CN112424340B - 用于分离心肌细胞群的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请尤其涉及样品中的心肌细胞的鉴定、分离和/或纯化。用于从异质分化细胞群中分离心肌细胞群的方法包括：(a)使样品与至少一种试剂接触，该试剂与至少一种心肌细胞表面标记物特异性结合，该心肌细胞表面标记物选自JAK2、DDR2、ACVRL1、CD200、SRPX、PRKACB、MST1R、P2RX1、TNFRSF10A、CHRND、KIAA0319、CD274、CCRL2、MBL2、ADORA和CD181；以及(b)分离与所述试剂结合的细胞。优选的实施例包括使样品与第一试剂接触以提供心室心肌细胞以及与第二试剂接触以提供心房心肌细胞，该第一试剂与选自JAK2、DDR2、ACVRL1、CD200、SRPX、PRKACB和MST1R的细胞表面标记物特异性结合，该第二试剂与选自P2RX1、TNFRSF10A、CHRND、KIAA0319、CD274、CCRL2、MBL2、ADORA3和CD181的细胞表面标记物特异性结合。另一实施例涉及分离的心肌细胞群在治疗心血管疾病或病症中的用途。

Description

用于分离心肌细胞群的方法
技术领域
本发明涉及样品中的心肌细胞的纯化。
背景技术
心血管疾病(CVD)仍然是全球范围内主要的死亡原因。由心血管疾病引起的心脏损害导致功能逐渐丧失和生活质量下降。鉴于我们目前无法产生新的功能性心脏组织或使用外部装置模仿心脏的活动，因此，心脏损伤比任何其他器官的损伤尤其更使人衰弱。由多方面事件引起的心血管疾病可导致不利的后果，包括形成纤维化疤痕组织以及降低通向心脏的血管的扩张能力。由此造成的血流和血压超负荷导致对心肌细胞的不可逆转的损害、心力衰竭并最终死亡。
几十年来，使用基于药物或基于装置的疗法来治疗CVD(例如心律不齐)已充满了与副作用相关的无效或不足的困难。这激发了基于干细胞疗法的最新进展和研究。例如，产生人多能干细胞(hPSC)衍生的心肌细胞旨在创建用于识别心血管疾病的遗传变异的平台，该平台在体外准确地重演疾病表型。最近，用于心血管疾病的干细胞疗法的进展突显了使用干细胞疗法通过修复或再生受损的心脏组织来提供功能性心肌细胞的无限供应以恢复心脏功能的潜力(Hotkar和Balinsky，2012)。虽然较早的研究已经报道了基于细胞的疗法的益处，可改善动物模型的心脏功能(Cambria等，2017)，但由于目前可用的细胞表面标记物对于纯化特定的心肌细胞亚群(心房、心室或起搏点)通常是非特异性的，我们质疑组织植入后是否仍会发生与组织排斥或心律不齐相关的并发症的风险。
尽管干细胞疗法为基于细胞的疗法提供了新的收入，以替代因疾病和年龄1,2而受损的心脏组织，但在体外使用混合细胞群可能会带来问题，因为污染的群可能影响疾病转归以及改变用于转化医学中的心血管移植物的效果。
先前已有报道，SIRPA可用作用于分离衍生自人多能干细胞的心肌细胞的特异性细胞表面标记物(Dubois等，Nat.Biotechnol.2011)。然而，仅SIRPA无法区分特定的心肌细胞群，如心室心肌细胞和心房心肌细胞。特定心肌细胞亚群的纯化是重要的，尤其是对基于细胞的疗法而言，因为心肌细胞亚群表现出不同的电生理性质。
发明内容
这样，本发明试图鉴定对心肌细胞亚群特异的细胞表面标记物，并随后证明可以使用这些特异性细胞外标记物来分离和纯化心房心肌细胞或心室心肌细胞。因此，本发明能够纯化特定的心肌细胞亚群，其可用于针对患者心脏的特定区域并减少由心律不齐引起的并发症的基于细胞的疗法。
在本申请文件中对显然是先前公开的文件的列举或讨论不应被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
在本文中引用的任何文件均通过引用其全文而并入本文。
本发明涉及用于分离心房心肌细胞或心室心肌细胞的特异性细胞表面标记物。
因此，在本发明的第一方面，提供了用于从样品中的异质分化细胞群中分离心肌细胞群的方法，该方法包括：(a)使样品与至少一种试剂接触，该试剂与至少一种心肌细胞表面标记物特异性结合；以及(b)分离与所述试剂结合的细胞，其中心肌细胞表面标记物选自如下所示的表1。
表1
