ES2880349T3 - Uso de células madre estromales derivadas del tejido adiposo en el tratamiento de la fístula - Google Patents

Uso de células madre estromales derivadas del tejido adiposo en el tratamiento de la fístula Download PDF

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Castro Rosa Ana Garcia
Arranz Mariano Garcia
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende células madre estromales derivadas de tejido adiposo, para su uso en el tratamiento de una fístula en un sujeto, en la que el tratamiento comprende administrar al menos 30 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo al sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de células madre estromales derivadas del tejido adiposo en el tratamiento de la fístula
Antecedentes de la invención
[0001] En general, una fístula es una conexión anormal o paso entre los órganos o vasos, que normalmente no se conectan. Las fístulas pueden desarrollarse en varias partes del cuerpo. Por ejemplo, los tipos de fístulas, nombradas por las áreas del cuerpo en las que ocurren, incluyen fístula anorrectal o fístula anal o fístula fecal (entre el recto u otra área anorrectal y la superficie de la piel), fístula arteriovenosa o fístula A-V (entre una arteria y una vena), fístula biliar (entre los conductos biliares y la superficie de la piel, a menudo causada por cirugía de la vesícula biliar), fístula cervical (abertura anormal en el cuello uterino), fístula craneosinus (entre el espacio intracraneal y un seno paranasal), fístula enteroenteral (entre dos partes del intestino), fístula enterocutánea (entre el intestino y la superficie de la piel, es decir, del duodeno o del yeyuno o del íleon), fístula enterovaginal (entre el intestino y la vagina), fístula gástrica (entre el estómago a la superficie de la piel), fístula metroperitoneal (entre el útero y la cavidad peritoneal), fístula perilinfa (un desgarro entre las membranas entre el oído medio e interno), fístula arteriovenosa pulmonar (entre es una arteria y una vena de los pulmones, lo que da lugar a una derivación de sangre), fístula rectovaginal (entre el recto y la vagina), fístula umbilical (entre el ombligo y el intestino), fístula traqueoesofágica (entre la respiración y las sondas de alimentación) y vesicovaginal fístula (entre la vejiga y la vagina). Las causas de las fístulas incluyen traumatismos, complicaciones del tratamiento médico y enfermedades.
[0002] El tratamiento de las fístulas varía según la causa y la extensión de la fístula, pero generalmente implica una intervención quirúrgica. Se utilizan con frecuencia varios procedimientos quirúrgicos, más comúnmente la fistulotomía, la colocación de un setón (un cordón que se pasa a través del camino de la fístula para mantenerlo abierto para el drenaje) o un procedimiento de colgajo endorrectal (donde se tira de tejido sano sobre el lado interno de la fístula para evitar que las heces u otro material reinfecten el canal). La cirugía para las fístulas anorrectales no está exenta de efectos secundarios, que incluyen recurrencia, reinfección e incontinencia.
[0003] García-Olmo et al. (Diseases of the Colon & Rectum, 2005, 48 (7), 1416-1423) describe los resultados de un ensayo clínico de fase I del tratamiento de la fístula de Crohn mediante un autotrasplante de células madre mesenquimales adiposas adiposas.
[0004] García-Olmo et al. (International Journal of Colorrectal Disease, 2003, 18 (5), 451-454) describe el trasplante autólogo de células madre mesenquimales adiposas para el tratamiento de la fístula rectovaginal en la enfermedad de Crohn perianal.
[0005] Lendeckel et al. (Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery, 2004, 32: 370-373) describe el uso de células madre autólogas derivadas de tejido adiposo para tratar defectos traumáticos del calvario generalizados.0678
[0006] Las enfermedades inflamatorias intestinales, tales como enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son las principales causas de fístulas anorrectal, enteroenteral, y enterocutánea. La incidencia notificada de fístula en la enfermedad de Crohn varía del 17% al 50%. El manejo de las fístulas en pacientes con enfermedad de Crohn continúa presentando un problema extremadamente desafiante ya que muchas de estas fístulas no responden a los tratamientos disponibles. Estas fístulas y su recurrencia son una complicación muy angustiosa que reduce significativamente la calidad de vida de los pacientes afectados. Las mejoras recientes en el tratamiento médico (por ejemplo, el tratamiento con Infliximab®) y el manejo quirúrgico experto han disminuido la necesidad de una cirugía complicada. Sin embargo, muchos pacientes no se curan. La falta de cicatrización de las fístulas se debe probablemente a la calidad subóptima de los tejidos que se han visto afectados por la enfermedad de Crohn. De hecho, las fístulas de Crohn proporcionan un sistema modelo para la cicatrización de heridas en algunas de las peores condiciones posibles. Otra causa principal de fístula es el traumatismo, por ejemplo, por violación o por lesiones sufridas durante el parto, en los tejidos de la vagina y la vejiga y/o el recto que conducen a fístula rectovaginal y fístula vesicovaginal. Cada año, aproximadamente 100.000 mujeres en todo el mundo en desarrollo sufren este tipo de fístulas (también conocidas como fístulas obstétricas) durante el trabajo de parto obstruido. Durante el trabajo de parto obstruido, la presión de la cabeza del bebé contra la pelvis de la madre corta el suministro de sangre a los tejidos delicados de la región. El tejido muerto desaparece y la mujer queda con una fístula vesicovaginal y, a veces, una fístula rectovaginal. Este agujero produce incontinencia permanente de orina y/o heces. El Fondo de Población de las Naciones Unidas (UNFPA) estima que la población mundial de pacientes con fístula obstétrica asciende a más de dos millones. Este cálculo podría ser una subestimación significativa. Las tasas de éxito de la reparación quirúrgica primaria oscilan entre el 88 y el 93 por ciento, pero disminuyen con los intentos sucesivos. Así, un porcentaje significativo de mujeres tiene fístulas obstétricas que no pueden repararse quirúrgicamente.
[0007] Se necesitan nuevas terapias para las fístulas.
Resumen de la invención
[0008] En el presente documento, entre otras cosas, se describen nuevas composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo descritas en el presente documento tienen un fenotipo distinto y exhiben una mayor homogeneidad de fenotipo que las composiciones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo descritas anteriormente, lo que las hace más adecuadas para su uso en el tratamiento de fístulas y heridas que las descritas anteriormente. composiciones. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo se pueden formular con soluciones u otras sustancias para que sirvan como productos farmacéuticos o dispositivos médicos, por ejemplo, como suturas o adhesivos. Además, se describen métodos novedosos para tratar fístulas y heridas utilizando células madre estromales derivadas de tejido adiposo, así como kits para la práctica de las mismas.
[0009] La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende tejido adiposo derivado de células madre estromales, para su uso en el tratamiento de una fístula en un sujeto, en donde el tratamiento comprende suministrar al sujeto al menos 30 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo.
[0010] Estas formas de realización de la presente invención, otras realizaciones y sus rasgos y características serán evidentes a partir de la descripción, dibujos y reivindicaciones que siguen.
Breve descripción de las figuras
[0011]
FIGURA 1 representa los resultados de la caracterización de células aisladas mediante los métodos del Ejemplo 1 mediante tinción por inmunofluorescencia. La frecuencia de células inmunopositivas se indica de la siguiente manera: -, menos del 5%; /-, 6-15%;+, 16-50%; +, 51-85%; y ++, 86-100%. P, número de pasaje.
FIGURA 2 representa la caracterización por inmunofluorescencia indirecta de células madre estromales derivadas de tejido adiposo. Las células del paciente n° 001 se pasaron 6 células después del implante n° 6. El color azul indica núcleos teñidos con DAPI. (A) CD90; (B) c-Kit; y (C) vi mentina.
FIGURA 3 resume los resultados clínicos obtenidos mediante determinados métodos y composiciones. F, mujer; M, hombre; NI, sin implante; NA, No analizado.
FIGURA 4 representa las curvas de crecimiento de células derivadas de lipoaspirado a diferentes concentraciones de FBS (0,5, 2,5 y 10%, como se indica). Se cultivaron fibroblastos sinoviales humanos en presencia de FBS al 5% o al 10%. Los números de células 6SD se muestran en términos de absorbancia a 595 nm. Los datos provienen de un experimento representativo con pozos triplicados.
FIGURA 5 representa la ampolla en la mucosa rectal después de inyectar células cerca de la abertura interna suturada.
FIGURA 6 muestra fotografías de una fístula antes (A) y ocho semanas después (B) de la inyección de células. FIGURA 7A representa histogramas de inmunocitometría de fluorescencia correspondientes al perfil de marcadores de superficie (CD3, CD9, CD1O, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31, CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e y CD49f) obtenidos de células aisladas de muestras de liposucción de un paciente involucrado en el estudio, en el pase 6.
FIGURA 7B muestra histogramas de inmunocitometría de fluorescencia correspondientes al perfil de marcadores de superficie (CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106, CD133, CD166, glicoforina, microglobulina p2, HLA I, HLA II y NGFR) obtenidos a partir de células aisladas a partir de muestras de liposucción de un paciente que participa en el estudio, en el paso 6.
Descripción detallada de la invención
1. Definiciones:
[0012] Como se usa en este documento, los siguientes términos y frases tendrán los significados expuestos a continuación. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
[0013] Los artículos "un" y "una" se refieren a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
[0014] Por "tejido adiposo" se quiere decir cualquier tejido graso. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo marrón o blanco, derivado del tejido adiposo subcutáneo, omental/visceral, mamario, gonadal o de otro tipo. Preferiblemente, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutáneo. Tales células pueden comprender un cultivo celular primario o una línea celular inmortalizada. El tejido adiposo puede ser de cualquier organismo que tenga tejido graso. Preferiblemente, el tejido adiposo es de mamífero, lo más preferiblemente el tejido adiposo es humano. Una fuente conveniente de tejido adiposo es la cirugía de liposucción, sin embargo, la fuente de tejido adiposo o el método de aislamiento del tejido adiposo no es crítico para la invención. Si se desean células estromales para el autotrasplante en un sujeto, el tejido adiposo se aislará de ese sujeto.
[0015] "Células madre estromales derivadas del tejido adiposo" se refiere a células mesenquimales madre que se originan a partir de tejido adiposo.
[0016] El término "adhesivo" se refiere a cualquier sustancia que une o conecta superficies juntas; por ejemplo, un pegamento.
[0017] El término "composición celular' se refiere a una preparación de células, cuya preparación puede incluir, además de las células, componentes no celulares tales como teléfonos medios de cultivo, por ejemplo, proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleótidos, co-enzimas, antioxidantes, metales y similares. Además, la composición celular puede tener componentes que no afecten al crecimiento o la viabilidad del componente celular, pero que se utilizan para proporcionar las células en un formato particular, por ejemplo, como matriz polimérica para encapsulación o preparación farmacéutica.
