CN111440760A - 一种人多能干细胞高效分化得到内皮细胞的方法 - Google Patents

一种人多能干细胞高效分化得到内皮细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111440760A
CN111440760A CN202010156258.6A CN202010156258A CN111440760A CN 111440760 A CN111440760 A CN 111440760A CN 202010156258 A CN202010156258 A CN 202010156258A CN 111440760 A CN111440760 A CN 111440760A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
medium
endothelial
days
pluripotent stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010156258.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111440760B (zh
Inventor
杨隽
秦克周
王雍
刘洪宪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202010156258.6A priority Critical patent/CN111440760B/zh
Publication of CN111440760A publication Critical patent/CN111440760A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111440760B publication Critical patent/CN111440760B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0692—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种人多能干细胞高效分化得到内皮细胞的方法，所述方法，包括以下：步骤1，人多能干细胞在含有Actin A，BMP4，Y27632的培养基中培养3天，分化为中胚层内皮前体细胞；步骤2，第4天更换为含有FGF2，VEGF，BMP4,SB431542的培养基，培养4天得到内皮祖细胞。

Description

一种人多能干细胞高效分化得到内皮细胞的方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体而言，是提供一种高效、经济的内皮细胞的培养方法，所得内皮祖细胞，可用于包括肺动脉高压在内的心肺疾病的细胞治疗及药物筛选。
背景技术
肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是一类预后不良、致残及致死率高的疾病。 PH早期表现为肺血管阻力进行性增加，引起肺动脉压力持续性升高，最终导致右心功能衰竭并死亡。肺动脉高压是一种慢性持续性复杂疾病，涉及许多相关病变。欧洲和美国的流行病学调查显示，特发性肺动脉高压在女性中最常见，家族性肺动脉高压与基因相关。
肺动脉高压患者生存期较短，在未经治疗的患者中，肺动脉高压功能分级Ⅰ、II级为6 年，Ⅲ级为2.5年，而IV级仅为6个月。若无有效的治疗，肺动脉高压患者的预后通常很差。这类患者的年死亡率约为15％。心肺功能不佳，活动能力低下，右心房压力升高，右心室进行性衰竭，心输出量低，脑钠肽水平升高以及相关的结缔组织疾病的进展都是预后不良的预兆。随着我国医学发展，肺动脉高压已被认识为一类引起严重的社会问题的疾病状态，不但给患者造成了严重的身心摧残，同时也给家庭和社会增加了巨大的人力及财力负担。因此，防治肺动脉高压是延长寿命，保证人民生活质量的一个十分迫切的需求。
内皮功能障碍一直被认为是PH发生的主要原因。在缺氧环境中,内皮细胞(ECs)能够调节血管张力并参与血管重塑和血管生成，内皮细胞包括生血内皮、血管内皮以及内皮祖细胞 (EPCs)。有文献报道，与对照组相比，PAH患者外周血中CD133+细胞数量增加。Toshner等人也证实了遗传性肺动脉高压患者来源的EPCs中保护性的BMPII型受体表达水平降低。EPCs 已经被证实具有促进缺血组织血管新生的作用，因此EPCs能够促进不同缺血性血管疾病的组织修复,如急性心肌梗死、不稳定心绞痛,中风,糖尿病微型血管病变,肺动脉高血压,动脉粥样硬化,和缺血性视网膜病变。与其他血细胞相比，EPCs在外周血或脐带血中含量较少，扩增潜力有限，因此在临床治疗中，获得大量有功能的EPCs进行血管修复是一个关键瓶颈。
人多能干细胞(human pluoripotent stem cells,hPSCs)包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)可以经过诱导分化产生内皮细胞。常用的一种方法是将细胞转移到超低附着板中获得拟胚体，随后进一步产生各种类型的细胞。但是拟胚体的分化往往耗时较长，导致该方法的成本大，效率较低。相对而言，单层细胞分化方法则具有较高的效率，但仍需进一步改进，以更好地理解复杂的因素。
为满足肺动脉高压在内的心肺疾病的细胞治疗及药物筛选的需要，本发明优化内皮细胞的制备方法。本发明的方法是将人多能干细胞高效定向分化为：有功能的内皮祖细胞和生血内皮细胞的方法。
发明内容
本发明提供一种改进的人内皮细胞的分化方法，以获得一种与健康供体分离的EPCs表型相匹配的人内皮祖细胞以供包括肺动脉高压在内的心肺疾病的细胞治疗及药物筛选。
