JP4399533B2 - 幹細胞のマーカーおよびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、哺乳類間葉幹細胞の単離および同定のためのマーカーに関する。また、このようなマーカーの方法および使用、並びに数が高められた細胞個体群および数が高められた細胞組成物を含んでなる細胞組成物も包含される。
発明の背景
間葉幹細胞
成体は、何回も分裂しながら特異的表現型の特性を有する娘細胞を生じることもできるいわゆる幹細胞を収容している。胚幹細胞、造血幹細胞および間葉幹細胞など数種類の幹細胞が、体内に存在している。間葉幹細胞は、骨、軟骨、筋肉、骨、靱帯、脂肪、および骨髄支質のような間葉組織を形成することができる。図１は、推定される間葉幹細胞（ＭＳＣ）から高度に分化した表現型への示唆された段階的移行の一覧表を示す。間葉幹細胞は骨髄、血管周囲、脂肪、皮膚、筋肉、骨および他の組織に存在する。それらの存在は、これらの組織の修復能力に寄与している。
ＭＳＣの医療での使用
一般に、ＭＳＣの医療での使用は、身体が攻撃を受けたときに自然には修復または再生することができない組織の再生においてその潜在能力を探求するためである。このため、ＭＳＣを単離し、培養で増殖させ、骨、軟骨、筋肉、骨髄支質、腱、脂肪などのような結合組織への分化を刺激する。次に、これらの組織を遺伝子工学処理した構築体を人体に再導入して、喪失したまたは損傷を受けた組織を修復することができる。もう一つの方法では、ＭＳＣを直接イン・ビボで刺激して、特異的組織の形成をイン・シテュー(in situ)で誘導することができる。
ＭＳＣは組織の遺伝子工学処理および移植のための有力な「構築ブロック」として定義されてきたが、研究者らはＭＳＣを同定し、単離し、特性決定するための一層良好な方法を探求し始めている。
α１０
新たに発見されたコラーゲン結合インテグリンであるα１０β１としては、インテグリンサブユニットα１０が挙げられる（Camper et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 20383-20389）。このインテグリンは軟骨細胞で発現し、コラーゲンII型アフィニティー精製によってウシ軟骨細胞から単離されたときには還元後に１６０ｋＤａのＭｒを示す。
クローニングおよびcDNAシークエンシングは、これが他のインテグリンαサブユニットの一般構造を共有していることを示した。予測されるアミノ酸配列は、シグナルペプチド（２２アミノ酸）、長い細胞外ドメイン（１０９８アミノ酸）、膜貫通ドメイン（２２アミノ酸）、および短い細胞質ドメイン（２２アミノ酸）を包含する１１６７アミノ酸の成熟タンパク質からなっている。大半のα−インテグリンサブユニットとは対照的に、α１０は保存配列ＫＸＧＦＦ（Ｒ／Ｋ）Ｒを含まない。その代わりに、α１０の予測アミノ酸配列はＫＬＧＦＦＡＨである。α鎖のＧＦＦＫＲモティーフはインテグリンサブユニットの会合およびインテグリンの血漿膜への輸送にとって重要であることが示唆されている（De Melker et al. (1997) Biochem. J. 328: 529-537）。
細胞外部分は７重の反復配列、Ｉ−ドメイン（１９９アミノ酸）、および３個の推定二価カチオン結合部位を含んでいる。配列分析により、α１０サブユニットはＩドメイン含有αサブユニットに極めて緊密に関連しており、α１（３７％）、α２（３５％）およびα１１（４２％）に対する最高同一性を有することが明らかになった。
α１１
α１１インテグリンは細菌になって同定され、クローニングおよび特性決定により、Ｉ−ドメインがβ１関連インテグリンを含むことが明らかになった。
ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは、１１８８アミノ酸の前駆体をコードする。１１６６アミノ酸の予測した成熟タンパク質は、７個の保存ＦＧＧＡＰ反復配列ＭＩＤＡＳモティーフを有するＩ−ドメイン、短い膜貫通領域、および配列ＧＦＦＲＳを含む２４アミノ酸のユニークな細胞質ドメインを含んでいる。
α１１は、反復配列５−７に潜在的二価カチオン結合部位を含む。細胞外の柄の部分に２２個のアミノ酸が挿入されていることにより（アミノ酸804-826）、α１１インテグリン配列が更に他のインテグリンα鎖から区別される。
アミノ酸配列比較により、α１０インテグリン鎖と最高同一性（４２％）を有することが明らかになった。α１１インテグリンに対する抗体を用いる免疫沈澱では、１４５ｋＤａのタンパク質が得られ、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、１４０ｋＤａのα２インテグリン鎖より明らかに大きかった。
ＭＳＣの単離および同定
イン・シテューでのＭＳＣの同定は、単一特異性およびユニーク分子プローブが存在しないことによって阻害される。従って、間葉幹細胞を更に特性決定して、組織における間葉幹細胞を明確に同定することができるプローブまたはプローブの組合せを同定する必要がある。このようなマーカーは、骨髄（ＢＭ）および血液組織からの間葉幹細胞の単離にも有用である。
骨髄吸引液中の１０，０００−１００，０００個の有核細胞からの約１個の細胞が間葉幹細胞であることが予想される。現在、骨髄から間葉幹細胞を単離するための主要な方法はプラスチック製培養皿に接着しコロニーを形成するそれらの能力に基づいているが、骨髄細胞の大半は接着もコロニーの形成もしない。次に、これらのコロニーを更に増殖させた後、画定因子を導入して特異的間葉組織に分化させる。しかしながら、この方法で単離した間葉幹細胞が均質な個体群であるかどうかは明らかではない。従って、特異的分化能力を有する間葉幹細胞のサブクラスを同定するのに用いることができるマーカーを見出すことが重要であろう。
米国特許第６，２００，６０６号明細書には、選択マーカーとしてＣＤ３４の使用による造血および非造血細胞から軟骨または骨前駆細胞の単離、および単離した幹細胞の骨および軟骨再生過程における更なる使用が記載されている。更に、間葉幹細胞の特異的マーカーは同定も開示もされていない。ＣＤ３４マーカーは初期リンパ造血幹および前駆細胞、小血管内皮細胞、胚繊維芽細胞、および胎児および成人神経組織、胎児卵黄嚢から誘導される造血前駆細胞、胚肝、および５週目のヒト胚の大動脈関連造血前駆細胞などの肝外胚組織における幾つかの細胞で発現する。
Pittenger et al.((1999) Science 284: 143-147）は、ヒト骨髄の密度遠心分離を用いてヒトＭＳＣを単離した。ＭＳＣを同定するのに用いた細胞マーカーは、ＳＨ−２、ＳＨ−３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２４である。
Majumdar et al.,((2000) J. Cell. Physiol. 185: 98-106）は、骨髄由来のヒトＭＳＣの濃縮のマーカーとしてＣＤ１０５を用いている。
Denni et al.,((2002) Cells Tissues Organs 170: 73-82）は、骨髄からヒトＭＳＣを濃縮するためにStro−１と呼ばれるマーカーを用いている。
これまでに述べた総てのマーカーは、ｈＭＳＣの濃縮に用いることができる。更に、それらはＭＳＣに限定的なものではなく、これらのマーカーを用いて濃縮すると、単離された個体群は不均質である。ｈＭＳＣの同定の単一特異性およびユニークプローブは今までのところは存在しない。
更に、間葉幹細胞が特定の種類の間葉細胞に分化するのを観察するには、マーカーが必要である。これらの細胞を人体に再導入して骨または軟骨のような損傷した間葉組織の喪失分に取って代わるときには、これが特に重要となる。
最後に、間葉幹細胞の特異性細胞表面の同定を用いて、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）のような細胞選別法によって細胞の複雑な混合物からそれらを単離することができる。
従って、上記問題点の観点からＭＳＣを同定し単離して、イン・ビボまたはイン・ビトロでの骨、軟骨、筋肉、骨髄、腱または結合組織修復に更に用いるのが極めて望ましい。これに関して、本発明は、この要求と利益を記載する。
発明の概要
哺乳類ＭＳＣを単離して同定しようとするときに当該技術分野で知られている上記不利益を考慮して、本発明は、哺乳類ＭＳＣの同定および単離に適する哺乳類ＭＳＣのマーカーを提供する。
本発明の一つの目的は、哺乳類ＭＳＣまたはＭＳＣの数が高められた細胞個体群を同定しまたは単離する方法を提供することである。
もう一つの目的は、哺乳類ＭＳＣを同定しまたは単離するための本発明によるマーカーの使用を提供することである。
従って、本発明は、哺乳類間葉幹細胞のマーカーを提供する。このマーカーは、間葉幹細胞の細胞表面上または間葉幹細胞の細胞内で発現したインテグリンα１０鎖および／またはインテグリンα１１鎖を含んでなる。
他の態様としては、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１鎖がインテグリンβ１鎖と組み合わせたヘテロ二量体として発現するものが挙げられる。
また、本発明は、哺乳類間葉幹細胞を同定する方法を提供する。このような方法は、
ａ） 間葉幹細胞を含んでなる試料を提供し、
ｂ） 間葉幹細胞の細胞表面上または間葉幹細胞の細胞内でのインテグリンα１０および／またはα１１鎖の発現を検出し、
ｃ） インテグリンα１０および／またはα１１鎖の発現を評価し、
ｄ） 上記ｃ）における評価に従って間葉幹細胞を同定する
工程を含んでなる。
他の態様としては、上記ｂ）における発現を、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１タンパク質の発現を検出することによって検出するものが挙げられる。