[0018] El término "cultivo" se refiere a cualquier crecimiento de las células, organismos, entidades multicelulares, o tejidos en un medio. El término "cultivo" se refiere a cualquier método para lograr tal crecimiento y puede comprender múltiples pasos. El término "cultivo adicional" se refiere a cultivar una célula, organismo, entidad multicelular, o tejido a una cierta etapa de crecimiento, a continuación, utilizando otro método de cultivo de traer dichas células, organism, entidad multicelular, o tejido a otra etapa de crecimiento. Un "cultivo celular" se refiere a un crecimiento de células in vitro. En tal cultivo, las células proliferan, pero no se organizan en tejido per se. Un "cultivo de tejidos" se refiere al mantenimiento o crecimiento de tejido, por ejemplo, explantes de órgano primordial o de un órgano adulto in vitro para preservar su arquitectura y función. Un "cultivo en monocapa" se refiere a un cultivo en donde las células se multiplican en un medio adecuado mientras están principalmente unidas entre sí y a un sustrato. Además, un "cultivo en suspensión" se refiere a un cultivo en donde las células se multiplican mientras están suspendidas en un medio adecuado. Asimismo, un "cultivo de flujo continuo" se refiere al cultivo de células o explantes en un flujo continuo de medio fresco para mantener el crecimiento celular, por ejemplo, la viabilidad. El término "medio condicionado" se refiere al sobrenadante, por ejemplo, libre de células/tejido cultivados, que resulta después de un período de tiempo en contacto con las células cultivadas, de modo que el medio ha sido alterado para incluir ciertos factores paracrinos y/o autocrinos producidos por las células y secretadas en el cultivo. Un "cultivo confluente" es un cultivo celular en donde todas las células están en contacto y, por lo tanto, se cubre toda la superficie del recipiente de cultivo, lo que implica que las células también han alcanzado su densidad máxima, aunque la confluencia no significa necesariamente que la división cesará o que la población no aumente de tamaño.
[0019] El término "medio de cultivo" o "medio" se reconoce en la técnica, y generalmente se refiere a cualquier sustancia o preparación usada para el cultivo de células vivas. El término "medio", como se usa en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquidos y medios líquidos que no mantienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos como agar, agarosa, gelatina y matrices de colágeno. Los medios gaseosos ejemplares incluyen la fase gaseosa a la que están expuestas las células que crecen en una placa de Petri u otro soporte sólido o semisólido. El término "medio" también se refiere a material que está destinado a ser utilizado en un cultivo celular, incluso si aún no ha entrado en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla de polvo que cuando se mezcla con agua u otro líquido se vuelve adecuada para el cultivo celular, puede denominarse "medio en polvo". "Medio definido" se refiere a medios que están hechos de componentes químicamente definidos (normalmente purificados). Los "medios definidos" no contienen extractos biológicos mal caracterizados como el extracto de levadura y el caldo de res. "Medio rico" incluye medios que están diseñados para apoyar el crecimiento de la mayoría o todas las formas viables de una especie en particular. Los medios enriquecidos a menudo incluyen extractos biológicos complejos. Un "medio adecuado para el crecimiento de un cultivo de alta densidad" es cualquier medio que permite que un cultivo celular alcance una DO600 de 3 o más cuando otras condiciones (como la temperatura y la tasa de transferencia de oxígeno) permiten dicho crecimiento. El término "medio basal" se refiere a un medio que promueve el crecimiento de muchos tipos de microorganismos que no requieren ningún suplemento nutricional especial. La mayoría de los medios basales generalmente se componen de cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carbohidratos, sales inorgánicas y vitaminas. Un medio basal generalmente sirve como base para un medio más complejo, al que se añaden suplementos tales como suero, tampones, factores de crecimiento, lípidos y similares. Los ejemplos de medios basales incluyen, entre otros, medio basal de Eagles, medio esencial mínimo, medio de Eagle modificado de Dulbecco, medio 199, mezclas de nutrientes Ham's F-10 y Ham's F-12, Mc Coy's 5A, Dulbecco's MEM/F-12, RPMI 1640 y medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM).
[0020] Los términos "comprende" y "que comprende" se utilizan en el sentido inclusivo, abierto, lo que significa que los elementos adicionales pueden ser incluidos.
[0021] El término "diferenciación" se refiere a la formación de células que expresan marcadores conocidos por estar asociados con las células que están más especializadas y más cerca de convertirse en células diferenciadas terminalmente incapaces de mayor división o diferenciación. Por ejemplo, en un contexto pancreático, la diferenciación se puede ver en la producción de grupos de células similares a islotes que contienen una mayor proporción de células betaepiteliales que producen mayores cantidades de insulina. Los términos diferenciación "adicional" o "mayor" se refieren a células que están más especializadas y más cerca de convertirse en células diferenciadas terminalmente incapaces de una división o diferenciación adicional que las células a partir de las cuales se cultivaron. El término "diferenciación final" se refiere a células que se han convertido en células diferenciadas terminalmente incapaces de una división o diferenciación adicional.
[0022] El término "fístula" se refiere a cualquier pasaje anormal o comunicación o de conexión, por lo general entre dos órganos internos o que conducen de un órgano interno a la superficie del cuerpo. Los ejemplos de fístulas incluyen, pero no se limitan a fístula anorrectal o fístula anal o fístula fecal, fístula arteriovenosa o fístula A-V, fístula biliar, fístula cervical, fístula craneosinus, fístula enteroenteral, fístula enterocutánea, fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístula metroperitoneal, fístula perilinfa, fístula arteriovenosa pulmonar, fístula rectovaginal, fístula umbilical, fístula traqueoesofágica y fístula vesicovaginal.
[0023] El término "incluyendo" se usa en el presente documento para significar "incluyendo, pero no limitado a". "Incluyendo" e " incluyendo, pero no limitado a" se usan indistintamente.
[0024] "Marcador" se refiere a una molécula biológica cuya presencia, concentración, actividad, o estado de fosforilación puede ser detectado y utilizado para identificar el fenotipo de una célula.
[0025] Un "parche" es un apósito o revestimiento aplicado a la cubierta o proteger una herida u otro dolor.
[0026] Un "paciente", "sujeto" o "huesped" a ser tratado por el método objeto puede significar un animal no humano o humano.
[0027] La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en este documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del juicio médico, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
[0028] La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente memoria significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un líquido o carga sólida, diluyente, excipiente, o de encapsulación disolvente de material, implicado en llevar o transportar el sujeto compuesto de un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. El término "fenotipo" se refiere a las características observables de una célula, tales como el tamaño, la morfología, la expresión de la proteína, etc.
[0029] El término "célula progenitora" se refiere a una célula que tiene la capacidad de crear la progenie que están más diferenciadas de sí mismo. Por ejemplo, el término puede referirse a una célula indiferenciada o una célula diferenciada en un grado menor a la diferenciación final que es capaz de proliferar y dar lugar a más células progenitoras que tienen la capacidad de generar un gran número de células madre que a su vez pueden dar lugar a a células hijas diferenciadas o diferenciables. En una realización preferida, el término célula progenitora se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, a menudo en diferentes direcciones, por diferenciación, por ejemplo, adquiriendo caracteres completamente individuales, como ocurre en la diversificación progresiva de células y tejidos embrionarios. La diferenciación celular es un proceso complejo que ocurre típicamente a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivar de una célula multipotente que a su vez se deriva de una célula multipotente, y así sucesivamente. Si bien cada una de estas células multipotentes puede considerarse células madre, la gama de tipos de células que puede dar lugar a cada una puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo. Tal capacidad puede ser natural o puede inducirse artificialmente tras el tratamiento con varios factores. Según esta definición, las células madre también pueden ser células progenitoras, así como los precursores más inmediatos de las células diferenciadas terminalmente.
[0030] La "proliferación" se refiere a un aumento en el número de células. "Proliferar" y "proliferación" se refieren a células que experimentan mitosis.
[0031] Tal como se utiliza aquí, el término "solución" incluye un portador farmacéuticamente aceptable o diluyente en donde las células de la invención permanecen viables.
[0032] El término "sustancialmente puro", con respecto a poblaciones de células madre derivadas de tejido adiposo, se refiere a una población de células de células madre derivadas de tejido adiposo que es al menos aproximadamente 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de pureza, con respecto a las células madre estromales derivadas del tejido adiposo que constituyen una población celular total. Refundido, el término "sustancialmente puro" se refiere a una población de células madre estromales derivadas de tejido adiposo de la presente invención que contienen menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente 5%, células comprometidas con linaje en la población original no amplificada y aislada antes de su posterior cultivo y amplificación.
[0033] "Soporte" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier dispositivo o material que pueda servir como base o matriz para el crecimiento de células madre estromales derivadas de tejido adiposo.
[0034] El término "sutura" se refiere a un hilo o fibra o de otro material de sujeción que se puede utilizar para coser una herida.
[0035] El término "tratar" como se usa en este documento se refiere a la reparación de una fístula o herida, así como la prevención de empeoramiento o repetición de fístulas o heridas.
[0036] "Agente terapéutico" o "terapéutico" se refiere a un agente capaz de tener un efecto biológico deseado en un huésped. Los agentes quimioterapéuticos y genotóxicos son ejemplos de agentes terapéuticos que generalmente se sabe que son de origen químico, en oposición a los biológicos, o que causan un efecto terapéutico mediante un mecanismo de acción particular, respectivamente. Los ejemplos de agentes terapéuticos de origen biológico incluyen factores de crecimiento, hormonas y citocinas. Se conocen en la técnica una variedad de agentes terapéuticos y pueden identificarse por sus efectos. Ciertos agentes terapéuticos son capaces de regular la proliferación y diferenciación celular. Los ejemplos incluyen nucleótidos quimioterapéuticos, fármacos, hormonas, proteínas no específicas (no anticuerpos), oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido que se unen a una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ARNm)), péptidos y peptidomiméticos.
[0037] Una "herida" es una lesión o daño al tejido, causada por medios físicos, causando la interrupción de la continuidad normal del tejido.
2. Composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo nuevo
[0038] En un aspecto, la invención se refiere a composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo con ciertas características, tales como un determinado fenotipo. Por ejemplo, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en una composición celular de la invención pueden caracterizarse por la expresión de marcadores de superficie celular, tamaño, consumo de glucosa, producción de lactato y rendimiento/viabilidad celular. Otro aspecto más de la presente invención se refiere a composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo que incluyen, como componente celular, preparaciones sustancialmente puras de células madre estromales derivadas de tejido adiposo que tienen un fenotipo particular, o la progenie de las mismas. Las composiciones de la presente invención que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo incluyen no solo poblaciones sustancialmente puras de las células progenitoras, sino que también pueden incluir componentes de cultivo celular, por ejemplo, medios de cultivo que incluyen aminoácidos, metales, factores de coenzimas, así como poblaciones pequeñas de otras células estromales, por ejemplo, algunas de las cuales pueden surgir por diferenciación posterior de células de la invención. Además, otros componentes no celulares pueden incluir aquellos que hacen que el componente de soporte celular adecuado bajo determinadas circunstancias, por ejemplo, implante, por ejemplo, continuo cultivo, o adecuado para su uso como biomaterial o composición farmacéutica.
[0039] En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo se producen a través de los métodos de cultivo descritos en la Sección 4 y la Ejemplificación.