一种将人多能干细胞分化为内皮细胞的方法，其特征在于，所述方法，包括以下步骤：步骤1，人多能干细胞，在含有Actin A，Y27632，BMP4的培养基中培养3天，分化为中胚层内皮前体细胞；
步骤2，第4天更换为含有FGF2，VEGF，BMP4,SB431542的培养基，培养4天得到内皮祖细胞。
其中，人多能干细胞可以用E8培养基传代培养，或用mTeSRTM1完整或成分明确的CDM培养基 (Chemical Defined Medium,CDM)传代培养，实验结果见图1。
其中，人多能干细胞在分化开始前可以用Accutase对人多能干细胞进行消化分离，
其中，步骤1可以在预铺底的细胞培养板中培养，其中预铺底采用：Vitronection胶，
其中，步骤1所述Y27632为美国专利US4997834公开的一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II 抑制剂，化学结构式如下：
Figure BDA0002404151750000021
其中，步骤1在加入Y27632的同时还可以加入DMSO，实验结果见图2。
其中，步骤2分化得到的EPCs可以通过磁珠分离，然后用EGM2+16％FBS(HyClone)培养基培养保存，并用于，标志蛋白和相关功能等各项指标的检测。
其中，步骤1中所述人多能干细胞可以是ESCs，iPSCs，
其中，步骤1分化得到的中胚层内皮前体细胞，经过步骤2分化为内皮祖细胞.所述内皮祖细胞包括内皮祖细胞(EPCs)和生血内皮细胞(HE)，实验结果见图3。
优选的，本发明所述方法，包括以下步骤：
步骤1，人多能干细胞用Accutase消化成单个细胞后，在vitronectin(CauliscellInc.# 500125)铺底的细胞培养板中用含有10μM Y27632、25ng/ml actinA和10ng/mL BMP4的E8 培养基，或用含有10μM Y27632、25ng/ml actinA和10ng/mL BMP4的mTeSRTM1(Stemcell #85850)或CDM完整的培养基培养3天，分化为中胚层内皮前体细胞；
步骤2，三天后更换培养基，换成含有100ng/ml FGF2，50ng/mlVEGF，50ng/mlBMP4,5 μM SB431542(Sigma-Aldrich,CAS 301836-41-9-Calbiochem)的E6培养基(GibcoA1516401) 中培养4天得到EPCs。
其中，步骤1的具体操作步骤如下：
在12孔板中，约3×104人多能干细胞细胞/孔接种于含有10μM Y27632、25ng/mlactinA 和10ng/mL BMP4的E8培养基中培养三天；
或
在12孔板中，约3×104细胞/孔接种于含有10μM Y27632、25ng/ml actinA和10ng/mL BMP4 的mTeSRTM1或CDM培养基中培养三天；
通过将10μM的Y27632溶于DMSO在分化前三天连续加入分化培养基，提高人多能干细胞向内皮细胞的分化效率。
其中，步骤1中所述人多能干细胞可以是ESCs，iPSCs，这些细胞可以购买得到，也可以使用现有技术分离得到；如以下方法：
ESCs或iPSCs用E8培养基(Gibco,A1516901)或mTeSRTM1完整的培养基(Stem cell#85850) 培养，根据需要，也可以使用加入或不加入含有hPSC-CDM补充因子(CauliscellInc.# 600301)的hPSC-CDM(Cauliscell Inc.#400105)培养基；培养板用Matrigel(BDBioscences#356230)铺底,所得细胞通过500μM EDTA消化3-5min；分化时将长到80％-90％的人ESCs/iPSCs细胞用Accutase(Gibco#A11105-01)进行消化分离；
其中，步骤1中所述分化为中胚层内皮前体细胞，方法如下：
将分离的ESCs或iPSCs以3×104细胞/孔在vitronectin(Cauliscell Inc.#500125)铺底的12孔细胞培养板中用E8基础培养基进行培养，随后换成含有含有10μMY27632、 25ng/ml actinA和10ng/mL BMP4的E8培养基(Gibco A1516901)中培养3天，分化为中胚层内皮前体细胞；
其中，步骤2中所述更换培养基，是换成含有100ng/ml FGF2，50ng/mlVEGF，50ng/ml BMP4, 5μM SB431542(Sigma-Aldrich,CAS 301836-41-9-Calbiochem)的E6培养基(Gibco A1516401) 中培养4天，产生EPCs或HE。
其中，步骤2得到EPCs，用含有DiI-Ac-LDL的无血清EBM-2培养基孵育，通过检测细胞对乙酰化LDL的摄取鉴定内皮细胞功能。
本发明中实验过程中，人多能干细胞，如胚胎干细胞(ESCs)，从ATCC公司购买获得，是人的胚胎干细胞H9；诱导多能干细胞(iPSCs)从公司购买获得或者通过基因转染技术将某些转录因子导入从外周血中提取的单核细胞，使其直接重编程成为胚胎干细胞样的多潜能干细胞。
以下是对本发明方法中的名词术语的解释：
人多能干细胞(human pluoripotent stem cells)包括胚胎干细胞(embryonicstem cell， ESCs，ESC)或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，是一类能够自我更新,无限增殖的多潜能细胞。
