BRPI0613811A2

BRPI0613811A2 - composição contendo células tronco estromais derivadas de tecido adiposo, suporte, método de preparação de uma composição contendo células tronco estromais derivadas de tecido adiposo, método de preparação de um adesivo para o reparo de fìstulas, método de tratamento de uma fìstula em um indivìduo, método de tratamento de uma ferida em um indivìduo, célula tronco estromal derivada de tecido adiposo e uso de células tronco estromais derivadas de tecido adiposo

Info

Publication number: BRPI0613811A2
Application number: BRPI0613811-0A
Authority: BR
Inventors: Maria Gema Fernandez Miguel; La Pena Manuel Angel Gonzalez De; Rosa Ana Garcia Castro; Mariano Garcia Arranz; Damian Garcia Olmo
Original assignee: Univ Madrid Autonoma; Cellerix Sl
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-05-16
Publication date: 2011-02-15
Also published as: AU2006261383A1; WO2006136244A3; EP3176257B1; US20170189452A1; BRPI0613811B8; DK3176254T3; LT2944688T; US20150065948A1; PT2944688T; RU2016152229A3; CY1116764T1; EP3176255A1; EP2292737B2; IL188378A; US20170209496A1; US11660318B2; EP3176256A1; PT3176255T; NL300953I1; LUC00085I2

Abstract

COMPOSIçAO CONTENDO CELULAS TRONCO ESTROMAIS DEVADAS DE TECIDO ADIPOSO, SUPORTE, MéTODO DE PREPARAçAO DE MA COMPOSIçAO CONTENDO CéLULAS TRONCO ESTROMAIS DERIVADAS DE ECIDO ADIPOSO, MéTODO DE PREPARAçAO DE UM ADESIVO PARA O REPARO DE FìSTULAS, MéTODO DE TRATAMENTO DE UMA FìSTULA EM UM NDIVìDUO, MéTODO DE TRATAMENTO DE UMA FERIDA EM UM NDIVìDUO, CéLULA TRONCO ESTROMAL DERIVADA DE TECIDO ADIPOSO USO DE CéLULAS TRONCO ESTROMAIS DERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO Trata-se de novos métodos e composições que tilizam células tronco estromais derivadas de tecido adiposopara o tratamento de fístulas.

Description

COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, SUPORTE, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DEUMA COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAIS DERIVADAS DETECIDO ADIPOSO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM ADESIVO PARA OREPARO DE FÍSTULAS, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA FÍSTULA EM UMINDIVÍDUO, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA FERIDA EM UMINDIVÍDUO, CÉLULA TRONCO ESTROMAL DERIVADA DE TECIDO ADIPOSOE USO DE CÉLULAS TRONCO ESTROMAIS DERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO

Referência Remissiva a Pedidos Correlatos

O presente pedido é uma continuação em parte doPedido de Patente Norte-americano N°. 11/065.461, depositadoem 25 de fevereiro de 2005 e uma continuação em parte doPedido de Patente Norte-americano N°. 11/056.241, depositadoem 14 de fevereiro de 2005, cujos teores são aquiincorporados especificamente a titulo de referência em suastotalidades.

Antecedentes da Invenção

Geralmente, uma fístula é uma conexão ou umapassagem anormal entre órgãos ou vasos que normalmente não seconectam. As fistulas podem se desenvolver em várias partesdo corpo. Por exemplo, os tipos de fistulas, nomeados para asáreas do corpo em que ocorrem, incluem a fístula anorretal oufístula no ânus ou fístula fecal (entre o reto ou a outraárea anorretal e a superfície da pele), afístulaarteriovenosa ou fístula A-V (entre uma artéria e uma veia) ,afístula biliar (entre os dutos do bile à superfície da pele,causada freqüentemente pela cirurgia de vesícula biliar), afístula cervical (abertura anormal no colo do útero), afístula do craniosinus (entre o espaço intracranial e o seioparanasal), a fístula enteroenteral (entre duas porções dointestino), a fístula enterocutânea (entre o intestino e asuperfície da pele, ou seja, do duodeno ou do jejuno ou doíleo), a fístula enterovaginal (entre o intestino e avagina), a fístula gástrica (entre o estômago à superfície dapele), a fístula metroperitoneal (entre o útero e a cavidadeperitoneal), a fístula de perilinfa (um rasgo entre asmembranas entre o ouvido médio e interno) , a fístulaarteriovenosa pulmonar (entre uma artéria e uma veia dospulmões, resultando em desvio de sangue), a fístularetovaginal (entre o reto e a vagina), a fístula umbilical(entre o umbigo e o tubo digestivo), a fístulatraqueoesofageal (entre os tubos respiratório e dealimentação) e a fístula vesicovaginal (entre a bexiga e avagina). As causas das fístulas incluem traumas, complicaçõesde tratamento médico e doenças.

O tratamento para as fístulas varia dependendo dacausa e da extensão da fístula, mas envolve geralmente umaintervenção cirúrgica. Vários procedimentos cirúrgicos sãogeralmente empregados, mais geralmente a fistulotomia, acolocação de um sedenho (um cordão que é passado através dotrajeto da fístula para mantê-la aberta para a drenagem) ouum procedimento de retalho endorretal (onde o tecido saudávelé puxado sobre o lado interno da fístula para evitar que asfezes ou um outro material reinfecte o canal). A cirurgiapara as fístulas anorretais tem efeitos colaterais, incluindoa recorrência, a reinfecção e a incontinência.

As doenças inflamatórias do intestino, tais como omal de Crohn e a colite ulcerativa, são as causas queconduzem às fístulas anorretal, enteroenteral eenterocutânea. A incidência relatada da fístula no mal deCrohn varia de 17% a 50%. 0 gerenciamento de fístulas empacientes com mal de Crohn continua a apresentar um problemaextremamente desafiador, uma vez que muitas tais fístulas nãorespondem aos tratamentos disponíveis. Tais fístulas e a suarecorrência são uma complicação muito aflitiva que reduzsignificativamente a qualidade de vida dos pacientesafetados. As melhorias recentes no tratamento médico (porexemplo, tratamento com Infliximab®) e na gerência cirúrgicaespecífica diminuíram a necessidade de cirurgias complicadas.

No entanto, muitos pacientes não são curados. A falha nacicatrização das fístulas se deve provavelmente à qualidadepouco favorável dos tecidos que foram afetados pelo mal deCrohn. Certamente, as fístulas de Crohn fornecem um sistemamodelo para a cicatrização de feridas sob algumas das piorescondições possíveis.

Uma outra causa principal das fístulas é o trauma,por exemplo, por estupro ou por lesões sofridas durante oparto, aos tecidos da vagina, do reto e/ou da bexiga queconduzem à fístula retovaginal e à fístula vesicovaginal.

Todo ano aproximadamente 100.000 mulheres no mundo emdesenvolvimento sofrem tais fístulas (também conhecidas comofístulas obstétricas) durante o trabalho de parto. Durante otrabalho de parto, a pressão da cabeça do bebê contra apélvis da mãe corta o suprimento de sangue aos tecidosdelicados da região. 0 tecido inoperante cai e a mulher ficacom uma fístula vesicovaginal e às vezes uma fístularetovaginal. Esse furo resulta em incontinência permanente deurina e/ou fezes. 0 United Nations Populational Fund (UNFPA)estima a população do mundo de mulheres que sofrem defístulas obstétricas em mais de dois milhões. Esse cálculopoderia ser uma depreciação significativa. Taxas de sucessopara reparo cirúrgico primário variam de 88 a 93 por cento,mas diminuem com tentativas sucessivas. Desse modo, umaporcentagem significativa das mulheres tem fístulasobstétricas que não podem ser reparadas cirurgicamente.

Novas terapias para fístulas se fazem necessárias.

Descrição Resumida da Invenção

Na presente invenção, são apresentadas, entreoutras coisas, novas composições que contêm células troncoestromais derivadas de tecido adiposo. As composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposodescritas na presente invenção têm um fenótipo distinto eexibem uma homogeneidade de fenótipo maior do que ascomposições de células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo, o que as torna desse modo mais apropriadas paraserem utilizadas no tratamento de fistulas e feridas em,relação às composições previamente descritas. As composiçõesque contêm células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo podem ser formuladas com soluções ou outrassubstâncias para servir como produtos farmacêuticos oudispositivos médicos, por exemplo, como suturas ou adesivos.

Além disso, são apresentados novos métodos para o tratamentode fistulas e feridas utilizando células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo, bem como kits para a prática dosmesmos.

Estas realizações da presente invenção, outrasrealizações e seus aspectos e características ficarãoevidentes a partir da descrição, dos desenhos e dasreivindicações seguintes.

Breve Descrição das Figuras

A FIGURA 1 ilustra os resultados da caracterizaçãode células isoladas pelos métodos do Exemplo 1 por tingimentopor imunofluorescência. A freqüência de célulasimunopositivas é indicada tal como segue: -, menos de 5%; +/-6-15%; +, 16-50%; ++, 51-85%; e +++, 86-100%. P, número dapassagem.

A FIGURA 2 ilustra a caracterização deimunofluorescência indireta das células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo. As células do paciente #001foram passadas a seis células subseqüentes ao implante n°. 6.A cor azul indica núcleos tingidos por DAPI. (A) CD90; (B) C-Kit; e (C) vimentina.A FIGURA 3 resume os resultados clínicos obtidosempregando determinados métodos e composições da invenção. F,Fêmea; M, macho; NI, nenhum implante; NA, não analisado.

A FIGURA 4 ilustra curvas de crescimento de célulasderivadas de lipoaspiração em concentrações diferentes de FBS(0,5, 2,5 e 10%, tal como indicado). Os fibroblastossinoviais humanos foram cultivados na presença de 5% ou 10%de FBS. Os números de células ± SD são mostrados em termos deabsorbância em 595 nm. Os dados são de uma experiênciarepresentativa com cavidades triplicadas.

A FIGURA 5 ilustra a bolha na mucosa retal depoisde as células terem sido injetadas perto da abertura internasuturada.

A FIGURA 6 ilustra fotografias de uma fístula antes(A) e oito semanas após (B) a injeção de células.

A FIGURA 7A ilustra histogramas de imunocitometriapor fluorescência correspondentes ao perfil dos marcadores desuperfície (CD3, CD9, CDlO, CDllb, CD13, CD14, CD15, CD16,CDl8, CDl9, CD28, CD29, CD31, CD34, CD36, CD38, CD44, CD45,CD4 9a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e e CD49f) obtidos de célulasisoladas de amostras de lipoaspiração de um pacienteenvolvido no estudo, na passagem 6.

A FIGURA 7B ilustra histogramas de imunocitometriapor fluorescência correspondentes ao perfil dos marcadores desuperfície (CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61,CD62E, CD62L, CD62P, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106,CD133, CDl66, glicoforina, microglobulina β2, HLA I, HLA II eNGFR) obtidos de células isoladas de amostras delipoaspiração de um paciente envolvido no estudo, na passagem 6.

Descrição Detalhada da Invenção

1. Definições:

Conforme empregado na presente invenção, osseguintes termos e frases terão os significados indicadosabaixo. A menos que esteja definido de alguma outra maneira,todos os termos técnicos e científicos empregados na presenteinvenção têm o mesmo significado que aquilo que é geralmentecompreendido por um elemento versado na técnica à qualpertence a presente invenção.

Os artigos "um" e "uma" referem-se a um ou mais deum (isto é, a pelo menos um) objeto gramatical do artigo. Porexemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de umelemento.

Por "tecido adiposo" entenda-se qualquer tecidoadiposo. 0 tecido adiposo pode ser tecido adiposo marrom oubranco, derivado de sítio subcutâneo, omental/visceral,mamário, gonádico ou outro sítio de tecido adiposo. Depreferência, o tecido adiposo é tecido adiposo brancosubcutâneo. Tais células podem compreender uma culturaprimária de células ou uma linhagem de células imortalizada.O tecido adiposo pode ser de qualquer organismo que tenhatecido adiposo. De preferência, o tecido adiposo é demamífero, e com a máxima preferência o tecido adiposo éhumano. Uma fonte conveniente de tecido adiposo é obtidaatravés da cirurgia de lipoaspiração, no entanto, a fonte detecido adiposo ou o método de isolamento de tecido adiposonão é essencial à invenção. Se as células estromais foremdesejadas para transplante autólogo em um indivíduo, o tecidoadiposo será isolado desse indivíduo.

"Células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo" referem-se às células tronco mesenquimais que seoriginam do tecido adiposo.

O termo "adesivo" refere-se a qualquer substânciaque une ou liga as superfícies entre si; por exemplo, umacola.

O termo "composição celular" refere-se a umapreparação de células, cuja preparação pode incluir, além dascélulas, componentes não-celulares tais como meios de culturade células, por exemplo, proteínas, aminoácidos, ácidosnucléicos, nucleotídeos, coenzimas, antioxidantes, metais, eoutros ainda. Além disso, a composição celular pode tercomponentes que não afetem o crescimento ou a viabilidade docomponente celular, mas que sejam utilizados para fornecer ascélulas em um formato particular, por exemplo, como umamatriz polimérica para encapsulação ou como um preparadofarmacêutico.

