項93に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の低分子PAK1阻害剤が、IPA3を含む、請求項94に記載の組成物。
- 前記ミオシンII阻害剤が、1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、請求項89から95のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤を含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の低分子非筋ミオシンII(NM II)阻害剤が、ブレビスタチンを含む、請求項97に記載の組成物。
- 前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項70、71、72、および73から98のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、請求項73から76および99のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、請求項100に記載の組成物。
- レチノイン酸シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項70、73、75、および77から101のいずれか一項に記載の組成物。
- レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記1つまたは複数の薬剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、請求項74、76、および102のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストを含む、請求項72に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストが、BMS−453およびBMS−195614の1つまたは複数を含む、請求項103または104に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストが各々、マイクロモル未満の濃度で存在する、請求項103から105のいずれか一項に記載の組成物。
- 300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項70、71、72、および77から106のいずれか一項に記載の組成物。
- 100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項70、71、72、および77から106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、請求項108に記載の組成物。
- 前記規定されたゼノフリー基本培地が、300μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項73から76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記規定されたゼノフリー基本培地が、100μMを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項73から76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、請求項111に記載の組成物。
- 前記拡大培養条件が、1つまたは複数の成長因子を含む、請求項70、71、72、および77から112のいずれか一項に記載の組成物。
- 1つまたは複数の成長因子が、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、請求項73から76および113のいずれか一項に記載の組成物。
- 異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、請求項70から114のいずれか一項に記載の組成物。
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