单核细胞(MNCs)：单核细胞(monocytes)是血液中最大的血细胞，也是体积最大的白细胞，是机体防御系统的一个重要组成部分。单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，当它们从骨髓进入血液时仍然是尚未成熟的细胞。目前认为它是巨噬细胞的前身，具有明显的变形运动，能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片。单核细胞还参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应。单核细胞也是对付细胞内致病细菌和寄生虫的主要细胞防卫系统，还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。与其他血细胞比较，单核细胞内含有更多的非特异性脂酶，并且具有更强的吞噬作用。
人外周血(peripheral blood，PB)：是除骨髓之外的血液,本研究使用前臂静脉取血。
内皮祖细胞(EPCs)：不同于人多能干细胞(hPSCs),EPCs是一种血管内皮细胞的前体细胞,为成血管细胞,在生理或病理因素刺激下,可参与损伤血管的修复，在外周血中含量极低。
生血内皮细胞(Hemogenic Endothelial cells,HE)是一种具备分化成为造血细胞能力的内皮前体细胞。
EGM2(Lonza)培养基：一种完整的内皮细胞培养基，由EBM2培养基和补充因子组成。
DiI-Ac-LDL：红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白。
EBM2(Lonza)培养基：一种基础的内皮细胞培养基。
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)：简称ES、EK或ESC细胞,是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ESCs都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
E8培养基：一种干细胞培养基，用于维持干细胞干性。
mTeSRTM1完整的培养基：一种干细胞培养基，用于维持干细胞干性。
hPSC-CDM补充因子：hPSC-CDM培养基的补充添加成分。
hPSC-CDM培养基：一种人多能干细胞CDM基础培养基。
Matrigel(BD Bioscences#356230)：Matrigel是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。
EDTA消化：乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)，是一种重要的络合剂，能够使细胞间连接断开。
EGM2+16％FBS(HyClone)培养基：EGM2培养基添加16％胎牛血清构成的内皮细胞培养基。
Accutase：ACCUTASETM细胞消化液包含有蛋白水解V酶和胶原酶活性，是胰酶/EDTA消化液的替换产品，用于从常规组织培养器皿和粘附培养器皿中消化细胞。
Vitronectin：玻连蛋白，又称S-蛋白或血清扩散因子，由两条单链的糖蛋白(65kD和75kD) 组成，存在于血浆和细胞外基质中。玻连蛋白通过Arg-Gly-Asp(RGD)序列介导，与特异性的细胞表面受体如整联素αVβ3和αVβ5结合。玻连蛋白可促进内皮细胞贴附，伸展和增殖，促进多种正常细胞及癌细胞的分化，可用于细胞迁移实验的研究。
Actin A：肌动蛋白A。
Y27632：Y-27632是一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，Ki分别为220nM和300 nM，Y-27632通过上皮-间充质过渡样调节促进人诱导多能干细胞(iPSCs)向中胚层谱系分化。 BMP4：骨形态发生蛋白4。
中胚层细胞：中胚层(mesoderm)指在三胚层动物的胚胎发育过程中，(原肠胚末期)处在外胚层和内胚层之间的细胞层。中胚层发育为躯体的真皮、肌肉、骨骼及其他结缔组织和循环系统，包括心脏、血管、骨髓、淋巴结、淋巴管等；体腔末、内脏的浆膜和系膜，以及内脏中结缔组织、血管和平滑肌等；肾脏、输尿道、生殖腺(不包括生殖细胞)、生殖管、肾上腺的皮质部。
FGF2：成纤维细胞生长因子2。
VEGF：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。该因子能有效的促进血管再生。
SB431542：SB-431542是一种有效，选择性的ALK5/TGF-βI型受体抑制剂，IC50值为94nM，US6465493，结构式如下：
Figure BDA0002404151750000061
E6培养基：一种干细胞培养基，应用于干细胞分化。
ESC/iPSC-EPCs：来源于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)或者诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSCs)分化得到的内皮祖细胞。
本发明的特点在于：
通过步骤1中加入Y27632或含Y27632的DMSO混合物至培养基，提高人多能干细胞向内皮细胞的分化效率。
本发明发现，将约3×104人多能干细胞/孔接种于含有10μM Y27632、25ng/mlactinA 和10ng/mL BMP4的E8培养基中培养三天。通过系列浓度梯度实验(Y27632的系列浓度 1.67uM、5uM、7.5uM、10uM)，结果显示三天内小剂量的Y27632处理可以提高内皮细胞分化效率,而且分化效率随着Y27632的浓度的增加而提高，实验结果见图2。
本发明得到的所得内皮祖细胞(EPCs)用含有终浓度10g/mL的DiI-Ac-LDL(Molecular Probes)的无血清EBM-2(Lonza)培养基中孵育，检测细胞对乙酰化LDL的摄取鉴定其功能。