“分离”是指从其他组分可分离或纯化的细胞。分离的细胞是指脱离了其可能天然存在的环境的细胞。相对于其天然可获得的状态，分离的细胞可以被纯化至任何程度。另外，该术语还包括鉴定、富集、分化和区分(例如，在本文中，区分心肌细胞亚型)。
迄今为止，还没有公开的基于本发明的细胞表面标记物的用于富集心肌细胞的方法。与迄今可用的现有技术方法相比，本发明提供了心肌细胞的明显更高水平的富集。此外，现有的用于选择心肌细胞的方法依赖于与流式细胞术或磁性细胞分离方法结合的线粒体染色的使用。较旧的方法需要通过percoll梯度离心，这在技术上具有挑战性且耗时。因此，本发明允许基于细胞表面标记物的鉴定而容易地富集心肌细胞。发明人已发现，可以基于细胞表面标记物CD200、JAK2、CD181和CHRND或这些细胞表面标记物中的任何一种的组合的表达来选择心肌细胞富集的细胞群。
干细胞样品可以是异质分化干细胞群。根据本公开内容的用于培养样品的方法是本领域技术人员已知的，并且在本文件的其他地方进行了描述。在各种实施例中，样品包括在培养物中从干细胞或祖细胞分化的心肌细胞。在一个示例中，干细胞是多能干细胞。在另一个示例中，多能干细胞是人胚胎干细胞(hES细胞)。用于引起干细胞(包括多能干细胞)或祖细胞分化的方法在本领域中是已知的，并且在本文件的其他地方进一步详细解释。在一个示例中，将细胞的分化偏向于心脏谱系的细胞。用于将细胞的分化偏向于心脏谱系的方法是本领域技术人员已知的。细胞可以处于完全分化的过程中或可以完全分化。根据本公开内容的合适的多能细胞包括人胚胎干细胞(hES)、来自其他灵长类动物的胚胎干细胞(如恒河猴干细胞或狨猴干细胞和人胚胎生殖(hEG)细胞)、诱导多能干细胞(iPS)或干细胞系，例如但不限于BG01、BG02、HUES细胞系(例如HUES1-17、HES2或HES3)或人ESC衍生的心脏祖细胞(例如hESC-CPC)。
在另一个示例中，样品包括混合细胞群(包括心肌细胞)。在另一个示例中，混合细胞群包括能够向下分化成心脏谱系的任何细胞类型。在又一个示例中，混合细胞群包括多能细胞、心脏祖细胞、诱导多能干细胞(iPS)、诱导/重新编程的心肌细胞、脐带组织、左心耳、心脏组织、循环内皮细胞、心脏成纤维细胞、脂肪组织或皮肤组织及其组合。
在一个示例中，混合细胞群包括分化的多能细胞和/或其后代。
在另一个示例中，根据本公开内容的样品或混合细胞群是人源的。在一个示例中，细胞是人源的多能细胞。然而，还可以设想，根据其中公开的任何方法，灵长类动物的多能细胞可以适合使用。根据本公开内容的样品或混合细胞群可以是自体同源的或同种异体的。
在一个特定的示例中，多能细胞是人胚胎干(hES)细胞。优选的后代可以包括定向心脏祖细胞(CPC)或衍生自定向心脏祖细胞的细胞。在一个示例中，后代细胞是心肌细胞。在一个示例中，心肌细胞是人心肌细胞。在优选的示例中，本公开内容的方法富集人心肌细胞。
“干细胞”是指在培养之前未分化且能够进行分化的干细胞。干细胞可以选自胚胎干(ES)细胞、多能干细胞、造血干细胞、全能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞和成体干细胞。尤其是，干细胞可以是人胚胎干(hES)细胞。例如，干细胞可以衍生自细胞培养物，如hES细胞。干细胞可以衍生自胚胎细胞系或胚胎组织。胚胎干细胞可以是经过培养并维持未分化状态的细胞。
“分化细胞”是指相比于与其进行比较的细胞，其进一步沿着发育途径发展。因此，胚胎干细胞可以分化成谱系限制性祖细胞(如中胚层干细胞)，其又可以进一步沿着途径分化成其他类型的祖细胞(如心肌细胞祖细胞)，然后分化成最终阶段的分化细胞，其在某些组织类型中发挥特有作用，并且可能保留也可能不保留进一步增殖的能力。
ES细胞产生所有分化细胞的潜力提供了产生任何哺乳动物细胞类型的手段，因此可以使用一系列培养条件来诱导分化。
相对术语“分化”描述了活跃的过程，在此过程中，细胞沿着发育途径发展，从而变得更加谱系限制性和成熟。
在所关注的分化细胞中，是不容易从体干细胞生长的细胞，或是可能大量需要而因此不容易由体干细胞产生有用量的细胞。
分化的干细胞可以在其细胞表面上表达标记物，标记物可以表明特定的细胞类型，例如表明心肌细胞。标记物可用于从其他分化细胞和未分化的干细胞中鉴定和分离分化的心肌细胞。
