CN112553289A - 一种评价car-t细胞有效性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种评估CAR‑T细胞有效性的方法，所述方法通过采用肿瘤类器官与CAR‑T细胞共培养，检测相关细胞因子和显微镜观测肿瘤类器官与CAR‑T细胞的相互作用及杀伤后的细胞形态变化评估CAR‑T细胞的有效性，可更为直观、准确和全面地评估CAR‑T细胞对肿瘤类器官是否有杀灭作用，所述方法具有较高的准确性、重现性和操作简便性。

Description

一种评价CAR-T细胞有效性的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种评价CAR-T细胞有效性的方法和一种CAR-T细胞的制备方法。
背景技术
随着城市化和老龄化进程的加快，恶性肿瘤已成为世界第二大死亡原因。尽管手术和放化疗仍是临床上治疗和缓解恶性肿瘤疾病进展的常规手段。然而个体差异以及药物耐受是临床上治疗失败的重要根源。肿瘤个体化免疫治疗是近年来全世界医学研究的热点，特别是以嵌合抗原受体(CAR)-T细胞领域，已经在多种肿瘤的免疫治疗方面取得重大突破。依据不同病人的表面抗原表达谱，设计并构建特异性靶向该抗原的CAR分子结构，装配到患者个体化的T细胞上，并以抗原独立的方式识别并杀伤肿瘤细胞。因此，CAR-T细胞免疫治疗是非常具有潜力的个人免疫治疗选择。
实际上，任何希望获得临床成功的个人免疫疗法都必须通过大量严格的临床前实验进行评估和验证。传统的单层细胞系和动物模型(患者来源的异种移植物，PDX)目前是临床前评估的两个常见选择。细胞系单层细胞可以在简单的体外培养条件下轻松扩增，但由于缺乏肿瘤特性而受到限制，而这正是个体化治疗评估的关键因素。PDX能较好的还原其原位肿瘤生物学特征，但费事费力，且接种成功率仍是关键的制约因素。
因此，仍亟需开发一种更准确、全面、直观和简便的评估CAR-T细胞有效性的方法。
发明内容
发明概述
本发明的第一目的是提供一种评估CAR-T细胞有效性的方法，解决现有技术中因缺乏肿瘤特性而不准确，及操作复杂，接种成功率低等问题；所述方法通过采用肿瘤类器官与CAR-T细胞共培养，检测相关细胞因子和显微镜观测肿瘤类器官与CAR-T细胞的相互作用及杀伤后的细胞形态变化，可更为直观和全面地确认CAR-T细胞对肿瘤类器官是否有杀灭作用，由于肿瘤类器官具有与患者肿瘤组织相近的肿瘤特性，以及不需要进行动物模型的构建，因此，所述方法更准确、全面、直观和简便。
进一步的，本发明公开了所述肿瘤类器官的制备方法，所述方法不同的培养时间采用不同的培养基进行培养，所得肿瘤类器官与肿瘤组织的病理形态学特征非常相似，可精确还原其来源肿瘤组织的病理形态学特征，进而提高评估CAR-T细胞有效性方法的准确性。
本发明的第二目的是提供一种CAR-T细胞的制备方法，所述方法操作简单，成功率高。
发明详述
第一方面，本发明提供一种评估CAR-T细胞有效性的方法。
一种评估CAR-T细胞有效性的方法，包括以下步骤：
(a)将肿瘤类器官经消化、细胞染色a，与细胞染色b后的CAR-T细胞分别重悬后共培养，得到共培养体系；
(b)取步骤(a)中共培养体系的上清液测定细胞因子；
(c)用接合荧光染料的颗粒酶B抗体对共培养体系进行染色，显微观测CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤情况。
所述肿瘤可以包括膀胱癌、肾癌或上尿路尿路上皮癌等肿瘤。
所述CAR-T细胞含有能与所述肿瘤或肿瘤类器官的细胞表面特异性靶点发生特异性结合的抗体。
在一些实施例中，所述肿瘤为膀胱癌，所述特异性靶点为MUC1。
在一些实施例中，所述肿瘤为肾癌，所述特异性靶点为GD2。
在一些实施例中，所述肿瘤上尿路尿路上皮癌，所述特异性靶点为CD70。
所述细胞因子可以包括白细胞介素-2、γ-干扰素和α-肿瘤坏死因子中的至少一种。
所述消化可以包括用含终浓度为10μM的Y-27632的TrypLE Express于37℃消化3-5min。
所述细胞染色a和所述细胞染色b可以采用活细胞示踪探针进行染色，且所述细胞染色a和所述细胞染色b所用活细胞示踪探针的颜色不同。
所述活细胞示踪探针的终浓度可以为100-500nM。在一些实施例中，所述活细胞示踪探针的终浓度为250nM。
所述接合荧光染料的颗粒酶B抗体的终浓度可以为5-20μg/ml。在一些实施例中，所述接合荧光染料的颗粒酶B抗体的终浓度为10μg/ml。
所述步骤(a)中的重悬可以包括：采用淋巴细胞无血清培养基进行重悬。
所述共培养可以包括：置磷酸盐缓冲液和基质胶混合后凝固的混合物上，于37℃，5％CO2条件下，培养24-72小时。
所述磷酸盐缓冲液和基质胶的体积比可以为1:2-2:1。在一些优选的实施例中，所述磷酸盐缓冲液和基质胶的体积比为1:1。
所述肿瘤类器官的培养方法可以包括：
A)取肿瘤组织块，剪碎，加入第一消化液消化，离心，得到第一沉淀物，用第二消化液消化第一沉淀物，离心，得到第二沉淀物，用中和培养液重悬第二沉淀物，过滤除去大块组织，再离心滤液，得第三沉淀物；
B)在冰浴条件下，用类器官培养基A和基质胶重悬第三沉淀物，接种，孵育；
C)步骤B)中接种后的基质胶凝固后，加入类器官培养基A，培养2-3天，再换用类器官培养基B培养6-13天，得到肿瘤类器官。
所述第一消化液中，所述胶原酶Ⅱ型的终浓度可以为5mg/ml。
所述第一消化液中，所述Y-27632的终浓度可以为10μM。
所述第二消化液可以为包含Y-27632的TrypLE Express胰酶替代物溶液。
所述第二消化液中，所述Y-27632的终浓度可以为10μM。