本发明的整个分化过程持续7天，所得细胞而后制备细胞悬液，进行细胞计数，并使用 CD31+微球(Miltenyi Biotec,Order no.130-091-935)按照说明书进行磁吸附分离，分离所得细胞在含有16％胎牛血清(HyClone)的EGM2培养基中保存。
本发明所得内皮祖细胞可以通过与从人外周血中分离得到的内皮祖细胞(EPCs)进行对比，鉴定标志蛋白表达；通过乙酰化LDL的摄取检测其内皮细胞功能，实验结果见图4和图5。将hPSC-EPCs注射入斑马鱼体内，可观察到其与原有血管整合，实验结果见图6。
作为对照，本发明还公开了从人外周血(peripheral blood，PB)中分离内皮祖细胞(EPCs) 的方法，步骤如下：取20毫升人体外周静脉血用密度梯度离心法分离出单核细胞(MNCs)，在加入16％胎牛血清(HyClone)的EGM2(Lonza)培养基中培养，待长出克隆后分离得到内皮祖细胞(EPCs)。
本发明所得内皮祖细胞(包括外周血分离得到EPCs的和人多能干细胞分化得到的ESC/iPSC-EPCs)，用途如下：
肺动脉高压的检测。
心肺血管病的细胞治疗及药物筛选。
本发明的内皮祖细胞的培养方法相较于目前使用其他三种内皮细胞分化方法，优点如下：
起始细胞数量最少(3×104细胞/孔)，使用最少种类小分子化合物(六种)，分化时间最短(七天)，内皮细胞分化效率最高(约92.17％)。
本发明的方法可用于血管研究和临床应用，所述方法简单、经济。
附图说明
图1改进的hESCs向内皮祖细胞高效分化的方案
图2 Y27632在剂量和时间上提高ESC/iPSC-EPCs的分化效率
图3 Y27632 ESC/iPSC向生血内皮HE的分化效率
图4 ESC/iPSCs-EPCs特征及与外周血来源的EPCs的比较
图5 ESC/iPSCs-EPCs与EPC早期标记基因表达水平相似
图6 ESC/iPSCs-ECs在斑马鱼异种移植模型中的成血管功能
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
内皮祖细胞的分化获得、纯化和培养
当人类的ESC/iPSC增长到80％-90％，用Accutase(Gibco#A11105-01)对它们分离并以 3×104细胞/孔在玻连蛋白(Cauliscell Inc.#500125)铺底的12孔细胞培养板中进行培养，在补充有25ng/mL肌动蛋白A(R&D,目录号338-AC),10μM Y27632和10ng/mL骨形态发生蛋白4(R&D，目录号314-BP)的E8培养基(Gibco A1516901)中培养3天，ESC/iPSC分化为中胚层内皮细胞。中胚层内皮细胞在补充有100ng/ml FGF2(R&D,目录号233-FB),50 ng/mlVEGF(R&D,目录号293-VE)50ng/ml BMP4,5μM SB431542(Sigma-Aldrich,CAS 301836-41-9-Calbiochem)E6培养基(Gibco A1516401)中培养4天，可产生EPCs，这整个分化过程持续7天。最后制备细胞悬液，进行细胞计数，并准备进行EPCs分离。使用CD31+微球(MiltenyiBiotec,Order no.130-091-935)进行EPCs磁珠分选，在含有16％胎牛血清 (HyClone)的EGM2培养基中培养。
ESC/iPSC-EPCs分别用含有终浓度10g/mL的DiI-Ac-LDL(Molecular Probes)的无血清 EBM-2(Lonza)培养基中孵育。检测细胞对乙酰化低密度脂蛋白的摄取。
实施例2
来自成人外周血样本的内皮祖细胞
从人外周血(peripheral blood，PB)中分离到EPCs。新鲜人体外周血(20mL)在伦理完全批准下获得,用密度梯度离心法从PB中分离出单核细胞(MNCs)，在加入16％胎牛血清的 EGM2(Lonza)培养基中培养。
实施例3
人多能干细胞培养
ESC/iPSC需要E8培养基或mTeSRTM1完整的培养基(Cat#85850)，再或者含hPSC-CDM补充因子(Cauliscell Inc.#600301)的hPSC-CDM(Cauliscell Inc.#400105)培养基在有基质胶(BD Bioscences#356230)铺底的六孔细胞培养板中培养,通过500μM EDTA消化 3-5min进行传代。hPSC-EPCs维持在EGM2+16％胎牛血清(HyClone)培养基中。
实施例4
流式细胞术鉴定内皮标志物
在中胚内皮层细胞分化为EPCs的过程中，将分化第3天或第7天的细胞，用含有EDTA 的0.25％胰酶消化，收集贴壁细胞，用含有0.2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液PBS制成单细胞悬液。小鼠抗人APJ APC-conjugated抗体(R&D,目录号:FAB8561A)进行1:50稀释使用，小鼠抗人CD31(CD31-FITC,目录号:555824,BD Pharmingen),小鼠抗人CD34 (CD34-APC,目录号:560940,BD Pharmingen),小鼠抗人CD43(CD43-APC,目录号:560198, BDPharmingen),小鼠抗人KDR(KDR-PE,FAB357P,R&D)and小鼠抗人NRP-1(NRP-1-PE, 目录号:565951,BD)抗体被1:20稀释使用。单细胞悬浮液随后与抗体在4℃孵育约40分钟。使用BDAccuriTMC6 Plus个人流式细胞仪(Becton Dickinson)检测细胞表面抗原。补偿由单一阳性对照设置。
实施例5
在离体基质胶上进行成管实验