更に他の態様としては、上記ｂ）における発現をインテグリンα１０および／またはインテグリンα１１のｍＲＮＡの発現を検出することによって検出するものが挙げられる。
更に、本発明は、試験化合物が哺乳類の間葉幹細胞の分化を調節するかどうかを測定する方法を提供する。
このような方法は、
ａ） 間葉幹細胞を提供し、
ｂ） 間葉幹細胞を試験化合物と接触させ、
ｃ） 試験化合物が間葉幹細胞の分化を調節することの指標として、間葉幹細胞の分化の速度またはパターンの変化を検出する
工程を含んでなる。
更に、本発明は、参照個体群に対して間葉幹細胞数が高められた哺乳類細胞の単離された個体群を産生する方法を提供する。このような方法は、
ａ） 少なくとも細胞の個体群の一部または参照個体群の一部であって、ＭＳＣと間葉幹細胞以外の少なくとも１種類の細胞とを含んでなるものを提供し、
ｂ） 上記ａ）の細胞の個体群に間葉幹細胞を同定する化合物を導入し、
ｃ） 上記ｂ）の細胞の個体群から間葉幹細胞を選択して単離することによって、間葉幹細胞数が高められた細胞の個体群を産生する
工程を含んでなる。
本発明による方法は、他の態様では、間葉幹細胞を、本発明で開示された方法によって上記間葉幹細胞の細胞表面上でのインテグリンα１０および／またはα１１鎖の発現を検出することによって間葉幹細胞として同定する方法を包含する。
更に、少なくとも１個の完全な生長可能な間葉幹細胞を含んでなる間葉幹細胞の数が高められた哺乳類細胞個体群が開示される。このような数が高められた細胞個体群は、間葉幹細胞が
ａ） 上記間葉幹細胞の細胞表面上または細胞内でインテグリンα１０鎖および／またはインテグリンα１１鎖を発現し、
ｂ） 関連したリンパ造血細胞または関係のない幹細胞に特異的な分子の発現が実質的にない
ことを特徴とする、個体群である。
また、本発明によるマーカーを発現し、本発明による間葉幹細胞の数が高くなった細胞の個体群を産生する方法によって得ることができる単離された哺乳類間葉幹細胞が開示される。
更にまた、本発明による数が高くなった細胞個体群または本発明による単離された間葉幹細胞を含んでなる哺乳類の細胞組成物が開示される。
哺乳類の間葉幹細胞の同定、哺乳類の間葉幹細胞の分化の調節、および哺乳類の間葉幹細胞の単離のための本発明によるマーカーの使用も提供される。
発明の具体的な説明
定義
本明細書で用いられる「齧歯動物」および「齧歯類」とは、系統発生上のRodentia目の総ての構成員を表す。
「ネズミ」という用語は、ラットおよびマウスなどのMuridae科のいずれかおよび総ての構成員を表す。
「実質的にない」という用語は、本明細書では、用いた分析法の検出限界以下であり、ネガティブ、すなわち含まないと思われることを意味するものとする。
「関連した」という用語は、本明細書では、特定の目的に用いられるまたはに関連していることを意味するものとする。従って、関連細胞は、特定の分化過程のために用いられるまたはに関連している細胞である。これから、関係のない細胞は任意の特異的分化課程のために用いられるまたはに関連しているものではなく、幾つかの選択肢を有するということになる。
ＭＳＣのマーカーとしてのインテグリンα１０およびインテグリンα１１
本発明者らは、意外なことには、インテグリンα１０β１およびα１１β１がヒト間葉幹細胞に存在することを見出した。従って、これらのインテグリンを用いて細胞個体群混合から間葉幹細胞を同定し、識別し、単離することができ、損傷した組織を修復するための細胞治療における有用な手段となる。
ヒトインテグリンα１０鎖配列は知られており、GenBank（商標名）／EBI Data Bank受託番号AF074015で公的に入手することができる。従って、インテグリンα１０鎖の新規な用途および方法を、本発明で開示する。
ヒトインテグリンα１１鎖配列は知られており、GenBank（商標名）／EBI Data Bank受託番号AF137378で公的に入手することができる。従って、インテグリンα１１鎖の新規な用途および方法を、本発明で開示する。
上記のように、本発明は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）のマーカーであって、哺乳類ＭＳＣの細胞表面上または哺乳類ＭＳＣの細胞内で発現したインテグリンα１０鎖および／またはインテグリンα１１鎖を含んでなる、マーカーに関する。
もう一つの態様では、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１鎖はインテグリンβ１鎖と組み合わせたヘテロ二量体として発現する。
哺乳類ＭＳＣは一般に骨髄、末梢血、臍帯血、肝、骨、軟骨、軟骨膜、筋肉、骨膜、滑膜または脂肪から単離される。単離は、プラスチック製培養皿に接着しコロニーを形成する細胞の能力に基づいているが、骨髄細胞の大半は接着もコロニーの形成もしない。本発明のマーカーを包含することのない哺乳類ＭＳＣの単離に適当な方法は、Mason JM et al（2000,「遺伝子によって強化された組織工学処理を用いる軟骨および骨の再生（Cartilage and bone regeneration using gene−enhanced tissue engineering）」．Clin．Orthop．379S：S171-178）、Chu CR et al（1997,「軟骨膜細胞を用いる骨軟骨修復（Osteochondral repair using perichondrial cells）」．Clin．Orthop．340：220-229(2000)）、およびDounchis JS et al （2000,「内生軟骨膜細胞およびポリ乳酸移植片を用いる軟骨修復（Cartilage repair with autogenic perichondrium cell and polylactic acid grafts）」．Clin．Orthop．377：248-264）にも詳細に記載されている。従って、本発明の（複数の）マーカーを導入することによって、既知の方法を用いることができる。
コロニーを更に増殖させた後、特異的な間葉組織に分化させるための画定した因子を誘発させることができる。軟骨細胞については、培養は、ペレット化したマイクロマスまたは血清なしのアルギン酸塩中での培養であり、ＴＧＦβ３を画定因子として加える。骨形成細胞については、細胞をデキサメタゾン、β−グリセロールリン酸塩、アスコルビン酸塩、および１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）の存在下で培養することができ、脂肪細胞については、細胞を１−メチル−３−イソブチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリン、およびインドメタシンの存在下で培養することができる。
従って、単離および増殖プロトコールにおいて本発明による（複数の）マーカーを用いることによって、均質なＭＳＣ個体群が得られる。この方法によって単離せずに増殖した間葉幹細胞は、均質な個体群である。特異的ＭＳＣの増殖のために培養物に包含される適当な因子に関する更なる詳細は、Caplan，AI（1991，「間葉幹細胞（Mesenchymal Stem Cells）」．J．Orthop．Res．9：641−650）、Pittenger MF et al．(1999，「成人間葉幹細胞の様々な能力（Mutlilineage potential of adult human mesenchymal stem cells）」，Science．284：143−7）、およびMinguell JJ，Erices，A and Conget，P（2001，「間葉幹細胞（Mesenchymal Stem Cells）」．Exp．Biol．Med．226（6）：507−520−細胞の分化に必要なことがある総ての因子の表）によって記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
ヒトＭＳＣは、骨髄、末梢血、臍帯血、肝、骨、軟骨、軟骨膜、筋肉、骨膜、滑膜または脂肪から単離することができる。次に、ＭＳＣを密度遠心分離の後に更に単離し、１．０７３g／mlの密度界面において単核細胞画分層の一部として見出すことができる（Percoll（商標名），Pharmaciａ）。適当な方法は、Vogel W et al（2003， 「骨髄由来の間葉幹細胞および神経前駆細胞の不均一性（Heterogeneity among bone marrow−derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells）」）、およびNevo，Z et al（1998，「再生した骨格組織における操作した間葉幹細胞（manipulated mesenchymal stem cells in regenerated skeletal tissues）」．Cell Transplant 7：63−70）によって詳細に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
この単核細胞画分から、１／１０，０００−１／１００，０００個の細胞が、培養皿の血清中で培養したときにコロニーを形成する（Bruder SP et al（1997）「広範囲継代培養中および低温保存後の精製したヒト間葉幹細胞の増殖動態、自己再生、および骨形成能力」．J．Cell．Biochem．64：278−294）。
従って、既知の単離および増殖プロトコールにおいてインテグリンα１０鎖および／またはインテグリンα１１鎖を含んでなる本発明によるマーカーの包含、並びに（複数の）マーカーのみの使用は、ＭＳＣ個体群の更なる評価およびその数を高めることに極めて重要となる。特に、哺乳類ＭＳＣに対する本発明によるマーカーとして、他の特異的およびユニークマーカーは、知られていない。
ＭＳＣの同定方法
本発明により、哺乳類ＭＳＣの同定方法を開示する。この方法は、
ａ） ＭＳＣを含んでなる試料を提供し、