O termo "cultura" refere-se a qualquer crescimentode células, organismos, entidades multicelulares ou de tecidoem um meio. O termo "cultura" refere-se a qualquer métodopara atingir tal crescimento e pode compreender múltiplasetapas. O termo "cultura adicional" refere-se à cultura deuma célula, um organismo, uma entidade multicelular ou de umtecido até um determinado estágio de crescimento, utilizandoentão um outro método de cultura para colocar a dita célula,organismo, entidade multicelular ou tecido em um outroestágio de crescimento. Uma "cultura de células" refere-se aum crescimento de células in vitro. Em tal cultura, ascélulas se proliferam, mas não se organizam no tecido per se.Uma "cultura de tecido" refere-se à manutenção ou crescimentode tecido, por exemplo, explantes de órgão primordial ou deum órgão de adulto in vitro de modo a preservar a suaarquitetura e função. Uma "cultura de monocamada" refere-se auma cultura em que as células se multiplicam em um meioapropriado quando unidas principalmente entre si e a umsubstrato. Além disso, uma "cultura de suspensão" refere-se auma cultura em que as células se multiplicam quando suspensasem um meio apropriado. Do mesmo modo, uma "cultura de fluxocontinuo" refere-se ao cultivo de células ou de explantes emum fluxo continuo do meio fresco para manter o crescimento decélulas, por exemplo, a sua viabilidade. 0 termo "meiocondicionado" refere-se ao sobrenadante, por exemplo, livrede células cultivadas/tecido, resultante depois de um períodode tempo em contato com as células cultivadas de modo que osmeios sejam alterados para incluir determinados fatoresautócrinos e/ou parácrinos produzidos pelas células esecretados na cultura. Uma "cultura confluente" é uma culturade células em que todas as células estão em contato e asuperfície inteira do vaso de cultura é desse modo coberta eimplica que as células também alcançaram a sua densidademáxima, embora a afluência não signifique necessariamente quea divisão irá cessar ou que a população não irá aumentar detamanho.

O termo "meio de cultura" ou "meio" é reconhecidono estado da técnica e refere-se geralmente a qualquersubstância ou preparado utilizado para o cultivo de célulasvivas. O termo "meio", tal como empregado na referência a umacultura de células, inclui os componentes do ambiente quecircunda as células. 0 meio pode ser sólido, líquido, gasoso,ou uma mistura de fases e materiais. O meio inclui meios decrescimento líquidos bem como meios líquidos que nãosustentam o crescimento de células. Os meios também incluemmeios gelatinosos tais como matrizes de ágar, agarose,gelatina e colágeno. Os meios gasosos exemplificadoresincluem a fase gasosa à qual são expostas as células quecrescem em uma placa de Petri ou em outro suporte sólido ousemi-sólido. 0 termo "meio" também se refere ao material quese presta para o uso em uma cultura de células, mesmo se eleainda não foi colocado em contato com as células. Em outraspalavras, um líquido rico em nutrientes preparado para acultura bacteriana é um meio. Similarmente, uma mistura em póque, quando misturada com água ou outro líquido se tornaapropriada para a cultura de células, pode ser denominada um"meio em pó". O "meio definido" refere-se aos meios que sãofeitos de componentes quimicamente definidos (geralmentepurificados). Os "meios definidos" não contêm extratosbiológicos mal caracterizados tais como o extrato de levedurae o caldo de carne. 0 "meio rico" inclui meios que sãodestinados ao crescimento de suporte da maioria ou de todasas formas viáveis de uma espécie particular. Os meios ricosincluem freqüentemente extratos biológicos complexos. Um"meio apropriado para o crescimento de uma cultura dedensidade elevada" é qualquer meio que permita que umacultura de células alcance uma OD6OO de igual ou maior do que3 quando outras condições (tais como a temperatura e a taxade transferência de oxigênio) permitem tal crescimento. 0termo "meio basal" refere-se a um meio que promove ocrescimento de vários tipos de microorganismos que nãorequerem nenhum suplemento de nutrientes especiais. A maiorparte dos meios basais compreende geralmente quatro gruposquímicos básicos: aminoácidos, carboidratos, sais inorgânicose vitaminas. Um meio basal serve geralmente como a base paraum meio mais complexo, ao qual suplementos como soro,tampões, fatores de crescimento, lipídios e outros ainda sãoadicionados. Os exemplos de meios basais incluem, mas semficar a eles limitados, Meio Basal Eagle, Meio EssencialMínimo, Meio Eagle Modificado da Dulbecco, Meio 199, Misturasde Nutrientes da Ham F-IO e Ham F-12, Mc Coy 5A, MEM/F-I 2 daDulbecco, RPMI 164 0 e Meio da Dulbecco Modificado Iscove(IMDM).

Os termos "compreende" e "que compreende" sãoutilizados no sentido inclusivo, aberto, significando queelementos adicionais podem ser incluídos.

O termo "diferenciação" refere-se à formação dascélulas que expressam os marcadores conhecidos por estaremassociados com as células que são mais especializadas e queestão mais perto de se tornar as células terminalmentediferenciadas que não têm capacidade de divisão oudiferenciação adicional. Por exemplo, em um contextopancreático, a diferenciação pode ser vista na produção deconjuntos de células similares a ilhotas que contêm umaproporção de células beta-epiteliais aumentada que produzemquantidades aumentadas de insulina. Os termos "adicional" oudiferenciação "maior" referem-se às células que são maisespecializadas e estão mais perto de se tornar célulasterminalmente diferenciadas que não têm capacidade de umadivisão ou diferenciação adicional do que as células dasquais foram cultivadas. 0 termo "diferenciação final" refere-se às células que se tornaram células terminalmentediferenciadas que não têm capacidade de uma divisão oudiferenciação adicional.

O termo "fístula" refere-se a qualquer passagem oucomunicação ou conexão anormal, geralmente entre dois órgãosinternos ou que conduz de um órgão interno à superfície docorpo. Os exemplos de fístulas incluem, mas sem ficar a elaslimitados, a fístula anorretal ou fístula no ânus ou fístulafecal, a fístula arteriovenosa ou fístula A-V, a fístulabiliar, a fístula cervical, a fístula do craniosinus, afístula enteroenteral, a fístula enterocutânea, a fístulaenterovaginal, a fístula gástrica, a fístula metroperitonealde perilinfa, a fístula arteriovenosa pulmonar, a fístularetovaginal, a fístula umbilical, a fístula traqueoesofageale a fístula vesicovaginal.

O termo "incluindo" é empregado na presenteinvenção para significar "incluindo mas sem ficar limitadoa". "Incluindo" e "incluindo mas sem ficar limitado a" sãoutilizados intercambiavelmente.

"Marcador" refere-se a uma molécula biológica cujapresença, concentração, atividade ou estado de fosforilaçãopode ser detectado e utilizado para identificar o fenótipo deuma célula.

Um "emplastro" é um curativo ou cobertura aplicadapara cobrir ou proteger uma ferida ou outra lesão.

Um "paciente", "indivíduo" ou "hospedeiro" a sertratado pelo método em questão pode significar um ser humanoou animal não-humano.

A expressão "farmaceuticamente aceitável" éempregada na presente invenção para se referir aos compostos,materiais, composições e/ou formas de dosagem que estãodentro do âmbito do julgamento médico correto, apropriadospara o uso em contato com tecidos de seres humanos e animaissem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessiva ououtro problema ou complicação, de acordo com uma relaçãorazoável de benefício/risco.

A expressão "veículo farmaceuticamente aceitável"tal como empregado na presente invenção, significa ummaterial, uma composição ou um veículo farmaceuticamenteaceitável, tal como uma carga, um diluente, um excipiente ouum solvente líquido ou sólido que encapsula o material,envolvido no carregamento ou no transporte do composto emquestão de um órgão ou porção do corpo, a um outro órgão ouporção do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável" no sentidode ser compatível com os outros ingredientes da formulação enão prejudicial ao paciente. 0 termo "fenótipo" refere-se àscaracterísticas observáveis de uma célula, tais como otamanho, a morfologia, a expressão de proteína, etc.

O termo "célula progenitora" refere-se a uma célulaque tem a capacidade de criar progênie, a qual é maisdiferenciada do que a mesma. Por exemplo, o termo pode sereferir a uma célula não-diferenciada ou célula diferenciadaa uma curta extensão da diferenciação final que é capaz deproliferação e de fazer com que mais células progenitorastenham a capacidade de gerar um grande número de células mãeque podem por sua vez fazer surgir células filhasdiferenciáveis ou diferenciadas. Em uma realização preferida,o termo "células progenitoras" refere-se a uma célula mãegeneralizada cujos descendentes (progênie) se especializam,freqüentemente em direções diferentes, na diferenciação, porexemplo, ao adquirir caráteres completamente individuais, talcomo ocorre na diversificação progressiva células embriônicase tecidos. A diferenciação celular é um processo complexo queocorre tipicamente através de muitas divisões celulares. Umacélula diferenciada pode se derivar de uma célulamultipotente que seja ela própria derivada de uma célulamultipotente, e assim por diante. Embora cada uma dessascélulas multipotentes possa ser considerada uma célulatronco, a faixa de tipos de células que cada uma pode fazersurgir pode variar consideravelmente. Algumas célulasdiferenciadas também têm a capacidade de fazer surgir célulascom um potencial desenvolvimental maior. Tal capacidade podeser natural ou pode ser induzida artificialmente quando dotratamento com vários fatores. Por esta definição, as célulastronco também podem ser células progenitoras, assim comoprecursores mais imediatos às células terminalmentediferenciadas.

"Proliferação" refere-se a um aumento no número decélulas. "Que se proliferam" e "proliferação" referem-se àscélulas que se submetem à mitose.

Conforme empregado na presente invenção, o termo"solução" inclui um veiculo ou diluente farmaceuticamenteaceitável em que as células da invenção permanecem viáveis.

O termo "substancialmente puro", com respeito àspopulações de células tronco derivadas de tecido adiposo,refere-se a uma população de células tronco derivadas detecido adiposo que é pelo menos aproximadamente 75%, depreferência pelo menos aproximadamente 85%, com maispreferência pelo menos aproximadamente 90%, e com a máximapreferência pelo menos aproximadamente 95% pura, com respeitoàs células tronco estromais derivadas de tecido adiposo queconstituem uma população total de células. Novamente, o termo"substancialmente puro" refere-se a uma população de célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo da presenteinvenção que contêm menos do que aproximadamente 20%, commais preferência menos do que aproximadamente 10%, e com amáxima preferência menos do que aproximadamente 5%, decélulas de linhagem empenhadas na população original não-ampliada e isolada antes do cultivo e amplificaçãosubseqüentes.

"Suporte", conforme empregado na presente invenção,refere-se a qualquer dispositivo ou material que pode servircomo uma fundação ou matriz para o crescimento de célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo.

O termo "sutura" refere-se a uma linha ou fibra oua outro material de fixação que pode ser utilizado parasuturar uma ferida.

O termo "tratamento", tal como utilizado napresente invenção, refere-se ao reparo de uma fístula ouferida, bem como à prevenção para que uma fistula ou feridanão piore nem retorne.

"Agente terapêutico" ou "terapêutico" refere-se aum agente que pode ter um efeito biológico desejado em umhospedeiro. Os agentes quimioterápicos e genotóxicos sãoexemplos de agentes terapêuticos que são conhecidosgeralmente por serem químicos na origem, ao contrário dosbiológicos, ou por causarem um efeito terapêutico por ummecanismo de ação particular, respectivamente. Os exemplos deagentes terapêuticos de origem biológica incluem fatores docrescimento, hormônios e citocinas. Uma variedade de agentesterapêuticos é conhecida no estado da técnica e pode seridentificada por seus efeitos. Determinados agentesterapêuticos podem regular a proliferação e a diferenciaçãode células. Os exemplos incluem nucleotídeos quimioterápicos,drogas, hormônios, proteínas não-específicas (não-anticorpo),oligonucleotídeos (por exemplo, os oligonucleotídeos anti-sentido que se ligam a uma seqüência de ácido nucléico alvo(por exemplo, seqüência de mRNA)), peptídeos epeptidomiméticos.

Uma "ferida" é um ferimento ou lesão ao tecido,causado por meios físicos, causando o rompimento dacontinuidade normal do tecido.

2. Composições que Contêm Novas Células Tronco EstromaisDerivadas de Tecido Adiposo

Em um aspecto, a invenção refere-se às composiçõesque contêm células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo com determinadas características, tais como umfenótipo particular. Por exemplo, as células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo em uma composição celular dainvenção podem ser caracterizadas pela expressão do marcadorde superfície da célula, pelo tamanho, pelo consumo deglicose, pela produção de lactato e pelorendimento/viabilidade da célula. Contudo, um outro aspectoda presente invenção refere-se às composições que contêmcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo queincluem, como um componente celular, preparadossubstancialmente puros de células tronco estromais derivadasde tecido adiposo que têm um fenótipo particular ou progêniedas mesmas. As composições que contêm células troncoestromais derivadas de tecido adiposo da presente invençãoincluem não somente populações substancialmente puras decélulas progenitoras, mas também podem incluir os componentesda cultura de células, por exemplo, meios de culturaincluindo aminoácidos, metais, fatores de coenzima, bem comopopulações pequenas de outras células estromais, por exemplo,algumas das quais podem surgir pela diferenciação subseqüentedas células da invenção. Além disso, outros componentes não-celulares podem incluir aqueles que resultam em componentescelulares apropriados para suporte sob circunstânciasparticulares, por exemplo, implante, por exemplo, culturacontinua ou apropriados para o uso como um biomaterial oucomposição farmacêutica.

Em determinadas realizações, as composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adipososão produzidas através dos métodos de cultura descritos naSeção 4 e na Exemplificação.

Em uma realização, é apresentada uma composição quecontém células tronco estromais derivadas de tecido adiposo,em que pelo menos aproximadamente 50%, pelo menosaproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelomenos aproximadamente 8 0%, pelo menos aproximadamente 85%,pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente95% ou de preferência pelo menos aproximadamente 96%, 97%,98% ou 99% das células tronco expressam os marcadores CD9,CDlO, CD13. CD2 9, CD44, CD4 9A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59,CD90 e/ou CD105. Em determinadas realizações das composiçõesque contêm células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo, menos de aproximadamente 15%, aproximadamente 10%,aproximadamente 5% e de preferência aproximadamente 4%, 3%,2% ou 1% das células tronco expressam os marcadores CD34CDllb, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102,CD104, CDl06 e/ou CD133.