对内皮祖细胞进行胰蛋白酶消化并重悬于含有16％胎牛血清的EGM-2培养基中。以细胞密度为1.0×104细胞/孔将细胞接种在铺有50μl无生长因子的基质胶(BDBiosciences)的96 孔板中，每组重复3次。在37℃培养6小时后，用奥林巴斯CK×41显微镜以10倍的放大倍数进行观察及拍照。
实施例6
免疫荧光试验
免疫荧光染色检测内皮表面标志分子：CD31、CD146、VE-cadherin及vWF，验证内皮细胞分化成功。免疫荧光技术又称荧光抗体技术，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光主要用于蛋白定位研究、相互作用研究和细胞信号转导研究。免疫荧光就是将免疫学方法与荧光标记技术相结合，研究特异抗原在细胞内的分布。免疫荧光特异性高、敏感性强、速度快，主要原理也就是抗原抗体反应，抗原抗体结合后再用荧光标记，通过显微镜下观察来确定某种特异性抗原是否存在。
方法如下：
用4％(w/v)多聚甲醛固定hPSC-EPCs或外周血分离得到的EPCs 10min，用0.1％(v/v) 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X100)的PBS溶液渗透5min。用10％(v/v)驴血清封闭30min 后，用以下一抗4℃过夜孵育；抗EPHB4(ABclonal,A3293,1:10 00)，抗EFNB2(ABclonal, A5669,1:10 00)，抗CD133(ABclonal,1155750301,1:10 00)和抗CD146(Abcam,ab75769, 1:10 00)。细胞用PBS洗涤，然后与偶联Alexa-488或Alexa-594(分子探针)的二抗孵育，共聚焦显微镜(Zeiss)观察,并获得共聚焦图像。所有的图像都是在室温下拍摄的，使用ZEN 2.6(蓝色版)对图像进行分析。
实施例7
核糖核酸提取(RNA)、互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成及实时荧光定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)
对第5天或第7天的ECs用CD14、DRA、LYZ、vWF、VE-CAD、CAV1和CD133、EFNB2、EPHB4等多个标记进行分析，鉴定EC分化成功率。RT-qPCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是:提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达(图4)。
方法如下：
用核糖核酸裂解液(Life Technologies)提取人细胞系总核糖核酸。用NanoDropND-1000 分光光度计(NanoDrop技术)测定核糖核酸产量。使用Prime ScriptTM RT试剂盒和gDNA去除剂(TAKARA)将总RNA(1μg)转换为cDNA。定量聚合酶链式反应(qPCR)使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech)完成，检测仪器使用CFXConnectTM Real-Time System(BIO-RAD)完成，目的基因表达归一化为参考基因GAPDH。
实施例8
斑马鱼细胞移植及观察
斑马鱼异种移植模型可以进一步证明ESC/iPSC-EPCs具有血管整合能力，将 ESC/iPSC-EPCs注入48个hpf斑马鱼胚胎的血流中，ESC/iPSC-ECs能够整合到已经发育的血管系统中。此外，我们在sugen5416处理后进行细胞治疗，结果显示，ESC/iPSC-EPCs处理的斑马鱼恢复正常的百分比(26.71±5.86)％高于仅使用对照组(EGM2+16％胎牛血清)的百分比(12.06±4.49)％(图6)。因此，我们得到的ESC/iPSC-EPCs具有较好应用潜力。
有关实验方法如下：
斑马鱼、转基因系Tg(Flk:GFP)按标准程序饲养，符合动物福利法规。受精48小时后，在胚胎约60μm居维叶的腹侧管的上方注入CM-Dil标记的hPSC-EPCs，然后将胚胎培养在30℃下48小时。采用立体显微镜进行荧光图像采集(徕卡MZ16FA)。
实施例9
微阵列分析
微阵列分析主要是指由成千上万个DNA样品或寡核氨酸，密集排列在玻片或硅片等固体支持物上，在与模板在严格的条件下进行杂交，最后由激光共聚焦显微镜等设备获取图像信息，通过计算机分析处理信息的技术集合。在这里我们利用微阵列分析了hPSC-EPCs与正常的EPCs(CON-EPCs)之间的相关性，结果显示其相关性高达90％以上。微阵列数据的细胞增殖标记基因MKi67相对表达水平看，IPAH-EPCs是最高的,然后hPSC-EPCs MKi67表达式的平均水平高于CON-EPC(图5和图6)。
以IPAH-EPC1、IPAH-EPC2、IPAH-EPC3、正常内皮祖细胞(Con1、Con2、Con3)、 hPSC-EPCs(H7EC、H9EC、202EC)为样本，使用HG-U133 Plus_2进行芯片分析。rma方法对芯片数据进行R包affy归一化处理，R包Cluster Profiler[28]对差异表达基因(log Fold Change<-2或>2,p-Value<0.05)进行聚类。
统计分析
采用t检验进行统计分析，数据以均数±标准差或均数标准误差表示。P<0.05为差异有统计学意义。
实验中所使用的设备，器具，试剂，培养基等均为现有技术，可以从市场上购买得到，或使用已知文献中的方法制备得到。
实验中的名词术语解释如下：
GFP:绿色荧光蛋白
CM-Dil：活细胞染色剂，CM-Dil通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞，有着强而稳定的红色荧光(激发峰553nm/发射峰570nm)。