ｂ） ＭＳＣの細胞表面上またはＭＳＣの細胞内でのインテグリン鎖α１０および／またはα１１の発現を検出し、
ｃ） インテグリン鎖α１０および／またはα１１発現を評価し、
ｄ） 上記ｃ）での評価に従って間葉幹細胞を同定する
工程を含んでなる。
更に詳細には、本発明による方法は、更に
ｅ） 哺乳類間葉幹細胞を含んでなる細胞懸濁液を提供し、
ｆ） ｅ）の細胞懸濁液を、モノクローナル抗体またはインテグリンα１０β１／またはα１１β１に結合するその断片と、上記モノクローナル抗体またはその断片がインテグリンα１０β１／α１１β１の細胞外ドメインと抗体−抗原複合体を形成する条件下で接触させ、
ｇ） ｆ）における上記モノクローナル抗体またはその断片に結合する細胞を分離し、
ｈ） 必要に応じて、ｇ）におけるモノクローナル抗体またはその断片に結合する細胞を上記抗体またはその断片から回収する
ことによって、場合によっては上記抗体またはその断片を含まない、哺乳類間葉幹細胞の個体群を産生する工程を含んでなることができる。
上記ｅ）において提供された哺乳類ＭＳＣを含んでなる細胞懸濁液は、骨髄、末梢血、臍帯血、肝、骨、軟骨、筋肉、軟骨膜、骨膜、滑膜組織、脂肪、またはＭＳＣを含んでなる任意の組織から単離することができる。細胞懸濁液は、哺乳類腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の他の骨髄空間から単離することもできる。ヒトＭＳＣの他の供給源としては、胚卵黄嚢、胎盤、および臍帯が挙げられる。
細胞の個体群をBMから回収すると、出発個体群または「未加工個体群」の０．０１−０．００１％のみがＭＳＣである。しかしながら、これは異なるドナー間で変動することがある。
もう一つの態様では、哺乳類ＭＳＣはヒトＭＳＣである。
もう一つの態様では、哺乳類ＭＳＣはネズミＭＳＣである。
もう一つの態様では、上記培養物は２〜４週間の培養物である。
一態様では、ＭＳＣの個体群を単離する方法は、更に
ｉ） ヒト患者からの骨髄吸引液（５−３０ｍｌ）を血液凝固を防止するため例えばヘパリンを含む注射器に集め、
ｊ） 骨髄試料をDulbeccoのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）または任意の同様な食塩水溶液で洗浄し、９００gで遠心分離した後細胞を回収し、この処置をもう一度繰り返し、
ｋ） 細胞を５０ｍｌ円錐試験管中の密度が１．０７３g／ｍｌのPercoll ２５ｍｌに装填して、細胞を２０℃で１１００gで３０分間遠心分離することによって分離し、
ｌ） 界面から有核細胞を回収して、ＤＰＢＳ ２容で希釈し、９００gで回収する。細胞を再懸濁し、細胞を計数し、細胞を必要な密度で、適当には２００，０００個／ｃｍ２で培養し、
ｍ） 細胞をDulbeccoの改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）または１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む任意の他の適当な培地（低グルコース）で培養し、
ｎ） 培地を２４および７２時間後および３または４日毎に取り換え、
ｏ） １０〜１４日目に対称コロニーとして増殖するｈＭＳＣを０．０５％トリプシンおよび０．５３ｍＭ ＥＤＴＡで５分間処理することによって継代培養し、培養基から血清を含む培地で洗浄し、８００gで５分間遠心分離することによって回収し、きれいなフラスコに５０００−６０００個／ｃｍ２ずつ接種する
工程を含んでなる。
ＭＳＣの分離は、同定したＭＳＣを分離するための選択および単離工程である。当業者に知られている様々な手法を用いて、ＭＳＣ以外の他の系統に選別された細胞を最初に除くことによって細胞を分離することができる。
抗体またはその断片を用いるときには、固形支持体に接着して、特異性の高い分離の準備をすることができる。用いる分離のための特定の手順、例えば、遠心分離、カラム、膜または磁気分離のような機械的分離は、集めようとする画分の生長能力を最大にするものである。異なる効力の様々な手法を用いることができることが、当業者に知られている。用いられる特定の手法は、分離の効率、その方法の細胞傷害性、作業の容易さおよび速さ、および精巧な装置および／または専門的技術の必要性によって変化する。
本発明の方法によって促進される細胞懸濁液からＭＳＣを分離するための手順は、例えば、抗体をコーティングした磁気ビーズを用いる磁気分離、本発明による抗体またはその断片に基づくアフィニティークロマトグラフィー、およびプレートなどの固形マトリックスに接着した抗体またはその断片を用いる「パンニング」、または他の好都合な手法を包含することができる。
正確な分離を行う手法としては、例えば、本発明の方法における抗体またはその断片の使用による蛍光活性化セルソーターであって、当業者に知られている複数のカラーチャンネル、光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなど様々な精巧度を有することができるものが挙げられる。
一態様では、提供された細胞個体群において、ＭＳＣの最初の濃縮工程を行う。この最初の選択はＭＳＣのネガティブ選択であることができ、すなわち他の系統が関連した細胞を最初の細胞の個体群から枯渇させまたは除去する。
更にもう一つの態様では、最初の濃縮は、ＭＳＣの所望な純度が得られるまで反復することができるＭＳＣのポジティブ選択である。
前節で述べられているように、ＭＳＣは混合細胞個体群のプラスチック接着の後、画定因子を用いる細胞の一層の任意増殖によって単離し、様々な間葉組織分化することができる。軟骨細胞については、培養物はペレット化したマイクロマス中または血清を含むまたは含まず且つ画定因子として加えたTGFβ３を含むアルギン酸塩中の培養物であることができる。骨形成細胞については、細胞をデキサメタゾン、β−グリセロールリン酸塩、アスコルビン酸塩、および１０％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）の存在下で培養することができ、脂肪細胞については、細胞を１−メチル−３−イソブチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリン、およびインドメタシンの存在下で培養することができる。更に適当な因子はMinguell JJ，Erices，A and Conget，P（2001）「間葉幹細胞（Mesenchymal Stem Cells）」．Exp．Biol．Med．226（6）：507−520によって例示され、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
本発明のもう一つの態様では、他の余り特異性でなく且つユニークでない哺乳類ＭＳＣマーカーを、本発明のマーカーを用いて平行して分析することができる。このような他のマーカーは、ＳＨ−２、ＳＨ−３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２０a、ＣＤ１２４、ＣＤ１０５、およびＭＳＣが発現することができるStro−１である。しかしながら、これらのマーカーは哺乳類ＭＳＣについては特異性ではない。ＭＳＣで発現しないマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５であり、それらの発現または発現の欠如は、別態様では、本発明による方法おいて評価することもできる。
もう一つの態様では、上記発現は、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１タンパク質の発現を検出することによって検出される。
α１０／α１１の発現は、一態様では、例えば、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ（商標））または特異性の高い任意の他の方法を用いることによる蛍光細胞選別法によって分析することができる。FACSを用いるマルチカラー分析を用いることができ、これは特に好都合である。従って、ＭＳＣは、特定の抗原に対する染色の程度に基づいて分離することができる。
最初の分離では、他のマーカーに対する抗体を用いて、１種類以上の蛍光色素で標識することができる。用いられる他のマーカーは、他の態様では、ＳＨ−２、ＳＨ−３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２０a、ＣＤ１２４、ＣＤ１０５、およびＭＳＣが発現することができるＳｔｒｏ−１であることができる。ＭＳＣで発現しないマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５であり、それらの発現または発現の欠如は他の態様では本発明による方法または断片で評価することもできる。
ＭＳＣでない他の系統または細胞個体群を一段階で除去しようとするときには、このような系統に特異的なマーカーに対する様々な抗体を包含することができる。
マルチカラー分析で用いることができる蛍光色素としては、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン、Texasレッドなど当業者に周知のものが挙げられる。
ＭＳＣは、死んだ細胞（ヨウ化プロピジウム、ＬＤＳ）と会合した色素を用いることによって、死んだ細胞に対して選択することができる。これらの細胞は、ウシ胎児血清を含んでなる培地で集めることができる。
ＭＳＣはまた、光散乱特性および様々な細胞表面抗原のそれらの発現を本発明による方法を用いる同定と組み合わせて選択することもできる。
あるいは、ＭＳＣは、免疫沈澱によってインテグリンα１０および／またはα１１鎖の発現を検出して同定することによって分析することもできる。適当な免疫沈澱法を、以下に簡単に説明する。任意の他の適当な免疫沈澱法を、本発明の方法で用いることもできる。
簡単に説明すれば、
１． インテグリンサブユニットα１０およびα１１の細胞質ドメインに対する抗体を用いて、細胞溶解物からそれぞれインテグリンα１０β１およびα１１β１を特異的に免疫沈澱することができる。インテグリンα１０またはα１１の免疫沈澱に適するポリクローナル抗体は知られており、J．Biol．Chem．(1998，273：20383-9）に公表されている。
２． 次に、インテグリンサブユニットα１０またはα１１を発現するＭＳＣを、場合によっては血清および増殖因子を含むＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩのような適当な細胞培地で増殖させることができる。プレートに付着している細胞をＰＢＳで一回洗浄した後、表面を例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce)／４ml ＰＢＳを用いて氷上で２０分間、または当業者に知られている任意の他の適当なビオチン化試薬を用いて、ビオチン化する。
３． 次に、細胞をＰＢＳで一回洗浄した後、１０ｍｌ ０．１Ｍグリシン／ＰＢＳを氷上で５分間加えた。ＰＢＳで一回洗浄した後、細胞を１ｍｌリーシス緩衝液（１％ ＮＰ−４０，１０％グリセロール，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＣａＣｌ２，プロテーゼインヒビターカクテルRoche，ｐＨ７．５）中氷上でリーシスする。
４． 細胞溶解物１５，０００gで１０分間遠心分離し、上清を除いてα１０／α１１プレ免疫血清と共にインキュベーションした後、２０μｌ Prot Ｇセファロース（Amersham）／１００μｌリーシス緩衝液を加える。
５． ４で１時間回転した後、溶解物を８０００rpmで１分間遠心分離し、上清を集める。それぞれの次の免疫沈澱のため、１５０μｌの細胞溶解物上清をエッペンドルフ試験管に採取し、抗血清またはモノクローナル抗体溶液１μｌを加える。
６． 用いた抗体はウサギ−抗−ヒトα１０血清およびウサギ−抗−ヒトα１１血清である（インテグリンの細胞質ドメインに対する血清は、α１１についてはTiger et al．（Developmental Biology（2001）237：116）、α１０についてはCamper et al（J．Biol．Chem．(2001）306：107−116）によって公表された）。
７． ４℃で２時間回転した後、２０μｌ プロトＧセファロース（Amersham）／１００μｌリーシス緩衝液を加え、混合物を更に４５分間回転する。次に、セファロース−ビーズを短時間遠心分離し、リーシス緩衝液で３回洗浄する。
８． ２０μｌ ＳＤＳ ＰＡＧＥ試料緩衝液（１００ｍＭ ＤＴＴを含む）をセファロースビーズに加え、試料を５分間煮沸する。
９． それぞれの試料５μｌを８％ストレートゲル（Novex）上で処理した後、PVDF膜で電気泳動する。膜を２％ ＢＳＡ／Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ中でブロック１時間ブロックし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、０．０５％ Ｔｗｅｅｎで１回洗浄した後、２μｌ エクストラビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）／８mlブロック緩衝液と共にインキュベーションする。
１時間後、エクストラビジン−ペルオキシダーゼ溶液を除去し、膜をＴＢＳＴ中で３ｘ２０分間洗浄する。次に、表面のビオチン化タンパク質を、例えば、ＥＣＬ（Amersham）で検出し、写真フィルム上に可視化することができる。
更にもう一つの態様では、インテグリン鎖α１０および／またはα１１の発現が、本発明による方法でＭＳＣの細胞表面またはＭＳＣの細胞内に検出される。フローサイトメトリーおよび免疫沈澱のような上記の方法を用いることができる。
更にもう一つの態様では、上記ｂ）における発現は、「免疫化学的方法（Immunochemical protocols）（「分子生物学の方法（Methods in molecular biology）」，Humana Press Inc）に記載の方法など任意のイムノアッセイによって検出される。検出は、様々な方法、例えば、免疫沈澱、ウェスタンブロット法またはフローサイトメトリー法、例えば、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）のような当業者に知られている任意の免疫法によって行うことができる。モノクローナル抗体またはその断片のような抗体は、特に細胞系統および／または分化の段階に関連したマーカー、表面膜タンパク質並びに細胞内マーカーの同定に特に有用である。従って、これは、インテグリンα１０並びにα１１の同定に適している。更に、同定は、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１分子に特異的に結合するタンパク質またはペプチドのような任意の特異的分子によっても行うことができる。このようなタンパク質またはペプチドの例は、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１分子に結合する天然リガンドである。このような天然リガンドは、形質転換し、化学的に合成し、または天然供給源から精製することができる。更にもう一つの態様では、上記発現はインテグリンα１０および／またはインテグリンα１１ ｍＲＮＡの発現を検出することによって検出される。特異タンパク質のｍＲＮＡ発現の検出は当業者には周知であり、一般に目的とするｍＲＮＡに特異的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いてこのプローブが他のｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件下でｍＲＮＡを探査することによって行われる。様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることもでき、これは当業者には明らかである。
適当なＰＣＲ法を、下記に示す。簡単に説明すれば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることができる。
ＲＮＡは、ヒト間葉幹細胞または軟骨形成前駆細胞から標準的方法によって、例えば、RNeasy Mini Kit（Qiagen Germany）の使用によって調整することができる。
cDNAは、トランスクリプターゼ反応、Superscript II（Invitrogen，米国）により、製造業者の推奨に従ってオリゴｄ（Ｔ）−プライマーまたは遺伝子特異的プライマーを用いて産生することができる。
その後、ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを増幅する。α１０に対する特異的プライマーである前進5’ GCT CCA GGA AGG CCC CAT TTG TG 3’および復帰5’ GTG TTT TCT TGA AGG GTG CCA TTT 3’、またはα１１に対する前進5’ GCT GCA GGC AGT GAC AGT A 3’および復帰5’ GCG ATG GGA ATG GTG ATC T 3’をｃＤＮＡに加え、特異的産物をPlatinum Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen，米国）により６５度で３０サイクルの製造業者の推奨条件に従って増幅する。
インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１分子の発現の評価を、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１分子を発現する参照細胞個体群並びにインテグリンα１０および／またはインテグリンα１１分子を発現しない細胞個体群と比較して行うことができる。インテグリンα１０およびα１１を発現する細胞の例は、α１０およびα１１インテグリン配列をトランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞およびＨＥＫ２９３細胞である。α１０およびα１１を発現しない細胞の例は、トランスフェクションしていないＣ２Ｃ１２細胞およびＨＥＫ２９３細胞である。
哺乳類ＭＳＣが濃縮した細胞の単離個体群の産生方法
本発明によれば、参照個体群と比較して哺乳類ＭＳＣが濃縮した細胞の個体群であって、
ａ） 細胞の個体群の少なくとも一部または参照個体群の少なくとも一部であって、ＭＳＣと少なくともＭＳＣ以外の少なくとも１個の細胞とを含んでなるものを提供し、
ｂ） 上記ａ）における細胞の個体群にＭＳＣを同定する化合物を導入し、
ｃ） 上記ｂ）の細胞の個体群からＭＳＣを選択して単離することによってＭＳＣが濃縮した細胞の個体群を産生する
工程を含んでなる方法が開示される。
個体群の提供は上節に記載されており、ＭＳＣの同定の方法と同様な方法で行うことができる。細胞の個体群をBMから集めるときには、出発個体群または「未加工個体群」の約０．０１−０．００１％がＭＳＣである。しかしながら、これは様々なドナー間で異なることがある。
ＭＳＣを同定する目的で導入される化合物は、タンパク質、ペプチド、モノクローナル抗体またはその部分、またはＭＳＣを同定するポリクローナル抗体でよい。一態様では、ＭＳＣは、上記のＭＳＣを同定するための方法によって上記ＭＳＣの細胞表面のインテグリン鎖α１０および／またはα１１の発現を検出することによってＭＳＣとして同定される。
ＭＳＣの選択および単離は、同定したＭＳＣを分離することにより単離する分離工程である。様々な手法を用いて、ＭＳＣ以外の系統に供される細胞を最初に除去することによって細胞を分離することができる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその部分は、本明細書では完全な生長可能な細胞のマーカーを同定するのに特に有用であり、マーカーは特定の細胞系統および／または分化の段階と関連した表面膜タンパク質である。ＭＳＣの同定に用いられる化合物は、分離工程に用いることもできる。従って、抗体またはその部分のような上記の（複数の）化合物を固形支持体に接着して、最初の大まかな分離を行うことができる。固形支持体の例は、ビーズ、例えば、磁気ビーズ、アガロースまたは他の同様な種類の当業者に知られているビーズである。細胞の分離に適する任意の手段を、分離が細胞の生長力に余り不利益にならない条件で用いることができる。
用いられる分離手法は、回収を行う画分のバイアビリティー（生存力）を最大限に保持するものであるべきである。バイアビリティーの評価を下記に説明する。
簡単に説明すれば、細胞バイアビリティーの評価は、例えば、フローサイトメトリーを用いて行うことができる。従って、細胞を染色した後であるがフローサイトメーターで処理する前に、下記の量／濃度の適当な細胞バイアビリティー色素を加えて、生／死細胞を識別することができる。多数のこのような色素が存在しており、その例およびそれらを用いる典型的な方法が記載されている。原理はこれらの色素のほとんどについて同じであり、これらの色素は、細胞膜が欠陥を有しているときに、通常の意味では、これらの色素で染色する細胞が死んでいる、および染色しない細胞が生きていると考えられるときに、細胞に入る。
色素の例は、下記の通りである。
ａ） ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）：
母液：エタノール／ＰＢＳ中に５０μg／μｌ
添加量：試験管中で培地１００μｌ当たり１μｌ
ｂ） ７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）
母液： ＭｅＯＨ中に１ｍｇ／ｍｌ
添加量：試験管中で培地１００μｌ当たり１μｌ
ｃ） Ｔｏ−Ｐｒｏ３
母液：１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液
添加量：溶液５００μｌ〜１ｍｌ当たり１μｌ
ｄ） エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）
母液：ＥｔＯＨ中に５０μg／ｍｌ
添加量：１ｘ１０６個の細胞当たり５μg／ｍｌ
他の方法は、A．Radbruchの「フローサイトメトリーおよび細胞選別法（Springer Labマニュアル）」Springer Verlag（第２版，2000年１月）に記載されている。
回収した画分の細胞バイアビリティーは＞９０％であり、好ましくは９５、９６、９７、９８、９９、９９．９または１００％である。
本発明の方法における細胞の分離に用いられる特定の手法は、分離の効率、その方法の細胞傷害性、作業の容易さおよび速さ、および精巧な装置および／または専門的技術の必要性によって変化する。
分離の手順としては、例えば、抗体コーティングした磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合したまたはモノクローナル抗体と共に用いられる細胞傷害性薬剤、例えば、補体および細胞毒素、およびプレートなどの固形マトリックスに接着した抗体を用いる「パンニング」、または他の好都合な手法を包含することができる。正確な分離を行う手法としては、蛍光活性化セルソーターであって、例えば、当業者に知られている複数のカラーチャンネル、光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなど様々な精巧度を有することができるものが挙げられる。
本発明の方法で用いるのに適する分離法のもう一つのプロトコールは、Orfao，A and Ruiz−Arguelles，A（（1996）「細胞選別法の一般的概念（General Concepts about Cell Sorting Techniques）」．Clin Biochem．29（1）：5−9）、およびHerzenberg，LA，De Rose，SC and Herzenberg，LA（（2000）「モノクローナル抗体およびFACS：免疫生物学および医学の相補的手段（Monoclonal Antibodies and FACS：complementary tools for immunobiology and medicine)」．Immunol．Today．21（8）：383−390）によって報告されている。
本発明による方法の一態様では、哺乳類ＭＳＣの少なくとも１つの濃縮段階が含まれる。
更にもう一つの態様では、ＭＳＣの最初の濃縮段階はネガティブ選択であり、すなわち他の系統が関連した細胞を最初の細胞の個体群から枯渇させまたは除去する。ネガティブ選択において除去しようとする細胞の例は、下記のマーカー、すなわちＣＤ１４（単核細胞、顆粒球、樹状細胞、マクロファージおよびB細胞）、ＣＤ３４（造血前駆細胞）およびＣＤ４５（白血球）によって同定される。哺乳類ＭＳＣのネガティブ選択に有用なそれらおよび他のマーカーは、Conget，PA，Minguell JJ（（1999）「ヒト骨髄間葉前駆細胞の表現型および機能特性（Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells）」．J．Cell Physiol．181：67−73）、およびPittenger MF et al．（（1999）「成人間葉幹細胞の様々な能力（Mutlilineage potential of adult human mesenchymal stem cells）」，Science．284：143−7）に詳細に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
更にもう一つの態様では、最初の濃縮は、ＭＳＣの所望な純度が得られるまで反復することができるＭＳＣのポジティブ選択である。ポジティブまたはネガティブ選択については、タンパク質、ペプチド、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を、上記したようにインテグリンα１０またはインテグリンα１１分子を同定するための化合物として用いることができる。この化合物は、直接分離を行うことができる磁気ビーズ、アビジンと共に除去することができるビオチン、支持体に結合したストレプトアビジン、蛍光活性化セルソーターと共に用いることができる蛍光色素など上節で例示されたような特定の細胞の種類の分離を容易にすることができる分離手段と対で用いることができる。目的とする細胞、すなわちＭＳＣのバイアビリティーに余り不利益にならない任意の手法を用いることができる。
一態様では、選択は、例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ（商標））または特異性の高い任意の他の同様な方法を用いることによる蛍光細胞選別法によって分析することができる。マルチカラー分析は、特に好都合であるFACSおよびフローサイトメトリーの技術に熟練した者に周知の技術を用いることができる。細胞は、特定の抗原に対する染色の程度に基づいて分離することができる。最初の分離では、他のマーカーに対する抗体を用いて、１種類以上の蛍光色素で標識することができ、特定の目的に用いられる系統、すなわちインテグリンα１０および／またはインテグリンα１１の抗体を（複数の）異なる蛍光色素に接合させることができる。他のマーカーは、他の態様では、ＳＨ−２、ＳＨ−３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２０a、ＣＤ１２４、ＣＤ１０５、およびＭＳＣが発現することができるＳｔｒｏ−１であることができる。ＭＳＣで発現しないマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５であり、それらの発現または発現の欠如は他の態様では本発明によるマーカー、例えば、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１の発現と共に評価することもできる。
他の系統または細胞個体群をこの段階で除去しようとするときには、このような系統に特異的なマーカーに対する様々な抗体を包含することができる。マルチカラー分析で用いることができる蛍光色素としては、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン、Texasレッドなどが挙げられる。
細胞は、ヨウ化プロピジウムまたはＬＤＳ−７５１（Laser Dye Styryl−７５１（６−ジメチルアミノ−２−［４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１，３−ブタジエニル］−１−エチルキノリニウムペルクロレート））のような死細胞と会合した色素を用いることによって、死細胞に対して選択することができる。細胞は、Iscoveの改良Dulbecco培地（ＩＭＤＭ）のような任意の適当な細胞培地、または任意の生理学的食塩溶液であって、好ましくはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝液であって、場合によってはウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むもので回収することができる。ポジティブまたはネガティブ選択のための他の手法であって、アフィニティーカラムなどのような正確な分離を行うことができ、Silvestri F，Wunder E，Sovalat H，Henon P，Serke S「ＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択：実験および臨床使用に現在利用可能な免疫吸着法の簡単な総説（Positive selection of ＣＤ３４＋ cells：a short review of theimmunoadsorption methods currently available for experimental and clinical use)」（「幹細胞の方法論についての第2回欧州ワークショップ」の報告，Mulhouse，フランス，1993年5月3−7日．J Hematother．1993 Winter；2（4）：473−81）、およびBasch RS，Berman JW，Lakow E．「ポジティブ免疫選択法を用いる細胞分離（Cell separation using positive immunoselective techniques）」（J Immunol Methods．1983年2月11日；56（3）：269−80）によって報告されているものを用いることができる。
細胞は、光散乱特性並びにそれらの様々な細胞表面抗原の発現に基づいて選択することができる。
分離の特定の順序は本発明には重要ではないと思われるが、示された順序は作用することが知られている本発明を行う一つの方法である。従って、細胞は最初に大まかに分離され、好ましくはネガティブ選択によって、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５のようなネガティブ細胞マーカーを用いてＭＳＣに関係のない細胞が除去されることが示唆される。このような細胞は、インテグリンα１０および／またはα１１の発現に対してネガティブである。ネガティブ選択の後に精密分離が続き、これはポジティブ選択であり、ポジティブ選択はＭＳＣと会合したマーカーのものであり、ネガティブ選択は系統と関連した細胞と会合したマーカーについてであり、他の幹細胞個体群はＭＳＣではない。次に、この分離に続いて、細胞個体群、または上記個体群を含んでなり、ＭＳＣとしての多系統潜在力と増加した自己再生能を有する細胞組成物の選択を行う。この組成物を、更に以下に説明する。
単離した哺乳類ＭＳＣ
本発明によれば、哺乳類ＭＳＣの細胞個体群が開示される。このような細胞個体群は、完全な生長可能なＭＳＣを含んでなり、このＭＳＣは、
ａ） 上記ＭＳＣの細胞表面上またはＭＳＣの細胞内でインテグリンα１０鎖および／またはインテグリンα１１鎖を発現し、
ｂ） 関連した造血細胞に特異的な分子は実質的に発現しない
ことを特徴としている。
関連した造血細胞に特異的な分子は、例えば、ＣＤ４５である。ＭＳＣ細胞が実質的に持たない他の分子は、例えば、ＣＤ３４およびＣＤ１４である。
もう一つの態様では、このような個体群の濃縮は約７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９．９または１００％である。このような細胞のバイアビリティーは、上記に詳細に記載されている。
本発明によれば、本発明のマーカーを発現する単離したＭＳＣが開示される。単離したＭＳＣは、本発明のＭＳＣが濃縮した細胞の個体群を産生する方法によって得ることができる。
細胞組成物
本発明によれば、哺乳類細胞組成物が開示される。このような組成物は、本発明による濃縮した哺乳類細胞個体群または本発明による単離した哺乳類ＭＳＣを含んでなる。
ヒトＭＳＣ細胞が９０％を上回り、通常は約９５％を上回り、例えば、９７、９８、９９．９％である組成物は、開示されたＭＳＣの濃縮法によって得ることができる。このようなＭＳＣは、骨細胞、軟骨細胞、例えば、肥厚軟骨細胞、筋肉細胞、筋管、間質細胞、Ｔ／Ｌ繊維芽細胞、脂肪細胞、腱細胞（tenocytes）、皮膚細胞、および他の細胞のような様々な系統のＭＳＣの総ての細胞の細胞再生および発生を促すことができる。これは、一般に以前に記載した特異的因子を加えた培養物で行われる。
最後に、単一細胞をＭＳＣ組成物から得て、ＭＳＣが欠乏した哺乳類の長期再構成、および／または間葉組織形成または再生に用いることができる。ＭＳＣ組成物は、治療上有効な用量で投与すべきであり、用量はヒトのような上記哺乳類の数を増やすことができる特異的な細胞数である。この細胞数はドナー毎に異なっていてもよく、細胞移植を必要とするヒトなどの哺乳類への細胞移植の技術に熟練した者によって症例毎に経験的に決定することができる。
ＭＳＣおよびＭＳＣを含んでなる組成物を移行して固定するには、様々な手順が考えられ、単離細胞を関節軟骨の損傷などの骨格上の欠陥部位に投与し、単離細胞を適当なゲルでインキュベーションし、生体で再吸収可能な（bioresorbable)骨格とインキュベーションし、または全身輸液するなどを包含する。異なる手順が知られており、例えば、Risbud，MV and Sittenger，M（（2002）「組織工学：イン・ビトロでの軟骨再生の進歩（Tissue Engineering：advances in in vitro cartilage regeneration）」．Trends in Biotech．20（8）：351-356）、Caplan，A and Bruder，S．P．（（2001）間葉幹細胞：21請求項の分子医薬の構築ブロック（Mesenchymal stem cells：building blocks for molecular medicine in the 21st century）」．Trends Mol Med．7（6）：259-64）、Lazarus，HM et al．(（1995）「ヒト骨髄由来の間質前駆細胞（間葉前駆細胞）のエクス・ビボ増殖およびそれに続く輸液：治療での使用の重要性（Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells（mesenchymal progenitor cells）：Implications for therapeutic use)」．Bone Marrow Transplant 16：557−564）、およびKoc ON et al（（2000）「多量投与量の化学療法を受けている進行胸部癌患者における自己由来の血液幹細胞および培養によって増殖した骨髄間葉幹細胞の同時輸液後の速やかな造血機能の回復（Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high−dose chemotherapy）」．J．Clin．Oncol 18（2）：307-16）によって詳細に記載されている。
場合によっては、ＭＳＣをインテグリンα１０またはα１１に対する抗体と共にインキュベーションして、細胞を定位置に保持することができる。従って、抗体を生体で再吸収可能な（bioresorbable）骨格に接合して細胞を固定した後、損傷または欠陥部位、例えば、骨格上の欠陥部位に移植することができる。この骨格により、ＭＳＣを３Ｄ固定を行うことができる。適当な生体材料骨格を、以下に例示する。記載例は、特定の応用に一層適する場合には、熟練した技術者にとって明らかな他の適当な骨格の使用の選択を制限するものではない。
骨格の種類としては、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびコポリマー（ＰＬＧＡ）のような生体で再吸収可能な（bioresorbable)ポリ（α−ヒドロキシエステル）骨格が挙げられる。
他の態様としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルギン酸塩、およびキトサンのようなポリマーゲルから誘導される骨格が挙げられる。
他の態様としては、リン酸三カルシウムおよび／またはヒドロキシアパタイトセラミックブロックのような多孔性キャリヤーから誘導される骨格が挙げられる（Luyten，F．P，Dell'Accio，F and De Bari，C（2001）「骨格組織工学：機会と挑戦（Skeletal tissue engineering：opportunities and challenges）」．Best Prac ＆ Res．Clin．Rheum．15（5）：759−770）。
本発明による細胞組成物は、遺伝病の治療に用いることができる。ＭＳＣと関連した遺伝病は、遺伝子欠陥を修正する目的で自己由来または同種ＭＳＣを遺伝子修飾することによって治療することができる。例えば、様々な結合組織疾患、例えば、骨形成不全症、Ehlers Danlos症候群、軟骨形成不全症、Alport症候群のような疾患は、相同またはランダム組換えによる野生型遺伝子をＭＳＣに導入することによって修正することができる。疾患の修正のための相同組換えの方法は知られており、Hatada S，Nikkuni K，Bentley SA，Kirby S，Smithies O．(（2000）「相同組換えによる造血前駆細胞の遺伝子修正（Gene correction in hematopoietic progenitor cells by homologous recombination）」．Proc Natl Acad Sci USA 97（25）：13807−11）によって記載されている。
同種ＭＳＣを用いると、遺伝子欠陥を有する同じ種の哺乳類由来の星状細胞を治療法として用いることができる。遺伝子療法の他の態様としては、正常なＭＳＣを利点を有し且つ選択的圧力を受けやすくすることができる薬剤耐性遺伝子、例えば、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）の導入が挙げられる。更に詳細については、Aran JM，Pastan I，Gottesman MM（1999）「多剤耐性表現型を伴う治療法：遺伝子療法におけるターゲット、化学保護剤および選択的マーカーとしてのMDR1遺伝子（Trapeutic strategies involving themultidrug resistance phenotype：the MDR1 gene as target，chemoprotectant，and selectable marker in gene therapy）」．(Adv Pharmacol 46：1−42）に記載されている。
ＭＳＣと関連したもの以外の疾患であって、疾患がホルモン、酵素、インターフェロン因子などのような特定の分泌産物の欠如に関係しているものを治療することもできる。適当な調節開始領域を用いることによって、欠陥タンパク質の誘導的産生を行うことができ、タンパク質の産生はこのようなタンパク質を正常に産生する細胞型とは異なる細胞型となるが、産生は天然の産生と同様のものとなる。リゾチーム、アンチセンスまたは他のメッセージを挿入して、特定の遺伝子産物または疾患、特に結合組織に対する罹患率を阻害することもできる。
ＭＳＣの調節
本発明によれば、試験化合物が哺乳類ＭＳＣの分化を調節するかどうかを決定する方法が開示される。このような方法は、
ａ） ＭＳＣを提供し、
ｂ） ＭＳＣを試験化合物と接触させ、
ｃ） ＭＳＣの分化の速度またはパターンの変化を試験化合物がＭＳＣ分化を調節する指標として検出する
工程を含んでなる。
提供されたＭＳＣは、開示された方法のいずれかによって得られた濃縮した細胞個体群、本発明の単離したＭＳＣ、または本発明による細胞組成物であることができる。
試験化合物は、ＭＳＣに影響を及ぼすことが知られているまたは影響を及ぼすと考えられる任意の化合物、例えば、医薬組成物、薬剤、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはそれらの部分、例えば、インテグリンα１０および／またはインテグリンα１１またはＭＳＣ上の任意の他の分子、ＭＳＣの増殖を促進するのに用いられる因子、例えば、ＦＧＦまたはウシ胎児血清（ＦＢＳ）、またはＭＳＣの分化を促進するのに用いられる因子、例えば、デキサメタゾン、ＴＧＦβ、インスリンであることができる。
例えば、試験化合物がＭＳＣ分化を調節する指標としてのＭＳＣの分化の速度またはパターンの変化の検出は、フローサイトメトリーまたは当業者に知られている任意の免疫法のような任意の他の適当な方法によって行うことができる。分化の速度またはパターンの変化は、未処理のまたは偽薬投与したＭＳＣ個体群と比較して試験化合物で調節したＭＳＣの動態、機能または表現型の検討であることがある。これは、少なくとも１個の第二の試験化合物に対する比較であることもある。
もう一つの態様では、ＭＳＣは、本明細書に開示されたＭＳＣを同定する方法によって上記ＭＳＣの細胞表面またはＭＳＣの細胞内でのインテグリン鎖α１０および／またはα１１の発現を検出することによってＭＳＣとして同定される。
哺乳類ＭＳＣの使用
ヒトまたはマウスＭＳＣのような本明細書で提供される哺乳類ＭＳＣには、多数の用途がある。例えば、１）ＭＳＣを欠いている宿主の再生、２）再生を必要とする患者の骨、軟骨、筋肉、骨髄、腱／靱帯、および結合組織の再生のためのＭＳＣの再接合による宿主の処理、３）ＭＳＣの自己再生に関連した増殖因子の検出および評価、４）ＭＳＣ系統の発生、およびそれらの発生および分化と関連した因子のスクリーニング。
更に、インテグリンα１０および／またはα１１は、幾つかの用途を有する。例えば、用途の例は、哺乳類間葉幹細胞を、損傷した組織を修復するための細胞療法における有用な手段として、混合細胞個体群から同定し、識別し、単離することであることがある。
本発明によれば、本発明によるインテグリンα１０および／またはα１１の用途は、ＭＳＣの同定の目的で開示される。
更に、本発明によるインテグリンα１０および／またはα１１の用途は、ＭＳＣの分化の調節について開示される。
更にまた、本発明によるインテグリンα１０および／またはα１１の用途は、ＭＳＣまたはＭＳＣの濃縮個体群の単離について開示される。
哺乳類ＭＳＣ
本発明で開示された方法および用途では、哺乳類ＭＳＣ、哺乳類細胞個体群、および哺乳類細胞組成物が開示される。
特定の態様では、哺乳類はヒトであることができる。
更に他の態様は、哺乳類がラット、マウス、またはMuridae科の任意の他の動物であるような齧歯類であるものを包含する。
実施例１
ヒトＭＳＣ上でのインテグリンα１０およびインテグリンα１１鎖の検出
目的
この例の目的は、免役沈澱を用いてインテグリンα１０およびα１１の発現のためのヒトＭＳＣを分析することである。
材料および方法
ヒト間葉幹細胞（継代２でＩｎ Ｖｉｔｒｏ，スウェーデンから入手）を、継代４までＭＳＣＢＭ培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，スウェーデンから提供）で培養した後、表面をビオチン化した。
簡単に説明すれば、プレートに接着した細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、表面を０．５ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce)を４ｍｌ ＰＢＳに溶解したもので２０分間ビオチン化した。次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１０ｍｌ ０．１Ｍグリシン／ＰＢＳを５分間加えた。
ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を１ｍｌリーシス緩衝液（１％ ＮＰ４０，１０％グリセロール，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＣａＣｌ２，プロテーゼインヒビターカクテルＢＭ，ｐＨ７．５）中でリーシスした。細胞溶解物をプラスチックスクレーパーで回収し、エッペンドルフ試験管に移し、１５，０００gで１０分間遠心分離した。
上記の遠心分離段階から回収した上清をα１０プレ免疫血清２μｌと共にインキュベーションした後、ProtＧセファロース（Amersham）２０μｌをリーシス緩衝液１００μｌに溶解したものを加えた。
細胞をリーシス緩衝液中で４℃で一晩回転した後、溶解物を８０００rpmで１分間遠心分離し、上清を回収した。それぞれの次に行う免疫沈澱のため、１５０μｌの細胞溶解物をエッペンドルフ試験管に移し、抗血清１μｌを加えた。用いた血清は、それぞれウサギ−抗−ヒトα１０およびウサギ−抗−ヒトα１１（いずれもインテグリンの細胞質ドメインに対する血清）であった。
４℃で１時間回転した後、２０μｌのタンパク質Ｇセファロース（Amersham）を１００μｌのリーシス緩衝液に溶解したものを加え、混合物を更に３０分間回転した。
次に、セファロースビーズを短時間遠心分離し、リーシス緩衝液で３回洗浄した。
２０μｌの SDS−PAGE試料緩衝液（１００ｍＭ ＤＴＴを含む）をセファロースビーズに加えた後、試料を５分間煮沸した。それぞれの試料５μｌを８％ SDS−PAGEゲル（Novex）で処理した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動した。
膜を２％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ＴＢＳＴ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で１時間ブロックし、ＴＢＳＴで１回洗浄した後、２μｌ エクストラビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）／８ｍｌブロック緩衝液と共にインキュベーションした。
エクストラビジン−ペルオキシダーゼ溶液を除去し、膜をＴＢＳＴ中で３ｘ２０分間洗浄した。次に、表面をビオチン化したタンパク質をＥＣＬ（Amersham）で検出し、写真フィルム上に可視化した。
結果および議論
図２に、免疫沈澱の結果を示す。培養物中のヒト間葉幹細胞は、それらの表面上にインテグリンα１０およびα１１を発現する。図において、上部バンドはα１０（左レーン）およびα１１（右レーン）である。両レーンの下部バンドはβ１鎖である。
インテグリンα１０およびα１１の発現が確認される。
実施例２
インテグリンα１０β１およびα１β１を発現するHEK２９３細胞の同定
目的
この例の目的は、α１０およびα１１に対する抗体を用いてインテグリンα１０β１およびインテグリンα１１β１を発現するHEK２９３細胞を同定し、識別することである。
材料および方法
インテグリンα１０およびα１１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞およびトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞をトリプシン化し、ＰＢＳで洗浄した後、α１０およびα１１に対するインテグリン抗体（１μｌ／ｍｌ、１％ ＢＳＡを補足したＰＢＳ中）と共に２０分間インキュベーションした。
標識した細胞をＰＢＳ／１％ ＢＳＡで２回洗浄した後、１μｌ／ｍｌの濃度のＰＥ標識したヤギ−抗−マウスＩｇ（Pharmingen，BD Biosciences）でＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中で２０分間インキュベーションした。
次いで、細胞をＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中で２回洗浄し、FACSort（商標）（Becton−Dickinson）上でCell Quest（商標）ソフトウェアプログラム（Becton−Dickinson）を用いて１０，０００の結果を集めることによって分析した。
結果
結果を、ＦＡＣＳ分析の後、ヒストグラムとして図３Ａ−Ｉに示す。
ＦＡＣＳ分析法では、図３Ｅには、ヒトα１０インテグリンサブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞に結合したα１０に対する抗体が示されている。これは、ＦＡＣＳヒストグラムにおける右への移動として見えた。
α１０に対する抗体は、中段パネル（右、図３Ｆ）に示されているように、ヒトα１１インテグリン−サブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞または図３Ｄに示されるようにトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞には結合しなかった。
同様に、図３Ｉには、ヒトα１１インテグリン−サブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞に結合したα１１に対する抗体が示されている。これは、ＦＡＣＳヒストグラムにおける右への移動として見えた。α１１に対する抗体は、図３Ｈに示されるようにヒトα１０インテグリン−サブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞または図３Ｇに示されるようにトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞には結合しなかった。
図３Ａ−Ｃは、コントロール（二次抗体のみ）を表しており、試験したＨＥＫ２９３細胞のいずれにも結合しなかった。
要約すれば、図３Ａ−Ｉは、インテグリンα１０β１およびインテグリンα１１β１を発現するＨＥＫ２９３細胞を、これらのインテグリンに向けた抗体を用いるＦＡＣＳ分析によって特異的に選別することができることを示している。
実施例３
ヒト骨髄由来のヒトコロニー形成細胞からインテグリンα１０を発現するＭＳＣの同定
目的
ヒト骨髄由来のコロニー形成細胞が、インテグリンα１０を発現し且つ間葉幹細胞の個体群を表すかどうかを試験する。
材料および方法
ヒト単核骨髄細胞を、骨髄から密度遠心分離によって単離した。
３０ｘ１０６個の細胞をT７５フラスコ中の２０ｍｌ培地（ＭＳＣＧＭ培地、Poieticsにより提供され、Invitroにより配達。４４０ｍｌ ＭＳＣＢＭ（ロット番号０１７１９０）および２ｘ２５ｍｌ ＭＣＧＳ（ロット番号０８２２９５）、およびL−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含んでなる）に採取し、細胞インキュベーターでインキュベーションした。
細胞を１２日目まで増殖させた後（培地は２回交換）、トリプシン化して、分離した（５０００個／ｃｍ２）。一般に、細胞は９０％集密度で分離した。
細胞を更に３日間増殖させた後、再度分離した（５０００個／ｃｍ２）。この時点で、ＦＧＦ−２のｈＭＳＣでのα１０発現に対する影響を検討した。１つのプレートは以前と同様に培地で増殖させ、１つのプレートは培地＋５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２で増殖させた。ＦＧＦ−２を含むまたは含まない培養物中で２週間後（１継代を含む）、細胞を分析する手段としてα１０に対するモノクローナル抗体を用いてＦＡＣＳによって細胞を分析した。
結果
結果を、図４にフローサイトメトリーヒストグラムとして示す。
ＦＧＦ−２の投与の２週間後、ＦＧＦ−２を投与した細胞の９６％はインテグリンα１０を発現した（下段パネル、図４ｂ）。
コントロール（二次抗体のみ）は、上段パネルの図４ａに示す。細胞を非ＭＳＣマーカー（ＣＤ３４およびＣＤ４５）について試験し、ネガティブであることを見出した（結果は示さず）。
細胞をその形態学についても分析し、光学顕微鏡法により、細胞がＭＳＣに典型的なコロニーを形成することが明らかになった。
推定的間葉幹細胞（ＭＳＣ）から高度に分化した表現型への段階的移行を示唆する略図（Caplan A．I．and Bruder S．P．，Trends Mol．Med．2001，7（6）：259−264）。 培養物中のヒト間葉幹細胞がインテグリンα１０およびα１１鎖をその細胞表面上に発現することを示す図。図中、両レーンの上部バンドはα１０（左レーン）およびα１１（右レーン）である。両レーンの下部バンドはβ１鎖である。 フローサイトメトリー分析の後のヒストグラム。図３Ｅには、ヒトα１０インテグリンサブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞に結合したα１０に対する抗体が見える。α１０に対する抗体は、中段パネル（右、図３Ｆ）に示されているように、ヒトα１１インテグリン−サブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞または図３Ｄに示されるようにトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞には結合しなかった。図３Ｉには、ヒトα１１インテグリン−サブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞に結合したα１１に対する抗体が示されている。α１１に対する抗体は、図３Ｈに示されるように、ヒトα１０インテグリン−サブユニットでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞または図３Ｇに示されるようにトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞には結合しなかった。図３Ａ−Ｃはコントロール（二次抗体のみ）を表しており、試験したＨＥＫ２９３細胞のいずれにも結合しなかった。 フローサイトメトリーヒストグラム。ＦＧＦ−２の投与の２週間後、ＦＧＦ−２を投与した細胞の９６％はインテグリンα１０を発現した（下段パネル、図４ｂ）。コントロール（二次抗体のみ）は、上段パネルの図４ａに示す。

Claims (13)

  1. 間葉幹細胞の細胞表面上または間葉幹細胞の細胞内で発現した、インテグリンα１０鎖、またはインテグリンα１０鎖とインテグリンα１１鎖を含んでなるマーカーの、哺乳類間葉幹細胞のマーカーとしての使用。
  2. インテグリンα１０鎖、またはインテグリンα１０鎖とインテグリンα１１鎖がインテグリンβ１鎖と組み合わせたヘテロ二量体として発現する、請求項１に記載の使用。
  3. 哺乳類間葉幹細胞の同定方法であって、
    ａ） 間葉幹細胞を含んでなる試料を提供し、
    ｂ） 間葉幹細胞の細胞表面上または間葉幹細胞の細胞内でのインテグリン鎖α１０、またはインテグリン鎖α１０とα１１の発現を検出し、
    ｃ） インテグリン鎖α１０、またはインテグリン鎖α１０とα１１発現を評価し、
    ｄ） 上記ｃ）での評価に従って間葉幹細胞を同定する
    工程を含んでなる、方法。
  4. 前記ｂ）の発現を、インテグリン鎖α１０、またはインテグリン鎖α１０とα１１タンパク質発現を検出することによって検出する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ｂ）の発現を、インテグリン鎖α１０、またはインテグリン鎖α１０とα１１のｍＲＮＡ発現を検出することによって検出する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記ｂ）の発現をイムノアッセイによって検出する、請求項３または４に記載の方法。
  7. 試験化合物が哺乳類間葉幹細胞の分化を調節するかどうかを測定する方法であって、
    ａ） インテグリンα１０、またはインテグリンα１０とインテグリンα１１を発現する間葉幹細胞を提供し、
    ｂ） 間葉幹細胞を試験化合物と接触させ、
    ｃ） 試験化合物が間葉幹細胞の分化を調節することの指標として、間葉幹細胞の分化の速度またはパターンの変化を検出する
    工程を含んでなり、
    ここで、間葉幹細胞が、関連したリンパ造血細胞または関係のない幹細胞に特異的な分子の発現が実質的にないものであり、かつ
    請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法によって間葉幹細胞の細胞表面上または間葉幹細胞の細胞内でのインテグリン鎖α１０、またはインテグリンα１０とインテグリンα１１の発現を検出することによって、分化の速度またはパターンを検出する、方法。
  8. 参照個体群に対して間葉幹細胞数が高められた哺乳類細胞の単離された個体群を産生する方法であって、
    ａ） 少なくとも細胞の個体群の一部または参照個体群の一部であって、間葉幹細胞と間葉幹細胞以外の少なくとも１種類の細胞とを含んでなるものを提供し、
    ｂ） 上記ａ）の細胞の個体群に、間葉幹細胞の細胞表面上または間葉幹細胞の細胞内で発現したインテグリンα１０鎖、またはインテグリンα１０とインテグリンα１１鎖を同定する化合物を導入し、
    ｃ） 上記ｂ）の細胞の個体群から間葉幹細胞を選択して単離することによって、間葉幹細胞数が高められた細胞の個体群を産生する
    段階を含んでなる、方法。
  9. 請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法によって間葉幹細胞の細胞表面上のインテグリンα１０、またはインテグリンα１０とα１１鎖の発現を検出することによって、間葉幹細胞を間葉幹細胞として同定する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ｃ）における選択を蛍光細胞選別法によって行う、請求項８または９に記載の方法。
  11. 哺乳類間葉幹細胞の同定のための、請求項１または２に記載のマーカーの使用。
  12. 哺乳類間葉幹細胞の分化を調節するための、請求項１または２に記載のマーカーの使用。
  13. 哺乳類間葉幹細胞を単離するための、請求項１または２に記載のマーカーの使用。
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