Em uma outra realização, é apresentada umacomposição que contém células tronco estromais derivadas detecido adiposo, em que pelo menos aproximadamente 50%, pelomenos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%,pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menosaproximadamente 95% ou de preferência pelo menosaproximadamente 96%, 97%, 98% ou 99% das células troncoexpressam os marcadores C-Kit, vimentina e/ou CD90. Emdeterminadas realizações das composições que contêm célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo, menos deaproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%e de preferência aproximadamente 4%, 3%, 2% ou 1% das célulastronco expressam os marcadores CD34, Fator VIII, alfa-actina,desmina, S-100 e/ou queratina. Também é apresentada umapopulação de células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo que expressam os marcadores C-Kit, vimentina e CD90 enão expressam os marcadores CD34, Fator VIII, alfa-actina,desmina, S-100 e queratina.

A caracterização fenotípica de uma população decélulas pelos marcadores de superfície pode ser executada pormeio de tingimento individual de células (citometria defluxo) ou ao fazer cortes histológicos da população no situ,feitos de acordo com os métodos normais. A determinação doperfil de expressão dos marcadores de superfície poranticorpos, a caracterização de imunofenótipo, pode serdireta, utilizando um anticorpo etiquetado ou indireto,utilizando um segundo anticorpo etiquetado contra o anticorpoprimário específico do marcador da célula, obtendo desse modoa amplificação do sinal. Por outro lado, a presença ou aausência de ligação ao anticorpo pode ser determinada pormétodos diferentes que incluem mas sem ficar a elaslimitados, a microscopia por imunofluorescência eradiografia. Similarmente, é possível executar omonitoramento dos níveis de ligação do anticorpo por meio decitometria de fluxo, uma técnica que permite que os níveis defluorocromo sejam correlacionados com a quantidade deantígenos presentes na superfície da célula ligadaespecificamente aos anticorpos etiquetados. A expressãodiferencial de uma série de marcadores de superfície em umapopulação de células fornece um método para a identificação ea isolação da dita população.

Em determinadas realizações, as composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adipososão suspensões de células tronco estromais derivadas detecido adiposo em várias soluções ou materiais, por exemplo,para o uso como produtos farmacêuticos ou biomateriais, talcomo descrito mais detalhadamente abaixo. Em uma realização,a composição celular compreende uma suspensão das célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo em questão nasolução de Ringer e HSA. Em uma outra realização, acomposição celular compreende uma suspensão das célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo em questão em ummaterial, tal como um polímero, cola, gel, etc. Taissuspensões podem ser preparadas, por exemplo, ao sedimentaras células tronco estromais derivadas de tecido adiposo emquestão a partir do meio de cultura e ao suspendê-lasnovamente na solução ou no material desejado. As célulaspodem ser sedimentadas e/ou alteradas fora do meio decultura, por exemplo, por meio de centrifugação, filtração,ultrafiltração, etc.

A concentração das células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo em questão nas composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposoem questão pode ser de pelo menos aproximadamente 5 χ 10^6células, pelo menos aproximadamente 10 χ 10^6 células, pelomenos aproximadamente 20 χ 10^6 células, pelo menosaproximadamente 30 χ 10^6 células ou pelo menosaproximadamente 40 χ 10^6 células.

Conseqüentemente, um outro aspecto da presenteinvenção refere-se à progênie das células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo em questão, por exemplo, ascélulas que foram derivadas de células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo. Tal progênie pode incluirgerações subseqüentes de células tronco estromais derivadasde tecido adiposo, assim como as células empenhadas nalinhagem geradas ao induzir a diferenciação das célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo em questão apóso seu isolamento do explante, por exemplo, induzidas invitro. Em determinadas realizações, as células de progêniesão obtidas após aproximadamente duas, aproximadamente três,aproximadamente quatro, aproximadamente cinco,aproximadamente seis, aproximadamente sete, aproximadamenteoito, aproximadamente nove ou aproximadamente dez passagensda população parental. No entanto, as células de progêniepodem ser obtidas após qualquer número de passagens dapopulação parental.

Em determinadas realizações, as composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposoda invenção serão fornecidas como parte de um preparadofarmacêutico, por exemplo, um preparado estéril, livre dapresença de vírus, bactérias e de outros patógenos nãodesejados, bem como um preparado livre de pirogênio. Isto é,para a administração humana, as composições em questão devematender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, bem comosegurança geral e pureza conforme requerido pelo escritóriodo FDA de padrões biológicos.

Em determinadas realizações, tais composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposopodem ser utilizadas para o transplante em animais, depreferência mamíferos, e ainda com a máxima preferência sereshumanos. As células podem ser de preferência autólogas, mastambém podem ser alogênicas ou xenogênicas com respeito aohospedeiro do transplante. Por causa das dificuldades naobtenção de células tronco autólogas suficientes, as célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo do doadoralogênico podem constituir uma fonte alternativa valiosa decélulas tronco para o uso terapêutico. É sabido no estado datécnica que as células tronco estromais do tutano do osso eas células estromais derivadas de tecido adiposo não provocamuma resposta dos linfócitos alogênicos in vitro e,conseqüentemente, as células tronco alogênicas estromaisderivadas de tecido adiposo derivadas de um doador poderiamser teoricamente utilizadas em qualquer paciente,independentemente da incompatibilidade de MHC.

Os métodos de administração das composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposoaos indivíduos, particularmente a indivíduos humanos, que sãodescritos em detalhe na presente invenção, incluem a injeçãoou o implante das células em sítios alvo nos indivíduos,sendo que as células podem ser introduzidas em um dispositivode aplicação que facilita a introdução por meio de injeção ouimplante, das células nos indivíduos. Tais dispositivos deaplicação incluem tubos, por exemplo, cateteres, para injetarcélulas e fluidos no corpo de um indivíduo receptor. Em umarealização preferida, os tubos têm adicionalmente uma agulha,por exemplo, uma seringa, através dos quais as composiçõesque contêm células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo podem ser inseridas no indivíduo em uma posiçãodesejada. As composições que contêm células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo podem ser inseridas em taldispositivo de aplicação, por exemplo, uma seringa, em formasdiferentes. Por exemplo, as composições que contêm célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo incluemcomposições das células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo que são suspensas em uma solução ou incorporadas emuma matriz de suporte quando contidas em tal dispositivo deaplicação.

Os veículos e diluentes farmaceuticamenteaceitáveis incluem soluções de tampão aquosas, soluçãosalina, solventes e/ou meios de dispersão. 0 uso de taisveículos e diluentes é bem conhecido no estado da técnica. Asolução é de preferência estéril e fluida até o ponto em quehaja a capacidade de fácil aplicação com seringa. Depreferência, a solução é estável sob as condições demanufatura e de armazenagem e protegida contra a açãocontaminante de microorganismos tais como as bactérias e osfungos através do uso de, por exemplo, parabenos,clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e outrosainda. As soluções que são composições que contêm célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo da invençãopodem ser preparadas através da incorporação das célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo tal comodescrito na presente invenção em um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável e, conforme necessário, outrosingredientes enumerados acima, seguida pela esterilizaçãofiltrada.

Alguns exemplos de materiais e soluções que podemservir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem:(1) açúcares, tais como a lactose, a glicose e a sacarose;(2) amidos, tais como o amido de milho e o amido de batata;(3) celulose e seus derivados, tais como a carbóxi metilcelulose sódica, a etil celulose e o acetato de celulose; (4)tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8)excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras parasupositórios; (9) óleos, tais como o óleo de amendoim, o óleode caroço de algodão, o óleo de açafrão, o óleo de gergelim,o azeite de oliva, o óleo de milho e o óleo de soja; (10)glicóis, tal como o propileno glicol; (11) polióis, tais comoa glicerina, o sorbitol, o manitol e o polietileno glicol;(12) ésteres, tais como o oleato de etila e o laurato deetila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais como ohidróxido de magnésio e o hidróxido de alumínio; (15) ácidoalgínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salinaisotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20)soluções com pH tamponadas; (21) poliésteres, policarbonatose/ou polianidretos; e (22) outras substâncias compatíveisatóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

Em determinadas realizações, as composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposocompreendem adicionalmente um adesivo. Em determinadasrealizações, o adesivo é um adesivo à base de fibrina, talcomo um gel de fibrina ou cola de fibrina ou polímero ouadesivo à base de fibrina ou outra cola adesiva de tecido oucirúrgica, tal como, por exemplo, cianoacrilato, colágeno,trombina e polietileno glicol. Outros materiais que podem serutilizados incluem mas sem ficar a eles limitados, alginatode cálcio, agarose, isoformas de colágeno dos tipos I, II, IVou outras, ácido poliláctico/poliglicólico, derivados dehialuronato ou outros materiais (Perka C. et al. (2 000) J.Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechriest VF. et al. (2000)J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541; Chu CR et al. (1995) J.Biomed. Mater. Res. 29:1147-1154; Hendrickson DA et al.(1994) Orthop. Res. 12:485-497). Em outras realizações, oadesivo é uma bandagem líquida, em que as composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposodo método são misturadas com o material da bandagem líquida.Uma "bandagem líquida" é uma solução que compreende umcomposto, por exemplo, um material polimérico, que é aplicadoa uma ferida com um spray ou uma escova, seguido pela remoçãodo solvente por vaporização para formar uma películaprotetora na ferida.Também são apresentados na presente invençãométodos para a preparação das composições que contêm célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo que compreendemcompostos ou materiais para o uso no reparo de fistulas ouferidas. Em uma realização, um método para a preparação detais materiais compreende a suspensão das células troncoestromais derivadas de tecido adiposo de uma composiçãocelular em questão com o material. Em uma realização, ascélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo sãosedimentadas fora do meio de cultura e são novamentesuspensas em uma cola ou gel de fibrina. A cola e o gel defibrina e outros polímeros e adesivos à base de fibrinas sãobem conhecidos no estado da técnica e estão comercialmentedisponíveis. Por exemplo, um kit comercialmente disponível decola de fibrina é Tissucol® Duo 2.0 e outros vedadores defibrina comercialmente disponíveis incluem Crosseal®, TISSEELVH Fibrin Sealant®, e outros ainda.

As composições que contêm células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo da invenção também podem serutilizadas para revestir um suporte, por exemplo, umdispositivo médico. Por exemplo, o suporte pode ser umasutura, linha, dispositivo de reparo de menisco, rebite,aderência, grampo, parafuso, placa óssea, sistema dechapeamento ósseo, tela cirúrgica, emplastro, por exemplo, umemplastro de reparo, emplastro cardiovascular ou emplastropericardial, tipóia, pino ortopédico, barreira contraaderência, stent, dispositivo de reparo/regeneração de tecidoguiado, dispositivo de reparo de cartilagem articular, guiade nervo, dispositivo de reparo de tendão, dispositivo dereparo de defeito septal atrial, agente de avolumação oupreenchimento, válvula de veia, estrutura de suporte dotutano do osso, dispositivo de regeneração de menisco,enxerto de ligamento e de tendão, implante celular ocular,caixa de fusão espinal, substituto da pele, substituto durai,substituto de enxerto de osso, passador de osso, curativopara ferida, cola, polímero ou hemostato.

Os suportes em que as composições que contêmcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo podemser embutidas ou incorporadas ou em que as composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposopodem ser revestidas incluem as matrizes que são compatíveiscom o receptor e que degradam em produtos que não sãoprejudiciais ao receptor. As matrizes biodegradáveis naturaise/ou sintéticas são exemplos de tais matrizes. As matrizesbiodegradáveis naturais incluem os coágulos do plasma, porexemplo, derivados de um mamífero, e matrizes de colágeno. Asmatrizes biodegradáveis sintéticas incluem polímerossintéticos tais como polianidridos, poliortoésteres e ácidopoliláctico. Outros exemplos de polímeros sintéticos emétodos de incorporação ou adaptação das células nestasmatrizes são conhecidos no estado da técnica. Vide, porexemplo, a Patente US N°. 4.298.002 e a Patente US N°.5.3 08.701. Estas matrizes fornecem suporte e proteção para ascélulas frágeis in vivo.

O suporte pode ser revestido com as células emqualquer maneira conforme conhecido por um elemento versadona técnica, por exemplo, por meio de encharcamento,pulverização, pintura, impressão, etc.

Em uma realização, o suporte é uma sutura, umgrampo, uma linha absorvível, uma linha não-absorvível, umalinha natural, uma linha sintética, uma linha demonofilamento ou uma linha de multifilamentos (também chamadade trança). Os métodos preferidos para a preparação dassuturas e outros suportes utilizados no fechamento de feridasrevestidas com as células tronco estromais derivadas detecido adiposo são descritos no Pedido de Patente Norte-americano N°. 11/056.241 "Biomaterial for Suturing",depositado em 14 de fevereiro de 2005, pedido esse que éincorporado a título de referência em sua totalidade. Ascomposições que contêm células tronco estromais derivadas detecido adiposo descritas na presente invenção representam asnovas composições que podem ser utilizadas com os métodosdescritos no Pedido de Patente Norte-americano N0.11/056.241.

Além disso, em qualquer uma das composições quecontêm células tronco estromais derivadas de tecido adiposo,pelo menos um agente terapêutico pode ser incorporado nacomposição. Por exemplo, uma composição pode conter umanalgésico, para auxiliar no tratamento da inflamação ou dador no local da fístula ou da ferida ou um agenteantiinfectivo para impedir a infecção do local tratado com acomposição.