[0040] En una realización, se proporciona una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, en donde al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% de las células madre expresan marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y/o CD105. En ciertas realizaciones de las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo, menos de aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5% y preferiblemente aproximadamente 4%, 3%, 2% o 1% de las células madre expresan los marcadores CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y/o CD133.
[0041] En otra realización, se proporciona una composición de células madre estromales que contiene derivados de tejido adiposo, en donde al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% de las células madre expresan los marcadores c-Kit, vimentina y/o CD90. En ciertas realizaciones de las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo, menos de aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5% y preferiblemente aproximadamente 4%, 3%, 2% o 1% de las células madre expresan los marcadores CD34, Factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y/o queratina. También se proporciona una población de células madre del estroma derivadas del tejido adiposo que expresa los marcadores c-Kit, vimentina y CD90 y no expresa los marcadores CD34, Factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y queratina.
[0042] La caracterización fenotípica de una población de células por marcadores de la superficie se puede realizar ya sea por tinción individual de las células (citometría de flujo) o mediante cortes histológicos de la población in situ, realizados de acuerdo con métodos normales. La determinación del perfil de expresión de marcadores de superficie por anticuerpos, caracterización inmunofenotípica, puede ser directa, utilizando un anticuerpo marcado o indirecto, utilizando un segundo anticuerpo marcado contra el anticuerpo primario específico del marcador celular, logrando así la amplificación de la señal. Por otro lado, la presencia o ausencia de unión al anticuerpo puede determinarse mediante diferentes métodos que incluyen, pero no se limitan a microscopía de inmunofluorescencia y radiografía. Asimismo, es posible realizar el seguimiento de los niveles de unión del anticuerpo mediante citometría de flujo, técnica que permite correlacionar los niveles de fluorocromo con la cantidad de antígenos presentes en la superficie celular unidos específicamente a los anticuerpos marcados. La expresión diferencial de una serie de marcadores de superficie en una población celular proporciona un método para la identificación y aislamiento de dicha población.
[0043] En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo son suspensiones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo en varias soluciones o materiales, por ejemplo para uso como productos farmacéuticos o biomateriales, como se describe en más detalle a continuación. En una realización, la composición celular comprende una suspensión de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo objeto en solución de Ringer y HSA. En otra realización, la composición celular comprende una suspensión de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo en un material, tal como un polímero, pegamento, gel, etc. Tales suspensiones se pueden preparar, por ejemplo, sedimentando las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en cuestión del medio de cultivo y resuspendiéndolas en la solución o material deseado. Las células pueden ser sedimentadas y/o cambiadas del medio de cultivo, por ejemplo, por centrifugación, filtración, ultrafiltración, etc.
[0044] La concentración de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo objeto en las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden ser de al menos 30 x 106 células/ml, o al menos 40 x 106 células/ml.
[0045] Por consiguiente, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a la progenie de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo en cuestión, por ejemplo, aquellas células que se han derivado de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo. Tal progenie puede incluir generaciones posteriores de células madre estromales derivadas de tejido adiposo, así como células comprometidas con el linaje generadas induciendo la diferenciación de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo objeto después de su aislamiento del explante, por ejemplo, inducidas in vitro. Las células de la progenie se pueden obtener después de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6 , aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 pases de la población parental. Sin embargo, las células de la progenie pueden obtenerse después de cualquier número de pases de la población parental.
[0046] En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo de la invención se proporcionan como parte de una preparación farmacéutica, por ejemplo, una solución estéril, libre de la presencia de virus no deseado, bacterias y otros agentes patógenos, como así como preparación libre de pirógenos. Es decir, para la administración humana, las composiciones objeto deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad así como con los estándares generales de seguridad y pureza requeridos por los estándares de la Oficina de Biológicos de la FDA.
[0047] En ciertas realizaciones, tales composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden usarse para el trasplante en animales, preferiblemente mamíferos, e incluso más preferiblemente seres humanos. La invención usa células que son alogénicas con respecto al hospedador del trasplante. Debido a las dificultades para obtener suficientes células madre autólogas, las células madre estromales derivadas del tejido adiposo de un donante alogénico podrían constituir una valiosa fuente alternativa de células madre para uso terapéutico. Se sabe en la técnica que las células madre estromales de la médula ósea y las células del estroma derivadas del tejido adiposo no provocaron una respuesta de linfocitos alogénicos in vitro y, en consecuencia, las células madre estromales derivadas del tejido adiposo alogénico de un donante podrían usarse teóricamente para cualquier paciente, independientemente de la incompatibilidad del MHC.
[0048] Los métodos para administrar las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo a sujetos, particularmente sujetos humanos, que se describen en detalle en el presente documento, incluyen la inyección o implantación de las células en sitios diana en los sujetos, las células se pueden insertar en un dispositivo de administración que facilita la introducción, inyección o implantación de las células en los sujetos. Dichos dispositivos de administración incluyen tubos, por ejemplo, catéteres, para inyectar células y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una realización preferida, los tubos tienen además una aguja, por ejemplo, una jeringa, a través de la cual las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden introducirse en el sujeto en una ubicación deseada. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo se pueden insertar en un dispositivo de administración de este tipo, por ejemplo, una jeringa, en diferentes formas. Por ejemplo, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo incluyen composiciones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo que se suspenden en una solución o se incrustan en una matriz de soporte cuando están contenidas en tal dispositivo de administración.
[0049] Los vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, soluciones tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales vehículos y diluyentes es bien conocido en la técnica. La solución es preferiblemente estéril y fluida en la medida en que se pueda inyectar fácilmente con jeringa. Preferiblemente, la solución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Las soluciones que son composiciones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo de la invención se pueden preparar incorporando células madre estromales derivadas de tejido adiposo como se describe en este documento en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y, según sea necesario, otros ingredientes enumerados anteriormente, seguido de esterilización por filtración.
[0050] Algunos ejemplos de materiales y soluciones que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13)agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
[0051] En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo además comprenden un adhesivo. En determinadas realizaciones, el adhesivo es un adhesivo a base de fibrina, como un gel de fibrina o pegamento de fibrina o polímero o adhesivo a base de fibrina, u otro adhesivo tisular o pegamento quirúrgico, como, por ejemplo, cianoacrilato, colágeno, trombina y polietilenglicol. Otros materiales que pueden usarse incluyen, entre otros, alginato de calcio, agarosa, tipos I, II, IV u otra isoforma de colágeno, ácido poliláctico/poliglicólico, derivados de hialuronato u otros materiales (Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 305-311; Sechriest VF. Y col. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 534-541; Chu CR y col. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29: 1147-1154; Hendrickson DA y col. (1994) Orthop. Res. 12: 485-497). En otras realizaciones, el adhesivo es un vendaje líquido, en donde las composiciones del método que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo se mezclan con el material líquido del vendaje. Un "vendaje líquido" es una solución que comprende un compuesto, por ejemplo, un material polimérico, que se aplica a una herida con un aerosol o un cepillo, seguido de la eliminación del disolvente por vaporización para proporcionar una película protectora sobre la herida.
[0052] En el presente documento también se describen métodos para preparar composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo que comprenden compuestos o materiales para su uso en la reparación de fístulas o heridas. En el presente documento se describe un método para preparar tales materiales que comprende suspender las células madre estromales derivadas de tejido adiposo de una composición celular en cuestión con el material. En una realización, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo se sedimentan fuera del medio de cultivo y se resuspenden en una cola o gel de fibrina. Las colas y geles de fibrina y otros polímeros y adhesivos basados en fibrina son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, un kit de pegamento de fibrina disponible comercialmente es el Tissucol® Duo 2.0, y otros selladores de fibrina disponibles comercialmente incluyen Crosseal®, TISSEEL VH Fibrin Sealant® y similares.
[0053] Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo de la invención también se pueden utilizar para recubrir un soporte, por ejemplo un dispositivo médico. Por ejemplo, el soporte puede ser una sutura, hilo, dispositivo de reparación de menisco, remache, tachuela, grapa, tornillo, placa ósea, sistema de placas óseas, malla quirúrgica, parche, por ejemplo, un parche de reparación, parche cardiovascular o parche pericárdico, cabestrillo, alfiler ortopédico, barrera de adhesión, stent, dispositivo de regeneración/reparación de tejido guiado, dispositivo de reparación de cartílago articular, guía nerviosa, dispositivo de reparación de tendón, dispositivo de reparación de defecto del tabique auricular, agente de relleno, válvula de vena, andamio de médula ósea, dispositivo de regeneración de menisco, ligamento e injerto de tendón, implante de células oculares, caja de fusión espinal, sustituto de piel, sustituto dural, sustituto de injerto óseo, clavija para huesos, vendaje para heridas, pegamento, polímero o hemostato.
[0054] Los soportes en los que las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo se pueden incorporar o incrustar o sobre los que las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden revestirse, incluidas matrices que son compatibles con el receptor y que se degradan en productos que no son dañinos para el receptor. Las matrices biodegradables naturales y/o sintéticas son ejemplos de tales matrices. Las matrices biodegradables naturales incluyen coágulos de plasma, por ejemplo, derivados de un mamífero, y matrices de colágeno. Las matrices biodegradables sintéticas incluyen polímeros sintéticos tales como polianhídridos, poliortoésteres y ácido poliláctico. En la técnica se conocen otros ejemplos de polímeros sintéticos y métodos para incorporar o incrustar células en estas matrices. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 4.298.002 y la patente de EE.UU. n° 5.308.701. Estas matrices brindan soporte y protección a las células frágiles in vivo.
[0055] El soporte puede recubrirse con células en cualquier forma tal como es conocido para un experto en la técnica, por ejemplo por inmersión, pulverización, pintura, impresión, etc.
[0056] En una realización, el soporte es una sutura, grapa, hilo absorbible, hilo no absorbible, hilo natural, hilo sintético, hilo monofilamento o hilo multifilamento (también llamado trenzado). Los métodos preferidos de preparación de suturas y otros soportes utilizados para cerrar heridas recubiertas con células madre estromales derivadas de tejido adiposo se describen en la publicación de patente EE. UU. n° US2006047312A1 "Biomaterial for Suturing", presentada el 14 de febrero de 2005. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo descritas en este documento representan nuevas composiciones que se pueden usar con los métodos descritos en la publicación de Patente de EE. UU. N° US2006047312A1.
[0057] Además, en cualquiera de composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo, al menos un agente terapéutico se puede incorporar en la composición. Por ejemplo, una composición puede contener un analgésico, para ayudar a tratar la inflamación o el dolor en el sitio de la fístula o herida, o un agente antiinfeccioso para prevenir la infección del sitio tratado con la composición.
