JPS63304978A

JPS63304978A - 上皮細胞の増殖法

Info

Publication number: JPS63304978A
Application number: JP63122988A
Authority: JP
Inventors: ラルフ・ミヒャエル・ドレーハー; ハンス−エミル・クノエル
Original assignee: Battelle Institut eV
Current assignee: Battelle Institut eV
Priority date: 1987-05-20
Filing date: 1988-05-19
Publication date: 1988-12-13
Also published as: DE3716907C2; EP0291696A3; EP0291696A2; DE3716907A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はヒトまたは動物の上皮細胞を、上皮細胞の成長
を促進する物質と接触させる培養において増殖させる方
法に関する。

（従来の技術）広範囲に及ぶ熱傷（Ｂｒａｎｄｗｕｎｄｅ）の治療に際
しては、従来の治療法、たとえば死体からの同種移植片
（＾ｌ１ｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ）　、ブタの皮膚
および人工皮膚の異種移植片（ＸｅｎｏｔｒａｎｓρＩ
ａｎｔａｔ）によっては本質的な進歩は達成されない、
これらの方法を採用すると延命は得られるが、免疫によ
る剥離反応のため永久的治療は今日まで不可能であった
。

これらの問題の解決はボストンのハワード・グリーン教
授の方法（エッチ・グリーンら、ブロク。

ナショナル、アカデ、サイ、ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）Ｊ１１９７９）
　、　５６６５）によって可能であると思われる。この
ためには、皮膚バイオプシー（約２ｃｄ）により採取し
たヒト表皮細胞を細胞培養において増殖させる。数週間
後には、上皮細胞を酵素により細胞結合体として採取し
、自己由来の細胞培養皮膚として火傷の移植に利用しう
る程度にまで上皮細胞の増殖は進んでいる。

しかし−次ヒト上皮細胞の培養には以下の２つ−の問題
がある。

１、皮膚バイオプシーにより上皮細胞を採取する際に、
他の細胞型、主として線維芽細胞も採取される。これら
の繊維芽細胞は上皮細胞よりも速やかにかつ良好に増殖
し、短期間でこれらを覆う、この問題は、放射線障害の
ためもはや分裂し得ない照射線維芽細胞を上皮細胞と共
に接種することによって解決しうる。

このフィーダ一層とも呼ばれる照射線維芽細胞が、上皮
細胞の採取に際して同様に得られる線維芽細胞の増殖を
妨げる。

２、−次ヒト上皮細胞はインビトロ培養においてきわめ
て低い増殖を示す、エッチ・グリーンおよびジェイ・ラ
インワルトの幾つかの報文（１，ジェイ・ジー・ライン
ワルトおよびエッッチ・グリーン、°セル鉦１９７５）
　３１７．　２．ジェイ・ジー・ラインワルトおよびエ
ッチ・グリーン、セル鉦１９７５）３３１；　３．エッ
チ・グリーン、セル、ｌ、１（１９７８）　８０１）に
、細胞内Ｃ−八へＰ水準を高めることによってより好ま
しい増殖が得られると記載されている。

この研究グループは上皮細胞の増殖に好ましい作用を及
ぼす４種の物質（１，）コレラ消毒、２、）　ジブチリ
ル−Ｃ−へ肝、３．）メチル−イソブチルキサンチン、
４．）イソプロテレノール）を確認することができた。

すべてに共通なことはｃ−ＡＭＰ水準の誘導および増大
である。これら４種の物質は上皮細胞の培養に関連して
米国特許第４，４５６，６８７号明細書に記載されてい
る０本発明はこの技術水準に由来する。

（発明が解決しようとする課題）重症の傷害のための移植片として上皮細胞を用いる際に
は、上皮細胞の増殖速度が重要である。

約３週間後にはこれらの患者に敗血症の危険性が高まる
ので、この３週間以内に約１〜２Ｍの細胞培養皮膚を生
成しなければならない。

（課題を解決するための手段）従来量も好ましい結果を示したコレラ毒素と比較してヒ
ト表皮細胞の増殖をかなり高める物質を確認することが
できた。この物質は、植物コリウス・フォルシコリ（Ｃ
ｏｌｅｕｓ　ｆｏｒｓｉｋｏｌｉｉ、シソ科すヤバナ属
の草）から単離されたフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌ
ｉｎ）　、すなわちジテルペンである。フォルスコリン
はｃ−ＡＭＰの合成に関与する酵素アデニル酸サイクラ
ーゼに直接に結合し、これを永久的に刺激する。この点
においてフォルスコリンはコレラ毒素またはイソプロテ
レノールときわめて著しく異なる。これらはアデニル酸
サイクラーゼと直接に反応するのではなく、間接的に結
合し、その際いわゆるＧ蛋白質を活性化し、これがさら
にアデニル酸サイクラーゼを活性化する。