Mais especificamente, os exemplos não-limitadoresde agentes terapêuticos úteis incluem as seguintes categoriasterapêuticas: analgésicos, tais como drogas, agonistas deopiato e salicilatos antiinflamatórios não-esteroidais;agentes antiinfectivos, tais como anti-helmínticos,antianaeróbicos, antibióticos, antibióticos deaminoglicosídeo, antibióticos antifúngicos, antibióticos decefalosporina, antibióticos de macrolídeo, antibióticosvariados de β-lactama, antibióticos de penicilina,antibióticos de quinolona, antibióticos de sulfonamida,antibióticos de tetraciclina, antimicobacterianos,antimicobacterianos antituberculosos, antiprotozoários,antiprotozoários antimalarianos, agentes antivirais, agentesanti-retrovirais, escabicidas, agentes antiinflamatórios,agentes antiinflamatórios corticosteróides, anestésicosantipruriginosos/locais, antiinfectivos tópicos,antiinfectivos tópicos antifúngicos, antiinfectivos tópicosantivirais; agentes eletrolíticos e renais, tais como agentesde acidificação, agentes de alcalinização, diuréticos,diuréticos inibidores de anidrase carbônica, diuréticos dealça, diuréticos osmóticos, diuréticos poupadores depotássio, diuréticos de tiazida, substituições de eletrólitose agentes uricosúricos; enzimas, tais como enzimaspancreáticas e enzimas trombolíticas; agentesgastrointestinais, tais como agentes antidiarréicos,antieméticos, antiinflamatórios gastrointestinais, agentesantiinflamatórios gastrointestinais de salicilato, agentesantiúlcera antiácidos, agentes antiúlcera inibidores da bombade ácido gástrico, agentes antiúlcera mucosal gástrica,agentes antiúlcera bloqueadores de H2, agentescolelitolíticos, digestivos, eméticos, laxantes e amaciantesde fezes e agentes pró-cinéticos; anestésicos gerais, taiscomo anestésicos por inalação, anestésicos por inalaçãohalogenados, anestésicos intravenosos, anestésicosintravenosos de barbiturato, anestésicos intravenosos debenzodiazepina e anestésicos intravenosos do agonista deopiato; hormônios e modificadores de hormônios, tais comoagentes abortivos, agentes adrenais, agentes adrenaiscorticosteróides, androgênios, antiandrogênios, agentesimunobiológicos, tais como imunoglobulinas,imunossupressores, toxóides e vacinas; anestésicos locais,tais como anestésicos locais de amido e anestésicos locais deéster; agentes musculoesqueletais, tais como agentesantiinflamatórios antigota, agentes antiinflamatórioscorticosteróides, agentes antiinflamatórios compostos deouro, agentes antiinflamatórios imunossupressores, drogasantiinflamatórias não-esteroidais (DAINEs), agentesantiinflamatórios de salicilato, minerais; e vitaminas, taiscomo a vitamina A, a vitamina B, a vitamina C, a vitamina D,a vitamina Eea vitamina K.As classes preferidas de agentes terapêuticos úteisdas categorias acima incluem: (1) analgésicos em geral, taiscomo a lidocaína ou derivados da mesma e analgésicos dedrogas antiinflamatórias não-esteroidais (DAINEs) , incluindoo diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofeno e naproxeno; (2)analgésicos de agonista do opiato, tais como a codeína,fentanila, hidromorfona e morfina; (3) analgésicos desalicilato, tal como a aspirina (AAS) (AAS revestidoentérico); (4) anti-histaminicos bloqueadores de Hl, taiscomo a clemastina e a terfenadina; (5) agentesantiinfectivos, tal como a mupirocina; (6) antiinfectivosantianaeróbicos, tais como o cloranfenicol e a clindamicina;(7) antiinfectivos antibióticos antifúngicos, tais como aanfotericina b, clotrimazol, fluconazol e cetoconazol; (8)antiinfectivos antibióticos de macrolideo, tais como aazitromicina e a eritromicina; (9) antiinfectivosantibióticos de β -Iactama variados, tais como o aztreonam eo imipenem; (10) antiinfectivos antibióticos de penicilina,tais como a nafcilina, a oxacilina, a penicilina Geapenicilina V; (11) antiinfectivos antibióticos de quinolona,tais como o ciprof loxacino e o norf loxac ino; (12)antiinfectivos antibióticos de tetraciclina, tais como adoxiciclina, minociclina e tetraciclina; (13) antiinfectivosantimicobacterianos antituberculosos tais como isoniazid(INH) e rifampin; (14) antiinfectivos antiprotozoários, taiscomo a atovaquona e a dapsona; (15) antiinfectivosantiprotozoários antimalarianos, tais como a cloroquina e apirimetamina; (16) antiinfectivos anti-retrovirais, tais comoo ritonavir e a zidovudina; (17) agentes antiinfectivosantivirais, tais como o aciclovir, o ganciclovir, o alfa-interferon e a rimantadina; (18) antiinfectivos tópicosantifúngicos, tais como a anfotericina B, clotrimazol,miconazol e nistatina; (19) antiinfectivos tópicosantivirais, tal como o aciclovir; (20) agentes eletrolíticose renais, tal como a lactulose; (21) diuréticos de alça, talcomo a furosemida; (22) diuréticos poupadores de potássio,tal como a trianterena; (23) diuréticos de tiazida, tal comoa hidroclorotiazida (HCTZ); (24) agentes uricosúricos, talcomo o probenecid; (25) enzimas tais como a RNase e a DNase;(26) antieméticos, tal como a proclorperazina; (27) agentesantiinflamatórios gastrointestinais de salicilato, tal como asulfasalazina; (28) agentes antiúlcera inibidores da bomba deácido gástrico, tal como o omeprazol; (29) agentes antiúlcerabloqueadores de H2, tais como a cimetidina, a famotidina, anizatidina e a ranitidina; (30) agentes digestivos, tal comoa pancrelipase; (31) agentes pró-cinéticos, tal como aeritromicina; (32) anestésicos locais de éster, tais como abenzocaina e a procaína; (33) agentes antiinflamatórioscorticosteróides musculoesqueletais, tais como abeclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona,hidrocortisona e prednisona; (34) imunossupressoresantiinflamatórios musculoesqueletais, tais como aazatioprina, ciclofosfamida e metotrexato; (35) drogasantiinflamatórios não-esteroidais (DAINEs)musculoesqueletais, tais como o diclofenaco, ibuprofeno,cetoprofeno, cetorlac e naproxeno; (36) minerais, tais como oferro, cálcio e magnésio; (37) compostos da vitamina B, taiscomo a cianocobalamina (vitamina B12) e a niacina (vitaminaB3); (38) compostos da vitamina C, tal como o ácidoascórbico; e (3 9) compostos da vitamina D, tal como ocalcitriol.

Em determinadas realizações, o agente terapêuticopode ser um fator do crescimento ou uma outra molécula queafete a proliferação e/ou a diferenciação de células. Osfatores do crescimento que induzem estados finais dediferenciação são bem conhecidos no estado da técnica e podemser selecionados de um fator que demonstrou induzir um estadofinal de diferenciação. Os fatores do crescimento para o usonos métodos descritos na presente invenção podem, emdeterminadas realizações, ser variantes ou fragmentos de umfator de crescimento natural. Por exemplo, uma variante podeser gerado ao fazer alterações de aminoácido conservadoras eao testar a variante resultante em um dos ensaios funcionaisdescritos acima ou em um outro ensaio funcional conhecido noestado da técnica. As substituições de aminoácidosconservadoras referem-se à permutabilidade dos resíduos quetêm cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo deaminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas é glicina,alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo deaminoácidos que têm cadeias laterais de hidroxila alifáticasé serina e treonina; um grupo de aminoácidos que têm cadeiaslaterais que contém amida é asparagina e glutamina; um grupode aminoácidos que têm cadeias laterais aromáticas éfenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidosque têm cadeias laterais básicas é lisina, arginina ehistidina; e um grupo de aminoácidos que têm cadeias lateraisque contêm enxofre é cisteína e metionina. Os grupos desubstituição de aminoácidos conservadores preferidos são:valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina- glutamina.

Conforme será apreciado pelos elementos versados natécnica, variantes ou fragmentos de fatores do crescimento depolipeptídeos podem ser gerados empregando técnicasconvencionais, tal como a mutagênese, incluindo a criação demutações(s) de ponto distintas ou por meio de truncamento.

Por exemplo, a mutação pode fazer surgir variantes que retêmsubstancialmente o mesmo subconjunto ou meramente o mesmosubconjunto, da atividade biológica de um fator docrescimento de polipeptídeos a partir do qual foi derivada.3. Métodos para a Preparação de Composições que ContêmNovas Células Tronco Estromais Derivadas de Tecido Adiposo

Os métodos para a preparação das células troncoestromais derivadas de tecido adiposo que compreendem ascomposições que contêm células tronco estromais derivadas detecido adiposo descritas acima também são apresentados. Emuma realização, um método compreende: (a) a coleta do tecidoadiposo de um indivíduo; (b) a obtenção de uma suspensão decélulas pela digestão enzimática; (c) a sedimentação dasuspensão de células e a re-suspensão de células em um meiode cultura; (d) o cultivo das células por pelo menosaproximadamente dez dias; e (g) a expansão das células porpelo menos duas passagens de cultura.

De preferência, as células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo são isoladas de tecido adiposo doindivíduo em que as composições que contêm células troncoestromais derivadas de tecido adiposo finais devem serintroduzidas. No entanto, as células tronco estromais tambémpodem ser isoladas de qualquer organismo da mesma espécie oude espécie diferente da do indivíduo. Qualquer organismo comtecido adiposo pode ser um candidato em potencial. Depreferência, o organismo é mamífero, e com a máximapreferência o organismo é humano.

Em determinadas realizações, as células sãocultivadas por pelo menos aproximadamente quinze dias, pelomenos aproximadamente vinte dias, pelo menos aproximadamente25 dias ou pelo menos aproximadamente trinta dias. Épreferível que as células sejam expandidas na cultura pormais tempo para incrementar a homogeneidade do fenótipo dacélula na população de células.

Em determinadas realizações, as células sãoexpandidas na cultura por pelo menos três passagens decultura ou são "passadas pelo menos três vezes". Em outrasrealizações, as células são passadas pelo menos quatro vezes,pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menossete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes oupelo menos dez vezes. É preferível que as células sejampassadas mais de três vezes para incrementar a homogeneidadedo fenótipo da célula na população de células. Certamente, ascélulas podem ser expandidas na cultura indefinidamentecontanto que a homogeneidade do fenótipo da célula sejaincrementada e a capacidade diferencial seja mantida.

As células podem ser cultivadas por meio dequalquer técnica conhecida no estado da técnica para cultivode células tronco. Uma discussão de várias técnicas decultura, bem como a sua escala ascendente, pode serencontrada em Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: AMmanual of Basic Technique, 4a edição, Wiley-Liss 2000. Emdeterminadas realizações, as células são cultivadas pelacultura de monocamada. Em uma realização, as células sãocultivadas e passadas tal como descrito no Exemplo 1 abaixo.

Qualquer meio com capacidade de suportar célulasestromais na cultura de tecido pode ser utilizado. Asformulações dos meios que suportam o crescimento defibroblastos incluem, mas sem ficar a eles limitadas, o MeioEagle Modificado da Dulbecco (DMEM), Meio Essencial MínimoModificado Alfa (.alpha.MEM) e Meios do Roswell Park MemorialInstitute 1640 (RPMI Meida 1640), e outros ainda.

Tipicamente, 0 a 20% Soro Fetal Bovino (FBS) ou 1-20% de sorode cavalo serão adicionados ao meio acima a fim de suportar ocrescimento de células e/ou condrócitos estromais. Noentanto, um meio definido poderia ser utilizado se os fatoresdo crescimento, as citocinas e os hormônios necessários emFBS para células e condrócitos estromais fossem identificadose fornecidos em concentrações apropriadas no meio decrescimento. Os meios úteis nos métodos da invenção podemconter um ou mais compostos de interesse, incluindo, mas semficar a eles limitados, antibióticos mitogênicos ou compostosdiferenciadores para células estromais. As células irãocrescer em temperaturas entre 31°C a 37°C em uma incubadoraumidifiçada. 0 teor de dióxido de carbono será mantido entre2% a 10%, e o teor de oxigênio entre 1% e 22%. As célulaspodem permanecer neste ambiente por períodos de até quatrosemanas.

Os antibióticos que podem ser suplementados no meioincluem, mas sem ficar a elas limitados, a penicilina e aestreptomicina. A concentração de penicilina no meio decultura quimicamente definido é de aproximadamente 10 aaproximadamente 200 unidades por ml. A concentração deestreptomicina no meio de cultura quimicamente definido é deaproximadamente 10 a aproximadamente 200 ug/ml.

As células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo podem ser estável ou transientemente transfectadas outransduzidas com um ácido nucléicos de interesse utilizandouma estratégia de vetor de plasmídeo, viral ou alternativa.Os ácidos nucléicos de interesse incluem, mas sem ficar aeles limitados, os produtos que codificam genes queintensificam a produção de componentes da matriz extracelularencontrados no tipo de tecido a ser reparado, por exemplo, naparede intestinal ou na parede vaginal.

A transdução de vetores virais que carregam osgenes regulatórios nas células tronco estromais pode serexecutada com vetores virais (adenovírus, retrovírus, vírusadeno-associados ou outros vetores) purificados porbandeamento de cloreto de césio ou outro método em umamultiplicidade de infecções (unidades virais:células) entre10:1 a 2000:1. As células serão expostas ao vírus em um meiolivre de soro ou meio contendo soro na ausência ou napresença de um detergente catiônico tal como apolietilenoimina ou Lipofectamine™ por um período de 1 horaa 24 horas (Byk T. et al (1998) Human Gene Therapy 9: 2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int.64: 45-49).