[0058] Más específicamente, ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos útiles incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos, como los fármacos antiinflamatorios no esteroides, agonistas de opiáceos y salicilatos; agentes anti-infecciosos, tales como antihelmínticos, antianaerobics, antibióticos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos antifúngicos, antibióticos de cefalosporina, antibióticos macrólidos, diversos antibióticos p-lactámicos, antibióticos de penicilina, antibióticos de quinolona, antibióticos de sulfonamida, antibióticos de tetraciclina, antituberculosis, antimicobacterianos, antipalúdicos, antiprotozoarios, agentes antivirales, agentes antirretrovirales, escabicidas, agentes antiinflamatorios, agentes antiinflamatorios corticosteroides, antipruriginosos/anestésicos locales, antiinfecciosos tópicos, antiinfecciosos tópicos antifúngicos, antiinfecciosos tópicos antivirales; agentes electrolíticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, diuréticos inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos de asa, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos tiazídicos, reemplazos de electrolitos y agentes uricosúricos; enzimas, tales como enzimas pancreáticas y enzimas trombolíticas; agentes gastrointestinales, tales como antidiarreicos, antieméticos, antiinflamatorios gastrointestinales, agentes antiinflamatorios gastrointestinales salicilatos, antiácidos antiulcerosos, antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, agentes antiulcerosos de la mucosa gástrica, agentes antiulcerosos bloqueadores H2, agentes colelitolíticos, digestantes, eméticos, laxantes y ablandadores de heces y agentes procinéticos; anestésicos generales, tales como anestésicos por inhalación, anestésicos por inhalación halogenados, anestésicos intravenosos, anestésicos intravenosos con barbitúricos, anestésicos intravenosos con benzodiazepinas y anestésicos intravenosos agonistas opiáceos; hormonas y modificadores de hormonas, tales como abortivos, agentes suprarrenales, agentes suprarrenales corticosteroides, andrógenos, antiandrógenos, agentes inmunobiológicos, tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides y vacunas; anestésicos locales, tales como anestésicos locales de amida y anestésicos locales de éster; agentes musculoesqueléticos, tales como agentes antiinflamatorios anti-gota, agentes antiinflamatorios corticosteroides, agentes antiinflamatorios compuestos de oro, agentes antiinflamatorios inmunosupresores, antiinflamatorios no esteroideos (AINE), agentes antiinflamatorios de salicilato, minerales; y vitaminas, tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.
[0059] Las clases preferidas de agentes terapéuticos útiles de las categorías anteriores incluyen: (1) analgésicos en general, tales como la lidocaína o derivados de los mismos y analgésicos de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), que incluyen diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno y naproxeno; (2) analgésicos agonistas opiáceos, tales como codeína, fentanilo, hidromorfona y morfina; (3) analgésicos de salicilato, tales como aspirina (ASA) (ASA con recubrimiento entérico); (4) antihistamínicos bloqueadores de H1, tales como clemastina y terfenadina; (5) agentes antiinfecciosos, como mupirocina; (6 ) antiinfecciosos antianaeróbicos, tales como cloranfenicol y clindamicina; (7) antibióticos antiinfecciosos antifúngicos, tales como anfotericina b, clotrimazol, fluconazol y ketoconazol; (8) antibióticos antiinfecciosos macrólidos, tales como azitromicina y eritromicina; (9) diversos antibióticos antiinfecciosos de p-lactama, tales como aztreonam e imipenem; (10) antibióticos antiinfecciosos de penicilina, tales como nafcilina, oxacilina, penicilina G y penicilina V; (11) antibióticos antiinfecciosos de quinolona, tales como ciprofloxacina y norfloxacina; (12) antibióticos antiinfecciosos de tetraciclina, tales como doxiciclina, minociclina y tetraciclina; (13) antiinfecciosos antimicobacterianos antituberculosos tales como isoniazida (INH) y rifampicina; (14) antiinfecciosos antiprotozoarios, tales como atovacuona y dapsona; (15) antiinfecciosos antiprotozoarios antipalúdicos, tales como cloroquina y pirimetamina; (16) antiinfecciosos anti-retrovirales, tales como ritonavir y zidovudina; (17) agentes antiinfecciosos antivirales, tales como aciclovir, ganciclovir, interferón alfa y rimantadina; (18) antiinfecciosos tópicos antifúngicos, tales como anfotericina B, clotrimazol, miconazol y nistatina; (19) antiinfecciosos tópicos antivirales, tales como aciclovir; (20) agentes electrolíticos y renales, como lactulosa; (21) diuréticos de asa, como furosemida; (22) diuréticos ahorradores de potasio, tales como triamtereno; (23) diuréticos tiazídicos, como hidroclorotiazida (HCTZ); (24) agentes uricosúricos, como probenecida, (25) enzimas como RNasa y DNasa; (26) antieméticos, como proclorperazina; (27) agentes antiinflamatorios gastrointestinales de salicilato, tales como sulfasalazina; (28) agentes antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, tales como omeprazol; (29) agentes antiulcerosos bloqueadores de H2, tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidina; (30) digestivos, como pancrelipasa; (31) agentes procinéticos, como eritromicina; (32) anestésicos locales de éster, tales como benzocaína y procaína; (33) agentes antiinflamatorios corticosteroides musculoesqueléticos, tales como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona y prednisona; (34) inmunosupresores antiinflamatorios musculoesqueléticos, tales como azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato; (35) fármacos antiinflamatorios no esteroideos musculoesqueléticos (AINE), como diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, ketorlaco y naproxeno; (36) minerales, como hierro, calcio y magnesio; (37) compuestos de vitamina B, como cianocobalamina (vitamina B12) y niacina (vitamina B3); (38) compuestos de vitamina C, como ácido ascórbico; y (39) compuestos de vitamina D, como calcitriol.
[0060] En ciertas realizaciones, el agente terapéutico puede ser un factor de crecimiento u otra molécula que afecta diferenciación y/o proliferación celular. Los factores de crecimiento que inducen estados de diferenciación final son bien conocidos en la técnica y pueden seleccionarse de cualquier factor que se haya demostrado que induce un estado de diferenciación final. Los factores de crecimiento para su uso en los métodos descritos en el presente documento pueden, en determinadas realizaciones, ser variantes o fragmentos de un factor de crecimiento que ocurre naturalmente. Por ejemplo, se puede generar una variante haciendo cambios conservadores de aminoácidos y probando la variante resultante en uno de los ensayos funcionales descritos anteriormente u otro ensayo funcional conocido en la técnica. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de alifatichidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.
[0061] Como los expertos en la técnica apreciarán, las variantes o fragmentos de factores de crecimiento polipeptídicos pueden ser generados usando técnicas convencionales, tales como mutagénesis, incluyendo la creación mutación puntual discreta, o por truncamiento. Por ejemplo, la mutación puede dar lugar a variantes que retienen sustancialmente la misma, o simplemente un subconjunto, de la actividad biológica de un factor de crecimiento polipeptídico del que se deriva.
3. Método de preparación de composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo
[0062] Los métodos para preparar las células madre estromales derivadas de tejido adiposo que comprenden las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo anteriormente descritas también se describen. En una realización, un método comprende: (a) recolectar tejido adiposo de un sujeto; (b) obtener una suspensión celular por digestión enzimática; (c) sedimentar la suspensión celular y resuspender las células en un medio de cultivo; (d) cultivo de las células durante al menos aproximadamente 10 días; y (g) expandir las células durante al menos dos pases de cultivo.
[0063] Preferiblemente, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo se aíslan del tejido adiposo del sujeto en donde las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo final son para ser introducidas. Sin embargo, las células madre estromales también pueden aislarse de cualquier organismo de la misma especie o de especies diferentes que el sujeto. Cualquier organismo con tejido adiposo puede ser un candidato potencial. Preferiblemente, el organismo es un mamífero, lo más preferiblemente el organismo es un ser humano.
[0064] En ciertas realizaciones, las células se cultivaron durante al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 25 días, o al menos aproximadamente 30 días. Es preferible que las células se expandan en cultivo durante más tiempo para mejorar la homogeneidad del fenotipo celular en la población celular.
[0065] En ciertas realizaciones, las células se expanden en cultivo durante al menos tres pases de cultivo o "pases al menos tres veces." En otras realizaciones, las células se pasan al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, o al menos diez veces. Es preferible que las células se pasen más de tres veces para mejorar la homogeneidad del fenotipo celular en la población celular. De hecho, las células pueden expandirse en cultivo indefinidamente siempre que se mejore la homogeneidad del fenotipo celular y se mantenga la capacidad diferencial.
[0066] Las células pueden cultivarse por cualquier técnica conocida en la técnica para el cultivo de células madre. Se puede encontrar una discusión de varias técnicas de cultivo, así como su ampliación, en Freshney, RI, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a Edición, Wiley-Liss 2000. En ciertas realizaciones, las células se cultivan por cultivo monocapa. En una realización, las células se cultivan y se pasan como se describe en el Ejemplo 1 a continuación.
[0067] Cualquier medio capaz de soportar las células estromales en cultivo de tejidos puede ser utilizado. Las formulaciones de medios que respaldarán el crecimiento de fibroblastos incluyen, entre otras, el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el medio mínimo esencial modificado alfa (.alfa.MEM)y el medio 1640 del Instituto Roswell Park Memorial (RPMI Media 1640) y similares. Típicamente, se añadirá 0 a 20% de suero fetal bovino (FBS) o 1 a 20% de suero de caballo a los medios anteriores para apoyar el crecimiento de células estromales y/o condrocitos. Sin embargo, se podría usar un medio definido si los factores de crecimiento, citocinas y hormonas necesarias en FBS para células estromales y condrocitos se identifican y se proporcionan en concentraciones apropiadas en el medio de crecimiento. Los medios útiles pueden contener uno o más compuestos de interés, incluidos, entre otros, compuestos antibióticos mitogénicos o diferenciadores para células estromales. Las células se cultivarán a temperaturas entre 31°C y 37°C en una incubadora humidificada. El contenido de dióxido de carbono se mantendrá entre el 2% y el 10% y el contenido de oxígeno entre el 1% y el 22%. Las células pueden permanecer en este entorno por períodos de hasta 4 semanas.
[0068] Los antibióticos que pueden complementarse en el medio incluyen, pero no se limitan a penicilina y estreptomicina. La concentración de penicilina en el medio de cultivo químicamente definido es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 unidades por ml. La concentración de estreptomicina en el medio de cultivo químicamente definido es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 pg/ml.
[0069] Las células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden ser estables o transitoriamente transfectadas o transducidas con un ácido nucleico de interés usando un plásmido, viral o estrategia vector alternativo. Los ácidos nucleicos de interés incluyen, pero no se limitan a aquellos que codifican productos génicos que mejoran la producción de componentes de la matriz extracelular que se encuentran en el tipo de tejido que se va a reparar, por ejemplo, pared intestinal o pared vaginal.
[0070] La transducción de vectores virales que portan genes reguladores en las células madre estromales se puede realizar con vectores virales (adenovirus, retrovirus, virus adeno-asociado, u otro vector) purificados por cloruro de cesio de bandas u otro método a una multiplicidad de infección (unidades virales: célula) de entre 10:1 a 2000:1. Las células se expondrán al virus en un medio sin suero o que contenga suero en ausencia o presencia de un detergente catiónico como polietilenimina o Lipofectamine™ durante un período de 1 a 24 horas (Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9: 2493-2502; Sommer B. y col. (1999) Calcif. Tissue Int. 64: 45-49).