Sugen 5416：Sugen 5416是选择性的VEGFR(Flk-1/KDR)抑制剂，IC50为1.23μM。IPAH-EPC1、IPAH-EPC2、IPAH-EPC3：肺动脉高压患者1、2、3的内皮祖细胞
Con1、Con2、Con3：正常对照内皮祖细胞1、2、3
H7EC：胚胎干细胞H7分化得到的内皮祖细胞
H9EC：胚胎干细胞H9分化得到的内皮祖细胞
202EC：诱导多能干细胞分化得到的内皮祖细胞
log Fold Change：差异倍数取对数
p-Value：假定值。

Claims (10)

1.一种将人多能干细胞人工分化为内皮细胞的方法，其特征在于，所述方法，包括以下步骤：
步骤1，人多能干细胞在含有Actin A，BMP4，Y27632的培养基中培养3天，分化为中胚层内皮前体细胞；
步骤2，第4天更换为含有FGF2，VEGF，BMP4,SB431542的培养基，培养4天得到内皮祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，人多能干细胞可以用E8培养基传代培养，或用mTeSRTM1完整或成分明确的CDM培养基(Chemical Defined Medium,CDM)传代培养，其中，人多能干细胞在维持培养中可以用EDTA对人多能干细胞进行消化分离。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1可以在预铺底的细胞培养板中培养，其中预铺底采用：Vitronection胶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1所述Y27632化学结构式如下：
Figure FDA0002404151740000011
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1在加入Y27632的同时还可以加入DMSO。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤2分化得到的内皮祖细胞可以通过磁珠分离，然后用EGM2+16％FBS(HyClone)培养基培养保存，并用于，标志蛋白和相关功能等各项指标的检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤2得到的内皮祖细胞包括内皮祖细胞(EPCs)和生血内皮细胞(HE)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，包括以下步骤：
步骤1，人多能干细胞用Accutase消化成单个细胞后，在vitronectin(CauliscellInc.#500125)铺底的细胞培养板中用含有10μM Y27632、25ng/ml actinA和10ng/mL BMP4的E8培养基，或用含有10μM Y27632、25ng/ml actinA和10ng/mL BMP4的mTeSRTM1(Stemcell#85850)或其他CDM完整的培养基培养3天，分化为中胚层内皮前体细胞；
步骤2，三天后更换培养基，换成含有100ng/ml FGF2，50ng/ml VEGF，50ng/ml BMP4,5μM SB431542(Sigma-Aldrich,CAS 301836-41-9-Calbiochem)的E6培养基(GibcoA1516401)中培养4天得到内皮祖细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中，步骤1的具体操作步骤如下：
在12孔板中，约3×104人多能干细胞细胞/孔接种于含有10μM Y27632、25ng/ml actinA和10ng/mL BMP4的E8培养基中培养三天；
或
在12孔板中，约3×104细胞/孔接种于含有10μM Y27632、25ng/mlactinA和10ng/mLBMP4的mTeSRTM1或其他CDM完整的CDM培养基中培养三天；
或
通过将10μM的Y27632融于DMSO在分化前三天连续加入分化培养基；
其中，步骤2得到内皮祖细胞，用含有红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的无血清EBM-2培养基孵育，通过检测内皮细胞对乙酰化LDL的摄取鉴定内皮细胞功能。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中，步骤1中所述人多能干细胞选自：ESCs，iPSCs，这些细胞可以购买得到，也可以使用现有技术分离得到；如以下方法：
ESCs或iPSCs用E8培养基(Gibco,A1516901)或mTeSRTM1完整的培养基(Stem cell#85850)培养，根据需要，也可以使用加入或不加入含有hPSC-CDM补充因子(CauliscellInc.#600301)的hPSC-CDM(Cauliscell Inc.#400105)培养基；培养板用Matrigel(BDBioscences#356230)铺底,所得细胞通过500μM EDTA消化3-5min；当人ESCs/iPSCs细胞增长到80％-90％开始分化时，用Accutase(Gibco#A11105-01)对它们分离；
其中，步骤1中所述分化为中胚层内皮前体细胞，方法如下：
将分离的ESCs或iPSCs以3×104细胞/孔在vitronectin(Cauliscell Inc.#500125)铺底的12孔细胞培养板中用E8基础培养基进行培养，随后换成含有10μM Y27632、25ng/mlactinA和10ng/mL BMP4的E8培养基(Gibco A1516901)中培养3天，分化为中胚层内皮前体细胞；