Outros métodos apropriados para a transferência devetores ou plasmídeos em células tronco incluem complexos delipídio/DNA, tais como aqueles descritos nas Patentes US N0 .5.578.475; 5.627.175; 5.705.308; 5.744.335; 5.976.567;6.020.202; e 6.051.429. Os reagentes apropriados incluem alipofectamina, uma formulação de lipossomo de 3:1 (peso/peso)de lipidio policatiônico de 2,3-dioleilóxi-N-[2(esperminocarbox-amido)etil]-N,N-dimetil-1-trifluoroacetato de propanamínio (DOSPA) (nome no ChemicalAbstracts Registry: N-[2-(2,5-bis[(3-aminopropil)amino]-1-oxpentil}amino, etil]-N,N-dimetil-2,3-bis(9-octadeceniloxi) -1-trifluoroacetato de propanamínio e fosfatidiletanolamina dedioleoíla de lipidio neutro (DOPE) em água com membranafiltrada. Uma formulação exemplificadora é Lipofectamine2000™ (disponível junto à Gibco/Life Technologies #11668019). Outros reagentes incluem: FuGENE™ 6 TransfectionReagent (uma mistura de lipídios na forma não-lipossomal eoutros compostos em 80% de etanol, que podem ser obtidosjunto à Roche Diagnostics Corp. # 1814443); e LipoTAXI™Transfection Reagent (uma formulação de lipidio da InvitrogenCorp., # 204110) . A transfecção de células tronco pode serexecutada por meio de eletroporação, por exemplo, tal comodescrito em M.L. Roach e J.D. McNeish (2000) Methods in Mol.Biol. 185:1. Os sistemas de vetores virais apropriados para aprodução de células tronco com alterações genéticas estáveispodem ser baseados em adenovírus e retrovírus e podem serpreparados utilizando componentes de vírus comercialmentedisponíveis.

A transfecção de vetores de plasmídeo que carregamgenes regulatórios nas células tronco estromais pode serintroduzida nas células em culturas de monocamada pelo usodos métodos de precipitação de DNA de fosfato de cálcio ou dedetergente catiônico (Lipofectamine™, DOTAP) ou em culturastridimensionais pela incorporação dos vetores de DNA doplasmídeo diretamente no polímero biocompatível (Bonadio J.et al. (1999) Nat. Med. 5: 753-759).

Para o acompanhamento e a detecção das proteínasfuncionais codificadas por estes genes, os vetores virais oude DNA do plasmídeo irão conter um gene do marcadorfacilmente detectável, tal como a proteína verde fluorescenteou a enzima beta-galactosidase, sendo que ambas podem seracompanhadas por meios histoquímicos.

4. Métodos de Tratamento de Fístulas e Feridas

Um outro aspecto da invenção refere-se a um novométodo para o uso de células tronco estromais derivadas detecido adiposo no tratamento de fístulas e feridas. Emrealizações preferidas, as células tronco estromais derivadasde tecido adiposo são derivadas do tecido adiposo doindivíduo a ser tratado. Em outras realizações preferidas, ascélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposocompreendem uma composição que contém células troncoestromais derivadas de tecido adiposo descrita na presenteinvenção. No entanto, outros preparados de células troncoestromais derivadas de tecido adiposo podem ser utilizadosnos métodos descritos na presente invenção, por exemplo, taiscomo aqueles descritos nas Patentes US N°.6.777.231 e6.555.374 e no Pedido de Patente Norte-americano N°.11/065.461 "Identification and Isolation of Multipotent CellsFrom Non-Osteochondral Mesenchymal Tissue", depositado em 25de fevereiro de 2005.

Em uma realização, um método para o tratamento deuma fístula em um indivíduo compreende: (a) o fechamento dofuro interno com uma sutura e (b) a aplicação de pelo menosaproximadamente 10 χ IO6i pelo menos aproximadamente 2 0 χIO6, pelo menos aproximadamente 3 0 χ IO6 ou pelo menosaproximadamente 4 0 χ IO6 células tronco estromais derivadasde tecido adiposo, por exemplo, em uma composição que contémcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo dainvenção, ao furo interno suturado fechado. Em determinadasrealizações, por exemplo, em que a primeira aplicação decélulas é insuficiente, o método pode compreenderadicionalmente: (c) a aplicação de uma segunda dose de pelomenos aproximadamente 2 0 χ IO6 células, pelo menosaproximadamente 3 0 χ IO6 ou pelo menos aproximadamente 4 0 χIO6 células tronco estromais derivadas de tecido adiposo, porexemplo, em uma composição que contém células troncoestromais derivadas de tecido adiposo da invenção, ao furointerno suturado fechado.

Em uma outra realização, a composição que contémcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposoutilizada no método é aquela em que pelo menosaproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelomenos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%,pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente90%, pelo menos aproximadamente 95% ou de preferência pelomenos aproximadamente 96%, 97%, 98% ou 99% das células troncoexpressam os marcadores CD9, CDlO, CD13. CD29, CD44, CD4 9A,CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e/ou CD105.

Em uma outra realização, a composição que contémcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposoutilizada no método é uma em que pelo menos aproximadamente50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menosaproximadamente 7 0%, pelo menos aproximadamente 8 0%, pelomenos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%,pelo menos aproximadamente 95% ou de preferência pelo menosaproximadamente 96%, 97%, 98% ou 99% das células troncoexpressam os marcadores C-Kit, vimentina e/ou CD90.

Os métodos comuns de administração das células dapresente invenção aos indivíduos, particularmente aindivíduos humanos, alguns dos quais são descritos emdetalhes na presente invenção, incluem a injeção ou oimplante das células em locais alvo nos indivíduos, sendo queas células da invenção podem ser introduzidas em umdispositivo de aplicação que facilite a introdução porinjeção ou implante das células nos indivíduos. Taisdispositivos de aplicação incluem tubos, por exemplo,cateteres, para injetar células e fluidos no corpo de umindivíduo receptor. Em uma realização preferida, os tubos têmadicionalmente uma agulha, por exemplo, uma seringa, atravésda qual as células da invenção podem ser introduzidas noindivíduo em um local desejado. As células da invenção podemser introduzidas em tal dispositivo de aplicação, porexemplo, uma seringa, em formas diferentes. Por exemplo, ascélulas podem ser suspensas em uma solução ou serincorporadas em uma matriz de suporte quando contidas em taldispositivo de aplicação. Os veículos e diluentesfarmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluçõesde tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. 0 usode tais veículos e diluentes é bem conhecido no estado datécnica. A solução é de preferência estéril e fluida até aoponto em que haja uma fácil capacidade de aplicação comseringa. De preferência, a solução é estável sob as condiçõesde manufatura e de armazenagem e é protegida contra a açãocontaminante de microorganismos tais como as bactérias e osfungos através do uso, por exemplo, de parabenos,clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e outrosainda. As soluções da invenção podem ser preparadas mediantea incorporação das células progenitoras tal como descrito napresente invenção em um veículo ou diluente farmaceuticamenteaceitável e, como necessário, outros ingredientes enumeradosacima, seguida pela esterilização por filtração.

Em outras realizações, um método para o tratamentode uma fistula em um indivíduo compreende: (a) o fechamentodo furo interno com uma sutura que compreende células troncoestromais derivadas de tecido adiposo, por exemplo, de umacomposição que contém células tronco estromais derivadas detecido adiposo em questão. Tais suturas revestidas comcélulas nas composições que contêm células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo em questão são descritas emdetalhe no Pedido de Patente Norte-americano N° . 11/056.241,depositado em 14 de fevereiro de 2005, o qual é incorporadona presente invenção a título de referência.

Os métodos podem, em algumas realizações,compreender adicionalmente: (d) a raspagem profunda de pelomenos uma trilha da fistula e (e) o preenchimento da ditatrilha de fistula com um material. Em determinadasrealizações, o método pode compreender adicionalmente aaplicação de pelo menos aproximadamente 10 χ IO6 célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo, por exemplo, deuma composição celular em questão, ao material. Depreferência, o material é um polímero ou um adesivo à base defibrina, tal como a cola ou o gel de fibrina. Em determinadasrealizações, a dose de pelo menos aproximadamente 10 χ IO6células tronco estromais derivadas de tecido adiposo já éenglobada dentro do material, por exemplo, de modo que omaterial compreenda uma composição que contém células troncoderivadas de tecido adiposo.

Em uma realização adicional, um método para otratamento de uma fistula em um indivíduo compreende:

(i) a raspagem profunda de pelo menos uma trilha dafistula,

(ii) o fechamento do furo interno da trilha raspadacom uma sutura,

(iii) a aplicação de pelo menos aproximadamente 10χ IO6i pelo menos aproximadamente 20 χ 10^6, pelo menosaproximadamente 30 χ 10^6 ou pelo menos aproximadamente 40 χ10^6 células tronco estromais derivadas de tecido adiposo aofuro interno suturado fechado,

por exemplo, em uma composição que contém células troncoestromais derivadas de tecido adiposo da invenção.

Em determinadas realizações, por exemplo, em que aprimeira aplicação de células é insuficiente, o método podecompreender adicionalmente:

(iv) a aplicação de uma segunda dose de pelo menosaproximadamente 20 χ de 10^6 células, pelo menosaproximadamente 30 χ 10^6 ou pelo menos aproximadamente 40 χ10^6 células tronco estromais derivadas de tecido adiposo aofuro interno suturado fechado,

A etapa (i) é realizada de preferência pelaraspagem profunda de todas as trilhas da fistula a seremtratadas, por exemplo, uma agulha de curetagem é introduzidano trato da fistula e um sangramento induzido é produzido aoraspar as paredes da fistula a fim de se obter a fibrinanatural que preencherá o trato da fistula. Estudos clínicosrecentes feitos pelos autores da presente invenção sugeremque a fibrina natural produzida por este método de raspagem éuma opção preferida comparada com o uso de vedadores defibrina artificiais; portanto, em uma realização preferida dométodo da invenção, os tratos fistulares a serem tratados nãosão preenchidos com tal material.

A etapa (iv) é realizada de preferência através daaplicação local das células, por exemplo, uma composição quecontém células tronco estromais derivadas de tecido adiposo,pela injeção nas paredes da fístula ao longo do trato dafístula. Por exemplo, duas injeções de 10 milhões de célulasao longo de 3 cm do trato da fístula.

Os métodos da invenção não podem ser utilizadospara o tratamento de qualquer fístula, incluindo mas semqualquer limitação, a fístula anorretal ou fístula no ânus oufístula fecal, a fístula arteriovenosa ou fístula A-V, afístula biliar, a fístula cervical, a fístula do craniosinus,a fístula enteroenteral, a fístula enterocutânea, a fístulaenterovaginal, a fístula gástrica, a fístula metroperitonealde perilinfa, a fístula arteriovenosa pulmonar, a fístularetovaginal, a fístula umbilical, a fístula traqueoesofageale a fístula vesicovaginal. De preferência, os métodos podemser utilizados para o tratamento de fístulas intestinais, porexemplo, aquelas que conectam o intestino a ele mesmo ou a umoutro órgão, tais como a fístula retovaginal, a fístulaenteroenteral, a fístula enterocutânea e a fístulaenterovaginal. Em uma outra realização preferida, os métodospodem ser utilizados para o tratamento de fístulas vaginaisou uterinas, por exemplo, aquelas que conectam a vagina ou oútero a ele mesmo ou a um outro órgão, tais como a fístulacervical, a fístula retovaginal, a fístula enterovaginal e afístula vesicovaginal.

A fístula pode ser acessada para o reparo cirúrgicoatravés de qualquer método conhecido no estado da técnica,por exemplo, através de incisão, de cateter, etc.

Em uma outra realização, um método para otratamento de uma ferida em um indivíduo compreende: (a) ofechamento da ferida com uma sutura e (b) a aplicação de pelomenos aproximadamente 10 χ IO6, pelo menos aproximadamente 20χ IO6, pelo menos aproximadamente 3 0 χ IO6 ou pelo menosaproximadamente 4 0 χ IO6 células tronco estromais derivadasde tecido adiposo, por exemplo, em uma composição que contémcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo, àferida suturada fechada. Em determinadas realizações, porexemplo, em que a primeira aplicação de células éinsuficiente, o método pode compreender adicionalmente: (c) aaplicação de uma segunda dose de pelo menos aproximadamente20 χ IO6 células, pelo menos aproximadamente 30 χ IO6 ou pelomenos aproximadamente 4 0 χ IO6 células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo, por exemplo, em uma composiçãoque contém células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo, à ferida suturada fechada. Em outras realizações, aferida pode ser preenchida com uma composição que contémcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo dainvenção, por exemplo, uma dose de pelo menos aproximadamente10 χ IO6 células tronco estromais derivadas de tecido adipososão abrangidas dentro de um material, por exemplo, de modoque o material compreenda a composição celular, em que omaterial é, por exemplo, um adesivo ou uma cola. Em outrasrealizações, um método para o tratamento de uma ferida em umindivíduo compreende: (a) o fechamento da ferida com umasutura que compreende as células tronco estromais derivadasde tecido adiposo, por exemplo, de uma composição que contémcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo. Taissuturas revestidas com as células das composições que contêmcélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo emquestão são descritas em detalhe acima e no Pedido de Patente

Norte-americano N°. 11/056.241, depositado em 14 de fevereirode 2 005, o qual é incorporado na presente invenção a títulode referência.

Os métodos descritos acima podem compreenderadicionalmente a administração de um agente terapêutico aoindivíduo que está sendo tratado, por exemplo, sistemicamenteou localmente no sítio da sutura. Em determinadasrealizações, as células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo são formuladas em uma composição que contém célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo que contém umagente terapêutico, tal como descrito acima. Em outrasrealizações, o agente terapêutico é administradoseparadamente, por exemplo, simultaneamente com os métodos,antes que o método seja executado ou após a execução dométodo. Em algumas realizações, o agente terapêutico éadministrado ao indivíduo antes, durante e após a execuçãodos métodos no indivíduo. Os agentes terapêuticosexemplificadores são descritos acima. Em realizaçõespreferidas, os agentes terapêuticos para o tratamento do malde Crohn são administrados ao indivíduo. Os agentesterapêuticos exemplificadores do mal de Crohn são agentesantiinflamatórios tais como os agentes que compreendem amesalamina, agentes imunossupressores tais como a 6-mercaptopurina e azatioprina; agentes biológicos tais como oinfliximab (Remicade®), antibióticos e agentes antidiarréicostais como o difenoxilato, a loperamida e a codeína.