[0071] Otros métodos adecuados para la transferencia de vectores o plásmidos en células madre incluyen complejos lípido/ADN, tales como los descritos en la patente de EE. UU. N° 5,578,475; 5,627,175; 5,705,308; 5,744,335; 5,976,567; 6,020,202; y 6,051,429. Los reactivos adecuados incluyen lipofectamina, una formulación de liposomas 3:1 (p/p) del lípido policatiónico Trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminecarbox-amido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA) (Nombre del registro de Chemical Abstracts: trifluoroacetato de N-[2-(2,5-bis[(3-aminopropil)amino]-1-oxpentilamino)etil]-N,N-dimetil-2,3-bis(9-octadeceniloxi)-1-propanamin-io), y el lípido neutro dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada por membrana. Un ejemplo es la formulación Lipofectamine 2000™ (disponible de Gibco/Life Technologies # 11668019). Otros reactivos incluyen: FuGENE™ 6 Transfection Reagent (una mezcla de lípidos en forma no liposomal y otros compuestos en etanol al 80%, obtenible de Roche Diagnostics Corp. # 1814443); y reactivo de transfección LipoTAXI™ (una formulación lipídica de Invitrogen Corp., n° 204110). La transfección de células madre se puede realizar mediante electroporación, por ejemplo, como se describe en M L. Roach y JD McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1. Los sistemas de vectores virales adecuados para producir células madre con alteraciones genéticas estables pueden basarse en adenovirus y retrovirus, y pueden prepararse usando componentes de virus disponibles comercialmente.
[0072] La transfección de vectores de plásmido que lleva los genes reguladores en las células estromales madre se puede introducir en las células en cultivos monocapa mediante el uso de precipitación de ADN con fosfato de calcio o métodos de detergente catiónico (Lipofectamine™ DOTAP) o en tres cultivos dimensionales mediante la incorporación de los vectores de ADN plasmídico directamente en el polímero biocompatible (Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5: 753­ 759).
[0073] Para que el seguimiento y la detección de proteínas funcionales codificadas por estos genes, los vectores de ADN viral o plásmido contendrán un gen marcador fácilmente detectable, tal como la proteína verde fluorescente o una enzima beta-galactosidasa, ambos de los cuales pueden ser rastreados por medios histoquímicos.
4. Métodos de tratamiento de fístulas y heridas
[0074] La invención se refiere a una composición farmacéutica novela que comprende células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso en el tratamiento de fístulas. También se describe en el presente documento un método novedoso para usar células madre estromales derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de heridas. En realizaciones preferidas, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo se derivan del tejido adiposo del sujeto a tratar. En otras realizaciones preferidas, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo comprenden una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo descrita en el presente documento. Sin embargo, se pueden usar otras preparaciones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo en los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, como los descritos en las patentes de EE. u U. Nos 6,777,231 y 6,555,374 y la publicación de patente de EE. Uu . N° 2006047312A1 "Identification and Isolation of Multipotent Cells From Non -Osteochondral Mesenchymal Tissue", presentada el 25 de febrero de 2005.
[0075] En una realización, el tratamiento de una fístula en un sujeto comprende: (a) cerrar el orificio interno con una sutura y (b) suministrar al menos aproximadamente 30 x 106, o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, en una composición de la invención que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, al orificio interno suturado cerrado. En determinadas realizaciones, por ejemplo, en las que la primera administración de células es insuficiente, el método puede comprender además: (c) administrar una segunda dosis de al menos aproximadamente 30 x 106, o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre estromales derivadas del tejido adiposo, p. ej., en una composición de la invención que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, al orificio interno suturado cerrado.
[0076] En otra realización, la composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo utilizadas es una en la que al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% de las células madre expresan marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y/o CD105.
[0077] En otra realización, la composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo utilizada es una en donde al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% de las células madre expresan los marcadores c-Kit, vimentina y/o CD90.
[0078] Los métodos comunes de administración de células a sujetos, particularmente sujetos humanos, algunos de los cuales se describen en detalle en este documento, incluyen la inyección o implantación de las células en sitios diana en los sujetos, las células se pueden insertar en un dispositivo de administración que facilita introducción, inyección o implantación, de las células en los sujetos. Dichos dispositivos de administración incluyen tubos, por ejemplo, catéteres, para inyectar células y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una realización preferida, los tubos tienen además una aguja, por ejemplo, una jeringa, a través de la cual se pueden introducir las células en el sujeto en una ubicación deseada. Las células se pueden insertar en un dispositivo de administración de este tipo, por ejemplo, una jeringa, en diferentes formas. Por ejemplo, las células se pueden suspender en una solución o incrustar en una matriz de soporte cuando están contenidas en un dispositivo de suministro de este tipo. Los vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, soluciones tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales vehículos y diluyentes es bien conocido en la técnica. La solución es preferiblemente estéril y fluida en la medida en que se pueda inyectar fácilmente con jeringa. Preferiblemente, la solución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Las soluciones de la invención se pueden preparar incorporando células progenitoras como se describe en el presente documento en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y, según se requiera, otros ingredientes enumerados anteriormente, seguido de esterilización por filtración.
[0079] En otras realizaciones, el tratamiento de una fístula en un sujeto comprende: (a) cerrar el orificio interno con una sutura que comprende células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, de una composición que contiene células madre estromales derivadas del tejido adiposo objeto. Tales suturas revestidas con células en las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo objeto se describen en detalle en la Publicación de Patente de EE. UU. N° 2006047312A1, presentada el 14 de febrero de 2005.
[0080] El tratamiento puede comprender además: (d) raspado profundo de al menos una pista de la fístula y (e) llenar dicha pista de la fístula con un material. El método puede comprender además suministrar al material al menos 30 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, de una composición celular objeto. Preferiblemente, el material es un polímero o adhesivo a base de fibrina, tal como un pegamento o gel de fibrina. Como se describe en el presente documento, la dosis de al menos 30 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo ya está incluida dentro del material, por ejemplo, de manera que el material comprende la composición que contiene células madre derivadas de tejido adiposo.
[0081] En una realización adicional, la composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una fístula en un sujeto se utiliza en un tratamiento que comprende:
(i) raspado profundo de al menos una pista de fístula
(ii) cierre del orificio interno de la pista de raspado con una sutura
(iii) que suministra al menos aproximadamente 30 x 106 o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo al orificio interno suturado cerrado,
en una composición de la invención que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo.
[0082] En ciertas realizaciones, por ejemplo, en donde la primera administración de células es insuficiente, el tratamiento puede además comprender:
(iv) la administración de una segunda dosis de al menos 30 x 106, o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo al orificio interno suturado cerrado, por ejemplo, en una composición de la invención que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo.
[0083] El paso (i) se realiza preferiblemente raspando profundamente todas las huellas de la fístula a tratar, por ejemplo, se introduce una aguja de legrado en el trayecto de la fístula y se produce un sangrado inducido raspando las paredes de la fístula para obtener fibrina natural que llenará el trayecto de la fístula. Estudios clínicos recientes de los inventores sugieren que la fibrina natural producida por este método de raspado es una opción preferida en comparación con el uso de selladores de fibrina artificiales, por lo tanto, en una realización preferida del método de la invención, los tractos fistulares a tratar no se rellenan con tal material.
[0084] El paso (iv) se lleva a cabo preferiblemente mediante administración local de las células, por ejemplo, una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, mediante inyección en las paredes de la fístula a lo largo del trayecto de la fístula. Por ejemplo, dos inyecciones de 10 millones de células a lo largo de 3 cm del trayecto de la fístula.
[0085] Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden usarse para tratar cualquier fístula, incluyendo pero no limitado a fístula anorrectal o fístula anal o fístula fecal, fístula arteriovenosa o fístula A-V, fístula biliar, fístula cervical, fístula craneosinusal, fístula enteroenteral, fístula enterocutánea, fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístula metroperitoneal, fístula perilinfa, fístula arteriovenosa pulmonar, fístula rectovaginal, fístula umbilical, fístula traqueoesofágica y fístula vesicovaginal. Preferiblemente, los métodos pueden usarse para tratar fístulas intestinales, por ejemplo, aquellas que conectan el intestino consigo mismo o con otro órgano, como fístula rectovaginal, fístula enteroenteral, fístula enterocutánea y fístula enterovaginal. En otra realización preferida, las composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar fístulas vaginales o uterinas, por ejemplo, aquellas que conectan la vagina o el útero consigo mismo o con otro órgano, como fístula cervical, fístula rectovaginal, fístula enterovaginal y fístula vesicovaginal.
[0086] La fístula se puede acceder para la reparación quirúrgica a través de cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, a través de la incisión, catéter, etc.
[0087] Se describe aquí un método de tratamiento de una herida en un sujeto, el cual comprende: (a) el cierre de la herida con una sutura y (b) administrar al menos aproximadamente 10 x 106, al menos aproximadamente 20 x 106, al menos aproximadamente 30 x 106, o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre estromales derivadas del tejido adiposo, por ejemplo, en una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, a la herida suturada cerrada. Como se describe en el presente documento, por ejemplo, cuando la primera administración de células es insuficiente, el método puede comprender además: (c) administrar una segunda dosis de al menos aproximadamente 20 x 106 células, al menos aproximadamente 30 x 106, o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, en una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, a la herida suturada cerrada. Como se describe en el presente documento, la herida puede rellenarse con una composición que contenga células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, una dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo incluidas dentro de un material, por ejemplo, de manera que el material comprende la composición celular, en la que el material es, por ejemplo, un adhesivo o cola. Como se describe en el presente documento, un método para tratar una herida en un sujeto comprende: (a) cerrar la herida con una sutura que comprende células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, de una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo del sujeto. Tales suturas revestidas con células de las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo objeto se describen en detalle anteriormente y en la Publicación de Patente de EE. UU. N° 2006047312A1, presentada el 14 de febrero de 2005.
[0088] Los métodos descritos anteriormente pueden adicionalmente comprender la administración de un agente terapéutico para el sujeto que está siendo tratado, por ejemplo, sistémica o localmente en el sitio de sutura. En determinadas realizaciones, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo se formulan en una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo que contiene un agente terapéutico, como se describió anteriormente. En otras realizaciones, el agente terapéutico se administra por separado, por ejemplo, simultáneamente con los métodos, antes de que se realice el método o después de que se realice el método. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra al sujeto antes, durante y después de que se realicen los métodos en el sujeto. Los agentes terapéuticos ejemplares se describen anteriormente. En realizaciones preferidas, se administran al sujeto agentes terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn. Ejemplos de agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn son agentes antiinflamatorios tales como agentes que comprenden mesalamina, agentes inmunosupresores tales como 6-mercaptopurina y azatioprina; agentes biológicos como infliximab (Remicade®), antibióticos y agentes antidiarreicos como difenoxilato, loperamida y codeína.
[0089] En realizaciones en las que las células madre alogénicas se utilizan, puede ser necesario el tratamiento de apoyo. Por ejemplo, los inmunosupresores pueden administrarse antes, durante y/o después del tratamiento para prevenir la EICH, según métodos conocidos en la técnica. Antes de la administración, las células también pueden modificarse para suprimir una reacción inmune del sujeto a las células o viceversa, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
[0090] La dosificación de cualquier agente terapéutico variará dependiendo de los síntomas, la edad y el peso corporal del paciente, la naturaleza y gravedad del trastorno que va a tratarse o prevenirse, la vía de administración, y la forma del agente. Cualquiera de las formulaciones objeto puede administrarse en una sola dosis o en dosis divididas. Las dosis de los agentes terapéuticos se pueden determinar fácilmente mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica o como se enseña en el presente documento. Además, se pueden administrar mezclas de más de un agente terapéutico, o se pueden administrar múltiples agentes terapéuticos en composiciones separadas.
[0091] Los agentes terapéuticos se pueden administrar oralmente, parenteralmente, mediante pulverización para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, o mediante un depósito implantado. El término parenteral, como se usa en este documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal.
[0092] El tiempo preciso de administración y la cantidad de cualquier agente particular que producirá el tratamiento más efectivo en un paciente dado dependerá de la actividad, farmacocinética y biodisponibilidad de un compuesto particular, la condición fisiológica del paciente (incluyendo edad, sexo, tipo y etapa de la enfermedad, estado físico general, capacidad de respuesta a una dosis dada y tipo de medicación), vía de administración y similares. Las pautas aquí presentadas pueden usarse para optimizar el tratamiento, por ejemplo, determinando el tiempo y/o la cantidad de administración óptimos, lo que no requerirá más que una experimentación rutinaria que consiste en monitorear al sujeto y ajustar la dosis y/o el momento.
[0093] Mientras que el sujeto está siendo tratado, la salud del paciente puede monitorizarse mediante la medición de uno o más de los índices pertinentes en momentos predeterminados durante un periodo de 24 horas. El tratamiento, incluido el suplemento, las cantidades, los tiempos de administración y la formulación, puede optimizarse de acuerdo con los resultados de dicha monitorización. El paciente puede ser reevaluado periódicamente para determinar el grado de mejora midiendo los mismos parámetros, la primera reevaluación de este tipo ocurre típicamente al final de las cuatro semanas desde el inicio de la terapia, y las reevaluaciones posteriores ocurren cada cuatro a ocho semanas durante la terapia y luego cada tres meses después. La terapia puede continuar durante varios meses o incluso años, siendo un mínimo de un mes la duración típica de la terapia para los seres humanos. Se pueden hacer ajustes a la(s) cantidad(es) de agente administrado y posiblemente al momento de la administración basándose en estas reevaluaciones.
[0094] El tratamiento puede ser iniciado con dosificaciones más pequeñas que son menores que la dosis óptima del compuesto. A partir de entonces, la dosis puede aumentarse en pequeños incrementos hasta que se logre el efecto terapéutico óptimo.
[0095] El uso combinado de varios agentes terapéuticos puede reducir la dosis requerida para cualquier componente individual porque el inicio y la duración del efecto de los diferentes componentes pueden ser de cortesía. En tal terapia combinada, los diferentes agentes activos pueden administrarse juntos o por separado, y simultáneamente o en diferentes momentos del día.
[0096] La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos objeto se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 y la DE50. Se prefieren las composiciones que exhiben grandes índices terapéuticos. Aunque se pueden usar compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de administración que dirija los agentes al sitio deseado para reducir los efectos secundarios.
[0097] Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de cualquier agente terapéutico o, alternativamente, de cualquier componente del mismo, se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para los agentes de la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la CI 50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición de síntomas semimáxima) determinada en cultivo celular. Esta información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
5. Kits
[0098] También se contemplan en el presente documento son los kits que incluyen las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo y, opcionalmente, instrucciones para su uso. Los kits que comprenden las composiciones farmacéuticas y biomateriales de la presente invención también están dentro del alcance de la divulgación. Los componentes del kit se pueden empaquetar para la práctica manual o parcial o totalmente automatizada de los métodos anteriores. Dichos kits pueden tener una variedad de usos, que incluyen, por ejemplo, terapia, reparación, preparación de biomateriales y otras aplicaciones.
Ejemplificación
[0099] La invención está ahora descrita de forma general, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente para fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no están destinados a limitar la invención.
Ejemplo 1: Preparación de células madre de lipoaspirados con una mejor homogeneidad
[0100] El tejido adiposo se obtuvo mediante liposucción, bajo anestesia local y sedación general. Se introdujo una cánula hueca de punta roma en el espacio subcutáneo a través de una pequeña incisión (menos de 0,5 cm de diámetro). Con succión suave, la cánula se movió a través del compartimento de la pared abdominal del tejido adiposo para la rotura mecánica del tejido graso. Se inyectaron una solución salina y la epinefrina vasoconstrictora en el compartimento de tejido adiposo para minimizar la pérdida de sangre. De esta forma se obtuvieron de 80 a 100 ml de lipoaspirado crudo de cada paciente a tratar.
[0101] El lipoaspirado crudo se lavó extensamente con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; Gibco BRL, Paisley, Escocia, Reino Unido) para eliminar las células de la sangre, solución salina y anestésico local. La matriz extracelular se digirió con una solución de colagenasa tipo II (0,075%; Gibco BRL) en solución salina balanceada (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, EE. UU.) Durante 30 min a 37°C para liberar la fracción celular. Luego, la colagenasa se inactivó mediante la adición de un volumen igual de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco BRL). La suspensión de células se centrifugó a 250 x g durante 10 min. Las células se resuspendieron en NH4Cl 0,16 M y se dejaron reposar durante 10 min a temperatura ambiente (TA) para la lisis de los eritrocitos. La mezcla se centrifugó a 250 x g y las células se resuspendieron en DMEM más FBS al 10% y una mezcla de ampicilina/estreptomicina al 1% (Gibco, BRL) y luego se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 100 mm a una concentración de 10-30 x 103 células/cm2.
[0102] Las células se cultivaron durante 24 horas a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 en aire. Luego, las placas se lavaron con PBS para eliminar las células no adheridas y los fragmentos celulares. Las células se mantuvieron en cultivo en el mismo medio y en las mismas condiciones hasta que alcanzaron aproximadamente el 80% de confluencia, con reposición del medio de cultivo cada 3 a 4 días. A continuación, las células se pasaron con tripsina-EDTA (Gibco BRL) a una dilución de 1:3 que corresponde a una densidad celular de aproximadamente 5-6 x 103 células/cm2. Para el trasplante, usamos células entre los pases 1 y 3, siendo preferibles las células que han sido pasados más de dos veces para aislar una población celular con alta homogeneidad. Caracterización celular se realizó utilizando células en los pasajes 1 a 9.
Ejemplo 2 - Caracterización de células madre de liDoasDirados con una mejor homogeneidad
[0103] Para caracterizar las células por tinción de inmunofluorescencia, las células se colocaron en placas a baja densidad en DMEM más 10% de FBS sobre el vidrio cubreobjetos en placas de 24 pocillos. Para estudios de inmunohistoquímica, las células se lavaron con PBS y se fijaron en acetona durante 10 min a -20°C. Para la tinción de a-actina, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min a TA. Después de bloquear con un PBS que contenía suero de cabra al 4% y Triton X-100 al 0,1%, las células se incubaron a 4°C durante la noche con anticuerpos primarios contra los siguientes marcadores celulares en las diluciones indicadas [(i) alfa-actina; Dako, Glostrup, Dinamarca; 1/50; (ii) vimentina; Sigma, St. Louis, Estados Unidos; 1/200; (iii) CD 90; Cy MBUS, Biotechnology LTD, Chandlers Ford, Hants, Reino Unido; 1/50; (iv) Factor VIII; Dako; 1/100; (v) CD 34; Chemicon, CA, EE.UU.; 1/100; (vi) c-Kit; Chemicon; 1/100; (vii) desmina; Dako; 1/100; (viii) citoqueratina; Dako; 1/100 y (ix) S-100; Dako; 1/50]. A continuación, las células se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o cloruro de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) conjugados (Sigma; 1/50) durante 45 min a temperatura ambiente. Para los controles negativos omitimos los anticuerpos primarios. Se contratiñeron los núcleos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). A continuación, las células se montaron en Mobiglow (MoBiTec, Gottingen, Alemania) y se observaron con un microscopio de epifluorescencia Eclipse TE300 (Nikon, Tokio, Japón). En cada caso, determinamos el número de células inmunopositivas en diferentes campos y los comparamos con el número de núcleos teñidos. Los campos seleccionados al azar se exportaron a una computadora (Macintosh G3; Apple Computer Inc., Cupertino, Ca, EE. UU.). A través de una cámara Spotl (Diagnostic Instruments Inc., Tampa, FL, EE. UU.). Se utilizaron células de músculo liso aórtico humano, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y fibroblastos sinoviales humanos como controles positivos para la inmunotinción con los diversos anticuerpos.
[0104] En el paso 1, un alto porcentaje (90-95%) de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo expresó vimentina, un marcador de células mesenquimales del citoesqueleto (FIGURA 1). La expresión de vimentina se mantuvo al mismo nivel hasta el pasaje 9 inclusive. Sin embargo, los niveles de otros marcadores disminuyeron con el tiempo. Por ejemplo, la a-actina, que se encontró en el 17% de las células derivadas de LPA en el pase 1, ya no era detectable en el pase 7. El marcador de células endoteliales, factor von Willebrandt (Factor VIII) y CD34, que también se encuentra en la superficie de las células endoteliales, solo se detectaron en los pases 1 a 3 (7% y 12% de células inmunopositivas, respectivamente). Por el contrario, la expresión de c-Kit (CD 117), un marcador de proliferación celular, aumentó con el tiempo, con un 99% de células inmunopositivas desde el pase 4 en adelante (FIGURA 2). El marcador de fibroblastos CD90, inicialmente expresado en aproximadamente el 80% de las células derivadas de LPA, se encontró en el 99% de las células del pase 6 (FIGURA 3). No se observó expresión del marcador neuroectodérmico S 100 o de la queratina de marcador ectodérmico en ninguna de las células derivadas de LPA en ningún momento. El cambio en los marcadores observados a medida que aumenta el número de pases indica un aumento en la homogeneidad de la preparación celular obtenida.
[0105] Para cuantificar el crecimiento celular, las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una concentración de 5 x 103 células/cm2 Después de que las células se hubieran adherido al sustrato (3 h), el medio de cultivo se reemplazó por DMEM suplementado con antibióticos al 1% más FBS al 0,5%, 2%, 5% o 10%. Como controles positivos para la prueba de cada lote de suero, también se cultivaron fibroblastos sinoviales humanos y se determinaron sus tasas de crecimiento. El medio se reemplazó cada dos días. A intervalos de 24 h, las células se fijaron con glutaraldehído al 1% y se determinó el número de células por pocillo, después de la tinción nuclear con violeta cristal, controlando la absorbancia a 595 nm. Se construyó una curva estándar para establecer la relación entre el número de células por pocillo y la absorbancia a 595 nm (r2 = 0,99).
[0106] Las células estromales derivadas de tejido adiposo viables se aislaron con éxito y se cultivaron a partir de los siete lipoaspirados (APLs). Estas células se hicieron crecer en cultivo y se pasaron a intervalos de 7 a 10 días. En algunos casos, las células se criopreservaron y descongelaron antes de la implantación. La tasa de crecimiento de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo (ADSC) dependía de la concentración sérica, con una proliferación máxima entre el 5% y el 10% de FBS (FIGURA 4). El tiempo medio de duplicación de la población en estas concentraciones de suero fueron 37,6±0,6 h, que no difirieron significativamente del tiempo de duplicación de la población de fibroblastos sinoviales humanos cultivados en las mismas condiciones (35,6±1,4 h; p>0,05; prueba t; resultados de tres experimentos independientes).
[0107] Con el fin de analizar las células de una manera más estandarizada y menos subjetiva, las células fueron también sometidas al análisis de Clasificador de Fluorescencia de Células Activadas (FACS). En general, el análisis de citometría de flujo permite la detección de antígenos de superficie mediante anticuerpos, que están directa (covalentemente) o indirectamente (anticuerpo secundario marcado con fluorescencia) unidos a un marcador fluorescente. Por otro lado, el análisis inmunohistoquímico descrito anteriormente exigió la permeabilización de las células y la posterior tinción con anticuerpos. Por tanto, este último requiere un protocolo optimizado individualmente en función de la proteína y el anticuerpo diana. Además, debido a la permeabilización de la membrana celular, no es posible distinguir entre proteínas marcadoras internas (no unidas a la membrana) y extracelulares. Es decir, con un análisis inmunohistoquímico es posible saber si se está expresando un marcador proteico pero no es posible distinguir si se está expresando en la superficie celular o intracelularmente.
[0108] El protocolo utilizado en la inmunocitometría para la detección de antígenos de superficie es estándar, y solamente requiere controles negativos apropiados. Además, el análisis FACS permite una evaluación del porcentaje de células positivas (células que expresan el antígeno de superficie) y el nivel de expresión (pocos o muchos antígenos de superficie en una célula). Estas evaluaciones son solo de naturaleza subjetiva utilizando inmunohistoquímica y pueden variar de un experimento a otro, lo que no ocurre con el análisis FACS.
[0109] Tal caracterización inmunofenotípica de las células puede realizarse en células recién aisladas y después de períodos de cultivo, por ejemplo, en el día 7, después de 4 semanas y después de 3 meses de cultivo. El análisis de marcadores de superficie en diferentes momentos permite evaluar la homogeneidad del fenotipo durante el cultivo. Ejemplos de este análisis y los datos que demuestran el fenotipo obtenidos a partir de muestras obtenidas a partir de 3 donantes sanos de cero a tres meses de cultivo se describen en detalle en la Publicación de Patente de EE. UU. N° 2006047312A1, presentada el 25 de febrero de 2005.
[0110] Después del aislamiento por el método descrito anteriormente, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo de uno de los pacientes se caracterizaron en función de la presencia/ausencia de una serie de marcadores de superficie. Para ello, se monitorizó la expresión de los siguientes marcadores de superficie mediante citometría de flujo: Integrina: CD11b, CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD61, CD104.
[0111] Marcadores hematopoyéticos: CD3, CD9, CD10, CD13, CD16, CD14, CD19, CD28, CD34, CD38, CD45, CD90, CD133, glicoforina.
[0112] Receptores de factores de crecimiento: CD105, NGFR.
[0113] Receptores de la matriz extracelular: CD15, CD31, CD44, CD50, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, CD102, CD106, CD146, CD166.
[0114] Otros: CD36, CD55, CD56, CD58, CD59, CD95, HLA-I, HLA-II, p2-microglobulina. Las células a caracterizar se recolectaron mediante digestión suave con tripsina, se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos a 4°C con marcadores de anticuerpos marcados con fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) contra cada uno de los marcadores de superficie a analizar. Los marcadores celulares se lavaron y analizaron inmediatamente usando el citómetro Epics-XL (Coulter). Como controles, se utilizaron células teñidas con anticuerpos inespecíficos de los correspondientes isótopos marcados con FITC o PE.
[0115] A partir del análisis del perfil de expresión de marcadores de superficie (Figura 7A/7B), los criterios utilizados para determinar qué marcadores definen la población de células y permitir que sean identificados y diferenciados con respecto a otros tipos de célula fueron los siguientes:
1. Deseche los marcadores que varían de una muestra a otra o con el tiempo durante el cultivo en la experimentación realizada con células madre estromales derivadas de tejido adiposo de donantes sanos en la publicación de patente de EE. UU. N° 2006047312A1, presentada el 25 de febrero de 2005.
2. Seleccione los marcadores en función de su relevancia biológica, descartando marcadores característicos de tipos celulares específicos (por ejemplo, CD3 es un marcador exclusivo de linfocitos).
[0116] Mediante la aplicación de estos criterios, la población de células madre multipotentes se caracteriza por ser positiva para CD9+, CD 10+, CD13+, CD29+, CD44+, CD49a+, CD51+, CD54+, CD55+, CD58+, CD59+, CD90 y CD105+; y carece de expresión de CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.
Ejemplo 3: Preparaciones de células madre que comprenden pegamento de fibrina para su uso en el tratamiento de la fístula
[0117] Para uso clínico, las células preparadas anteriormente se pueden usar después de tres o menos pases (FIGURA 3), pero se usan preferiblemente después de dos o más pases como descrito anteriormente para proporcionar una preparación celular con mayor homogeneidad. Los cultivos celulares para uso clínico se tripsinizaron durante 3 min a 37°C. La tripsinización se detuvo mediante la adición de DMEM más FBS y la suspensión se centrifugó a 110 x g durante 5 min. Las células se lavaron en PBS y la suspensión se centrifugó de nuevo a 150 x g durante 5 min. Las células se resuspendieron entre 3 y 30 x 106 células/ml en 1 a 2 ml de solución de lactato de Ringer y se colocaron en una jeringa adecuada. Se puede añadir opcionalmente albúmina de suero humano (HSA) a la solución de lactato de Ringer.
[0118] En ciertos casos, la mitad de las células se resuspendió en el componente de trombina de un kit de pegamento de fibrina (Tissucol® Duo 2,0; Baxter, Madrid, España) antes de la combinación de dos componentes del kit, en un intento de mejorar la obturación de los tractos de las fístulas. El uso de pegamento de fibrina para llenar la abertura de una fístula es conocido en la técnica; sin embargo, no es eficaz como tratamiento independiente para la fístula. La adición de cola de fibrina a las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo descritas en el presente documento sirve para retener las células localmente, y hemos observado que las células crecen bien dentro de las colas y geles de fibrina.
Ejemplo 4: Mejora de procedimiento quirúrgico para la reparación de fístulas utilizando preparaciones de células madre de lipoaspirados
[0119] Se realizó un ensayo clínico de fase I diseñado para probar la viabilidad y la seguridad de autólogo de células madre trasplante usando el tejido adiposo se ha descrito anteriormente composiciones de células madre estromales para el tratamiento de las fístulas de Crohn. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética y Ensayos Clínicos de1Hospital La Paz el 12 de abril de 2002 y se generó un formulario de consentimiento informado detallado para ser firmado por los pacientes. Se mantuvo informado al Comité de Ética sobre el progreso del estudio a lo largo del ensayo clínico.
Métodos
[0120] Los pacientes fueron seleccionados de acuerdo a los siguientes criterios de inclusión: más de 18 años de edad; diagnóstico de enfermedad de Crohn al menos cinco años antes del ensayo; presencia de una o más fístulas de Crohn complejas (fístula enterocutánea, fístula supraesfinteriana y/o fístula rectovaginal) que no respondieron al tratamiento médico y fueron tratadas sin éxito mediante cirugía clásica al menos dos veces; y acuerdo para participar, con firma del formulario de consentimiento informado. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: incumplimiento de los criterios de inclusión; discapacidad mental; delgadez extrema; alergia a la estética local; diagnóstico previo de cáncer; y SIDA.
[0121] Cinco pacientes (Nos 001-005) se inscribieron en el estudio. Había tres hombres y dos mujeres, y la edad promedio fue de 35,1 ± 2,4 años (intervalo: 31,2 a 37,5 años). Se realizaron nueve implantes celulares: tres en fístulas rectovaginales; cinco en fístulas enterocutáneas (cuatro fístulas diferentes en un paciente) y una en una fístula perianal supraesfinteriana. Todas las fístulas enterocutáneas tenían bajo flujo, menos de 50 cc por día, y estaban ubicadas en la pared abdominal (tabla 1). Ningún paciente fue tratado con Nutrición Parenteral Total, Remicaid u Octreótrido al mismo tiempo que este procedimiento. Los pacientes 001 y 002 requirieron dos procedimientos de liposucción porque, después de la primera liposucción, ninguna célula madre sobrevivió a la criopreservación.
[0122] Un paciente fue excluido debido a la contaminación bacteriana de células cultivadas. Inoculamos nueve fístulas en cuatro pacientes con células madre estromales autólogas derivadas del tejido adiposo (ADSC) en el pase tres o antes. Se siguieron ocho fístulas inoculadas semanalmente durante al menos ocho semanas. En seis fístulas, la apertura externa se cubrió con epitelio al final de la semana 8 y, por lo tanto, estas fístulas se consideraron curadas (75%). En las otras dos fístulas, solo hubo cierre incompleto de la abertura externa, con una disminución del flujo de salida (no cicatrizado; 25%). No se observaron efectos adversos en ningún paciente al final del período de seguimiento (al menos seis meses y no más de dos años).
[0123] En el caso de fístulas enterocutáneas, todas las pistas se rasparon de profundidad. En el caso de las fístulas rectovaginales se utilizó un abordaje vaginal, con desprendimiento de la pared vaginal posterior. El espacio se separó por completo y la abertura rectal se cerró con puntos de sutura absorbibles 3/0. La mucosa rectal había sido dañada por la enfermedad de Crohn y era extremadamente frágil. En el caso de las fístulas perianales, se extrajo el núcleo de la vía principal y se cerró el orificio rectal con suturas absorbibles 3/0 a través de la mucosa esclerótica.
[0124] Utilizando una aguja, en los casos de fístula enterocutánea, inyectamos células en la pared de la vía. En los casos de fístulas rectovaginales y perianales, inyectamos células en la mucosa rectal, cerca de la abertura interna suturada. En todos los casos, observamos una ampolla llena de líquido en la zona de la inyección después de la inyección (FIGURA 5). El número de células inyectadas varió de 3 a 30 x 106, dependiendo del crecimiento de las células cultivadas (FIGURA 3).
[0125] El tiempo desde el comienzo de la preparación de inóculo para el final de la inyección fue de menos de 90 minutos en todos los casos. En el caso de las fístulas enterocutáneas, las pistas se rellenaron con pegamento de fibrina y luego se suturó la piel. En caso de fístulas rectovaginales, se construyó un colgajo vaginal de avance. Cuando se detectaron huellas accesorias, también se rellenaron con pegamento de fibrina.
[0126] No se aplicaron vendajes después de la operación. Se inició la ingesta de líquidos doce horas después del procedimiento y alimentos sólidos seis horas después. Uno a tres días después de la cirugía, el paciente fue dado de alta y se programaron visitas de seguimiento en la clínica ambulatoria.
[0127] Se obtuvieron dos muestras histopatológicas. Se obtuvo una muestra (paciente número 002) del área de una fístula enterocutánea (7 meses después del implante n° 2 y 10 días después del implante n° 3). La otra muestra (paciente número 001) se obtuvo de la pared rectovaginal, un año después del primer implante, (implante N° 1), durante el procedimiento quirúrgico asociado con el implante N° 6. Las muestras se incluyeron en parafina, se seccionaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina y se evaluaron.
[0128] Un seguimiento semanal fue programado a ocho semanas después de la cirugía. Los pacientes se consideraron curados cuando se evidenció una epitelización total de la abertura externa después de ocho semanas, independientemente de las observaciones previas. Después de ocho semanas, hubo un seguimiento mensual durante al menos seis meses y no más de dos años.
Resultados
[0129] Cinco pacientes fueron incluidos en el estudio y siete liposucciones se realizaron (FIGURA 3). El paciente número 003 fue eliminado del ensayo durante el procedimiento de implantación como resultado del descubrimiento de contaminación por bacterias Gram positivas de las células lipoaspiradas cultivadas. Las bacterias se identificaron como Oerkovia xanthineolytica. Una fístula enterocutánea en el paciente 002 fue eliminada del estudio debido a una cirugía abdominal de urgencia por una nueva fístula enterovesicular que resultó en sepsis aguda. La laparotomía requirió la resección del área del implante. Por lo tanto, no pudimos cumplir con el programa de seguimiento mínimo de ocho semanas en este caso.
[0130] Nueve fístulas de cuatro pacientes se inocularon con ADSC después de tres o menos pasajes (FIGURA 3). Se consideró que ocho fístulas eran adecuadas para la retención en el estudio y se siguieron durante al menos ocho semanas (FIGURA 3). En seis fístulas, la abertura externa se había epitelizado en la semana 8 y estas fístulas se consideraron curadas (75%) (FIGURA 6 ). Los otros dos tuvieron sólo cierre incompleto de la abertura externa, con una disminución del flujo de salida, según lo informado por los pacientes (25%; no cicatrizado; FIGURA 3). No hubo una relación directa entre el número de células inyectadas o el tiempo de cultivo y el éxito del procedimiento. Tampoco hubo una relación directa entre el sexo o la edad del paciente y la curación. Los estudios posteriores que hemos realizado indican que una dosis inicial de 20 x 106 células es adecuada. Hemos determinado que se puede usar una segunda dosis de 40 x 106 células en el caso de que falle la primera dosis. Se prefieren dosis de células más altas porque hemos observado que un mayor número de células tiene un mejor efecto terapéutico en la reparación de tejidos.
[0131] Se llevaron a cabo procedimientos quirúrgicos y de implantación sin dificultad técnica adicional en las nueve fístulas tratadas. No se observaron reacciones adversas inmediatas (por ejemplo, anafilaxia, reacciones alérgicas) en ninguno de los casos estudiados.
[0132] Dos muestras histopatológicas se obtuvieron siete meses (fístula enterocutánea) y un año (fístula recto-vaginal) después de la cirugía. No se detectó transformación citológica en una serie completa de cortes histopatológicos.
Discusión
[0133] En un informe anterior, que describe el tratamiento basado en células con éxito de una mujer joven con una fístula recto-vaginal recurrente que no habían respondido al tratamiento médico. Por lo tanto, diseñamos el presente ensayo clínico de fase I para evaluar la viabilidad y seguridad de dicho trasplante autólogo de células madre estromales de tejido adiposo (con mejoras en el protocolo original) para el tratamiento de fístulas de Crohn que no responden, así como para probar el uso de células madre estromales del tejido adiposo junto con un pegamento de fibrina.
[0134] Elegimos el tejido adiposo como fuente de las células madre debido a su capacidad de diferenciación miogénica y el hecho de que responden bien a las fístulas trasplantes musculares. Además, la grasa de liposucción está disponible en grandes cantidades y se puede recolectar con efectos adversos mínimos en el paciente. Otros grupos han utilizado células madre derivadas de la médula ósea pero, en tales casos, se requiere un procedimiento de movilización celular que puede ser peligroso para algunos pacientes, como aquellos con un infarto de miocardio. En nuestro estudio, todos los procedimientos de liposucción produjeron una cantidad de células clínicamente útiles con características de células madre.
[0135] Hemos seguido nuestros pacientes de acuerdo con el programa previsto, y se observó una curación completa en 6 de los 8 procedimientos. Es importante señalar que la enfermedad de Crohn proporciona las peores condiciones para un abordaje quirúrgico de las fístulas debido a la fragilidad del tejido y los enormes problemas asociados con la curación en estos pacientes. Nuestros pacientes fueron elegidos porque no habían respondido al tratamiento médico y al menos dos procedimientos quirúrgicos previos, pero nuestro tratamiento pareció ser bastante efectivo. No obstante, los nuevos brotes de la enfermedad de Crohn aún pueden producir nuevas fístulas en cualquier paciente dado que deberán tratarse nuevamente con las células autólogas criopreservadas de ese paciente.
[0136] No se conoce el mecanismo biológico que subyace al éxito terapéutico del trasplante de ADSC. Las células madre pueden diferenciarse en tejido conectivo, muscular o cicatricial. Alternativamente, la secreción de factores de crecimiento por parte de las células madre podría facilitar la cicatrización de heridas. Vimos tejido cicatricial típico en las fístulas examinadas histopatológicamente, pero no tenemos forma de distinguir las células del tejido conectivo local trasplantadas. Observamos una curación completa en el 75% de los casos con nuestro tratamiento.
Referencias
[0137] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. by Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de EE. UU. N°: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende células madre estromales derivadas de tejido adiposo, para su uso en el tratamiento de una fístula en un sujeto, en la que el tratamiento comprende administrar al menos 30 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo al sujeto.
2. Uso de células madre estromales derivadas de tejido adiposo en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una fístula en un sujeto, en donde el tratamiento comprende administrar al menos 30 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo al sujeto.
3. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1, o el uso de la reivindicación 2, en donde el tratamiento comprende administrar al sujeto al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo.
4. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde el tratamiento comprende: (a) cerrar el orificio interno de la fístula con una sutura y (b) entregar al menos 30 x 106, o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo al orificio interno suturado cerrado.
5. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 4, o el uso de la reivindicación 4, en donde el tratamiento además comprende: (c) administrar una segunda dosis de al menos 30 x 106, o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas del tejido adiposo al orificio interno suturado cerrado.
6. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1, o el uso de la reivindicación 2, donde el tratamiento comprende:
(i) raspado profundo de al menos un trayecto de fístula, opcionalmente donde el paso (i) se lleva a cabo raspando profundamente todas las pistas de fístula a tratar y se produce un sangrado inducido raspando las paredes de la fístula para obtener fibrina natural que llenará el trayecto de la fístula;
(ii) cerrar el orificio interno de la pista raspada con una sutura; y
(iii) administrar al menos 30 x 106, o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo al orificio interno suturado cerrado.
7. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1, o el uso de la reivindicación 2, en la que:
(i) dicha composición farmacéutica se administra como una primera dosis al orificio interno cerrado del tracto de fístula después cerrar el orificio interno con una sutura, y una segunda dosis de dicha composición farmacéutica se administra a uno o más sitios en las paredes del trayecto de la fístula después de dicha primera dosis de dicha composición farmacéutica;
(ii) dicha composición farmacéutica se administra como una primera dosis a uno o más sitios en las paredes del trayecto de la fístula después de cerrar el orificio interno del trayecto de la fístula con una sutura, y se administra una segunda dosis de dicha composición farmacéutica al tracto cerrado. agujero interno suturado; (iii) dicha composición farmacéutica se administra como una primera dosis al orificio interno cerrado del trayecto de la fístula después de cerrar el orificio interno con una sutura, y se administra una segunda dosis de dicha composición farmacéutica al orificio interno suturado cerrado; o
(iv) dicha composición farmacéutica se administra como una primera dosis en uno o más sitios en las paredes del trayecto de la fístula después de cerrar el orificio interno del trayecto de la fístula con una sutura, y se administra una segunda dosis de dicha composición farmacéutica a una persona o más sitios en las paredes del tracto de la fístula después de dicha primera dosis de dicha composición farmacéutica.
8. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-7, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde:
(i) la composición farmacéutica comprende al menos 30 x 106, o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas del tejido adiposo; y/o
(ii) la concentración de dichas células madre estromales derivadas de tejido adiposo en la composición es de al menos 5 x 106 células/ml.
9. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-8, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-8 , donde:
(i) la fístula es una fístula intestinal, y donde opcionalmente la fístula es fístula rectovaginal, fístula enteroenteral, fístula enterocutánea o fístula enterovaginal;
(ii) la fístula es una fístula vaginal o uterina, y en la que, opcionalmente, la fístula es una fístula cervical, fístula rectovaginal, fístula enterovaginal o fístula vesicovaginal;
(iii) la fístula es una fístula anorrectal, fístula anal, fístula fecal, fístula arteriovenosa, fístula biliar, fístula cervical, fístula craneosinus, fístula enteroenteral, fístula enterocutánea, fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístula arteriovenosa metroperitoneal, fístula pulmonar peritoneal, fístula rectovaginal, fístula umbilical, fístula traqueoesofágica, fístula vesicovaginal o fístula perianal; o
(iv) la fístula es una fístula anorrectal, enterorectal, enterocutánea, rectovaginal o vesicovaginal.
10. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-9, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde la fístula es una fístula de Crohn.
11. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-10, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en donde:
(i) dichas células madre estromales derivadas del tejido adiposo son alogénicas con respecto al sujeto ser tratado; y/o
(ii) las células madre estromales derivadas del tejido adiposo son células madre estromales derivadas del tejido adiposo humano.
12. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-11, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en donde dichas células madre estromales derivadas del tejido adiposo se preparan mediante un método que comprende: (a) recolectar tejido adiposo de un sujeto; (b) obtener una suspensión celular por digestión enzimática; (c) sedimentar la suspensión celular y resuspender las células en un medio de cultivo; (d) cultivo de las células durante al menos 10 días; y (e) expandir las células durante al menos dos pases de cultivo, en donde opcionalmente (i) dichas células madre estromales derivadas del tejido adiposo se pasan al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, en al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, o al menos diez veces; o (ii) se pasan más de tres veces.
13. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-12, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en donde:
(i) al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y/o CD105; y/o
(ii) menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2% o menos del 1% del tejido adiposo que expresan las células madre estromales derivadas los marcadores CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y/o CD133.
14. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-12, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en donde las células madre estromales derivadas del tejido adiposo expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105 y no expresan los marcadores CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y/o CD133.
15. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-12, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en donde:
(i) al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de las células madre estromales derivadas del tejido adiposo expresan los marcadores c-Kit, vimentina y/o CD90;
(ii) menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2% o menos del 1% de las células madre expresan los marcadores CD34, Factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y/o queratina; o (iii) las células madre estromales derivadas de tejido adiposo expresan los marcadores c-Kit, vimentina y CD90 y no expresan los marcadores CD34, Factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y queratina.
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