最終的にはフォルスコリンもコレラ毒素も細胞における
Ｃ−へＭＰ水準を高めるが、その際フォルスコリンはア
デニル酸サイクラーゼに直接に結合して活性化するので
、Ｇ蛋白質のＡＤＰ−リボシル化を経て間接的にアデニ
ル酸サイクラーゼを刺激するコレラ毒素によるものより
も明らかに高い活性化が得られる。

ここに記載するフォルスコリンを用いた実験はすべて、
１Ｇ−”Ｈの濃度のコレラ毒素と比較して行われた。ヒ
ト上皮細胞の培養におけるフォルスコリンの作用は著し
く用量依存性である。　１０−’Ｍまたは５　Ｘｌ０−
’Ｈのフォルスコリンの濃度において最良の増殖が観察
される。しかし１０−’Ｍにおいても、観察された細胞
増殖はコレラ毒素を用いた場合よりもなお高い、　１０
−’Ｍフォルスコリンにおける作用がほぼコレラ毒素の
作用に相当する。

本発明は以下の実施例によってより詳細に説明すること
ができる。

実施例１フォルスコリンの作用エム・グリーンの方法（エム・グリーンら、ＰＮＡＳユ
■１９７９）　５６６５）に従って皮膚をトリプシン処
理することにより角度細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｚｙｔｅ
）を採取し、細胞密度２．５　Ｘ　１０’個／　ｃｄに
おいて接種した。

実施例１．２および３における皮膚試料は年令３０〜４
０才の患者から得た。さらに、致死量の照射を施した３
Ｔ３線維芽細胞２Ｘ１０’個／Ｃ−を接種した培養につ
いては米国特許第４，０１６，０３６号明細書に記載さ
れている。

−培地としてはＤＭＥＭおよびＨＡＭのＦ１２（３：１
）の混合物に下記の添加物を含むものを使用した。

ヒドロコルチゾン　　　　０．４ｐｇ／ａｆｆｉインシ
ュリン　　　　　　５　μｇ　／　ｒｎｌトリョードチ
ロニン　　　２ＸＩＯ−’阿トランスフェリン　　　　
５　　ｐｇ／ｄｉアデニン　　　　　　　　８Ｘ１０’
Ｍゲンタマイシン、ペニシリンストレプトマイシン　　　各５０ｐｇ／ｙｔｒｌウシ胎
仔血清　　　　　　１０　　％ＥＧＦ　（２日後）　　　　　　　　　１０　　μｇ／
ｌＩｒ１コレラ毒素と比較したフォルスコリンの作用を
調べるために、種々の濃度のフォルスコリン（１０−’
〜１０−８Ｍ）およびコレラ毒素１０−’Ｍを含む対応
する添加物を添加した。１０日後に試料を固定し、角度
細胞コロニーをローダミンＢで染色した。フォルスコリ
ン濃度１０４〜１０−’Ｈにおいて角度細胞コロニーの
大きさが明らかに増大しているのが確認された。フォル
スコリン濃度１０１Ｍはなおコレラ毒素を添加した場合
と同等の結果を示し、１０−”Ｈのフォルスコリンはコ
レラ毒素よりも明らかに劣っていた。

実施例２実施例１に記載したと同様な実験において、種々の濃度
のフォルスコリンを用いた角度細胞培養およびコレラ毒
素を用いた培養を、コンフルエンス（Ｋｏｎｆ　Ｉｕｅ
ｎｚ）に達するまで行った。さらに、１２日後に細胞を
分離し、計数した。

７ｔルスコ！Ｊ　７５ｘｌＯ−’Ｍ　　１３　ＸＩＯ’
　　　１８これらのデータは、培地中５Ｘ１０−’Ｍま
たは１０４Ｍのフォルスコリン濃度において、コンフル
エンス状態の角度細胞培養に達するまでの時間がコレラ
毒素と比較して約４０％短縮されたことを明瞭に示す。

実施例３実験例１に記載したと同様に行ったこの実験においては
、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）およびビオメゾイカ・
ヴイエン社の合成血清（ヌーーシーラム（Ｎｕ−３ｅｔ
ｕｍ）　Ｎｏ、　１）を用いて比較実験を行った。

ヌー−ンーラム、コレラ　毒素１０−’Ｍ　　　　　　
　８Ｘ１０’　　　　　　　　２３これらの実験も、フ
ォルスコリンが血清の選択に関係なく約５Ｘ１０−’〜
１０−’Ｍの濃度範囲において角皮細胞の増殖をかなり
促進し、従ってコンフルエンス状態の培養に達するまで
の時間、従って細胞培養皮膚移植に達するまでの時間が
短縮されることを明瞭に示した。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）上皮細胞をフォルスコリンと接触させることを特
徴とする、上皮細胞の増殖を促進させる物質と接触させ
た培養においてヒトまたは動物の上皮細胞を増殖させる
方法。
（２）フォルスコリンを約１０＾−＾５Ｍから１０＾−
＾６Ｍまで、特に約５×１０＾−＾６Ｍまでの濃度にお
いて使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法
。