Nas realizações em que são empregadas célulastronco alogênicas, um tratamento de suporte pode serrequerido. Por exemplo, os imunossupressores podem seradministrados antes, durante e/ou após o tratamento para aprevenção de GVHD, de acordo com os métodos conhecidos noestado da técnica. Antes da administração, as células tambémpodem ser modificadas para suprimir uma reação imunológica doindivíduo às células, ou vice-versa, de acordo com os métodosconhecidos no estado da técnica.

A dosagem de qualquer agente terapêutico irá variardependendo dos sintomas, da idade e do peso corpóreo dopaciente, da natureza e da gravidade do distúrbio a sertratado ou impedido, da via de administração e da forma doagente. Qualquer uma das formulações em questão pode seradministrada em uma dose única ou em doses divididas. Asdosagens para os agentes terapêuticos podem ser facilmentedeterminadas pelas técnicas conhecidas pelos elementosversados na técnica ou conforme mostrado na presenteinvenção. Além disso, misturas de mais de um agenteterapêutico podem ser administradas, ou agentes terapêuticosmúltiplos podem ser administrados em composições separadas.

Os agentes terapêuticos podem ser administradosoralmente, parenteralmente, por meio de inalação em spray,topicamente, retalmente, nasalmente, bucalmente,vaginalmente, ou através de um reservatório implantado. 0termo parenteral, tal como empregado na presente invenção,inclui as técnicas de injeção ou infusão subcutânea,intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular,intra-esternal, intratecal, intralesional e intracranial.

O tempo exato de administração e a quantidade dequalquer agente particular que irá resultar no tratamentomais eficaz em um dado paciente vai depender da atividade, dafarmacocinética e da biodisponibilidade de um compostoparticular, da condição fisiológica do paciente (incluindoidade, sexo, tipo e estágio da doença, da condição físicageral, resposta a uma dada dosagem e tipo de medicação), davia de administração, e outros ainda. As diretrizesapresentadas na presente invenção podem ser utilizadas paraotimizar o tratamento, por exemplo, ao determinar aquantidade e/ou o tempo de administração mais favoráveis, oque irá requerer experimentação não mais do que rotineira queconsiste no monitoramento do indivíduo e no ajuste da dosageme/ou do tempo.

Quando o indivíduo está sendo tratado, a saúde dopaciente pode ser monitorada pela medição de um ou mais dosteores relevantes em horas predeterminadas durante um períodode 24 horas. O tratamento, incluindo o suplemento, asquantidades, os tempos de administração e a formulação, podeser otimizado de acordo com os resultados de tal monitoração.

0 paciente pode ser periodicamente reavaliado para determinara extensão da melhoria pela medição dos mesmos parâmetros,sendo que a primeira reavaliação ocorre tipicamente ao finalde quatro semanas do início da terapia e as reavaliaçõessubseqüentes ocorrem a cada quatro a oito semanas durante aterapia e então a cada três meses depois disso. A terapiapode continuar por diversos meses ou mesmo anos, sendo umperíodo típico de um mínimo um mês de terapia para sereshumanos. Os ajustes para a(s) quantidade(s) do agenteadministrado e possivelmente para o tempo de administraçãopodem ser feitos com base nessas reavaliações.

0 tratamento pode ser iniciado com dosagens menoresque são menos do que a dose mais favorável do composto.

Depois disso, a dosagem pode ser aumentada por incrementospequenos até que o efeito terapêutico mais favorável sejaatingido.

0 uso combinado de diversos agentes terapêuticospode reduzir a dosagem requerida para qualquer componenteindividual porque o início e a duração do efeito decomponentes diferentes podem ser complementares. Em talterapia combinada, os agentes ativos diferentes podem seraplicados em conjunto ou separadamente, e simultaneamente ouem horas diferentes do dia.

A toxicidade e a eficácia terapêutica dos compostosem questão podem ser determinadas por meio de procedimentosfarmacêuticos padrão em culturas de células ou em animaisexperimentais, por exemplo, para a determinação de LD50 eED50. As composições que exibem teores terapêuticos elevadossão as preferidas. Embora os compostos que exibem efeitoscolaterais tóxicos possam ser usados, deve ser tomado cuidadopara projetar um sistema de aplicação que alveje os agentesao local desejado a fim de reduzir os efeitos colaterais.Os dados obtidos dos ensaios de cultura de célulase estudos animais podem ser utilizados na formulação de umafaixa de dosagem para o uso em seres humanos. A dosagem dequalquer agente terapêutico ou alternativamente de quaisquercomponentes no mesmo, fica de preferência compreendida dentrode uma faixa de concentrações circulantes que incluem ED50com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentrodessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da viade administração utilizada. Para agentes da presenteinvenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimadainicialmente a partir dos ensaios de cultura de células. Umadose pode ser formulada nos modelos animais para atingir umafaixa de concentração circulante de plasma que inclui IC50(isto é, a concentração de composto de teste que atinge umainibição máxima média de sintomas) tal como determinado nacultura de células. Tais informações podem ser utilizadaspara determinar com mais exatidão as doses úteis nos sereshumanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo,pela cromatografia líquida de alto desempenho.

5. Kits

Em outras realizações, a invenção contempla kitsque incluem as composições que contêm células troncoestromais derivadas de tecido adiposo e opcionalmente asinstruções para o seu uso. Os kits farmacêuticos quecompreendem as composições e os biomateriais da presenteinvenção também estão dentro do âmbito da invenção. Oscomponentes do kit podem ser acondicionados para a práticamanual ou parcial ou completamente automatizada dos métodosantecedentes. Tais kits podem ter uma variedade de usos,incluindo, por exemplo, terapia, reparo, preparação debiomateriais e outras aplicações.

Exemplificação

A invenção que agora está sendo descrita de maneirageral será compreendida mais facilmente com referência aosseguintes exemplos, que são incluídos meramente parafinalidades ilustrativas de determinados aspectos erealizações da presente invenção e não se prestam a limitar ainvenção.

Exemplo 1: Preparação de Células Tronco a Partir deLipoaspirados com Homogeneidade Incrementada

O tecido adiposo foi obtido por lipoaspiração, sobanestesia local e sedação geral. Uma cânula com a ponta semcorte oca foi introduzida no espaço subcutâneo através de umaincisão pequena (menos de 0,5 cm de diâmetro). Com sucçãodelicada, a cânula foi movida através do compartimento daparede abdominal do tecido adiposo para o rompimento mecânicodo tecido adiposo. Uma solução salina e epinefrinavasoconstritora foram injetadas no compartimento do tecidoadiposo para minimizar a perda sangüínea. Dessa maneira, 80 a100 ml de lipoaspirado bruto foram obtidos de cada paciente aser tratado.

0 lipoaspirado bruto foi lavado extensivamente comsolução salina tamponada com fosfato estéril (PBS; Gibco BRL,Paisley, Escócia, Reino Unido) para remover as célulassangüíneas, a solução salina e o anestésico local. A matrizextracelular foi digerida com uma solução de colagenase tipoII (0,075%; Gibco BRL) na solução salina equilibrada (5mg/ml; Sigma, St. Louis, EUA) por trinta minutos a 370C paraliberar a fração celular. Em seguida, a colagenase foiinativada pela adição de um volume igual do Meio EagleModificado da Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) que continha 10% desoro fetal de bovino (FBS; Gibco BRL). A suspensão de célulasfoi centrifugada em 250 χ g por dez minutos. As células foramnovamente suspensas em 0,16 M de NH4Cl e colocadas em repousopor dez minutos à temperatura ambiente (RT) para a Iise doseritrócitos. A mistura foi centrifugada em 250 χ g e ascélulas foram novamente suspensas em DMEM mais 10% de FBS emistura de 1% de ampicilina/estreptomicina (Gibco, BRL) eforam então chapeadas em pratos de cultura de tecido de 100mm em uma concentração de 10-30 χ IO3 células/cm2.

As células foram cultivadas por 24 horas a 370C emuma atmosfera de 5% de CO2 no ar. Os pratos foram entãolavados com PBS para remover as células não-aderentes e osfragmentos de células. As células foram mantidas na culturano mesmo meio e sob as mesmas condições até que alcançaram aafluência de aproximadamente 8 0%, com substituição do meio decultura a cada três a quatro dias. As células foram entãopassadas com tripsina-EDTA (Gibco BRL) em uma diluição de 1:3que corresponde a uma densidade de células de aproximadamente5-6 χ IO3 células/cm2. Para o transplante, foram utilizadascélulas entre as passagens 1 e 3, sendo que as células forampassadas mais de duas vezes a fim de isolar preferivelmenteuma população de células com homogeneidade elevada. Acaracterização de células foi executada utilizando célulasnas passagens 1 a 9.

Exemplo 2: Caracterização de Células Tronco a Partir deLipoaspirados com Homogeneidade Incrementada

Para caracterizar as células por tingimento porimunofluorescência, as células foram chapeadas em densidadebaixa em DMEM mais 10% de FBS em lamínulas de vidro em placasde 24 cavidades. Para estudos de imunohistoquímica, ascélulas foram lavadas com PBS e fixadas em acetona por dezminutos a -20°C. Para o tingimento da a-actina, as célulasforam fixadas em 4% de paraformaldeído por dez minutos à RT.

Após a obstrução com um PBS que continha 4% de soro de cabrae 0,1% de Triton X-IOO, as células foram incubadas a 40C atéa manhã seguinte com os anticorpos primários versus osseguintes marcadores de células nas diluições indicadas [(i)alfa-actina; Dako, Glostrup, Dinamarca; 1/50; (ii) vimentina;Sigma, St. Louis, EUA; 1/200; (iii) CD 90; CYMBUS,Biotechnology Ltd, Chandlers Ford, Hants, Reino Unido; 1/50;(iv) Fator VIII; Dako; 1/100; (v) CD 34; Chemicon, Ca, EUA;1/100; (vi) C-Kit; Chemicon; 1/100; (vii) desmina; Dako;1/100; (viii) citoqueratina; Dako; 1/100 e (ix) S-IOO; Dako;1/50]. Em seguida, as células foram incubadas com afluoresceína apropriada dos anticorpos secundários deisotiocianato conjugado (FITC) ou cloreto de isotiocianato detetrametilrodamina conjugado (TRITC) (Sigma; 1/50) por 45minutos à RT. Para controles negativos, foram omitidos osanticorpos primários. Os núcleos foram contratingidos com41,6-diamidino-2-fenil indol (DAPI). As células foram entãomontadas em Mobiglow (MoBiTec, Gottingen, Alemanha) e foramobservadas com um microscópio de epifluorescência EclipseTE300 (Nikon, Tóquio, Japão). Em cada caso, foramdeterminados os números de células imunopositivas em camposdiferentes e comparados aos números de núcleos tingidos. Oscampos aleatoriamente selecionados foram exportados para umcomputador (Macintosh G3; Apple Computer Ink., Cupertino, CA,EUA) através de uma câmera Spotl (Diagnostic InstrumentsInc., Tampa, FL, EUA). As células de músculo liso aórticashumanas, as células endoteliais de veia umbilical humana(HUVEC) e os fibroblastos sinoviais humanos foram utilizadoscomo controles positivos para imunotingimento com váriosanticorpos.

Na passagem 1, uma porcentagem elevada (90-95%) decélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposoexpressou a vimentina, um marcador de células citoesqueletaismesenquimais (FIGURA 1). A expressão de vimentina foi mantidano mesmo nível até e incluindo a passagem 9. Os níveis deoutros marcadores caíram, no entanto, com o tempo. Porexemplo, a a-actina, que foi encontrado em 17% das célulasderivadas de LPA na passagem 1 não foi mais detectável napassagem 7. O marcador de células endoteliais, fator de vonWillebrandt (Fator VIII) e CD34, que também é encontrado nasuperfície de células endoteliais, foi detectado somente naspassagens 1 a 3 (7% e 12% de células imunopositivas,respectivamente). Em contraste, a expressão de C-Kit (CD117), um marcador da proliferação de células, aumentou com opassar do tempo, com 99% de células imunopositivas a partirda passagem 4 em diante (FIGURA 2) . 0 marcador defibroblastos CD90, foi inicialmente expresso emaproximadamente 8 0% das células derivadas de LPA, foiencontrado em 99% das células a partir da passagem 6 (FIGURA3). Nenhuma expressão do marcador neuroectodermal SlOO ou domarcador ectodermal queratina foi observada em nenhuma dascélulas derivadas de LPA a qualquer momento. A mudança nosmarcadores observados como o número de aumentos das passagensindica um aumento na homogeneidade do preparado de célulasobtido.

Para quantificar o crescimento de células, ascélulas foram chapeadas em placas de 24 cavidades em umaconcentração de 5 χ IO3 células/cm2. Depois que as célulastinham se unido ao substrato (3 h) , o meio de cultura foisubstituído por DMEM suplementado com 1% de antibióticos mais0,5%, 2%, 5% ou 10% de FBS. Como controles positivos paratestar cada grupo de soro, os fibroblastos sinoviais humanostambém foram cultivados, e as suas taxas de crescimento foramdeterminadas. 0 meio foi substituído a cada dois dias. Emintervalos de 24 horas, as células foram fixadas com 1% deglutaraldeído e o número de células por cavidade foideterminado, após o tingimento nuclear com violeta decristal, monitorando a absorbância em 595 nm. Uma curvapadrão foi construída para estabelecer a relação entre onúmero de células por cavidade e a absorbância em 595 nm (r2 = 0,99).As células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo viáveis foram isoladas com sucesso e cultivadas detodos os sete lipoaspirados (LPAs). Essas células cresceramna cultura e foram passadas em intervalos de sete a dez dias.