所述类器官培养基A可以包括以下组分及终浓度：以类器官培养基A的总体积计，体积百分比为0.5-1.5％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为0.5-1.5％的GlutaMAX 100×，体积百分比为0.5-1.5％的HEPES缓冲液100×，0-5ng/ml的表皮生长因子；5-15ng/mL的成纤维生长因子，5-20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，0-750nM的A83-01，0-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，5-15μM的Y-27632，5-15mM的烟酰胺和体积百分比为1-3％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释。
在一些实施例中，所述类器官培养基A可以包括以下组分及终浓度：以类器官培养基A的总体积计，体积百分比为1％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为1％的GlutaMAX 100×，体积百分比为1％的HEPES缓冲液100×；7-12ng/mL成纤维生长因子10，7-12ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，250-750nM的A83-01，5-7μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，5-15μM的Y-27632，8-12mM的烟酰胺和体积百分比为2％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释，所述类器官培养基A不含表皮生长因子。
在一些实施例中，所述类器官培养基A可以由以下组分及终浓度组成：以类器官培养基A的总体积计，体积百分比为0.5-1.5％Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为0.5-1.5％的GlutaMAX100×，体积百分比为0.5-1.5％的HEPES缓冲液100×，0-5ng/ml的表皮生长因子；5-15ng/mL成纤维生长因子，5-20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，0-750nM的A83-01，0-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，5-15μM的Y-27632，5-15mM的烟酰胺和体积百分比为1-3％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释。
在一些实施例中，所述类器官培养基A可以由以下组分及终浓度组成：以类器官培养基A的总体积计，体积百分比为1％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为1％的GlutaMAX 100×，体积百分比为1％的HEPES缓冲液100×；7-12ng/mL的成纤维生长因子10，7-12ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，250-750nM的A83-01，5-7μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，5-15μM的Y-27632，8-12mM的烟酰胺和体积百分比为2％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释，所述类器官培养基A不含表皮生长因子。
所述类器官培养基B可以包含以下组分及终浓度：以类器官培养基B总体积计，体积百分比为0.5-1.5％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为0.5-1.5％的GlutaMAX 100×，体积百分比为0.5-1.5％的HEPES缓冲液100×，30-75ng/ml的表皮生长因子；5-15ng/mL的成纤维生长因子10，5-20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，0-750nM的A83-01，0-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，8-12mM的烟酰胺和体积百分比为1-3％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释，所述类器官培养基B不含ROCK抑制剂。
在一些实施例中，所述类器官培养基B可以包括以下组分及终浓度：以类器官培养基B总体积计，体积百分比为1％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为1％的GlutaMAX 100×，体积百分比为1％的HEPES缓冲液100×，45-55ng/ml的表皮生长因子；5-7ng/mL成纤维生长因子10，12-17ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，250-750nM的A83-01，5-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，8-12mM的烟酰胺和体积百分比为2％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释，所述类器官培养基B不含ROCK抑制剂。
所述类器官培养基B可以由以下组分及终浓度组成：以类器官培养基B总体积计，体积百分比为0.5-1.5％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为0.5-1.5％的GlutaMAX 100×，体积百分比为0.5-1.5％的HEPES缓冲液100×，30-75ng/ml的表皮生长因子；5-15ng/mL的成纤维生长因子10，5-20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，0-750nM的A83-01，0-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，8-12mM的烟酰胺和体积百分比为1-3％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释，所述类器官培养基B不含ROCK抑制剂。
在一些实施例中，所述类器官培养基B可以由以下组分及终浓度组成：以类器官培养基B总体积计，体积百分比为1％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为1％的GlutaMAX 100×，体积百分比为1％的HEPES缓冲液100×，45-55ng/ml的表皮生长因子；5-7ng/mL成纤维生长因子10，12-17ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，250-750nM的A83-01，5-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，8-12mM的烟酰胺和体积百分比为2％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释，所述类器官培养基B不含ROCK抑制剂。
所述中和培养基可以包含：以中和培养基总体积计，体积百分比为0.5-1.5％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为0.5-1.5％的GlutaMAX 100×，体积百分比为0.5-1.5％的HEPES缓冲液100×，7-13μM的Y-27632和体积百分比为10-25％的胎牛血清，用Advanced DMEM/F12培养基稀释。在一些实施例中，所述中和培养基包含：以中和培养基总体积计，体积百分比为1％的Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为1％的GlutaMAX 100×，体积百分比为1％的HEPES缓冲液100×，10μM的Y-27632和体积百分比为20％的胎牛血清，用Advanced DMEM/F12培养基稀释。
所述Antibiotic-Antimycotic 100×可以包含青霉素、链霉素或两性霉素B中的至少一种。在一些实施例中，所述Antibiotic-Antimycotic 100×包含青霉素、链霉素和两性霉素B。
以抗生素溶液的总体积计，所述青霉素的终浓度可以为5000-15000单位/mL。在一些实施例中，以抗生素溶液的总体积计，所述青霉素的终浓度为7000-12000单位/mL。在一些实施例中，以抗生素溶液的总体积计，所述青霉素的终浓度为10000单位/mL。
以Antibiotic-Antimycotic 100×的总体积计，所述链霉素的终浓度可以为5000-15000单位/mL。在一些实施例中，以Antibiotic-Antimycotic 100×的总体积计，所述链霉素的终浓度为7000-12000单位/mL。在一些实施例中，以Antibiotic-Antimycotic100×的总体积计，所述链霉素的终浓度为10000单位/mL。
以Antibiotic-Antimycotic 100×的总体积计，所述两性霉素B的终浓度可以为10-35μg/mL。在一些实施例中，以Antibiotic-Antimycotic 100×的总体积计，所述两性霉素B的终浓度为15-30μg/mL。在一些实施例中，以Antibiotic-Antimycotic 100×的总体积计，所述两性霉素B的终浓度为25μg/mL。
所述第一消化液可以为包含胶原酶Ⅱ型和Y-27632的Advanced DMEM/F12培养基。
所述孵育可以包括：于37℃孵育1-2min，翻转，再孵育8-10min。
所述步骤C)中的培养的培养条件可以为37℃和含体积分数为5％的CO2的培养箱中。
第二方面，本发明提供一种任一前述CAR-T细胞的培养方法。
一种任一前述CAR-T细胞的培养方法，包括以下步骤：(i)取分离得到的CD3+T细胞，接种；加入预洗后的免疫磁珠培养；(ii)弃去培养基C，重悬细胞并接种，加入包含CAR的慢病毒、聚凝胺和白细胞介素-2，离心，培养，得到CAR-T细胞。
所述预洗可以包括：取免疫磁珠，涡旋混匀，加入缓冲液D，混匀，置于磁力架上分离，弃去上清液，沉淀物用培养基C重悬。
所述缓冲液D可以为：以缓冲液D的总体积计，含体积百分比为0.1％的牛血清白蛋白和终浓度为2mM的乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液。
所述预洗中沉淀物的重悬所用培养基的体积与预洗时免疫磁珠的取用体积相同。
所述免疫磁珠可以为CD3/CD28抗体偶联磁珠。
所述预洗后的免疫磁珠的加入量可以为25μl/孔。
所述包含CAR的慢病毒的加入量可以按照MOI＝10的量计算。
所述聚凝胺的终浓度可以为2.5-7.5μg/ml。
所述白细胞介素-2的终浓度可以为25-75U/ml。
所述步骤(i)中CD3+T细胞的接种量可以为0.5×106个细胞/孔。
所述步骤(i)中CD3+T细胞的分离方法可以包括：取肿瘤病人外周血，加基础培养基混匀，加入至Ficoll淋巴细胞分离液中，离心；吸取中间白细胞层，用基础培养基洗涤白细胞层，得外周血单个核细胞；将外周血单个核细胞用MACS缓冲液重悬，离心；弃去上清液，再用MACS缓冲液重悬沉淀物，加CD3磁珠；于4℃孵育15min；加入MACS缓冲液，离心，弃上清；用MACS缓冲液重悬沉淀物，置MACS磁力架进行分选，再用MACS缓冲液冲洗至少三次，得到CD3+T细胞。
所述MACS缓冲液可以包含：以MACS缓冲液的总体积计，含体积百分比为0.5％的牛血清白蛋白和终浓度为2mM乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液。
所述步骤(i)中的培养可以包括：在37℃条件下培养24-72小时。
所述步骤(ii)中的接种的接种量为1×106个细胞/孔。
所述步骤(ii)中的培养可以包括：在37℃条件下，孵育2-8小时，再加入培养基C培养7-9天，每2天更换培养基C一次。
所述培养基C可以包含：以培养基C的总体积计，含体积百分比为10％的胎牛血清，终浓度为50IU/ml的白介素-2和终浓度为1ng/ml的白介素-15，用RMPI 1640培养基稀释。
有益效果
相比现有技术，本发明具有包括以下的有益效果：
(1)由于肿瘤类器官具有与患者肿瘤组织相近的肿瘤特性，以及不需要进行动物模型的构建，因此，采用肿瘤类器官与CAR-T细胞共培养，可提高评估CAR-T细胞有效性方法的准确性和操作简便性。
(2)通过检测相关细胞因子和显微镜观测肿瘤类器官与CAR-T细胞的相互作用及杀伤后的细胞形态变化，可更为直观、准确和全面地评估CAR-T细胞对肿瘤类器官是否有杀灭作用。
(3)在培养所述肿瘤类器官时采用不同的培养基进行培养，所得肿瘤类器官与肿瘤组织的病理形态学特征非常相似，可精确还原其来源肿瘤组织的病理形态学特征，进而提高评估CAR-T细胞有效性方法的准确性。
(4)采用本发明所述类器官培养基及方法培养膀胱癌类器官，培养成功率高，传代次数多，进而提高评估CAR-T细胞有效性方法的效率。
(5)将染色后的肿瘤类器官和CAR-T细胞置磷酸盐缓冲液和基质胶混合后凝固的混合物上培养，一方面有利于肿瘤类器官与CAR-T细胞直接和充分的接触；另一方面有利于避免肿瘤类器官贴壁，同时也避免细胞与细胞之间聚团，而影响相互作用，有利于提高所述评估CAR-T有效性的方法的准确性，有利于所述评估CAR-T有效性的方法的重现性。
(6)采用接合荧光染料的颗粒酶B抗体观测CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤情况，能清楚和直观地观察到CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤情况，尤其是肿瘤类器官的细胞内部杀伤情况，且能减少染料的背景干扰，和染料对细胞的杀伤所造成的影响，提高所述评估CAR-T有效性的方法的准确性。
附图说明
图1为本采用实施例2所述类器官培养基A和类器官培养基B及实施例4所述培养方法所获得的膀胱癌类器官光学显微镜观察结果；随着培养时间延长，膀胱癌类器官体积逐渐增大；图中标尺为50μm。
图2为采用实施例2所述类器官培养基A和类器官培养基B及实施例4所述培养方法所获得的膀胱癌类器官形态结构图；其中，Tissue-HE表示膀胱癌组织的苏木素-伊红染色图；Organoid-BF表示膀胱癌类器官的明视野镜检图；Organoid-HE表示膀胱癌类器官的苏木素-伊红染色图；图中标尺为50μm。
图3为患者的膀胱癌组织的免疫荧光染色鉴定结果图；图中标尺为100μm。
图4为采用实施例2所述类器官培养基A和类器官培养基B及实施例4所述培养方法所获得的膀胱癌类器官的免疫荧光染色鉴定结果图。
图5为采用实施例2所述类器官培养基A和类器官培养基B及实施例6所述传代方法得到的传代的膀胱癌类器官的生长图。
图6为对比例6所得膀胱癌类器官的生长图；图中标尺为50μm。
图7为对比例7所得膀胱癌类器官的生长图；图中标尺为50μm。
图8为对比例8所得膀胱癌类器官的生长图；图中标尺为50μm。
图9为实施例10中所述共培养体系的结构示意图；图中1为基质胶；2为肿瘤类器官；3为CAR-T细胞；4为淋巴细胞无血清培养基。
图10为实施例10中膀胱癌类器官实验组和膀胱癌类器官对照组的细胞因子检测结果；图中MUC1-CAR表示膀胱癌类器官实验组，CD19-CAR表示膀胱癌类器官对照组。
图11为实施例10中肾癌类器官实验组和肾癌类器官对照组的细胞因子检测结果；图中GD2-CAR表示肾癌类器官实验组，CD19-CAR表示肾癌类器官对照组。
图12为实施例10中上尿路尿路上皮癌类器官实验组和上尿路尿路上皮癌类器官对照组的细胞因子检测结果；图中CD70-CAR表示上尿路尿路上皮癌类器官实验组，CD19-CAR表示上尿路尿路上皮癌类器官对照组。
图13为实施例10中膀胱癌类器官实验组和膀胱癌类器官对照组的免疫杀伤结果；图中：MUC1-CAR所示图表示MUC1-CAR-T细胞对膀胱癌类器官的免疫杀伤结果；CD19-CAR所示图表示CD19-CAR-T细胞对膀胱癌类器官的免疫杀伤结果；绿色代表CAR-T细胞，红色代表肿瘤类器官，白色代表接合荧光染料的颗粒酶B抗体的染色结果，图中标尺为100μm。
图14为实施例10中GD2-CAR-T细胞对肾癌类器官实验组和肾癌类器官对照组的免疫杀伤结果；图中：GD2-CAR所示图表示GD2-CAR-T细胞对肾癌类器官的免疫杀伤结果；CD19-CAR所示图表示CD19-CAR-T细胞对肾癌类器官的免疫杀伤结果；绿色代表CAR-T细胞，红色代表肿瘤类器官，白色代表接合荧光染料的颗粒酶B抗体的染色结果，图中标尺为100μm。
图15为实施例10中CD70-CAR-T细胞对上尿路尿路上皮癌类器官实验组和上尿路尿路上皮癌类器官对照组的免疫杀伤结果；图中：CD70-CAR所示图表示CD70-CAR-T细胞对上尿路尿路上皮癌类器官的免疫杀伤结果；CD19-CAR所示图表示CD19-CAR-T细胞对上尿路尿路上皮癌类器官的免疫杀伤结果；绿色代表CAR-T细胞，红色代表肿瘤类器官，白色代表接合荧光染料的颗粒酶B抗体的染色结果，图中标尺为100μm。
术语说明
本发明中，rpm表示转每分钟；μM表示微摩尔每升；nM表示纳摩尔每升；μg表示微克；μL表示微升；ng/mL表示纳克每毫升；mL表示毫升；离心时的g为离心力单位，例如200g表示离心力为200倍重力加速度；U/ml表示“单位每毫升”；CAR表示嵌合抗原受体；CD19仅表达于B细胞，不表达于实体瘤，是血液瘤的特异性靶点，用于实体瘤的CAR-T对照组；MUC1为一种肿瘤特异性靶点，在膀胱癌有高表达；GD2为一种肿瘤特异性靶点，在肾癌上高表达；CD70为一种肿瘤特异性靶点，在上尿路尿路上皮癌上高表达；IL-2表示白介素-2；IFN-γ表示γ-干扰素；TNF-α表示α-肿瘤坏死因子。
本发明中，冰浴条件是指冰水混合物条件，约0℃。余量指剩余含量。
本发明中，“任选的”表示其所描述的组分可以存在，也可以不存在。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明中所用到的试剂及其来源：
Figure BDA0002842141230000091
Figure BDA0002842141230000101
实施例1：类器官培养基
按表1配制类器官培养基：
表1：类器官培养基的配方
Figure BDA0002842141230000102
Figure BDA0002842141230000111
实施例2：类器官培养基
按表2配制类器官培养基：
表2：类器官培养基的配方
Figure BDA0002842141230000112
实施例3：类器官培养基
按表3配制类器官培养基：
表3：类器官培养基的配方
Figure BDA0002842141230000113
Figure BDA0002842141230000121
实施例4：膀胱癌类器官的培养
中和培养液的组成为：以中和培养液的总体积计，体积百分比为1％的Antibiotic-Antimycotic100×，体积百分比为1％的GlutaMAX 100×，体积百分比为1％的HEPES缓冲液100×，10μM的Y-27632和体积百分比为20％的胎牛血清，用Advanced DMEM/F12培养基稀释。
第一消化液的组成为：含终浓度为5mg/ml的胶原酶Ⅱ型和10μM的Y-27632的Advanced DMEM/F12培养基。
第二消化液的组成为：含10μM的Y-27632的TrypLE Express胰酶替代物溶液。
操作：分别取实施例1-3所述类器官培养基A和类器官培养基B，按以下步骤培养类器官：
A)取膀胱癌组织块，剪碎至肉糜状，加入第一消化液于37℃消化45min，离心，得到第一沉淀物，第一沉淀物用第二消化液消化3分钟，离心，得到第二沉淀物，用中和培养液重悬第二沉淀物，再用70μm细胞筛网过滤，再离心滤液，得第三沉淀物；
B)在冰浴条件下，用类器官培养基A和基质胶重悬第三沉淀物，接种至事先37℃预热的6孔板中，并再次置于37℃孵育1-2min；待基质胶微滴稍成型立即翻转，再次孵育8-10min；
C)步骤B)中接种后的基质胶凝固后，加入类器官培养基A，培养3天，再换用类器官培养基B培养7-12天，得到膀胱癌类器官，所述类器官培养基B每2-3天更换一次。
取膀胱癌组织及所得类器官进行光学显微镜观察、苏木素-伊红染色和免疫荧光染色，结果见图1-图4，由结果可知所得类器官与膀胱癌组织的病理形态学特征相似，所得类器官可精确还原其来源肿瘤组织的病理形态学特征；采用实施例4所述方法培养所得膀胱癌类器官生长较多，细胞形态好，且生长速度快。
对比例1：类器官培养基(参考CN 111411083 B中配方)
一种胃癌类器官培养基，包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，2×；N-acetylcysteine，0.5μM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R-spondin 1，800ng/mL；Wnt3a，100ng/mL；CHIR99021，8μM；thiazovivin，1.5μM；Gastrin I，25ng/mL；丙戊酸，0.5mM；青霉素链霉素混合液，1.2×；两性霉素B，0.8μg/mL；Primocin，1mg/mL；上述特异性添加因子各组分的终浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的终浓度为准。
对比例2：类器官培养基(参考CN109837242A中配方)
一种类器官培养基，所述类器官培养基含有1％青霉素、1％链霉素、50ng/mL的EGF、50ng/mL的成纤维细胞生长因子、50ng/mL的Noggin重组蛋白、20mM的HEPES、500nM的A83-01、1.0μg/mL的R Spondin 3、5μM的Y-27632、5μM的SB202190、1％的B27、3mM的Glutamax、8％FBS的Advanced DMEM/F12培养基。
对比例3：类器官培养基(参考CN108396010A中配方)
一种类器官培养基，所述类器官培养基含有50ng/mL的EGF、100ng/mL的Wnt-3a、1μg/mL的R-Spondin1、500nM的A83-01、10μM的Y-27632、50ng/mL的Noggin重组蛋白、12μMSB202190、1×N2、1×B27补充剂、10mM的HEPES、2mM的Glutamax、500单位/mL青霉素、500单位/mL链霉素、12.5μg/mL两性霉素、10％FBS的DMEM/F12培养基。
对比例4：类器官培养基(参考CN111876386A中配方)
按表4配制类器官培养基：
表4：类器官培养基的配方
Figure BDA0002842141230000131
Figure BDA0002842141230000141
对比例5：类器官的培养
试剂：同实施例4。
操作：分别取对比例1-4所述类器官培养基，按以下步骤培养类器官：
A)取膀胱癌组织块，剪碎成直径＜2毫米的碎片，加入第一消化液，在37℃的摇床(120rpm)消化1h，200g离心5分钟，弃去上清液，得到第一沉淀物，用10mL室温的AdvancedDMEM/F-12洗涤第一沉淀物，200g离心5分钟，弃去上清液，得到第二沉淀物；
B)将第二沉淀物用第二消化液，在37℃的摇床(120rpm)消化10分钟，加入10mL冷的含20％FBS的Advanced DMEM/F-12以终止消化，在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第三沉淀物，加入2mL冷的Advanced DMEM/F-12洗涤第三沉淀物，在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第四沉淀物；
C)用10mL冷的Advanced DMEM/F-12重悬第四沉淀物，用70μm的细胞滤网过滤除去大块组织；细胞计数，收集100,000个细胞，在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第五沉淀物；用30μL类器官培养基和300μL基质胶重悬第五沉淀物，接种；
D)步骤C)中接种后的基质胶凝固后，加入类器官培养基培养，培养基每2-3天更换一次；培养2-3周，得到类器官。
实施例5：不同类器官培养基的培养成功率
取不同患者的膀胱癌组织，按照实施例4的培养方法分别培养10例，分别考察实施例1-3膀胱癌类器官的培养基。各类器官培养基及其培养方法的培养成功率如表4所示。
表4：不同类器官培养基的培养成功率
培养基 培养方法 培养成功率
实施例1 实施例4 85％
实施例2 实施例4 95％
实施例3 实施例4 90％
对比例1 实施例5 65％
对比例2 实施例5 80％
对比例3 实施例5 75％
对比例4 实施例5 75％
实施例6：类器官的传代
一、类器官的传代
试剂：
第二消化液：同实施例1。
类器官培养基：实施例1-3中任一种(传代采用的类器官培养基与培养类器官时所用培养基相同)。
操作：
取实施例4中含所得膀胱癌类器官的基质胶，在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第四沉淀物，往第四沉淀物中加入第二消化液，在37℃的摇床(120rpm)消化3-5分钟；加入实施例4所述中和培养基以终止消化；在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第五沉淀物，用10mL冷的Advanced DMEM/F-12重悬第五沉淀物，使用10mL移液管进行吹打，将类器官吹打成较小的细胞团，在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第六沉淀物，加入30μL预冷的类器官培养基A重悬细胞沉淀后，加入600-900μL的基质胶，接种，在接种后的基质胶凝固后，加入类器官培养基A培养3天，再用类器官培养基B培养7-12天，得到传代的膀胱癌类器官，所述类器官培养基B每2-3天更换一次。
二、最少可传代次数统计
按以上操作对实施例4和对比例1-5所得类器官进行连续传代，每当30％的类器官扩增形成直径超过200μm大小的细胞团时就进行传代，记录最少可传代次数。统计结果如表5。
表5：最少可传代次数统计表
Figure BDA0002842141230000151
Figure BDA0002842141230000161
对比例6：不含表皮生长因子的类器官培养基及其培养结果
按表6配制类器官培养基：
表6：类器官培养基的配方
Figure BDA0002842141230000162
膀胱癌类器官的培养：取对比例6的类器官培养基A和类器官培养基B，按实施例4所述的步骤培养膀胱癌类器官，并对所得膀胱癌类器官进行光学显微镜观察。
培养结果：见图6，使用对比例6所述培养基按照实施例4所述步骤培养膀胱癌类器官，结果发现类器官生长较少，细胞形态较差，且生长缓慢。
实施例7：上尿路尿路上皮癌类器官和肾癌类器官的培养
中和培养液、第一消化液、第二消化液：同实施例4。
操作：取实施例2所述类器官培养基A和类器官培养基B，以上尿路上皮癌组织块或肾癌组织块为肿瘤组织块，按下列操作培养上尿路上皮癌类器官或肾癌类器官：
A)取肿瘤组织块，剪碎至肉糜状，加入第一消化液于37℃消化45min，离心，得到第一沉淀物，第一沉淀物用第二消化液消化3分钟，离心，得到第二沉淀物，用中和培养液重悬第二沉淀物，再用70μm细胞筛网过滤，再离心滤液，得第三沉淀物；
B)在冰浴条件下，用类器官培养基A和基质胶重悬第三沉淀物，接种至事先37℃预热的6孔板中，并再次置于37℃孵育1-2min；待基质胶微滴稍成型立即翻转，再次孵育8-10min；
C)步骤B)中接种后的基质胶凝固后，加入类器官培养基A，培养3天，再换用类器官培养基B培养7-12天，得到上尿路上皮癌类器官或肾癌类器官，所述类器官培养基B每2-3天更换一次。
实施例8：T细胞的分离
MACS缓冲液：以MACS缓冲液的总体积计，含体积百分比为0.5％的牛血清白蛋白和终浓度为2mM乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液。
抽取肿瘤病人10ml外周血，加RPMI基础培养基10ml混匀后，缓慢加入至15mlFicoll淋巴细胞分离液中，在2000g，25℃的条件下离心30min；小心吸取中间白细胞层，用基础培养基洗涤白细胞层两次，获得外周血单个核细胞。
将获得的外周血单个核细胞用MACS缓冲液重悬，在500g，25℃的条件下离心10min；弃去上清液，再用80μL MACS缓冲液重悬沉淀物，加20μL CD3磁珠；于4℃孵育15min；加入2ml MACS缓冲液，300g离心10min，弃上清；用500μl MACS缓冲液重悬沉淀物，置MACS磁力架进行分选，再用MACS缓冲液冲洗三次，每次500μl，得到CD3+T细胞。
实施例9：CAR-T细胞制备
本实施例中，所述CAR的慢病毒为包含靶向MUC1、GD2、CD19或CD70的CAR的慢病毒，按以下步骤制备CAR-T细胞。
本实施例中，所述培养基C的组成为：以培养基C的总体积计，含体积百分比为10％的胎牛血清，终浓度为50IU/ml的白介素-2和终浓度为1ng/ml的白介素-15，用RMPI 1640培养基稀释。
一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
1、预洗的免疫磁珠：取出CD3/CD28抗体偶联磁珠，涡旋振荡混匀30秒，按照25μl/孔计算所需的CD3/CD28抗体偶联磁珠量，吸取至1.5mL离心管中。加入1ml缓冲液D(所述缓冲液D的组成为：以缓冲液D的总体积计，含体积百分比为0.1％的牛血清白蛋白和终浓度为2mM的乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液)，漩涡震荡5秒，将离心管置于磁力架上1min，弃去上清，用与CD3/CD28抗体偶联磁珠量相同体积的培养基C重悬；得预洗的免疫磁珠；
2.将上述分离的CD3+T细胞接种至24孔板中，接种后CD3+T细胞的浓度为0.5×106个细胞/ml，再在每孔中加入25μl预洗的免疫磁珠，于37℃培养2天；
3、在显微镜下观察细胞状态及细胞集落形成，小心吸弃1.4ml培养基，重悬细胞至2×106个细胞/ml；按1×106个细胞/孔接种于24孔板中或48孔板中，37℃静置0.5-1小时；
4、将包含CAR的慢病毒涡旋混匀10-20秒后，离心；
5、往上述步骤3中所得接种后的孔板中加入包含CAR的慢病毒，按照MOI＝10的量计算包含CAR的慢病毒的加入体积：
包含CAR的慢病毒的加入体积(μl)＝MOI×接种细胞数(个)/滴度(TU/ml)×1000；
6、加入聚凝胺和白介素-2，小心晃匀，所述聚凝胺的终浓度为5μg/ml；所述白介素-2的终浓度为50U/ml；
7、用封口膜封严24孔板，在800g，32℃的条件下离心30min；
8、取出细胞板，于37℃孵育4h；
9、加入1mL的培养基C，37℃培养48h；
10、用培养基C清洗和重悬细胞，继续在37℃培养48h；隔2天更换培养基C一次；得到靶向MUC1、GD2、CD19或CD70的CAR-T细胞；所述培养基C包含：以培养基C的总体积计，含体积百分比为10％的胎牛血清，终浓度为50IU/ml的白介素-2和终浓度为1ng/ml的白介素-15，用RMPI 1640培养基稀释。
实施例10：共培养体系建立
表1：不同肿瘤类器官与CAR-T细胞的共培养体系
Figure BDA0002842141230000181
Figure BDA0002842141230000191
操作：取表1所述组别中的肿瘤类器官和CAR-T细胞，按以下步骤制备共培养体系：
(1)预处理的48孔板：将磷酸盐缓冲液与基质胶按体积比为1:1混匀后，按300μL/孔加入至48孔细胞培养板中，立即移入37℃孵育0.5h备用；
(2)取肿瘤类器官并离心，经TrypLE Express(含10μM Y27632)消化3-5min后，收集的细胞用250nM的CellTrackerTM Orange CMTMR Dye(厂家：Invitrogen)染色避光染色半小时备用；
(3)取CAR-T细胞，用终浓度为250nM的CelltractCellTrackerTM Green CMFDA Dye(厂家：Invitrogen)染色半小时备用；
(4)用300μL的X-VIVOTM 15无血清培养基(厂家：LONZA；货号04-418Q)分别重悬肿瘤类器官与CAR-T细胞，加入至上述步骤(1)中预处理的48孔板中，共培养72h，得共培养体系；通过荧光显微镜观测共培养体系中的肿瘤类器官与CAR-T的生长状况；吸取上述共培养体系的上清液100μL，用ELISA检测试剂盒检测所述上清液中的细胞因子水平；所述细胞因子包括白细胞介素-2，γ-干扰素以及α-肿瘤坏死因子。
(5)往共培养体系中加入10μg/ml的接合荧光染料的颗粒酶B抗体(Granzyme B(D2H2F)Rabbit mAb(Alexa
Figure BDA0002842141230000192
647Conjμgate))孵育30min；通过激光共聚焦显微镜观测肿瘤类器官与CAR-T细胞的相互作用及杀伤后的细胞形态变化，并记录特异性的接合荧光染料的颗粒酶B抗体的染色结果。
结果：见图10-15。
结论：由结果可知：
(1)采用接合荧光染料的颗粒酶B抗体观测CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤情况，能清楚和直观地观察到CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤情况，尤其是肿瘤类器官的细胞内部杀伤情况，且能减少染料的背景干扰，和对细胞的杀伤所造成的影响，所述评估CAR-T有效性的方法的准确性高。
(2)检测相关细胞因子和显微镜观测肿瘤类器官与CAR-T细胞的相互作用及杀伤后的细胞形态变化，可更为直观、准确和全面地评估CAR-T细胞对肿瘤类器官是否有杀灭作用。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种评估CAR-T细胞有效性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将肿瘤类器官经消化、细胞染色a，与细胞染色b后的CAR-T细胞分别重悬后共培养，得到共培养体系；
(b)取步骤(a)中共培养体系的上清液测定细胞因子；
(c)用接合荧光染料的颗粒酶B抗体对共培养体系进行染色，显微观测CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤情况。
2.根据权利要求1所述的方法，所述细胞因子包括白细胞介素-2、γ-干扰素和α-肿瘤坏死因子中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，所述消化包括用含终浓度为10μM的Y-27632的TrypLEExpress于37℃消化3-5min；和/或所述细胞染色a和所述细胞染色b采用活细胞示踪探针进行染色，且所述细胞染色a和所述细胞染色b所用活细胞示踪探针的颜色不同。
4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(a)中的重悬包括：采用淋巴细胞无血清培养基进行重悬；和/或所述共培养包括：置磷酸盐缓冲液和基质胶混合后凝固的混合物上，于37℃，5％CO2条件下，培养24-72小时。
5.根据权利要求1所述的方法，所述肿瘤类器官的培养方法包括：
A)取肿瘤组织块，剪碎，加入第一消化液消化，离心，得到第一沉淀物，用第二消化液消化第一沉淀物，离心，得到第二沉淀物，用中和培养液重悬第二沉淀物，过滤除去大块组织，再离心滤液，得第三沉淀物；
B)在冰浴条件下，用类器官培养基A和基质胶重悬第三沉淀物，接种，孵育；
C)步骤B)中接种后的基质胶凝固后，加入类器官培养基A，培养2-3天，再换用类器官培养基B培养6-13天，得到肿瘤类器官。
6.根据权利要求5所述的方法，所述第一消化液为包含胶原酶Ⅱ型和Y-27632的Advanced DMEM/F12培养基；所述第二消化液为包含Y-27632的TrypLE Express胰酶替代物溶液；所述类器官培养基A包括以下组分及终浓度：以类器官培养基A的总体积计，体积百分比为0.5-1.5％Antibiotic-Antimycotic 100×，体积百分比为0.5-1.5％的GlutaMAX 100×，体积百分比为0.5-1.5％的HEPES缓冲液100×，0-5ng/ml的表皮生长因子；5-15ng/mL成纤维生长因子，5-20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，0-750nM的A83-01，0-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，5-15μM的Y-27632，5-15mM的烟酰胺和体积百分比为1-3％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释；所述类器官培养基B包括以下组分及终浓度：以类器官培养基B总体积计，体积百分比为0.5-1.5％的Antibiotic-Antimycotic100×，体积百分比为0.5-1.5％的GlutaMAX 100×，0.5-1.5％的HEPES缓冲液100×，30-75ng/ml的表皮生长因子；5-15ng/mL的成纤维生长因子10，5-20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，0-750nM的A83-01，0-15μM的SB202190，50-150ng/mL的Noggin重组蛋白，250-750ng/mL的Rspondin-1重组蛋白，0.8-1.2mM的N-乙酰半胱氨酸，8-12mM的烟酰胺和体积百分比为1-3％的B27补充剂50×，用基础培养基Advanced DMEM/F12稀释，所述类器官培养基B不含ROCK抑制剂。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述方法中所述CAR-T细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(i)取分离得到的CD3+T细胞，接种；加入预洗后的免疫磁珠培养；(ii)弃去培养基，重悬细胞并接种，加入包含CAR的慢病毒、聚凝胺和白细胞介素-2，离心，培养，得到CAR-T细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，所述预洗包括：取免疫磁珠，涡旋混匀，加入缓冲液，混匀，置于磁力架上分离，弃去上清液，沉淀物用培养基重悬。
9.根据权利要求7所述的方法，所述包含CAR的慢病毒的加入量按照MOI＝10的量计算；和/或所述聚凝胺的终浓度为2.5-7.5μg/ml；和/或所述白细胞介素-2的终浓度为25-75U/ml。
10.根据权利要求7所述的方法，所述步骤(i)中的培养包括：在37℃条件下培养24-72小时；所述步骤(ii)中的培养包括：在37℃条件下，孵育2-8小时，再加入培养基C培养7-9天，每2天更换培养基C一次。
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