其中，步骤2中所述更换培养基，是换成含有100ng/ml FGF2，50ng/ml VEGF，50ng/mlBMP4,5μM SB431542(Sigma-Aldrich,CAS 301836-41-9-Calbiochem)的E6培养基(GibcoA1516401)中培养4天，产生内皮祖细胞(EPCs)。
CN202010156258.6A 2020-03-09 2020-03-09 一种人多能干细胞高效分化得到内皮祖细胞的方法 Active CN111440760B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010156258.6A CN111440760B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种人多能干细胞高效分化得到内皮祖细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010156258.6A CN111440760B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种人多能干细胞高效分化得到内皮祖细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111440760A true CN111440760A (zh) 2020-07-24
CN111440760B CN111440760B (zh) 2022-09-23

Family

ID=71650554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010156258.6A Active CN111440760B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种人多能干细胞高效分化得到内皮祖细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111440760B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265377A (zh) * 2021-06-11 2021-08-17 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种动脉内皮促进功能性t细胞再生的方法
CN115247151A (zh) * 2022-09-21 2022-10-28 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 制备造血内皮细胞的方法及制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110024660A (ko) * 2009-09-03 2011-03-09 차의과학대학교 산학협력단 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 혈청 및 이종 비함유 분화방법
CN102388130A (zh) * 2009-02-27 2012-03-21 细胞动力国际有限公司 多能细胞的分化
CN102952777A (zh) * 2012-11-29 2013-03-06 山东大学 人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法
CN105062957A (zh) * 2015-06-05 2015-11-18 芜湖医诺生物技术有限公司 血管内皮细胞祖细胞的培养方法
CN109797132A (zh) * 2019-03-15 2019-05-24 苏州大学 一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法
CN110438065A (zh) * 2019-07-25 2019-11-12 中山大学 一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102388130A (zh) * 2009-02-27 2012-03-21 细胞动力国际有限公司 多能细胞的分化
KR20110024660A (ko) * 2009-09-03 2011-03-09 차의과학대학교 산학협력단 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 혈청 및 이종 비함유 분화방법
CN102952777A (zh) * 2012-11-29 2013-03-06 山东大学 人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法
CN105062957A (zh) * 2015-06-05 2015-11-18 芜湖医诺生物技术有限公司 血管内皮细胞祖细胞的培养方法
CN109797132A (zh) * 2019-03-15 2019-05-24 苏州大学 一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法
CN110438065A (zh) * 2019-07-25 2019-11-12 中山大学 一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265377A (zh) * 2021-06-11 2021-08-17 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种动脉内皮促进功能性t细胞再生的方法