Em alguns casos, as células foram criopreservadas edescongeladas antes do implante. A taxa de crescimento dascélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo (ADSC)dependeu da concentração de soro, uma com proliferação máximaentre 5% e 10% de FBS (FIGURA 4) . 0 tempo de duplicação-população média nestas concentrações de soro era de 37,6 ±0,6 horas, que não diferiu significativamente do tempo deduplicação-população dos fibroblastos sinoviais humanoscultivados sob as mesmas condições (35,6 ± 1,4 horas; ρ >0,05; T-teste; resultados de três experiênciasindependentes).

A fim de analisar as células de uma maneira maispadronizada e menos subjetiva, as células também foramsubmetidas à análise do Classificador de Células Ativado porFluorescência (FACS). De modo geral, a análise da citometriade fluxo permite a detecção de antígenos de superfície pelosanticorpos, que estão direta (covalentemente) ouindiretamente (anticorpo etiquetado fluorescente secundário)ligados a um marcador fluorescente. Por outro lado, a análiseimunohistoquímica acima descrita requereu a permeabilizaçãodas células e um tingimento subseqüente com anticorpos. Dessemodo, esta última requer um protocolo individualmenteotimizado dependendo da proteína e do anticorpo alvo. Alémdisso, devido à permeabilização da membrana celular, não épossível distinguir entre as proteínas internas (não ligadasã membrana) e do marcador extracelular. Isto é, com umaanálise imunohistoquímica é possível saber se um marcador deproteína está sendo expresso, mas não é possível distinguirse ele está sendo expresso na superfície da célula ou dentroda célula.

O protocolo usado na imunocitometria para adetecção dos antígenos de superfície é padronizado e requersomente controles negativos apropriados. Além disso, aanálise de FACS permite uma avaliação da porcentagem decélulas positivas (células que expressam o antígeno desuperfície) e o nível da expressão (poucos ou muitosantígenos de superfície em uma célula). Essas avaliações sãosomente de natureza subjetiva utilizando imunohistoquímica epodem variar da experiência à experiência, o que não ocorrecom a análise de FACS.

Tal caracterização imunofenotípica das células podeser executada em células recentemente isoladas e apósperíodos de culturas, por exemplo, no dia 7, após quatrosemanas e após três meses de cultura. A análise dosmarcadores de superfície em tempos diferentes permite aavaliação da homogeneidade do fenótipo durante o cultivo. Osexemplos desta análise e os dados que demonstram o fenótipoobtido das amostras obtidas de três doadores saudáveis dezero a três meses de cultivo são descritos de modo abrangenteno Pedido de Patente Norte-americano N°. 11/065.461,depositado em 25 de fevereiro de 2005, o qual é incorporadona presente invenção a título de referência.

Após o isolamento pelo método acima descrito, ascélulas tronco estromais derivadas de tecido adiposo de umdos pacientes foram caracterizadas em função dapresença/ausência de uma série de marcadores de superfície.Para fazer isso, a expressão dos seguintes marcadores desuperfície foi monitorada pela citometria de fluxo:

Integrina: CDlIb, CDl8, CD2 9, CD4 9a, CD4 9b, CD4 9d,CD4 9e, CD4 9 f, CD51, CD61, CD104.

Marcadores hematopoiéticos: CD3, CD9, CD10, CD13,CDl6, CD14, CDl9, CD28, CD34, CD38, CD45, CD90, CD133,glicoforina.

Receptores do fator do crescimento: CD105, NGFR.

Receptores de matriz extracelular: CD15, CD31,CD44, CD50, CDSA, CD62E, CD62L, CD62P, CD102, CD106, CD146,CDl66.

Outros: CD3 6, CD55, CD56, CD58, CD59, CD95, HLA-I,HLA-II, p2-microglobulina.

As células a serem caracterizadas foram coletadaspor meio da digestão delicada com tripsina, lavadas com PBS eincubadas por trinta minutos a 4 °C com os marcadores doanticorpo etiquetados de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina(PE) versus cada um dos marcadores de superfície a seremanalisados. Os marcadores de células foram lavados eanalisados imediatamente utilizando o citômetro Epics-XL(Coulter). Como controles, foram utilizadas células tingidascom os anticorpos não-específicos dos isótoposcorrespondentes etiquetados com FITC ou PE.

A partir da análise do perfil da expressão dosmarcadores de superfície (Figura 7A/7B), os critériosutilizados para determinar quais marcadores definem apopulação de células e permitem que seja identificada ediferenciada com respeito a outros tipos de células eram osseguintes:

1. Descartar os marcadores que variam de umaamostra a outra ou com o tempo durante o cultivo naexperimentação feita com as células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo de doadores saudáveis no Pedidode Patente Norte-americano, depositado em 25 de fevereiro de2005, o qual incorporado na presente invenção a título dereferência.

2. Selecionar os marcadores como uma função de suarelevância biológica, rejeitando os marcadorescaracterísticos de tipos específicos de células (por exemplo,CD3 é um marcador exclusivo aos linfócitos).

Aplicando estes critérios, a população de célulastronco multipotente é caracterizada como sendo positiva paraCD9+, CDlO+, CD13+, CD29+, CD44+, CD49A+, CD51+, CD54+,CD55+, CD58+, CD59+, CD90+ e CD105+; e como não tendo aexpressão de CDllb, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45,CD4 9f, CDl02, CD104, CD106 e CD133.

Exemplo 3: Preparados de Células Tronco que Compreendem Colade Fibrina para o Uso no Tratamento de Fistulas

Para o uso clínico, as células tal como preparadasacima podem ser utilizadas após três ou poucas passagens(FIGURA 3) , mas são utilizadas de preferência após duas oumais passagens tal como descrito acima para resultar em umpreparado de células com homogeneidade mais elevada. Asculturas de células para o uso clínico foram tripsinizadaspor três minutos a 37°C. A tripsinização foi interrompidapela adição de DMEM mais FBS e a suspensão foi centrifugadaem 110 χ g por cinco minutos. As células foram lavadas em PBSe a suspensão foi centrifugada outra vez em 150 χ g por cincominutos. As células foram novamente suspensas entre 3 e 30 χ10^6 células/ml em 1 a 2 ml da solução de lactato de Ringer eforam colocadas em uma seringa apropriada. A albumina de sorohumano (HSA) pode opcionalmente ser adicionada à solução delactato de Ringer.

Em determinados casos, metade das células foinovamente suspensa no componente trombina de um kit de colade fibrina (Tissucol® Duo 2.0; Baxter, Madri, Espanha) antesda combinação dos dois componentes do kit, em uma tentativade incrementar a obturação dos tratos das fístulas. O uso dacola de fibrina para preencher uma abertura de fístula éconhecido no estado da técnica; no entanto, não é eficientecomo um tratamento autônomo para fístula. A adição da cola defibrina às composições que contêm células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo descrita na presente invençãoserve para reter localmente as células e foi observado que ascélulas crescem bem dentro das colas e géis de fibrina.

Exemplo 4: Procedimento Cirúrgico Incrementado para o Reparode Fistulas Usando Preparações de Células Tronco a Partir deLipoaspirados

Uma experimentação clinica de fase I foi realizada,projetada para testar a praticabilidade e segurança dotransplante de células tronco autólogas utilizando ascomposições que contêm células tronco estromais derivadas detecido adiposo descritas acima para o tratamento de flstulasde Crohn. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética eExperimentação Clinica do Hospital La Paz em 12 de abril de2002 e um formulário de consentimento informado detalhado foigerado para ser assinado pelos pacientes. 0 Comitê de Éticafoi informado sobre o progresso do estudo durante toda aexperimentação clinica.

Métodos

Os pacientes foram selecionados de acordo com osseguintes critérios de inclusão: mais de 18 anos de idade;diagnóstico de mal de Crohn pelo menos cinco anos antes daexperimentação; presença de uma ou mais flstulas de Crohncomplexas (fistula enterocutânea, fistula supra-esfincterianae/ou retovaginal) que não haviam respondido ao tratamentomédico e tinham sido tratadas em vão por cirurgia clássicapelo menos duas vezes; e o acordo em participar, com aassinatura no formulário de consentimento informado. Oscritérios de exclusão eram tal como segue: Falha emsatisfazer os critérios de inclusão; deficiência mental;magreza extrema; alergia a anestésicos locais; diagnósticoprévio de câncer e AIDS.

Cinco pacientes (n°. 001-005) foram registrados noestudo. Havia três homens e duas mulheres, e a idade médiaera de 35,1 ± 2,4 anos (faixa: 31,2 a 3 7,5 anos). Noveimplantes de células foram executados: três em fístulasretovaginais; cinco em fístulas enterocutâneas (quatrofístulas diferentes em um paciente; e um em uma fístulaperianal supra-esfincteriana. Todas as fístulasenterocutâneas tinham baixo fluxo - menos de 50característica por dia - e eram situadas na parede abdominal(Tabela 1). Nenhum paciente foi tratado com a NutriçãoParenteral Total, Remicaid ou Octreotride simultaneamente comeste procedimento. Os pacientes 001 e 002 requereram doisprocedimentos de lipoaspiração porque, após a primeiralipoaspiração, nenhuma célula tronco sobreviveu àcriopreservação.

Um paciente foi excluído devido à contaminaçãobacteriana das células cultivadas. Nove fístulas foraminoculadas em quatro pacientes com células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo autólogas (ADSC) na passagem trêsou anterior. Oito fístulas inoculadas foram acompanhadassemanalmente por pelo menos oito semanas. Em seis fístulas, aabertura externa foi coberta com epitélio no fim da semana 8e, desse modo, essas fístulas foram consideradas curadas(75%). Em outras duas fístulas, havia somente um fechamentoincompleto da abertura externa, com uma diminuição no fluxode saída (não-curadas: 25%). Nenhum efeito adverso foiobservado em qualquer paciente no final do período deacompanhamento (pelo menos seis meses e não mais de doisanos).

No caso de fístulas enterocutânea, todas as trilhasforam raspadas profundamente. No caso de fístulasretovaginais, foi utilizada uma abordagem vaginal, comremoção da parede vaginal posterior. A abertura foi separadacompletamente e a abertura retal foi fechada com 3/0 depontos absorvíveis. A mucosa retal havia sido danificada pelomal de Crohn e estava extremamente frágil. No caso defístulas perianais, o núcleo da trilha principal foi retiradoe o furo retal foi fechado com 3/0 de pontos absorvíveisatravés da mucosa esclerótica.

Utilizando uma agulha, no caso de fístulaenterocutânea, células foram injetadas na parede da trilha.No caso de fístulas retovaginais e perianais, células foraminjetadas na mucosa retal, perto da abertura internasuturada. Em todos os casos, foi observada uma bolhapreenchida com fluido na área da injeção após a injeção(FIGURA 5). O número de células injetadas variou de 3 a 30 χ10^6, dependendo do crescimento das células cultivadas (FIGURA 3).

O tempo do início da preparação do inóculo ao fimda injeção foi de menos de 90 minutos em todos os casos. Nocaso de fístulas enterocutâneas, as trilhas foram preenchidascom cola de fibrina e a pele foi então suturada. No caso defístulas retovaginais, um retalho vaginal de avanço foiconstruído. Quando as trilhas acessórias foram detectadas,também foram preenchidas com a cola de fibrina.

Nenhuma bandagem foi aplicada após a operação. Aingestão de líquidos foi iniciada doze horas após oprocedimento, e alimentos sólidos seis horas mais tarde. Um atrês dias após a cirurgia, o paciente recebeu alta e visitasde acompanhamento foram programadas na clínica ambulatorial.

Duas amostras histopatológicas foram obtidas. Umespécime (paciente número 002) foi obtido da área de umafístula enterocutânea (sete meses após o implante #2 e dezdias após o implante #3). 0 outro espécime (paciente número001) foi obtido da parede retovaginal, um ano depois doprimeiro implante, (implante #1) , durante o procedimentocirúrgico associado com o implante #6. Os espécimes foramincorporados na parafina, seccionados, tingidos comhematoxilina e eosina, e avaliados.

0 acompanhamento semanal foi programado por oitosemanas após a cirurgia. Os pacientes foram consideradoscurados quando uma epitelização total da abertura externa eraevidente após oito semanas, independentemente de observaçõesprévias. Após oito semanas, houve um acompanhamento mensalpor pelo menos seis meses e não mais de dois anos.

Resultados

Cinco pacientes foram incluídos no estudo e setelipoaspirações foram executadas (FIGURA 3). 0 paciente número003 foi eliminado da experimentação durante o procedimento deimplante em conseqüência da descoberta de contaminação porbactérias Gram-positivas das células lipoaspiradascultivadas. As bactérias foram identificadas como Oerkoviaxanthineolytica. Uma fístula enterocutânea no paciente 002foi eliminada do estudo por causa de cirurgia abdominal deemergência para uma nova fístula enterovesicular que haviaresultado em sepse aguda. A laparotomia exigiu a ressecção daárea de implante. Portanto, não foi possível a adesão àprogramação mínima de oito semanas de acompanhamento nestecaso.

Nove fístulas de quatro pacientes foram inoculadascom as ADSCs após três ou poucas passagens (FIGURA 3) . Oitofístulas foram consideradas apropriadas para retenção noestudo e foram acompanhadas por pelo menos oito semanas(FIGURA 3). Em seis fístulas, a abertura externa tinha sidoepitelizada na semana 8 e essas fístulas foram consideradascuradas (75%) (FIGURA 6). As outras duas tiveram somente umfechamento incompleto da abertura externa, com uma diminuiçãono fluxo de saída, tal como relatado pelos pacientes (25%:não-curados; FIGURA 3). Não havia nenhuma relação diretaentre o número de células injetadas e o tempo de cultura e osucesso do procedimento. Também não havia nenhuma relaçãodireta entre o sexo ou a idade do paciente e a cicatrização.

Estudos subseqüentes indicaram que uma dose inicial de 20 χIO6 células é apropriada. Foi determinado que uma segundadose de 40 χ IO6 células poderia ser utilizada caso aprimeira dose falhasse. Doses de células mais elevadas sãopreferidas, uma vez que foi observado que números maiselevados de células têm um efeito terapêutico melhor noreparo de tecido.

Procedimentos cirúrgicos e de implante foramexecutados sem dificuldade técnica adicional em todas as novefístulas tratadas. Nenhuma reação adversa imediata (porexemplo, anafilaxia, reações alérgicas) foi observada emnenhum dos casos estudados.

Duas amostras histopatológicas foram obtidas setemeses (fístula enterocutânea) e um ano (fistula retovaginal)após a cirurgia. Nenhuma transformação citológica foidetectada em uma série completa de seções histopatológicas.

Discussão

Em um relatório precedente, foi descrito otratamento à base de células bem-sucedido de uma mulher jovemcom uma fístula retovaginal recorrente que não respondia aotratamento médico. Desse modo, a presente experimentaçãoclínica de fase I foi planejada para avaliar apraticabilidade e a segurança de tal transplante de célulastronco estromais autólogas derivadas de tecido adiposo (comincrementos no protocolo original) para o tratamento defístulas de Crohn não-responsivas, bem como para testar o usode células tronco estromais derivadas de tecido adiposoconjuntamente com uma cola de fibrina.

Tecido adiposo foi escolhido como a fonte decélulas tronco por causa de sua capacidade para adiferenciação miogênica e pelo fato de que as fístulasrespondem bem aos transplantes de músculo. Além disso,gordura de lipoaspiração está disponível em grandesquantidades e pode ser colhida com efeitos adversos mínimosao paciente. Outros grupos utilizaram células troncoderivadas da medula óssea; nesses casos, um procedimento demobilização celular é requerido, o qual pode ser perigoso aalguns pacientes, tais como aqueles com infarto do miocárdio.Em nosso estudo, todos os procedimentos de lipoaspiraçãoresultaram em um número de células clinicamente útil comcaracterísticas de células tronco.

Os pacientes nesse caso foram acompanhados deacordo com o programa programado e a sua cicatrizaçãocompleta foi observada em seis de oito procedimentos. Éimportante observar que o mal de Crohn fornece as piorescondições para uma abordagem cirúrgica de fístulas por causada fragilidade do tecido e dos grandes problemas associadoscom a cicatrização nestes pacientes. Os pacientes nesse casoforam escolhidos porque não tinham respondido ao tratamentomédico e a pelo menos dois procedimentos cirúrgicosprecedentes, mas o tratamento nesse caso pareceu sercompletamente eficaz. Não obstante, novos surtos de mal deCrohn ainda podem produzir novas fístulas em qualquerpaciente que necessitasse ser novamente tratado utilizandocélulas autõlogas criopreservadas desse paciente.

O mecanismo biológico que fundamenta o sucessoterapêutico do transplante de ADSCs é desconhecido. Ascélulas tronco podem se diferenciar em tecido conectivo,muscular ou de cicatriz. Alternativamente, a secreção defatores do crescimento pelas células tronco pode facilitar acicatrização de feridas. Foi observado um tecido típico decicatriz nas fístulas histopatologicamente examinadas, masnão existe nenhuma maneira para distinguir as célulastransplantadas das células de tecido conectivo locais. Acicatrização completa foi observada em 75% dos casosutilizando o presente tratamento.

Referências

A prática da presente invenção empregará, a menosque esteja indicado de alguma outra maneira, técnicasconvencionais de biologia das células, cultura de células,biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNArecombinante, e imunologia, que estão dentro do estado datécnica. Tais técnicas são explicadas integralmente naliteratura. Consultar, por exemplo, Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd Ed., ed. por Sambrook, Fritsch andManiatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNACloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed. , 1985);Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis etal. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription AndTranslation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); CultureOf Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987);Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, APractical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise,Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods InEnzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayerand Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook OfExperimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C.Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Todas as publicações e patentes aqui mencionadas,incluindo os artigos listados a seguir, são aqui incorporadasa título de referência em sua totalidade tal como se cadapublicação ou patente individual fosse indicada específica eindividualmente para ser incorporada a título de referência.No caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquerdefinições, irá prevalecer.

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A presente invenção apresenta, entre outras coisas,métodos e composições para o tratamento e a prevenção defístulas. Embora realizações especificas da presente invençãotenham sido discutidas, a especificação acima é ilustrativa enão restritiva. Muitas variações da invenção tornar-se-ãoaparentes aos elementos versados na técnica com a revisão dopresente relatório descritivo. As reivindicações em anexo nãose prestam a reivindicar todas tais realizações e variações,e o âmbito completo da invenção deve ser determinado por meiode referência às reivindicações, juntamente com o seu âmbitocompleto dos equivalentes, e o relatório descritivo,juntamente com tais variações.

Claims

1. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, caracterizada pelo fato de quepelo menos aproximadamente 50% das células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo que compreendem a composiçãoexpressam os marcadores CD9, CDlO, CDl3. CD2 9, CD44, CD4 9A,CD51, CD54, CD55, CD58, CD59 CD90 e CD105.

2. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que pelo menos aproximadamente 85%das células tronco estromais derivadas de tecido adiposo quecompreendem a composição expressam os marcadores CD9, CDlO7CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59 CD90 eCD105.

3. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que pelo menos aproximadamente 95%das células tronco estromais derivadas de tecido adiposo quecompreendem a composição expressam os marcadores CD9, CDlO,CDl3, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59 CD90 eCDl05.

4. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que pelo menos aproximadamente 99%das células tronco estromais derivadas de tecido adiposo quecompreendem a composição expressam os marcadores CD9, CD10,CD13, CD29, CD44, CD4 9A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59 CD90 eCDl05.

5. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que menos do que aproximadamente 5% das células tronco estromais derivadas de tecido adiposoque compreendem a composição expressam os marcadores CD34CDllb, CD14, CDl5, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102,CDlO4, CDlO6 e/ou CD133.

6. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente umasolução de Ringer e HSA.

7. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a concentração das célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo que compreendema composição é de pelo menos aproximadamente 10 χ IO6células/ml.

8. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a concentração das célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo que compreendema composição é de pelo menos aproximadamente 20 χ IO6células/ml.

9. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente umadesivo.

10. COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAISDERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que o dito adesivo é uma cola defibrina ou um gel.

11. SUPORTE, caracterizado pelo fato decompreender uma composição contendo células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo de acordo com a reivindicação 1.

12. SUPORTE, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o dito suporte é uma sutura.

13. SUPORTE, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o dito suporte é um remendo.

14. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃOCONTENDO CÉLULAS TRONCO ESTROMAIS DERIVADAS DE TECIDOADIPOSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender: (a) a coleta do tecido adiposo de umindivíduo; (b) a obtenção de uma suspensão de células pormeio de digestão enzimática; (c) a sedimentação da suspensãode células e a resuspensão das células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo em um meio de cultura; (d) ocultivo das células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo por pelo menos aproximadamente dez dias; e (g) apassagem das células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo pelo menos duas vezes.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que as células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo são cultivadas por pelo menosvinte dias.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de compreender a passagem das célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo pelo menos trêsvezes.

17. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM ADESIVO PARA 0REPARO DE FÍSTULAS, caracterizado pelo fato de compreender asuspensão de uma composição contendo células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo de acordo com a reivindicação 1com um polímero à base de fibrina.

18 . MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM FÍSTULA EM UMINDIVÍDUO, caracterizado pelo fato de compreender: (a) ofechamento do furo interno com uma sutura e (b) a aplicaçãode pelo menos aproximadamente 10 χ 10^6 células troncoestromais derivadas de tecido adiposo ao furo internosuturado fechado.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que as células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo compreendem uma composiçãocontendo células tronco estromais derivadas de tecido adiposode acordo com a reivindicação 1.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente: (d) araspagem profunda de pelo menos uma trilha de fístula; (e) opreenchimento da dita trilha de fistula com um adesivo.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente: (f) aaplicação de pelo menos aproximadamente 10 χ IO6 célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo ao adesivo.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o dito adesivo é uma cola defibrina ou um gel.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o dito adesivo compreendeadicionalmente uma composição contendo células troncoestromais derivadas de tecido adiposo de acordo com areivindicação 1.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito método compreendeadicionalmente: (c) a aplicação de uma segunda dose de pelomenos aproximadamente 20 χ IO6 células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito método compreende aaplicação de pelo menos aproximadamente 20 χ IO6 célulastronco estromais derivadas de tecido adiposo.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que o dito método compreendeadicionalmente: (c) a aplicação de uma segunda dose de pelomenos aproximadamente 4 0 χ IO6 células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que as células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo são derivadas do tecido adiposodo indivíduo.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a fístula é uma fístulaanoretal, enteroenteral, enterocutânea, retovaginal ouvesicovaginal.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente aadministrando de um agente terapêutico ao dito indivíduo.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o dito agente terapêutico éadministrado localmente ao furo interno suturado fechado.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que o dito agente terapêutico éadministrado sistemicamente ao dito indivíduo.

32. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA FERIDA EM UMINDIVÍDUO, caracterizado pelo fato de compreender: (a) ofechamento da ferida com uma sutura e (b) a aplicação de pelomenos aproximadamente 10 χ IO6 células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo à ferida suturada fechada.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que as células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo compreendem uma composiçãocelular de acordo com a reivindicação 1.

34. CÉLULA TRONCO ESTROMAL DERIVADA DE TECIDOADIPOSO, caracterizada pelo fato de expressar os marcadoresc-Kit, vimentina e CD90 e não expressar os marcadores CD34,fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100 e queratina.

35. CÉLULA TRONCO ESTROMAL DERIVADA DE TECIDOADIPOSO, caracterizada pelo fato de expressar os marcadoresCD9, CD10, CDl3, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58,CD59 CD90 e CD105 e não expressar os marcadores CD34, CDllb,CD14, CDl5, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104,CD106 e/ou CD133.

36. USO DE CÉLULAS TRONCO ESTROMAIS DERIVADAS DETECIDO ADIPOSO, caracterizado pelo fato de servir namanufatura de uma composição farmacêutica para o tratamentode fístulas em um indivíduo.

37. USO7 de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que as ditas células troncoestromais derivadas de tecido adiposo são derivadas do tecidoadiposo do indivíduo a ser tratado.

38. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que as ditas células troncoestromais derivadas de tecido adiposo compreendem umacomposição contendo células tronco estromais derivadas detecido adiposo tal como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, 34 ou 35.

39. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêuticacompreende pelo menos aproximadamente 10 χ IO6 células troncoestromais derivadas de tecido adiposo.

40. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêuticaé aplicada como uma primeira dose ao furo interno fechado dotrato da fístula após o fechamento do furo interno com umasutura.

41. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêuticaé aplicada como uma primeira dose a um ou mais sítios nasparedes do trato da fístula após o fechamento do furo internodo trato da fístula com uma sutura.

42. USO, de acordo com a reivindicação 40 ou 41,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêuticacompreende pelo menos aproximadamente 10 χ IO6 células troncoestromais derivadas de tecido adiposo.

43. USO, de acordo com a reivindicação 40 ou 41,caracterizado pelo fato de que uma segunda dose da ditacomposição farmacêutica é aplicada ao furo interno suturadofechado ou um ou mais sítios nas paredes do trato da fístulaapós a dita primeira dose da dita composição farmacêutica.

44. USO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que a segunda dose da ditacomposição farmacêutica compreende pelo menos aproximadamente-20 χ IO6 células tronco estromais derivadas de tecidoadiposo.

45. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que as ditas células troncoestromais derivadas de tecido adiposo são compreendidas emuma sutura.

46. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que as ditas células troncoestromais derivadas de tecido adiposo são aplicadas a ummaterial para o preenchimento de uma trilha da fístula.

47. USO, de acordo com a reivindicação 46,caracterizado pelo fato de que o dito material é um polímeroà base de fibrina ou um adesivo, tal como uma cola de fibrinaou um gel.

48. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a fístula é uma fístulaanoretal, fístula no ânus, fístula fecal, fístulaarteriovenosa, fístula biliar, fístula cervical, fístula docraniosinus, fístula enteroenteral, fístula enterocutânea,fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístulametroperitoneal de perilinfa, fístula arteriovenosa pulmonar,fístula retovaginal, fístula umbilical, fístulatraqueoesofageal ou fístula vesicovaginal.

49. USO, de acordo com a reivindicação 48,caracterizado pelo fato de que a fístula é uma fístulaanoretal, enteroretal, enterocutânea, retovaginal ouvesicovaginal.

50. USO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêuticaé administrada em combinação com um agente terapêutico aoindivíduo que está sendo tratado.

51. USO, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado pelo fato de que o dito agente terapêutico éadministrado sistêmica ou localmente no sítio de sutura.

52. USO, de acordo com a reivindicação 51,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêuticacompreende o dito agente terapêutico.

53. USO, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado pelo fato de que o dito agente terapêutico éadministrado separadamente com respeito ã dita composiçãofarmacêutica que compreende as ditas células tronco estromaisderivadas de tecido adiposo.

54. USO, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado pelo fato de que o dito agente terapêutico é umagente anti-inflamatório, um agente imunosupressor, um agentebiológico, um antibiótico ou um agente antidiarréico.

55. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA FÍSTULA EM UMINDIVÍDUO, caracterizado pelo fato de compreender as etapasde:(i) raspagem profunda de pelo menos uma trilha dafístula,(ii) fechamento do furo interno da trilha raspadacom uma sutura,(iii) aplicação de pelo menos aproximadamente 10 χ10^6 células tronco estromais derivadas de tecido adiposo aofuro interno suturado fechado.