CN117025505A - 胃粘膜上皮前体样细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胃粘膜上皮前体样细胞及其制备方法和应用，胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法包括：提供胃粘膜上皮原代细胞；将所述胃粘膜上皮原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％，使用胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到胃粘膜上皮前体样细胞，其中，所述重编程培养基包括基础培养基、胃泌素和生长因子。本发明解决了胃粘膜上皮前体样细胞在体外无法连续传代且不能表达胃粘膜上皮前体样细胞标志物的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胃粘膜上皮前体样细胞及其制备方法和应用。
背景技术
胃体自我更新的上皮细胞包含4种终末分化细胞，它们以不同的速率被替换：泌酸细胞(壁细胞)、酶原细胞(主细胞)、颈粘液细胞和分泌激素的肠内分泌细胞。颈黏液细胞具有分泌功能，并可作为主细胞的中间祖细胞。尽管干细胞的性质在胃体和胃窦不同，人们一致认为所有的胃粘膜细胞都来自干细胞。成人组织中的干细胞可以再生一个谱系中的所有常驻细胞类型，研究干细胞的出发点通常是利用它们可以再生丢失的或受损的组织的潜力。
消化性溃疡(peptic ulcer，PU)主要指发生在胃和十二指肠的慢性溃疡，即胃溃疡(gastric ulcer，GU)和十二指肠溃疡(duodenal ulcer，DU)，是一种临床上常见的慢性胃肠道疾病。由于抑制胃酸药物、保护胃黏膜药物、根除幽门螺杆菌药物的使用，PU发病率已呈下降趋势，有效治愈率明显提高，但如何降低PU的复发率，仍是当前PU治疗中的一大难题。近几十年来，随着成体间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的发现，以及其具有的多向分化能力，让人们看到了利用MSC分化为胃黏膜上皮细胞以改善胃黏膜防御-修复屏障和炎症反应，从而治疗GU并防止其复发的可能性。胃粘膜上皮前体样细胞具有细胞数量大、取材创伤性小、可向胃黏膜上皮细胞分化、无免疫排斥反应等优点。利用胃黏膜上皮前体样细胞移植治疗GU，或可增强胃溃疡患者的胃黏膜屏障，有望成为一种新颖的治疗手段。
随着胃粘膜上皮前体样细胞能够移植治疗GU，人们会对胃粘膜上皮前体样细胞的要求越来越高，人类原代细胞将更接近地代表胃粘膜上皮细胞，但目前的技术仅限于分离分化的胃粘膜上皮细胞，这些胃粘膜上皮细胞不能自我更新，因此只能在体外或体外环境内维持几天的活性。现有技术中，无论哪种方式来源的胃粘膜上皮前体样细胞，都存在体外培养困难，不能连续传代以及不能维持胃粘膜上皮前体样细胞标志物的问题。
因此，有必要提供一种胃粘膜上皮前体样细胞及其制备方法和应用以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供新型的胃粘膜上皮前体样细胞及其制备方法和应用，以解决胃粘膜上皮前体样细胞在体外无法连续传代且不能表达胃粘膜上皮前体样细胞标志物的问题。
为实现上述目的，本发明的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：
S0：提供胃粘膜上皮原代细胞；
S1：将所述胃粘膜上皮原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％，使用胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到胃粘膜上皮前体样细胞，其中，所述重编程培养基包括基础培养基、胃泌素和生长因子。
本发明的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法的有益效果在于：通过将所述胃粘膜上皮原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％，使用胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到胃粘膜上皮前体样细胞，其中，所述重编程培养基包括基础培养基、胃泌素和生长因子，以维持胃黏膜上皮前体样细胞在体外培养中不断实现自我更新和增殖，从而本申请解决了胃粘膜上皮前体样细胞在体外无法连续传代且不能表达胃粘膜上皮前体样细胞标志物的问题。
优选的，所述胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法还包括：S2：将所述胃粘膜上皮前体样细胞放入所述重编程培养基中进行扩增培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％后，使用所述胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到传代的胃粘膜上皮前体样细胞。其有益效果在于：可以在重编程培养基中持续扩增胃粘膜上皮前体样细胞且得到的胃粘膜上皮前体样细胞能表达胃粘膜上皮前体样细胞标志物。
优选的，所述重编程培养基还包括ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGF-β信号抑制剂、营养补充剂和缓冲液。
优选的，以占所述基础培养基的体积计，所述胃泌素的含量为0.1-5nmol/L，所述生长因子的含量为190-340ng/ml。
优选的，以占所述基础培养基的体积计，所述ROCK激酶抑制剂的含量为5-15μM，所述Wnt信号通路激动剂的含量为1-10μM，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-5μM，所述营养补充剂的含量为2-10％。
优选的，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子10、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子。
优选的，以占所述基础培养基的体积计，所述成纤维细胞生长因子10的含量为150-250ng/ml，所述表皮生长因子的含量为10-30ng/mL，所述碱性成纤维生长因子的含量为30-60ng/mL。
优选的，所述胃粘膜上皮前体样细胞阳性表达至少一种分子包括LGR5和CD44，至少一种角蛋白包括CK19，至少一种CD分子包括CD24。
优选的，所述胃粘膜上皮前体样细胞不表达HLA-DRPQ。
本发明又提供了一种胃粘膜上皮前体样细胞，所述胃粘膜上皮前体样细胞通过所述胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法制备得到。
本发明的胃粘膜上皮前体样细胞的有益效果在于：所述胃粘膜上皮前体样细胞制备方法简单，得到的胃粘膜上皮前体样细胞能够降低胃溃疡对人体的影响。
本发明又提供了一种胃粘膜上皮前体样细胞的应用，所述胃粘膜上皮前体样细胞用于制备治疗消化性溃疡的胃粘膜上皮前体样细胞制剂，使用所述胃粘膜上皮前体样细胞制剂干预体内动物模型后考察对消化性溃疡的影响。
本发明的胃粘膜上皮前体样细胞的应用的有益效果在于：能够治疗消化性溃疡，异体移植后不会产生免疫排斥。
优选的，所述动物模型包括药物诱导的胃溃疡模型。
附图说明
图1为本发明实施例的第四代胃粘膜上皮前体样细胞形态的照片示意图；
图2为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物CD24的情况示意图；
图3为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物LGR5的情况示意图；
图4为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物CD44的情况示意图；
图5为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物CK19的情况示意图；
图6为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物HLA-DRPQ的情况示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
对于细胞体外培养技术，近年来很多研究人员进行了大量的研究，例如，在2007年，Yang等首次通过一种新的体外细胞培养方法从健康的人胃组织里培养出胃上皮细胞克隆，这些细胞克隆具有近似胃干细胞的特性，包括快速增殖、多向分化、八聚体结合转录因子4(octamer transcription factor 4，Oct-4)阳性表达等；随后，Barker等将Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠胃腺体内分离出的单个Lgr5+ve细胞培养在含有EGF、Noggin、R-sponding的三维基质胶(matrigel)培养体系中，发现在该培养体系下Lgr5+ve细胞能够形成类似于胃的微型结构，即胃类器官(gastric organoid)，该液体环境模拟体内干细胞所处的微环境，R-spondin(Wnt信号通路激活剂)和EGF是维持Lgr5+胃干细胞体外增殖的重要因素，Noggin可促使类器官中胃小凹数目增多，富含层黏连蛋白的基质胶提供支持胃类器官生长的环境。这一胃类器官模型在体外可以进行长期增殖并保持稳定的遗传特性和生物学行为，同时因其包含了能够产生多种细胞亚型的祖细胞群，其在体外培养诱导条件下能够分化形成具有不同功能的胃上皮细胞。2017年，Garcia等使用富含EGF、HGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等的培养基对成人胃黏膜层细胞进行原代分离培养，观察到在呈单层生长的胃成纤维细胞表面可见球状克隆形成，对成球状生长的细胞团进一步鉴定发现这些细胞可表达胚胎干细胞和胃干细胞特有的分子标志物，并能在体外培养条件下自发分化形成胃上皮祖细胞。上述体外胃干细胞模型的成功建立，尤其是胃类器官模型的建立，为进一步深入探究胃干细胞在生理和病理条件下的作用机制奠定了基础。现阶段，人们对人胃干细胞的研究还很有限。
胃中的每个胃单位都有一小部分能够实现终生上皮自我更新的单克隆性干细胞。尽管胃干细胞与肠道干细胞在本质上有相似之处，但人们对两者的了解却很少，胃干细胞可能参与了胃癌这一全球性健康问题的发病机制。在胃体的壁粘膜中，胃干细胞可能位于峡部，循环缓慢，产生双向迁移的后代，分化为成熟的常驻谱系，并具有不同的寿命。缺乏分子标记是胃干细胞研究的最大障碍，识别正常和疾病状态下的胃干细胞标志物，以及可靠的体外培养和扩增胃干细胞的方法，是这一领域研究的重点。在胃窦较简单的粘膜中，胃窦干细胞更靠近腺体底部，产生的子代类型较少，似乎具有胃窦细胞和肠道干细胞之间的杂交特征。胃窦干细胞中至少有一个亚群(如果不是全部群体)携带表面标志物LGR5，并且在成年小鼠中快速复制(可能每天复制)，在成年小鼠中，LGR5可以长期促进所有成熟上皮谱系。在胃干细胞的培养扩增和分化过程中，应该进一步确定它们的生长需求和信号通路，以及这些细胞是否经历持续复制或谱系分化的决定因素。由于整个胃的干细胞持续地对外部信号和局部组织损伤做出反应，因此它们必须占据一个复杂的生态位，以传递稳态信号以及有关感染和炎症的信息。一些内在的和来自微环境的信号结合起来，可能会将具有增殖潜能的胃干细胞转化为具有异常、化生分化模式的细胞，从而导致异常增生和癌。由于我们对干细胞微环境的了解有限，在基础消化病学研究中，很少有领域引起了如此大的兴趣或挑战。开发出分离和培养表达已被验证的分子标记的干细胞的方法是很重要的。感染和组织损伤可诱导胃上皮化生和癌症，这一进展将推进对干细胞特性以及对感染和组织损伤的反应的理解。
本发明为了解决胃粘膜上皮前体样细胞在体外无法连续传代且不能表达胃粘膜上皮前体样细胞标志物的问题，提供了一种胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：
S0：提供胃粘膜上皮原代细胞；
S1：将所述胃粘膜上皮原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％，使用胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到胃粘膜上皮前体样细胞，其中，所述重编程培养基包括基础培养基、胃泌素和生长因子。
具体的，通过将所述胃粘膜上皮原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％，使用胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到胃粘膜上皮前体样细胞，其中，所述重编程培养基包括基础培养基、胃泌素和生长因子，以维持胃黏膜上皮前体样细胞在体外培养中不断实现自我更新和增殖，从而本申请解决了胃粘膜上皮前体样细胞在体外无法连续传代且不能表达胃粘膜上皮前体样细胞标志物的问题。
本发明的一些实施例，所述胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法还包括：S2：将所述胃粘膜上皮前体样细胞放入所述重编程培养基中进行扩增培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％后，使用所述胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到传代的胃粘膜上皮前体样细胞。可以在重编程培养基中持续扩增胃粘膜上皮前体样细胞且得到的胃粘膜上皮前体样细胞能表达胃粘膜上皮前体样细胞标志物。
本发明的一些实施例，所述重编程培养基还包括ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGF-β信号抑制剂、营养补充剂和缓冲液。
本发明的一些实施例，所述ROCK激酶抑制剂Y-27632来源于陶术生物，所述Wnt信号通路激动剂CHIR99021来源于陶术生物，所述TGF-β信号抑制剂A8301来源于陶术生物，所述营养补充剂包括N2营养补充剂和B27营养补充剂，所述N2营养补充剂来源于翌圣生物，所述B27营养补充剂来源于翌圣生物。
本发明的一些实施例，以占所述基础培养基的体积计，所述胃泌素的含量为0.1-5nmol/L，所述生长因子的含量为190-340ng/ml。一些具体实施例，以占所述基础培养基的体积计，所述胃泌素的含量为0.5nmol/L、1nmol/L、2nmol/L、3nmol/L和4nmol/L中的任意一种，所述生长因子的含量为200ng/ml、230ng/ml、250ng/ml、270ng/ml、300ng/ml和320ng/ml中的任意一种。
本发明的一些实施例，以占所述基础培养基的体积计，所述ROCK激酶抑制剂的含量为5-15μM，所述Wnt信号通路激动剂的含量为1-10μM，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-5μM，所述营养补充剂的含量为2-10％。一些具体实施例，以占所述基础培养基的体积计，所述ROCK激酶抑制剂的含量为6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM和14μM中的任意一种，所述Wnt信号通路激动剂的含量为2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM和9μM，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM和4μM，所述营养补充剂的含量为3％、4％、5％、6％、7％、8％和9％中的任意一种。
本发明的一些实施例，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子10、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子。
本发明的一些具体实施例，所述成纤维细胞生长因子10(英文名称为FibroblastGrowth Factors 10，英文简称为FGF10)来源于上海信裕生物，所述表皮生长因子(英文名称为Epidermal growth factor，英文简称为EGF)来源于近岸生物，所述碱性成纤维生长因子(英文名称为basic fibrobast growth factor，英文简称为bFGF)来源于近岸生物；所述胃泌素(英文名称为gastrin)来源于北京博尔迈生物。
本发明的一些实施例，以占所述基础培养基的体积计，所述成纤维细胞生长因子10的含量为150-250ng/ml，所述表皮生长因子的含量为10-30ng/mL，所述碱性成纤维生长因子的含量为30-60ng/mL。一些具体实施例，以占所述基础培养基的体积计，所述成纤维细胞生长因子10的含量为160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml、200ng/ml、210ng/ml、220ng/ml、230ng/ml和240ng/ml中的任意一种，所述表皮生长因子的含量为15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL中的任意一种，所述碱性成纤维生长因子的含量为35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL和55ng/mL中的任意一种。
本发明的一些实施例，所述胃粘膜上皮前体样细胞阳性表达至少一种分子包括LGR5和CD44，至少一种角蛋白包括CK19，至少一种CD分子包括CD24。
本发明的一些实施例，所述胃粘膜上皮前体样细胞不表达HLA-DRPQ。一些具体实施例，所述HLA-DRPQ为HLA-DR/DP/DQ。
本发明又提供了一种胃粘膜上皮前体样细胞，所述胃粘膜上皮前体样细胞通过所述胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法制备得到。具体的，所述胃粘膜上皮前体样细胞制备方法简单，得到的胃粘膜上皮前体样细胞能够降低胃溃疡对人体的影响。
本发明又提供了一种胃粘膜上皮前体样细胞的应用，所述胃粘膜上皮前体样细胞用于制备治疗消化性溃疡的胃粘膜上皮前体样细胞制剂，使用所述胃粘膜上皮前体样细胞制剂干预体内动物模型后考察对消化性溃疡的影响。能够治疗消化性溃疡，异体移植后不会产生免疫排斥。
本发明的一些实施例，所述动物模型包括药物诱导的胃溃疡模型。
实施例
一、起始组织性质以及来源合法性声明：
以胃粘膜上皮组织作为起始原料获取阳性表达CD24、LGR5、CD44和CK19的人胃黏膜上皮前体样细胞。
具体的，所述胃粘膜上皮组织经病理检查显示为正常胃粘膜上皮组织。
具体的，所述正常胃粘膜上皮组织为来源于年龄不超过70岁的患者的手术样本，患者经医学检查无传染性病毒感染，患者在术前6个月内未使用过类固醇激素药物。患者在术前对手术样本的获取目的充分知情，并签署了知情同意书。
二、胃粘膜上皮原代细胞的获取
首先，使用无菌PBS缓冲液对胃粘膜上皮组织进行清洗和灭菌处理后，使用3毫升细胞消化液在37摄氏度下对胃粘膜上皮组织进行消化处理90分钟，从而获取原代细胞悬液，其中，3毫升细胞消化液由Ⅰ型胶原酶、无菌PBS缓冲液和胰酶消化液组成，无菌PBS缓冲液和胰酶消化液的体积相同，Ⅰ型胶原酶占细胞消化液的体积百分比为1％；
然后，使用70微米的无菌筛网对原代细胞悬液在无菌PBS缓冲液的辅助下进行筛网分选，去除粘液和未消化的胃粘膜上皮组织并收集滤液，以完成筛网分选；
然后，将滤液进行离心处理后并去除上清以得到沉淀物，向沉淀物中加入红细胞溶解平衡液(来源于上海士锋生物科技有限公司)进行重悬以后，再次进行离心处理并重复上述过程，直至再次离心处理后在沉淀物中观察不到红细胞为止，以完成对红细胞的裂解去除，最终得到胃粘膜上皮原代细胞，其中，每次离心处理的离心速度为1000g，每次离心处理的离心时间为3分钟。
三、胃粘膜上皮前体样细胞的获取
重编程培养基组分包括：以占基础培养基DMEM/F12(来源于武汉普诺赛生命科技有限公司)的体积计，含量为20纳克/毫升的上皮细胞生长因子EGF，含量为50纳克/毫升的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，含量为1％的营养补充剂N2(1X)，含量为1％的B27营养补充剂(1X)，含量为10μM的ROCK激酶抑制剂Y-27632，含量为3μM的Wnt信号通路激动剂CHIR99021，含量为1μM的TGF-β信号抑制剂A8301，含量为1纳摩尔/升的胃泌素和含量为200纳克/毫升的成纤维细胞生长因子10(英文简称为FGF10)，含量为5％的胎牛血清(胎牛血清的英文简称为：FBS，来源于北京百奥莱博科技有限公司)。
将胃粘膜上皮原代细胞以10000个/平方厘米的接种面积置于6孔板中，每孔加2毫升重编程培养基进行退分化培养，直至胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％后，使用胰酶消化液对胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，消化处理的时间为5分钟，将胃粘膜上皮前体样细胞再继续使用重编程培养基进行扩增培养，扩增培养又可称为传代培养，胃粘膜上皮前体样细胞可持续传代，使用重编程培养基对胃粘膜上皮前体样细胞进行传代培养以得到第四代胃粘膜上皮前体样细胞。
图1为本发明实施例的第四代胃粘膜上皮前体样细胞形态的照片示意图。
参照图1，表明使用重编程培养基培养的胃粘膜上皮前体样细胞即使培养到第四代，也具备多角形的细胞形态，说明其仍保持前体状态。
四、对胃粘膜上皮前体样细胞进行流式检测
图2为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物CD24的情况示意图；图3为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物LGR5的情况示意图；图4为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物CD44的情况示意图；图5为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物CK19的情况示意图；图6为本发明实施例的胃粘膜上皮前体样细胞的基因表达标志物HLA-DRPQ的情况示意图。
将第四代胃粘膜上皮前体样细胞与重编程培养基分离后，用无菌PBS缓冲液润洗第四代胃粘膜上皮前体样细胞，然后用胰酶消化液对第四代胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理后再进行离心处理，离心处理结束后收集细胞沉淀物，其中，离心处理的转速为300g，离心处理的时间为5分钟；向细胞沉淀物中加入100微升染色缓冲液重悬细胞至流式管中，再分别加入5微升待测流式抗体孵育20分钟后，每个流式管中用400微升染色缓冲液重悬后以得到细胞悬浮液，对细胞悬浮液进行流式检测，流式检测具体步骤包括：
使用流式细胞术对P4胃黏膜上皮前体细胞进行鉴别分析；
对P4的胃黏膜上皮前体细胞进行表面标志物染色：
将10厘米皿(来源于Corning，型号为430167)培养的P4胃黏膜上皮前体细胞吸弃小分子重编程培养基，使用5毫升无菌PBS缓冲液润洗，然后用往培养皿中滴加2毫升胰酶消化液进行消化处理得到细胞混合物，将细胞混合物置于15毫升离心管中，将离心管放入离心机中，离心机在转速为200g的条件下离心处理5分钟，弃去离心处理后的细胞混合物的上层清液，得到细胞沉淀物；
向细胞沉淀物中加入400微升的染色缓冲液(来源于BD Biosciences，型号为554656)对细胞沉淀物进行重悬，将重悬后的细胞沉淀物转移到3个1.5毫升离心管，100微升/管分别往上述3个1.5毫升离心管中加入5微升的待测流式抗体，吹打混匀，将1.5毫升离心管置于2-8摄氏度的冰箱中静置30分钟后，800微升/管加入PBS离心，离心速度为300g，离心时间为5分钟，离心结束，离心结束，弃上清，每管加入400微升染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬，然后转移至流式管中，将重悬后的细胞混合物进行表面标志物的流式检测。抗体名称货号分别是：CD24(abcam，ab290730)；CD44(abcam,ab254530)；HLA-DRPQ(abcam，ab7856)，
对P4代的胃黏膜上皮前体细胞进行胞内标志物染色：
将10厘米培养皿(来源于Corning，货号为430167)培养的P4胃黏膜上皮前体细胞吸弃小分子重编程培养基，使用5毫升无菌PBS缓冲液润洗，然后用往培养皿中滴加2毫升胰酶消化液进行消化处理得到细胞混合物，将细胞混合物置于15ml离心管中，将离心管放入离心机中，离心机在转速200g的条件下离心处理5分钟，弃去离心处理后的细胞混合物的上层清液，得到细胞沉淀物；
向细胞沉淀加入1毫升固定穿膜液(来源于BD Biosciences，货号为554714)，放入于2-8摄氏度的冰箱中静置50分钟，加入2毫升PBS离心，离心速度为300g，离心时间为5分钟，离心结束，加入300微升染色缓冲液重悬细胞沉淀。将重悬后的细胞沉淀物转移到2个1.5毫升离心管，100微升/管，分别往上述2个1.5毫升离心管中加入5微升的待测流式抗体，吹打混匀，放入37摄氏度的培养箱中静置30分钟。孵育完毕，800微升/管加入PBS离心，离心参数300g、5min。离心结束，弃上清，每管加入400微升染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬，然后转移至流式管中，将重悬后的细胞混合物进行胞内标志物的流式检测。抗体名称及货号：LGR5(来源于abcam，货号为ab75850)；CK19(来源于abcam，货号为ab205445)；
参照图2、图3、图4和图5，标志物CD24的阳性峰的阳性率为96.3％，标志物LGR5的阳性峰的阳性率为96.7％，标志物CD44的阳性峰的阳性率为99.9％，标志物CK19的阳性峰的阳性率为93.2％，阳性峰的阳性率大于70％说明胃粘膜上皮前体样细胞阳性表达该标志物，因此，本发明的胃粘膜上皮前体样细胞阳性表达CD24、LGR5、CD44和CK19，P4代胃黏膜上皮前体细胞表现出胃黏膜上皮前体细胞特性；参照图6，标志物HLA-DRPQ的阳性峰的阳性率为0.31％，阳性峰的阳性率大于70％说明胃粘膜上皮前体样细胞阳性表达该标志物，因此，本发明的胃粘膜上皮前体样细胞阴性表达HLA-DRPQ，说明本发明的胃粘膜上皮前体样细胞不表达MHC-Ⅱ类抗原，患者移植该细胞后机体无法通过免疫系统的MHC-II类抗原识别该种细胞，患者机体的免疫系统不会对其产生免疫攻击，因此患者机体产生排异反应的可能性小。
五、胃粘膜上皮前体样细胞制剂的制备
将胃黏膜上皮前体样细胞接种在海藻酸钠凝胶上以制得胃粘膜上皮前体样细胞制剂，胃粘膜上皮前体样细胞制剂用于修复溃疡的胃黏膜组织，胃粘膜上皮前体样细胞制剂为胃粘膜上皮前体样细胞贴片，其中，每平方厘米的胃粘膜上皮前体样细胞贴片含有1×106个胃粘膜上皮前体样细胞。
六、胃粘膜上皮前体样细胞制剂在动物模型中的应用，并进行效果论证
应用前体细胞或者干细胞尤其是来源于成年胃粘膜上皮的前体细胞以修复受损胃组织，是治疗胃病颇具潜力的新型疗法。
胃粘膜屏障是一个复杂的系统，涉及物理、化学和生物防御机制，保护胃免受刺激性食物、盐酸和胃蛋白酶活性的影响。几个条件，如胃炎、胃黏膜糜烂和溃疡，可破坏胃粘膜屏障导致其损坏。胃粘膜损伤是兽医学中常见的疾病。由于许多经常使用的药物，如非甾体抗炎药或糖皮质激素。有几种疾病可以破坏粘膜的防御机制包括幽门螺杆菌感染、肝脏或肾脏疾病，肾上腺皮质功能减退症、休克、脊髓疾病、自身免疫性疾病，原发性胃肠道疾病和肿瘤。因此，胃或十二指肠溃疡通常是由于胃粘膜或十二指肠上皮屏障功能缺陷引起的。胃溃疡被描述为胃粘膜上的一个巨大的“月亮坑”缺陷。内窥镜研究显示，48.5％的犬在胃或十二指肠近端有溃疡。胃癌与其他家畜相比，在胃癌中也很常见，因为肿瘤切除会导致胃深部伤口，需要进行组织重建。大多数胃恶性肿瘤是癌，占50-90％。其次是肉瘤和恶性淋巴瘤。一些研究试图移植胃粘膜缺损。
胃黏膜缺损可由多种因素引起，包括使用非甾体抗炎药、幽门螺杆菌感染、胃肠道和脊髓疾病以及肿瘤等，给患者带来极大的痛苦。
动物模型是比格犬胃溃疡模型，适应症是胃溃疡；
雄性比格犬胃溃疡模型的建立：手术诱导雄性比格犬胃粘膜缺损，具体方法如下：雄性比格犬禁食不禁水24小时，麻醉禁食不禁水24小时的雄性比格犬以后，在无菌条件下打开比格犬的腹腔，暴露胃部，将内径为5毫米、长为30毫米的玻璃管的管腔内注入冰醋酸0.2毫升，垂直置于雄性比格犬的胃部靠近胃窦部浆膜面1.5分钟，可见胃部的局部组织颜色变白，拭去浆膜面的冰醋酸，缝合切口，术后3～5天形成溃疡，以得到雄性比格犬胃溃疡模型。
将六只雄性比格犬胃溃疡模型随机分为对照组(三只)和实验组(三只)，对照组的三只雄性比格犬胃溃疡模型使用西咪替丁治疗。
每条雄性比格犬都用盐酸氯胺酮用以诱导麻醉和维持麻醉。
对照组中的三只雄性比格犬在腹中线进行腹腔镜手术，然后对病变部位的表面贴一个3厘米×2厘米的圆形贴片，采用薇乔3/0将圆形贴片与病变部位的上皮侧单纯连续缝合，然后给三只雄性比格犬喂服传统的药物。
实验组中的三只雄性比格犬在腹中线进行腹腔镜手术，然后对病变部位的表面贴一个3厘米×2厘米的圆形贴片，采用薇乔3/0将圆形贴片与病变部位的上皮侧单纯连续缝合，然后对病变部位的表面贴一个4厘米×5厘米的胃粘膜上皮前体样细胞贴片用以修复病变部位，胃粘膜上皮前体样细胞贴片采用薇乔3/0将圆形贴片与病变部位的上皮侧单纯连续缝合。
对实验组和对照组中的雄性比格犬进行临床、内镜、生化(血清蛋白和脂质，胃蛋白酶活性)、病理组织学和免疫组织化学评价。
术后通过内镜和血生化方法检测胃黏膜上皮前体细胞贴片对于胃黏膜修复的作用。
胃黏膜上皮能够不断的再生和修复以应对内环境、病原体和外源物质的侵害，胃前体细胞在其中发挥了关键作用。这种在胃黏膜上皮中存在的特异性前体细胞即成体干细胞，它们始终保持自我更新能力，在衰老或损伤的细胞脱落后，能分裂、分化产生新的胃黏膜上皮细胞进行补充，从而维持上皮细胞的稳态，促进在胃黏膜上皮的的再生和修复，甚至癌症的发展。
胃前体细胞在胃黏膜上皮的动态更新和损伤后修复中发挥关键作用。随着谱系追踪和分子标记等技术的发展，人们对于胃前体细胞的生理特性的认识取得突破性进展，也确定了Lgr5、SOX2等分子标志物，并建立了体外研究模型。由于胃前体细胞增殖、分化的动态平衡是维持干细胞池稳态的关键，持续的炎症反应可诱发前体细胞增殖加速而致胃干细胞池失稳态，进而参与胃黏膜病变的发生。H.pylori感染诱发胃前体细胞静息-增殖分化失衡及细胞表型转化可能是其致胃癌的机制之一。同时，胃前体细胞也可能作为胃肿瘤的起源细胞而参与了胃癌发生、发展的多个步骤。深入探究胃前体细胞在胃黏膜损伤修复中的作用机制及其在胃黏膜发生肠化生和异型增生中的作用至关重要，尤其是如何将胃前体细胞与H.pylori的致病机制、胃癌发生的分子机制及起源之间联系起来可能成为今后研究热点。随着前体细胞研究技术及理论的发展和深入，胃前体样细胞的研究在胃部疾病防治方面具有广阔前景。
可以预期，通过移植胃黏膜上皮前体样细胞进入受损的胃黏膜中，除了胃黏膜上皮前体样细胞本身可能向胃黏膜上皮细胞分化外，其分泌的细胞因子亦可与胃黏膜上皮前体样细胞协同作用，在促使胃黏膜上皮前体样细胞向胃黏膜上皮细胞分化的同时，刺激血管内皮细胞的迁移、增殖，形成新生血管，增加黏膜血供，并抑制炎症反应和减少纤维组织增生，促进溃疡愈合，从而达到创面修复和黏膜下组织重建的目的。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。
Claims (12)
1.一种胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S0：提供胃粘膜上皮原代细胞；
S1：将所述胃粘膜上皮原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％，使用胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到胃粘膜上皮前体样细胞，其中，所述重编程培养基包括基础培养基、胃泌素和生长因子。
2.根据权利要求1所述的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，还包括：
S2：将所述胃粘膜上皮前体样细胞放入所述重编程培养基中进行扩增培养，直至所述胃粘膜上皮前体样细胞的融合度不低于80％后，使用所述胰酶消化液对所述胃粘膜上皮前体样细胞进行消化处理，以得到传代的胃粘膜上皮前体样细胞。
3.根据权利要求2所述的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述重编程培养基还包括ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGF-β信号抑制剂、营养补充剂和缓冲液。
4.根据权利要求3所述的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，以占所述基础培养基的体积计，所述胃泌素的含量为0.1-5nmol/L，所述生长因子的含量为190-340ng/ml。
5.根据权利要求4所述的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，以占所述基础培养基的体积计，所述ROCK激酶抑制剂的含量为5-15μM，所述Wnt信号通路激动剂的含量为1-10μM，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-5μM，所述营养补充剂的含量为2-10％。
6.根据权利要求1所述的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子10、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子。
7.根据权利要求6所述胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，以占所述基础培养基的体积计，所述成纤维细胞生长因子10的含量为150-250ng/ml，所述表皮生长因子的含量为10-30ng/mL，所述碱性成纤维生长因子的含量为30-60ng/mL。
8.根据权利要求1所述胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述胃粘膜上皮前体样细胞阳性表达至少一种分子包括LGR5和CD44，至少一种角蛋白包括CK19，至少一种CD分子包括CD24。
9.根据权利要求1所述胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述胃粘膜上皮前体样细胞不表达HLA-DRPQ。
10.一种胃粘膜上皮前体样细胞，其特征在于，通过权利要求1-9任一项所述的胃粘膜上皮前体样细胞的制备方法制备得到。
11.一种如权利要求10所述的胃粘膜上皮前体样细胞的应用，其特征在于，所述胃粘膜上皮前体样细胞用于制备治疗消化性溃疡的胃粘膜上皮前体样细胞制剂，使用所述胃粘膜上皮前体样细胞制剂干预体内动物模型后考察对消化性溃疡的影响。
12.根据权利要求11所述的胃粘膜上皮前体样细胞的应用，其特征在于，所述动物模型包括药物诱导的胃溃疡模型。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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