CN115247151A (zh) * 2022-09-21 2022-10-28 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 制备造血内皮细胞的方法及制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111440760B (zh) 2022-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Noseda et al. PDGFRα demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium
JP7386290B2 (ja) ヒト心室前駆細胞の生着のための遺伝子マーカー
Guan et al. In vitro cardiomyogenic potential of human amniotic fluid stem cells
KR100835034B1 (ko) 포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방조직을 이용한 심근 세포의 유도
US20130266543A1 (en) Multipotent Adult Stem Cell Population
JP7275109B2 (ja) ニューロピリン－１（ｎｒｐ１）のヒト心室前駆細胞を単離するための細胞表面マーカーとしての使用
US20160320409A1 (en) Method for identifying and selecting cardiomyocytes
AU2004278634A1 (en) Method of inducing the differentiation of stem cells into cardiomyocytes
CN111440760B (zh) 一种人多能干细胞高效分化得到内皮祖细胞的方法
CN112725261B (zh) 多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法
CN112359012B (zh) 诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法及其应用
Choi et al. Purification of pig muscle stem cells using magnetic-activated cell sorting (MACS) based on the expression of cluster of differentiation 29 (CD29)
Ban et al. Non-genetic purification of ventricular cardiomyocytes from differentiating embryonic stem cells through molecular beacons targeting IRX-4
Stone et al. The neural crest population responding to endothelin-3 in vitro includes multipotent cells
US20150329827A1 (en) Muse cells isolation and expansion
JPWO2008150030A1 (ja) Ｇ−ｃｓｆを用いた心筋細胞への分化誘導方法
CN112553289A (zh) 一种评价car-t细胞有效性的方法
CN112424340B (zh) 用于分离心肌细胞群的方法
Bunnell et al. Common transcriptional gene profile in neurospheres-derived from pATSCs, pBMSCs, and pNSCs
WO2014191978A2 (en) Chorion-derived mscs cells and conditioned media as inducer for angiogenesis application for the treatment of cardiac degeneration.
Guenther et al. The treasury of Wharton's Jelly
Harichandan et al. Molecular signatures of primary human spermatogonial progenitors and its neighboring peritubular stromal compartment
Qin et al. The Differentiation of Pluripotent Stem Cells towards Endothelial Progenitor Cells–Potential Application in Pulmonary Arterial Hypertension
Rallapalli et al. Isolation, growth kinetics, and immunophenotypic characterization of adult human cardiac progenitor cells
US20240191227A1 (en) Use of CD56 to predict the differentiation potential of muscle stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant