CN117064916A - 子宫内膜修复制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

子宫内膜修复制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种子宫内膜修复制剂及其制备方法和应用。所述子宫内膜修复制剂包含子宫内膜来源细胞的条件培养液，所述子宫内膜来源细胞具有前体细胞特征，并阳性表达阶段特异性胚胎抗原，有助于构建对子宫内膜损伤修复具有积极效果的体外共培养体系，对研究子宫内膜的病理生理修复和治疗宫腔粘连(intrauterineadhesion,IUA)意义重大。

Description

子宫内膜修复制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及子宫内膜修复制剂及其制备方法和应用。
背景技术
人子宫组织存在子宫内膜上皮干细胞(endometrial epithelial stem cells,eESCs)和子宫内膜间充质干细胞(endometrial mesenchymal stem cells,eMSCs)。组织器官的损伤修复，成体干细胞的增殖分化起到非常关键的作用，子宫内膜的损伤修复同样需要上皮-间质两种干细胞的参与，因此体外构建子宫内膜上皮干细胞和间质干细胞培养体系对研究子宫内膜的病理生理修复和治疗宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)意义重大。
子宫内膜间充质干细胞eMSCs已经被证明具有多谱系分化的能力，而子宫内膜上皮干细胞eESCs由于很难用传统的二维培养方法进行长时间的体外培养，因此其功能检测在体外研究中受到了限制。
可见，成功实现eESCs的体外培养具有重要意义，不仅有助于进一步了解子宫内膜上皮细胞的起源和修复机制，更重要的是有助于拓展子宫内膜干细胞的细胞来源。
发明内容
本发明的目的在于提供促一种子宫内膜修复制剂及其制备方法和应用，在成功实现对子宫内膜上皮前体样细胞体外培养以及进一步获取所述子宫内膜上皮前体样细胞的条件培养液基础上构建了对子宫内膜损伤修复具有积极效果的体外共培养体系，对研究子宫内膜的病理生理修复和治疗宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)意义重大。
为实现上述目的，本发明的所述子宫内膜修复制剂包含子宫内膜来源细胞的条件培养液，所述子宫内膜来源细胞具有前体细胞特征，并阳性表达阶段特异性胚胎抗原。其有益效果在于：来源于具有前体细胞特征，并阳性表达阶段特异性胚胎抗原的子宫内膜来源细胞的条件培养液有助于构建对子宫内膜损伤修复具有积极效果的体外共培养体系，对研究子宫内膜的病理生理修复和治疗宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)意义重大。
优选的，所述阶段特异性胚胎抗原为SSEA-1。
优选的，所述子宫内膜来源细胞为子宫内膜上皮前体细胞或子宫内膜上皮前体样细胞。
本发明所述子宫内膜修复制剂的制备方法包括：提供所述子宫内膜来源细胞，使用条件培养基对所述子宫内膜来源细胞进行条件培养，所述条件培养结束后，从得到的培养产物中获取所述子宫内膜来源细胞的条件培养上清。
优选的，所述条件培养基包括基础培养基和血清类物质。
优选的，以占所述基础培养基的体积计，所述血清类物质的含量不超过20％。
优选的，所述基础培养基为Hep-X基础培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基、MEM培养基、William’s Medium E培养基、Ham’s F-10培养基、Ham’sF-12培养基、IMDM培养基、McCoy’5A培养基、RPMI-1640培养基、BME培养基、M-199Medium培养基、Leibovitz Medium培养基、CMRL1066培养基、Neurobasal培养基和Fischers的任意一种。
优选的，所述子宫内膜来源细胞由内膜前体细胞培养基对阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞进行体外培养得到。
优选的，所述上皮细胞相关标志物为EpCAM、E-Cadherin、CD9、CK19、CD24和CD44的任意一种。
优选的，所述内膜前体细胞培养基包括所述基础培养基、生长因子、TGF-β信号通路抑制剂、Wnt信号通路激动剂、ROCK激酶抑制剂和血清类物质。
进一步优选的，所述内膜前体细胞培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸和抗坏血酸的至少一种。
优选的，以占所述基础培养基的体积计，所述丙酮酸钠的含量为5-20微克/毫升，所述生长因子的含量为5-50纳克/毫升，所述Rock激酶抑制剂含量为0.5-50微摩尔/升，所述WNT信号通路激动剂的含量为0.5-50微摩尔/升，所述TGF-β信号通路抑制剂的含量为0.5-50微摩尔/升，所述血清类物质的含量不超过20％。
本发明所述子宫内膜修复制剂在制备子宫内膜损伤修复药物方面的应用包括将所述子宫内膜修复制剂与子宫内膜间质细胞或血管内皮细胞共培养。
附图说明
图1为本发明实施例1中对离心管待测细胞悬液验证磁珠分选效率的流式分析结果；
图2为本发明实施例1中对分选管待测细胞悬液验证磁珠分选效率的流式分析结果；
图3为本发明实施例2的EpCAM+细胞、P0细胞、P1细胞和P2细胞经表面抗体流式检测后得到的EpCAM和SSEA-1的表达情况对比图；
图4为本发明实施例2的使用ECM进行扩增培养第4天的EpCAM+细胞光镜图；
图5为本发明实施例2的使用TEM-1培养基培养第2天的EpCAM+细胞光镜图；
图6和图7分别为本发明实施例3的1-P3-SSEA-1+细胞和2-P3-SSEA-1+细胞的OD值变化趋势图；
图8为本发明实施例3的1-P3-SSEA-1+细胞形成的克隆团块光镜照片；
图9为本发明实施例4对1-P3-SSEA-1+细胞进行流式细胞检测得到的EpCAM、SUSD2、CD34、CD45、CD90和CD105表达情况对比图；
图10为本发明实施例4对1-P3-SSEA-1+细胞进行高通量转录组测序得到的前30位差异基因的GO生物学进程聚类分析图；
图11是本发明实施例5使用SSEA-1+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6和12小时用光镜观察到的小管形成情况对比照片；
图12是本发明实施例5使用SUSD2+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6和12小时用光镜观察到的小管形成情况对比照片；
图13是本发明实施例5的SSEA-1+细胞和SUSD2+细胞的VEGFA,TNF,IL-1A和IL-1B的表达水平对比图；
图14是本发明实施例5的使用SSEA-1+-CM作用于SUSD2+细胞以启动划痕实验后的第0，6小时和12小时用光镜观察到的划痕愈合情况对比照片；
图15是本发明实施例5的SUSD2+-CM作用于SUSD2+细胞以启动划痕实验后的第0，6小时和12小时用光镜观察到的划痕愈合情况对比照片；
图16是本发明实施例5的SSEA-1+细胞和SUSD2+细胞的ITGB2,ITGB4,ITGB7和NOTCH1的表达水平对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
人子宫组织存在子宫内膜上皮干细胞(endometrial epithelial stem cells,eESCs)和子宫内膜间充质干细胞(endometrial mesenchymal stem cells,eMSCs)。组织器官的损伤修复，成体干细胞的增殖分化起到非常关键的作用，子宫内膜的损伤修复同样需要上皮-间质两种干细胞的参与，因此体外构建子宫内膜上皮干细胞和间质干细胞培养体系对研究子宫内膜的病理生理修复和治疗宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)意义重大。
研究发现，eMSCs具有克隆形成能力和多系分化能力，可以应用不同的诱导培养基进行体外诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞等。然而，由于子宫内膜上皮前体细胞的获取和体外培养困难，迄今为止相关研究甚少。
因此，在体外稳定培养人子宫内膜上皮干细胞，为研究子宫内膜病理生理修复提供细胞模型，对IUA的再生医学治疗和探索具有重要的科学意义。
本发明实施例以人子宫内膜细胞为种子细胞进行体外培养，得到的子宫内膜上皮前体样细胞符合人子宫内膜上皮干细胞特征并实现了体外的稳定培养。
本发明实施例的子宫内膜上皮前体样细胞表达阶段特异性胚胎抗原(Stage-Specific EmbryonicAntigen)，且所述阶段特异性胚胎抗原的表达率不低于80％。
一些具体的实施例中，所述阶段特异性胚胎抗原具体为SSEA-1。
本发明实施例的子宫内膜上皮前体样细胞的制备方法包括：
S1：获取阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞；
S2：使用内膜前体细胞培养基对所述阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞进行体外培养。
本发明一些实施例的所述步骤S1中，所述上皮细胞相关标志物为上皮细胞标志物和上皮前体细胞标志物的任意一种，且表达率不低于70％。
一些具体实施例的所述步骤S1中，所述上皮细胞标志物为EpCAM、E-Cadherin、CD9和CK19的任意一种。
一些具体实施例的所述步骤S1中，所述上皮前体细胞标志物为CD24和CD44的任意一种。
一些具体的实施例中，所述阶段特异性胚胎抗原为SSEA-1。
本发明一些实施例的所述步骤S1中，获取阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞的步骤包括：对包含人子宫内膜细胞的原代细胞悬液进行筛网分选、红细胞裂解去除和细胞分选后得到所述阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞。
一些具体的实施例中，所述细胞分选为免疫磁珠分选。
一些具体的实施例中，所述细胞分选为流式分选。
本发明一些实施例的所述步骤S2中，使用内膜前体细胞培养基对所述阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞进行体外培养的步骤包括：使用所述内膜前体细胞培养基以0.3×104-1×105个/平方厘米的接种密度对所述阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞培养至细胞融合度不低于80％后进行消化，然后继续使用所述内膜前体细胞培养基进行传代培养。
一些实施例中，所述传代培养的传代比例不低于1：3。
进一步的，所述体外培养进行的过程中，每24-48小时进行置换一次所述内膜前体细胞培养基。
本发明实施例中，经所述步骤S2得到的子宫内膜上皮前体样细胞阳性表达阶段特异性胚胎抗原且表达率不低于80％。
一些实施例中，所述步骤S2结束后，使用所述内膜前体细胞培养基对所述阳性表达阶段特异性胚胎抗原的子宫内膜上皮前体样细胞继续进行扩增培养。
本发明一些实施例的所述步骤S2中，所述内膜前体细胞培养基包括基础培养基、生长因子、TGF-β信号通路抑制剂、Wnt信号通路激动剂、ROCK激酶抑制剂和血清类物质。
具体的，由生长因子、Rock信号通路抑制剂、WNT信号通路激动剂和TGF-β信号通路抑制剂组成的重编程物质通过重编程的方式高效诱导子宫内膜细胞转化为阳性表达阶段特异性胚胎抗原的子宫内膜上皮前体样细胞，从而成功实现了子宫内膜上皮前体样细胞的体外培养。
一些实施例中，以占所述基础培养基的体积计，所述生长因子的含量为5-50纳克/毫升，所述Rock激酶抑制剂的含量为0.5-50微摩尔/升，所述WNT信号通路激动剂的含量为0.5-50微摩尔/升，所述TGF-β信号通路抑制剂的含量为0.5-50微摩尔/升，所述血清类物质的含量不超过20％。
一些实施例中，所述内膜前体细胞培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸和抗坏血酸的至少一种。
一些实施例中，所述基础培养基为MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640、CMRL1066、WilliamE、Neurobasal或Fischers培养基的任意一种。
一些实施例中，所述基础培养基为Hep-X基础培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、Ham’s F-10培养基、Ham’s F-12培养基、IMDM培养基、McCoy’5A培养基、M-199Medium培养基、Leibovitz Medium培养基、CMRL1066培养基、Neurobasal培养基和Fischers的任意一种。
一些实施例中，所述生长因子成分为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、白介素-6和抑瘤素的至少一种。
一些实施例中，所述Rock信号通路抑制剂为Y27632、Fasudil、Thiazovivin和SB-772077-B中的至少一种。
一些实施例中，所述WNT信号通路激动剂为重组WNT蛋白、重组R-spondin蛋白、BIO、CHIR99021和TWS119中的至少一种。
一些实施例中，所述TGF-β信号通路抑制剂为A8301、RepSox和SB431542中的至少一种。
本发明实施例还提供了所述子宫内膜上皮前体样细胞在子宫内膜损伤相关药物制备方面的应用。
本发明实施例还提供了子宫内膜修复制剂，包含子宫内膜来源细胞的条件培养液，所述子宫内膜来源细胞具有前体细胞特征，并阳性表达阶段特异性胚胎抗原。
一些实施例中，所述阶段特异性胚胎抗原为SSEA-1。
一些实施例中，所述子宫内膜来源细胞为子宫内膜上皮前体细胞或子宫内膜上皮前体样细胞。
本发明实施例所述子宫内膜修复制剂的制备方法包括：使用条件培养基对所述子宫内膜来源细胞进行条件培养，所述条件培养结束后，从得到的培养产物中获取所述子宫内膜来源细胞的条件培养上清，所述条件培养基包括基础培养基和血清类物质。
一些实施例中，以占所述基础培养基的体积计，所述血清类物质的含量不超过20％。
一些实施例中，所述血清类物质为动物源血清。
一些实施例中，所述动物源血清为胎牛血清。
一些实施例中，所述体外培养基和所述条件培养基中的动物源血清可以用血清替代物替换。
一些实施例中，所述血清替代物为无动物源成份的血小板及其衍生物。
一些实施例中，所述血清替代物为一磷酸鞘氨酸和吲哚乙酸。
本发明各实施例中，如无特别说明，细胞培养均在37摄氏度环境下且二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中进行。
本发明各实施例中涉及统计学分析的数据，每组实验至少重复3次，实验结果数据利用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。两组数据间比较使用双尾非配对t检验来计算统计学差异，多组数据间差异的比较使用用ANOVA方差分析计算统计学差异。p<0.05被认为具有统计学差异。
实施例1
本发明实施例1提供了阳性表达上皮细胞标志物EpCAM的原代子宫内膜细胞的制备方法。
实施例1的所述步骤S1中，以人子宫内膜组织作为起始原料获取阳性表达EpCAM的人原代子宫内膜细胞。
具体的，所述人子宫内膜组织经病理检查显示均为单纯性增生期内膜，具体为增殖晚期(月经第11-12天)内膜。
具体的，所述人子宫内膜组织为来源于年龄不超过45岁的女性患者的手术样本，患者经医学检查未发现有恶性子宫内膜、恶性肿瘤以及子宫内膜恶性病变，患者在术前三个月内未使用过类固醇激素药物。患者在术前对手术样本的获取目的充分知情，并签署了知情同意书。
首先，使用无菌PBS缓冲液对体积为1立方毫米的子宫内膜组织进行清洗和灭菌处理后，使用由Ⅰ型胶原酶、无菌PBS缓冲液和胰酶消化液组成的3毫升细胞消化液在37摄氏度下对子宫内膜组织消化60分钟，从而获取包含人子宫内膜细胞的原代细胞悬液。无菌PBS缓冲液和胰酶消化液具有相同的体积，Ⅰ型胶原酶占改良缓冲液的体积百分比为1％。
然后，使用100目的无菌筛网对所述原代细胞悬液在无菌PBS缓冲液的辅助下进行筛网分选，收集滤液并去除粘液和未消化的组织，以完成筛网分选。
然后，将得到的滤液离心并去除上清后，向得到的沉淀物加入红细胞溶解平衡液进行重悬后再次离心并重复上述过程直至再次离心后在细胞沉淀中观察不到红细胞为止，以完成红细胞裂解去除。具体的，每次离心的速率为1000g，离心时间为3分钟。
最后，向经红细胞裂解去除得到的细胞沉淀加入100微升染色缓冲液重悬后，加入10微升磁珠标记的EpCAM一抗，并在4摄氏度下进行20分钟的第一次孵育；经所述第一次孵育形成的孵育混合液与7微升磁珠标记的EpCAM二抗混合后在4摄氏度下进行15分钟的第二次孵育；经第二次孵育后形成的悬液使用EasySep磁珠分选专用磁极进行分选。具体的，将装有悬液的分选管置于EasySep磁珠分选专用磁极中，加入2.5毫升染色缓冲液后室温静置5分钟，然后将分选管中的悬液快速倾倒至离心管中，得到离心管中的离心管悬液以及残留于分选管中的分选管悬液，以完成所述免疫磁珠分选。
实施例1中，对经免疫磁珠分选得到的离心管悬液和分选管悬液分别离心后，向得到的细胞沉淀分别加入100微升的染色缓冲液和5微升的EpCAM流式抗体重悬后在4摄氏度下孵育30分钟；然后分别弃去上清后向得到的细胞沉淀中再加入600微升染色缓冲液重悬至流式管中，得到离心管待测细胞悬液和分选管待测细胞悬液。上机分析离心管待测细胞悬液和分选管待测细胞悬液中细胞的EpCAM表达率，以验证磁珠分选效率。流式细胞仪分析均采用相应Isotpye流式抗体作为对照。
图1为实施例1中对离心管待测细胞悬液验证磁珠分选效率的流式分析结果。图2为实施例1中对分选管待测细胞悬液验证磁珠分选效率的流式分析结果。
参照图1和图2，图1所示的流式分析结果表明，离心管待测细胞悬液中，细胞的EpCAM表达率不超过2％，可视为几乎不表达EpCAM；图2所示的流式分析结果表明，分选管待测细胞悬液中，细胞的EpCAM阳性表达率超过97％。
由此可见，经实施例1的筛网分选、红细胞裂解去除和免疫磁珠分选后得到的离心管悬液中的原代子宫内膜细胞阴性表达EpCAM(简记为EpCAM-细胞)；分选管悬液中的原代子宫内膜细胞阳性表达EpCAM(简记为EpCAM+细胞)，且表达率超过97％。
实施例2
实施例2使用一种内膜前体细胞培养基(简记为TEM-1培养基)对实施例1的EpCAM+细胞进行体外培养，得到了阳性表达SSEA-1的子宫内膜上皮前体样细胞(简记为1-SSEA-1+细胞)，从而成功实现了对子宫内膜上皮前体样细胞的体外稳定培养。
实施例2使用的TEM-1培养基由DMEM/F12培养基、抗坏血酸、丙酮酸钠、HGF、EGF、Y27632、CHIR99021、A8301、S1P和LPA组成。
以占TEM-1培养基的体积计：抗坏血酸的含量为10微克/毫升；丙酮酸钠的含量为1毫摩尔/升；HGF的含量为20纳克/毫升；EGF的含量为20纳克/毫升；Y27632的含量为10微摩尔/升；CHIR99021的含量为3微摩尔/升；A8301的含量为1微摩尔/升；S1P的含量为1微摩尔/升；LPA的含量为5微摩尔/升。
实施例2中，使用TEM-1培养基进行体外培养的步骤为：
将EpCAM+细胞以1×105个/平方厘米的接种面积置于12孔板中，每孔加2毫升TEM-1培养基扩增培养至细胞融合度不低于80％后，使用胰酶消化液进行1-5分钟的消化后，再继续使用TEM-1培养基进行传代培养至第三代。
为说明TEM-1培养基对EpCAM+细胞在体外培养过程中EpCAM和SSEA-1表达情况的影响，实施例2中对经磁珠分选后得到的EpCAM+细胞、EpCAM+细胞经TEM-1培养基扩增培养至汇合率不低于80％后得到的原代细胞(简记为P0细胞)，P0细胞继续在TEM-1培养下经第一次传代培养得到的第一代细胞(简记为P1细胞)，以及经第二次传代培养得到的第二代细胞(简记为P2细胞)进行表面抗体流式检测，考察不同细胞的EpCAM和SSEA-1表达情况。
具体的，吸弃TEM-1培养基后用无菌PBS缓冲液润洗，然后用胰酶消化液进行消化后离心收集沉淀物；向沉淀物加入100微升染色缓冲液重悬细胞至流式管中，再分别加入5微升待测流式抗体孵育20分钟后每管6用600微升染色缓冲液重悬后进行表面抗体流式检测。具体的表面抗体流式检测方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
图3为EpCAM+细胞、P0细胞、P1细胞和P2细胞经表面抗体流式检测后得到的EpCAM和SSEA-1的表达情况对比图。
参照图3，经磁珠分选后得到的EpCAM+细胞中，阳性表达EpCAM的细胞比例可达97％以上，且仅有8％左右的细胞阳性表达SSEA-1；经TEM-1培养基扩增培养得到的P0细胞中，阳性表达EpCAM细胞的比例下降至约50％，阳性表达SSEA-1细胞的比例上升为50％左右；传代后形成的P1细胞和P2细胞中，子宫内膜上皮细胞的特征标记物EpCAM几乎不表达，而阳性表达SSEA-1细胞的比例进一步上升，P2细胞中阳性表达SSEA-1细胞的比例升高至超过80％。由此可见，TEM-1培养系统不仅成功实现了对人子宫内膜上皮细胞的体外培养，还影响了细胞的EpCAM和SSEA-1表达情况，有利于获得SSEA-1+细胞。
为说明TEM-1培养基中的重编程物质对EpCAM+细胞向SSEA-1+细胞转化的重要性，实施例2还提供了由DMEM F/12、双抗和胎牛血清组成的常规培养基(简记为ECM)对EpCAM+细胞进行体外培养的技术方案，考察ECM对EpCAM+细胞的影响。
具体的，ECM由445毫升的DMEM F/12、5毫升的双抗和50毫升的胎牛血清组成。具体的扩增培养方法请参见前述TEM-1进行体外培养的部分。
在ECM下进行培养的第二天仅有约10-20％左右的细胞贴壁。在ECM培养进行到第4-5天，观察到大量漂浮细胞的现象，提示细胞出现了大量的凋亡现象。
图4为使用ECM进行扩增培养第4天的EpCAM+细胞光镜图。图5为使用TEM-1培养基培养第二天的EpCAM+细胞光镜图。参见图4和图5，相较于TEM-1培养基对EpCAM+细胞的扩增培养，ECM培养下细胞的生长状态明显不佳。上皮细胞集落的形态并不明显。而EpCAM+细胞在TEM培养下，细胞生长状态旺盛，可见形成典型的巢形或玫瑰花形的上皮细胞集落，细胞体积大，呈椭圆形，胞核大且核仁明显；此外，可见上皮细胞集落和集落之间有典型的间质细胞贴壁，呈梭形或纤维状，呈中间稍宽两端尖状。
由此可见，本发明实施例提供的重编程物质对EpCAM+细胞的扩增以及向SSEA-1+细胞的转化而言是至关重要的。
实施例3
实施例3使用了另一种内膜前体细胞培养基(简记为TEM-2)对实施例1的EpCAM+细胞进行体外培养，也得到了阳性表达SSEA-1的子宫内膜上皮前体样细胞(简记为2-SSEA-1+细胞)。
实施例3使用的TEM-2培养基由DMEM/F12培养基、抗坏血酸、丙酮酸钠、HGF、EGF、Thiazovivin、BIO、SB431542、S1P和LPA组成。
以占TEM-1培养基的体积计：抗坏血酸的含量为10微克/毫升；丙酮酸钠的含量为1毫摩尔/升；HGF的含量为20纳克/毫升；EGF的含量为20纳克/毫升；Thiazovivin的含量为1微摩尔/升；BIO的含量为2微摩尔/升；SB431542的含量为10微摩尔/升；S1P的含量为1微摩尔/升；LPA的含量为5微摩尔/升。
使用实施例3的TEM-2培养基进行体外培养的过程和实施例2的TEM-1培养基进行体外培养的过程相比，区别为：使用TEM-2培养基进行实施例2记载的体外培养过程，取得到的第三代细胞使用TEM-2培养基培养至汇合率不低于80％后进行流式分选，得到2-SSEA-1+细胞。
具体的，分选前的消化、离心、重悬和孵育过程请参见实施例1进行表面抗体流式检测前的具体步骤。通过MoFlo XDP流式分选系统进行流式分选，得到SSEA-1+细胞。流式分选的具体过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
对实施例2和3的1-SSEA-1+细胞和2-SSEA-1+细胞分别采用TEM-1培养基和TEM-2培养基继续进行传代培养至第三代，分别得到1-P3-SSEA-1+细胞和2-P3-SSEA-1+细胞。传代培养的步骤同实施例2。
采用细胞活力检测试剂(CCK-8)考察了两种P3-SSEA-1+细胞的增殖能力。具体的，向两种P3-SSEA-1+细胞中分别加入胰酶消化液进行消化后进行细胞计数，计数后将细胞消化后按5×103/孔接种于96孔板中，每孔添加100微升对应的TEM-1培养基培养。设置9个复孔并且按照天数分组，7天每组1块板，于固定时间点连续检测7天。检测时按每孔添加10微升CCK-8检测液并混匀，置于37℃箱子中孵育2h后与酶标仪测量其在450mm波长下的OD值并记录数值，得到图6和图7分别所示的1-P3-SSEA-1+细胞和2-P3-SSEA-1+细胞的OD值变化趋势图。参照图6和图7，两种P3-SSEA-1+细胞经TEM培养7天后仍处于指数生长期，具备强的自我更新和增殖传代能力。
考察了1-P3-SSEA-1+细胞的克隆形成能力。对1-P3-SSEA-1+细胞在1×103/孔的接种密度下在6孔板中经对应的TEM-1培养基培养14天后，吸弃培养基，使用PBS对细胞团润洗3遍后使用4％多聚甲醛室温固定、去除多聚甲醛以及PBS润洗细胞团后，加入0.1％结晶紫溶液室温染色后使用PBS冲洗残留染料，镜下观察克隆团块及拍照计数，得到图8所示的1-P3-SSEA-1+细胞形成的克隆团块光镜照片。参照图8，1-P3-SSEA-1+细胞形成细胞个头较大的，多角形或蝌蚪形的单一细胞克隆，呈玫瑰花状或巢团样分布。
定义细胞数目不低于50个的克隆团块为大克隆团块。通过计数表明，1-P3-SSEA-1+细胞能够形成134±6个大克隆团块显示出良好的克隆能力。
实施例4
实施例4考察了P3-SSEA-1+细胞的表型特征，进一步证明了SSEA-1+细胞是人子宫内膜上皮来源的成体干细胞。
对1-P3-SSEA-1+细胞和2-P3-SSEA-1+细胞均进行表面抗体的流式检测，具体检测方法请参见实施例2，结果表明，两种P3-SSEA-1+细胞均不表达人子宫内膜间充质干细胞eMSCs的特征标志物。
以1-P3-SSEA-1+细胞为例，参见图9所示的1-P3-SSEA-1+细胞的EpCAM、SUSD2、CD34、CD45、CD90和CD105表达情况对比图。SUSD2、CD34、CD45、CD90和CD105是人子宫内膜间充质干细胞eMSCs的特征标志物，1-P3-SSEA-1+细胞不表达SUSD2、EpCAM、CD34、CD45、CD90和CD105，说明SSEA-1+细胞并非间质细胞。
另外，P3-SSEA-1+细胞不表达EpCAM，进一步证明了TEM培养对EpCAM+细胞向SSEA-1+细胞转化所起到的重要作用。更重要的是，P3-SSEA-1+细胞不表达成熟体细胞标志物EpCAM，说明了P3-SSEA-1+细胞是去分化状态的细胞。
实施例4对1-P3-SSEA-1+细胞进行了高通量转录组测序，得到如图10所示的前30位差异基因的GO生物学进程聚类分析图。从图10中可以看到，SSEA-1+细胞的上皮分化相关的基因表达更多。
具体的，高通量转录组测序由上海市吉凯基因化学技术有限公司完成，制备3个生物学重复的样本，每个设置3个技术重复。
实施例5
作为本领域公知常识的是，子宫内膜修复的过程中，新生血管形成和内膜间质细胞的迁移起到了非常重要的作用。
实施例5制备了一种子宫内膜修复制剂，即1-P3-SSEA-1+细胞的条件培养液(简记为SSEA-1+-CM)并考察其对人血管内皮细胞以及人子宫内膜间质细胞的作用，证明SSEA-1+细胞具有诱导新生血管形成以及促进子宫内膜间质细胞迁移的作用，显示出对子宫内膜的再生修复的治疗潜能，能够在子宫内膜损伤相关药物制备方面得以应用。
SSEA-1+-CM的制备方法为：将1-P3-SSEA-1+细胞按6×105个/孔的接种密度接种于6孔板上，每孔使用2.5毫升TEM-1培养基培养至融合度达到80％后，更换为ECM培养基进行培养，每24h全量更换1次ECM培养基并收集上清作为SSEA-1+-CM。
本实施例还考察了子宫内膜间质细胞(简记为SUSD2+细胞，来源于上海赛立维生物科技有限公司)的条件培养液(简记为SUSD2+-CM)对人血管内皮细胞的作用以及对子宫内膜间质细胞迁移的作用。SUSD2+-CM的制备方法请参见前述SSEA-1+-CM的制备方法。
通过小管形成实验考察SSEA-1+-CM对人血管内皮细胞的作用，具体为：将人血管内皮细胞按6×105个/孔的接种密度接种于6孔板上，每孔使用2.5微升ECM-1培养基进行培养至融合度达到80％后用胰酶消化液消化，使用SSEA-1+-CM重悬消化液后接种于基质胶包被的96孔板上以启动小管实验，并在小管实验开始后的第6和12h时用光镜观察小管形成情况并进行拍照记录。
通过小管形成实验考察SUSD2+-CM对人血管内皮细胞作用的步骤请参见前述通过小管形成实验考察SSEA-1+-CM对人血管内皮细胞的作用步骤。
图11是使用SSEA-1+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6和12小时用光镜观察到的小管形成情况对比照片。参照图11，SSEA-1+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6小时就能够观察到明显的血管形成现象，第12小时的血管形成更加密集和显著，可见SSEA-1+-CM能够有效促进小管形成。
图12是使用SUSD2+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6和12小时用光镜观察到的小管形成情况对比照片。参照图12，SUSD2+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6小时能够观察到血管形成现象，第12小时的血管形成进一步密集和显著。
参照图11和图12，即使是SUSD2+-CM作用于人血管内皮细胞后的第12小时血管的密集程度和显著程度也显然不如图11所示的SSEA-1+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6小时观察到的血管密集和显著程度。
进一步的，对使用每单位区域形成小管的平均长度进行统计可知：
SUSD2+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6小时统计每单位区域形成的小管长度平均为2毫米，而SSEA-1+-CM作用于人血管内皮细胞后的第6小时统计的小管长度平均可达18毫米，具有显著的增加(P<0.05)。
SUSD2+-CM作用于人血管内皮细胞后的第12小时统计每单位区域形成的小管长度平均为15毫米，而SSEA-1+-CM作用于人血管内皮细胞后的第12小时统计的小管长度平均可达25毫米，具有显著的增加(P<0.05)。
进一步的，本实施例对SSEA-1+细胞和SUSD2+细胞进行qPCR检测，考察两种细胞中与血管形成相关因子的表达情况，得到图13所示的SSEA-1+细胞和SUSD2+细胞的VEGFA,TNF,IL-1A和IL-1B的表达水平对比图。参照图13，相较于SUSD2+细胞，SSEA-1+细胞的与血管形成相关因子VEGFA,TNF,IL-1A和IL-1B的相对表达水平显著增加(P<0.001)。
综上所述，SSEA-1+-CM对促进小管的形成能力强于SUSD2+-CM。
通过划痕实验考察SSEA-1+-CM对SUSD2+细胞的作用。具体的，将SUSD2+细胞按1×106个/孔的接种密度接种于6孔板上，每孔加入2.5微升SSEA-1+-CM培养24小时直至细胞融合度大于90％；用10微升枪头在6孔板上每孔划3条划痕，用PBS润洗2遍，再用SSEA-1+-CM培养以启动划痕实验。分别于划痕实验启动后的0，12小时和24小时用光镜观察划痕愈合情况并记录，得到图14所示的使用SSEA-1+-CM作用于SUSD2+细胞以启动划痕实验后的第0，6小时和12小时用光镜观察到的划痕愈合情况对比照片。
通过划痕实验考察SUSD2+-CM对SUSD2+细胞的作用。具体步骤请参见前述通过划痕实验考察SSEA-1+-CM对SUSD2+细胞作用的实验步骤，得到图15所示的SUSD2+-CM作用于SUSD2+细胞以启动划痕实验后的第0，6小时和12小时用光镜观察到的划痕愈合情况对比照片。
参照图14和图15，无论是SSEA-1+-CM作用于SUSD2+细胞还是SUSD2+-CM作用于SUSD2+细胞启动的划痕实验在启动后的12小时都能够明显观察到细胞迁移现象，可见SSEA-1+-CM和SUSD2+-CM均能够促进子宫内膜间质细胞的迁移。其中：
SUSD2+-CM作用于SUSD2+细胞启动的划痕实验，在启动后的第6小时统计得到的划痕愈合面积百分比平均为25％，而SSEA-1+-CM作用于SUSD2+细胞启动的划痕实验在启动后的第6小时统计得到的划痕愈合面积百分比平均为62％，具有显著的增加(P<0.05)。
SUSD2+-CM作用于SUSD2+细胞启动的划痕实验在启动后的第12小时统计得到的划痕愈合面积百分比平均为60％，而SSEA-1+-CM作用于SUSD2+细胞启动的划痕实验在启动后的第12小时统计得到的划痕愈合面积百分比平均为90％，具有显著的增加(P<0.05)。
进一步的，本实施例对SSEA-1+细胞和SUSD2+细胞进行qPCR检测，考察两种细胞中促迁移相关因子的表达情况，得到图16所示的SSEA-1+细胞和SUSD2+细胞的ITGB2,ITGB4,ITGB7和NOTCH1的表达水平对比图。参照图16，相较于SUSD2+细胞，SSEA-1+细胞的促迁移相关因子ITGB2,ITGB4,ITGB7和NOTCH1的相对表达水平显著增加(P<0.01)。
综上所述，相较于SUSD2+-CM，SSEA-1+-CM对子宫内膜间质细胞迁移的促进作用更强。
使用SSEA-1+-CM对SUSD2+细胞进行培养，通过qPCR测试进一步考察了SSEA-1+-CM对SUSD2+细胞的纤维化相关因子的影响，证明SSEA-1+-CM培养后的SUSD2+细胞的TGF-β1,β-catenin,COL1A和αSMA的mRNA表达相较于SUSD2+细胞而言显著下调(P<0.05)。由此可见SSEA-1+细胞具有抑制SUSD2+细胞纤维化相关因子表达的能力。
具体的，将SUSD2+细胞按6×105个/孔接种于6孔板中，每孔添加2毫升TEM培养至融合度达80％左右时，将其分为两组，一组继续用ECM培养，另一组用SSEA-1+-CM进行培养，每天全量换液，7天后提取RNA进行qPCR测试。具体纤维化相关因子的下调程度请参见表1。证明SSEA-1+-CM培养后的SUSD2+细胞的TGF-β1,β-catenin,COL1A和αSMA的mRNA表达相较于SUSD2+细胞而言显著下调。由此可见SSEA-1+细胞具有抑制SUSD2+细胞纤维化相关因子表达的能力。
表1
本实施例的qPCR测试过程中使用的内标为β-actin，各引物来源于上海生工生物工程股份有限公司。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (12)

1.一种子宫内膜修复制剂，其特征在于，包含子宫内膜来源细胞的条件培养液，所述子宫内膜来源细胞具有前体细胞特征，并阳性表达阶段特异性胚胎抗原。
2.根据权利要求1所述的子宫内膜修复制剂，其特征在于，所述阶段特异性胚胎抗原为SSEA-1。
3.根据权利要求1所述的子宫内膜修复制剂，其特征在于，所述子宫内膜来源细胞为子宫内膜上皮前体细胞或子宫内膜上皮前体样细胞。
4.如权利要求1所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，包括：
提供所述子宫内膜来源细胞，使用条件培养基对所述子宫内膜来源细胞进行条件培养，所述条件培养结束后，从得到的培养产物中获取所述子宫内膜来源细胞的条件培养上清，所述条件培养基包括基础培养基和血清类物质。
5.根据权利要求4所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，以占所述基础培养基的体积计，所述血清类物质的含量不超过20％。
6.根据权利要求4所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为Hep-X基础培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基、MEM培养基、William’s Medium E培养基、Ham’s F-10培养基、Ham’s F-12培养基、IMDM培养基、McCoy’5A培养基、RPMI-1640培养基、BME培养基、M-199Medium培养基、Leibovitz Medium培养基、CMRL1066培养基、Neurobasal培养基和Fischers的任意一种。
7.根据权利要求4所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，所述子宫内膜来源细胞由内膜前体细胞培养基对阳性表达上皮细胞相关标志物的人原代子宫内膜细胞进行体外培养得到。
8.根据权利要求7所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，所述上皮细胞相关标志物为EpCAM、E-Cadherin、CD9、CK19、CD24和CD44的任意一种。
9.根据权利要求7所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，所述内膜前体细胞培养基包括所述基础培养基、生长因子、TGF-β信号通路抑制剂、Wnt信号通路激动剂、ROCK激酶抑制剂和血清类物质。
10.根据权利要求9所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，所述内膜前体细胞培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸和抗坏血酸的至少一种。
11.根据权利要求9所述的子宫内膜修复制剂的制备方法，其特征在于，以占所述基础培养基的体积计，所述生长因子的含量为5-50纳克/毫升，所述Rock激酶抑制剂含量为0.5-50微摩尔/升，所述WNT信号通路激动剂的含量为0.5-50微摩尔/升，所述TGF-β信号通路抑制剂的含量为0.5-50微摩尔/升，所述血清类物质的含量不超过20％。
12.如权利要求1所述的子宫内膜修复制剂在制备子宫内膜损伤修复药物方面的应用，其特征在于，包括将所述子宫内膜修复制剂与子宫内膜间质细胞或血管内皮细胞共培养。
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