“标记物”是指可用于鉴定所需心肌细胞的任何部分(moiety)。例如，标记物可以是在所关注的细胞上表达的多肽分子，如“表面标记物”。特异性标记物可以仅存在于所关注的细胞中，或涵盖所关注的细胞，或者与其他细胞相比，所关注的细胞中标记物的可检测水平足够高，从而可以使用本领域已知的多种方法中的任何一种来鉴定所关注的细胞。本领域技术人员将理解，表达是相对术语，并且其他细胞类型有不同的表达。例如，祖细胞可以表达在完全分化的后代细胞中未发现的多肽。所关注的细胞可以表达在周围组织中不表达的多肽，例如胎儿表型的心肌细胞可以表达在成熟的心肌细胞中或在非心肌细胞谱系的其他细胞中未发现的CD166多肽。这种特异性足以用于细胞的鉴定和分离。
“心肌细胞”是指在心脏肌细胞谱系中显示出心脏肌细胞的至少一个表型特征的任何细胞。这类表型特征包括心脏蛋白(如心脏肌节蛋白或肌原纤维蛋白或心房利钠因子)的表达或电生理特征。术语“心肌细胞”和“肌细胞”可互换使用。在一个示例中，心肌细胞被定义为在心脏肌细胞谱系中表达细胞表面标记物CD200、JAK2、CD181和CHRND的任何细胞。该细胞还可以表达一种或多种其他标记物(不是必需的细胞表面标记物)，包括α-辅肌动蛋白、膜联蛋白、心房利钠肽(ANP)、脑利尿肽(BNP)、心肌肌钙蛋白I(cTn1)、心肌肌钙蛋白-T、小窝蛋白-2、小窝蛋白-3、连接蛋白-43、dHAND、eHAND、GATA-4、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、Nkx2.5。
在用于检测和/或分离的典型试验中，使异质分化干细胞群与至少一种标记物特异性“试剂”接触，并直接或间接检测形成的复合物的存在。
用于分离和选择基于细胞表面标记物的表达的细胞的方法对于本领域技术人员而言是熟悉的。
然后可以分离与结合剂结合的分离的或选择的细胞。可以通过本领域已知的任何方法来实现细胞的分离，包括基于亲和力的相互作用、亲和力淘选、磁珠(例如Dynabeads)或流式细胞术。流式细胞术优选采用细胞分选仪，以便可以从对这些细胞表面标记物不呈染色阳性的细胞中去除带有表面标记物CD200、JAK2、CD181和CHRND(因此对CD200、JAK2、CD181和CHRND呈染色阳性)的细胞。
在一个示例中，使用本文所述的结合剂和任选地一种或多种其他细胞表面标记物来选择细胞，并使用荧光激活细胞分选(FACS)或磁性激活细胞分选(MACSTM)来分离细胞。在一个示例中，使用MACSTM来选择细胞，其中细胞是体内研究或体内施用的组合物所需要的。
在另一个示例中，可以通过结合到固定的支持物来分离细胞，然后通过将细胞从支持物中去除来收获细胞。
细胞的收获可以通过将分离的细胞收集到合适的容器或收集皿、试管等中来实现。
在各种实施例中，根据使用本文中公开的表面标记物的方法获得了心肌细胞富集的细胞群。然而，应当理解，细胞可以包括一种或多种其他的细胞表面标记物，通常是已知在心肌细胞上表达的标记物。
在各种实施例中，该方法还包括通过使样品与第一试剂接触以提供第一心室心肌细胞群以及与第二试剂接触以提供第二心房心肌细胞群，在样品中分化心肌细胞亚型，第一试剂与选自表1的行A的细胞表面标记物特异性结合，第二试剂与选自表1的行B的细胞表面标记物特异性结合。
在各种实施例中，第一试剂和第二试剂是相同的。换句话说，有利地，可以使用单一试剂来区分心肌细胞亚型。例如，单一试剂(如抗体)可用于区别和分离SIRPA+心室心肌细胞和心房心肌细胞，即SIRPA+CD200+细胞是心室心肌细胞，而SIRPA+CD200-细胞是心房样的。
在本发明的其他实施例中，该方法还包括以下步骤：在分离心肌细胞群之前，产生样品的培养物并引起样品中细胞的分化，即提供被诱导分化成心肌细胞的人多能干细胞群，然后选择在样品中带有细胞表面标记物的细胞。
“试剂”是指能够通过化学或物理手段与另一部分(例如，细胞表面上的标记物)结合的任何部分，其中试剂和标记物形成结合对。例如，对这些细胞表面标记物具有特异性的抗体是可以商业获得的，或可以使用本领域已知的常规方法来产生，因此抗体和标记物形成结合对。
这样，在各种实施例中，结合剂是抗体或其片段。示例性抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。可以重组产生或根据标准技术通过杂交瘤的生成产生抗体。
抗体可以是单克隆的或多克隆的。合适的单克隆抗体可以通过已知技术制备，例如那些公开在H.Zola的“单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies:A manual oftechniques)”(CRC Press，1988)和J G R Hurrell的“单克隆杂交瘤抗体：技术与应用(Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and applications)”(CRC Press，1982)中的技术，两者均通过引用并入本文。片段可以包含一个或多个可变重链(variableheavy，VH)或可变轻链(variable light，VL)结构域。例如，术语抗体片段包括Fab样分子(Better等(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)Science 240，1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL伴侣结构域经由柔性寡肽连接(Bird等(1988)Science 242，423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)以及包括分离的V结构域的单结构域抗体(dAb)(Ward等(1989)Nature 341，544)。抗体片段还包括任何“抗体变体”，其指任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交，例如但不限于由免疫球蛋白的轻链可变区和/或重链可变区和/或恒定区的噬菌体展示产生的单链抗体分子、或能够以本领域技术人员已知的免疫测定形式与抗原结合的其他免疫相互作用分子。
在Winter和Milstein(1991)Nature 349，293-299中找到在保留其特异性结合位点的抗体片段的合成中涉及的技术的综述。
在各种实施例中，结合剂可能是适体。
分子库，如抗体库(Clackson等，1991，Nature 352，624-628；Marks等，1991，J MolBiol 222(3):581-97)、肽库(Smith，1985，Science 228(4705):1315-7)、表达cDNA库(Santi等(2000)J Mol Biol 296(2):497-508)、除抗体框架外的其他支架(如亲和体)上的库(Gunneriusson等，1999，Appl Environ Microbiol 65(9):4134-40)或基于适体的库(Kenan等，1999，Methods Mol Biol 118，217-31)可用作来源，从中选择对给定基序具有特异性的结合剂用于本发明的方法，尤其是能粘附并结合表1中定义的那些蛋白质生物标记物的那些结合剂。
分子库可以在原核细胞(Clackson等，1991，同上；Marks等，1991，同上)或真核细胞(Kiek等，1999，Proc Natl Acad Sci USA，96(10):5651-6)体内表达，或者可以在体外表达而无细胞参与(Hanes和Pluckthun，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42；He和Taussig，1997，Nucleic Acids Res 25(24):5132-4；Nemoto等，1997，FEBS Lett，414(2):405-8)。在使用基于蛋白质的库的情况下，经常将编码潜在结合分子的库的基因包装在病毒中，并将该潜在结合分子展示在病毒的表面(Clackson等，1991，同上；Marks等，1991，同上；Smith，1985，同上)。
当从库中选择潜在结合分子时，通常使用一种或几种具有确定基序的选择肽。提供结构的氨基酸残基可用于设计选择肽的基序，其降低肽或带电荷的极性或疏水性的侧链的柔性，允许与结合分子的相互作用。
抗体或包括抗体可变区的蛋白质可以与部分未共轭或共轭。合适的部分的示例包括生物素或荧光标记，例如FITC。促进根据本发明的心肌细胞的富集或检测的任何合适的标记旨在被包括在本公开内容的范围内。
因此，在各种实施例中，抗体用可检测部分标记。可检测部分可以选自：荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分、酶促部分和第二抗体。“可检测部分”意味着包括可被检测并且该部分的相对量和/或相对位置确定的任何部分。
可检测部分可以是荧光部分和/或发光部分和/或化学发光部分，当暴露于特定条件时，可以被检测。例如，荧光部分可能需要暴露于在特定波长和强度下的辐射(即光)以引起荧光部分的激发，从而使其能够在特定波长下发射可以被检测的可检测荧光。
可替代地，可检测部分可以是能够将(优选不可检测的)底物转化成可以可视化和/或检测的可检测产物的酶。所使用的合适的酶的示例可以是已知用于如ELISA的试验中的那些酶。
可替代地，可检测部分可以是用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁显像研究的99mTc和123I。其他易于检测部分包括例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，如123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。显然，为了使可检测部分易于检测，要检测的试剂(例如，在本文所述的测试样品和/或对照样品中的一种或多种蛋白质和/或用于检测所选蛋白质的抗体分子)必须具有足够的适当原子同位素。
可以将放射性标记或其他标记以已知方式并入本发明的试剂(即，在本发明的方法的样品中存在的蛋白质和/或本发明的结合剂)中。例如，如果结合部分是多肽，则可以生物合成或者可以通过使用合适氨基酸前体(包含例如取代氢的氟-19)的化学氨基酸合成来合成。如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In等标记可以例如经由结合部分中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以经由赖氨酸残基连接。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80，49-57)可以用于并入123I。参考文献(“免疫闪烁成像中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)”，J-F Chatal，CRCPress，1989)详细描述了其他方法。用于将其他可检测部分(如酶促部分、荧光部分、发光部分、化学发光部分或放射性部分)与蛋白质共轭的方法是本领域众所周知的。
应当理解，可以同时或按顺序使用结合剂。例如，可以首先基于与CD200、JAK2、CD181或CHRND结合的细胞表面来选择细胞，然后通过流式细胞术来分离细胞，然后用与另一种细胞表面标记物结合的结合剂来进一步选择细胞，随后进一步进行流式细胞术。可替代地，可以使用同时与所有细胞表面标记物结合的结合剂来选择细胞，其中，结合剂中的一种可以用例如FITC(异硫氰酸荧光素)标记，并且第二结合剂用例如藻红蛋白(PE)标记，这有助于通过流式细胞术进行分离。
根据本发明，根据本文公开的方法所选择的细胞构成具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的心肌细胞的细胞群。在一个示例中，选择的或分离的细胞具有至少约70％的心肌细胞。在另一个示例中，选择的或分离的细胞具有至少约80％的心肌细胞。在另一个示例中，选择的细胞具有至少约90％的心肌细胞。
本发明还提供了根据本文所述方法的心肌细胞富集的细胞群。在一个示例中，细胞群具有至少约70％的心肌细胞。在另一个示例中，细胞群具有至少约80％的心肌细胞。在另一个示例中，细胞群具有至少约90％的心肌细胞。
在各种实施例中，分离的细胞包括具有至少约85％的心肌细胞的细胞群。
在各种实施例中，本发明还可以提供纯化的细胞群，其包括至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的心肌细胞。在其他示例中，纯化的细胞群可以包括至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的具有CD200、JAK2、CD181和CHRND表面标记物的心肌细胞。
在各种实施例中，使用荧光激活细胞分选法来分离心肌细胞群。
在各种实施例中，样品中的细胞包括从人多能干细胞分化的心肌细胞。细胞可以是ES03细胞和/或BJ iPS细胞。
在本发明的另一方面中，提供了用于检测样品中的心肌细胞的方法，该方法包括：(a)使样品与至少一种结合剂在足以使结合剂去结合的条件下接触一段时间，该结合剂与至少一种心肌细胞表面标记物特异性结合，该心肌细胞表面标记物选自：CD200、JAK2、CD181和CHRND；以及(b)分离与结合剂结合的细胞，其中结合剂结合的细胞是心肌细胞。
通过免疫组织化学检测心肌细胞，并且样品是包括心肌细胞的混合细胞群。
在本发明的另一方面中，提供了分离的心肌细胞群，其通过本发明的方法分离。在各种实施例中，分离的心肌细胞群可以包括至少85％的纯度。“纯度”是指表1中用于分离相应的心室特异性心肌细胞和心房特异性心肌细胞的那些细胞表面标记物的特异性。
在本发明的又一方面中，提供了用于医学的分离的心肌细胞群。本发明的分离的心肌细胞群可以用于预防、修复和/或治疗受试者的至少一种心脏病症。可以接受治疗的心血管疾病或病症包括冠心病、心肌病、心内膜炎、先天性心血管缺陷和充血性心力衰竭、长QT综合征和其他离子通道病变。
这样，在本发明的另一方面中，提供了药物组合物，其包括治疗有效量的所述细胞群以及药学上可接受的载体。
在本发明的又一方面中，提供了用于治疗患有心血管疾病或病症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的所述分离的细胞群或药物组合物。
“心血管疾病或病症”是指与心血管或循环系统有关的疾病或病症。心血管疾病和/或病症包括但不限于心包、心脏瓣膜(即功能不全的瓣膜、狭窄的瓣膜、风湿性心脏病、二尖瓣脱垂、主动脉回流)、心肌(冠状动脉疾病、心肌梗塞、心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛)的疾病和/或病症。本领域技术人员将意识到，心血管疾病和/或病症可以由先天性缺陷、环境影响(即饮食、生活方式、压力等)和其他缺陷或影响引起。
本文公开的纯化的心肌细胞或药物组合物可以手术植入、注射、递送(例如通过导管或注射器)或者以其他方式直接或间接施用到需要修复或增强的位点。肠胃外施用的示例性途径包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、心肌内、心内膜、心外膜、鼻内或鞘内以及输注技术。
动脉内施用包括递送到主动脉、递送到心脏的心房或心室或递送到血管。在将细胞递送到心脏的心房或心室的情况下，可以将细胞施用到左心房或左心室，以避免因将细胞快速递送到肺部而引起的并发症。
在本发明的另一方面中，本文公开的鉴定的、分离的、富集的和纯化的心肌细胞或组合物可以可选地被包装在合适的容器中，容器带有用于所需目的(如重构心肌细胞细胞功能以改善心肌的某些异常或者用于筛查或诊断应用)的书面说明书。
此外，纯化的心肌细胞还可以用于生成工程心脏组织或补片，其用于向梗塞的心脏上的移植、药物筛选或心脏毒性测试、器官芯片等。
因此，本发明提供了试剂盒，其包括与心肌细胞表面标记物结合的至少一种结合剂以及用于分离或富集心肌细胞的说明书，心肌细胞表面标记物选自表1。可以在水性介质中或以冻干形式来包装试剂盒的组分。该试剂盒通常还将包含使用说明书。
本领域技术人员将认识到，在不脱离如广泛描述的本发明的范围的情况下，可以对具体实施例中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面都应被认为是说明性的而不是限制性的。
有利地，利用由Hrvatin等(2014)报道用于细胞内分选后分析RNA的方法(MARIS)，本发明分别基于已知的细胞内标记物MLC2a和MLC2v已经分离了心房心肌细胞和心室心肌细胞。对衍生自两种人多能干细胞(ES03和BJ iPS)的细胞进行心房心肌细胞和心室心肌细胞的分离。然后准备心肌细胞样品用于RNA测序。从RNA测序数据的分析表明，潜在的表面标记物可用于纯化特定的心肌细胞亚型。
如本文所用，术语“特异性结合”应被理解为是指相比于与替代细胞和物质反应或缔合时，结合剂(例如抗体或包括抗体可变区的蛋白质)与特定细胞或物质反应或缔合时频率更高、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更高。例如，与靶蛋白特异性结合的结合剂是这样的试剂，相比于与不相关的蛋白质和/或其表位或免疫原性片段结合时，其与该蛋白质或其表位或免疫原性片段结合时具有更高的亲和力、活动性、更容易、和/或持续时间更长。通过阅读该定义还应理解，例如，与第一靶标特异性结合的结合剂可以或可以不与第二靶标特异性结合。这样，“特异性结合”并不一定需要另一分子的排他性结合或不可检测的结合，这被术语“选择性结合”所涵盖。通常，但并非必须，提及结合是指特异性结合。
如本文所用，术语“受试者”应被理解为是指任何受试者，包括人类或非人类受试者。非人类受试者可以包括非人类灵长类动物、有蹄类动物(牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛)、犬科动物、猫科动物、兔类动物(兔、野兔和鼠兔)、啮齿动物(小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠)、鸟类和鱼类。在一个示例中，受试者是人类。
如本文所用，术语“治疗有效量”应被理解为是指从本发明方法获得的足够量的心肌细胞富集的细胞群，或以其他方式通过本发明方法获得的导致疾病或病况的症状改善或修复的分离的和纯化的细胞。技术人员将意识到，这样的量将根据例如特定受试者和/或疾病的类型或严重程度或水平而变化。该术语不应被解释为将本公开内容限制为特定量，例如细胞的重量或数量，确切地说本公开内容涵盖足以在受试者中实现所述结果的任何数量的细胞。
如本文所用，术语“治疗”包括施用治疗有效量的心肌细胞富集的细胞群或以其他方式分离的和纯化的细胞或包括本文所述的足以减少或消除特定疾病或病况的至少一种症状的细胞的组合物。
本文使用术语“富集”或其变体来描述细胞群，其中当与未处理的细胞(例如在其天然环境中的细胞)群相比，在该细胞群中，一种特定细胞类型的细胞的比例或百分比或者多种特定细胞类型的比例或百分比增加。
在一个示例中，术语“富集的”是指心肌细胞的比例或百分比大于最初包含其的细胞群中的心肌细胞的比例或百分比。
附图说明
为了使本发明能被充分理解并易于付诸实践，现在将通过非限制性示例的方式仅描述本发明的优选实施例，该描述是根据说明性的附图进行的。
在图中：
图1.在衍生自人多能干细胞(PSC)定向分化的心肌细胞中的异质性
(a)GiWi分化方案的示意图，该方案生成不同的心房样、心室样和起搏样心肌细胞群。(b)代表性的FACS图说明了SIRPA+PSC衍生的心肌细胞的纯化。分别从ES03细胞和BJiPS细胞生成的SIRPA+心肌细胞的百分比的图形表示。(c)对cTnT(绿色)免疫染色的心肌细胞的代表性图像。细胞核(蓝色)用DAPI染色。比例尺，100μm。
图2.通过MARIS方法鉴定心房和心室特异性细胞表面标记物
(a)代表性的FACS图说明了MLC2v和MLC2a PSC衍生的心肌细胞的纯化。从ES03细胞或BJ iPS细胞的分化获得的心室心肌细胞相比心房心肌细胞的差异倍数的图形表示。误差线表示标准偏差，n＝3次实验。*P<0.05和**P<0.01；由学生t检验评估。(b)热图说明同一组内的生物复制的聚类。(c)热图示出50个差异表达的细胞表面基因。
图3.验证用于纯化心肌细胞亚群的特异性细胞表面标记物
(a)代表性的FACS图(左图)说明了分别使用SIRPA+/CD181+抗体和SIRP+/CHRND+抗体纯化心房心肌细胞。示出关于MLC2a表达的qPCR数据的图形表示说明了心房心肌细胞群的富集(右图)。误差线表示标准偏差，n＝3次实验。*P<0.05和**P<0.01；由学生t检验评估。(b)左图中示出了使用SIRPA+/CD200+抗体和SIRPA+/JAK2+抗体纯化心室心肌细胞的FACS图。在这些分离的心肌细胞上进行了定量PCR，显示出心室特异性(MLC2v)基因的明显上调。误差线表示标准偏差，n＝3次实验。*P<0.05和**P<0.01；由学生t检验评估。
图4.使用单个细胞表面标记物高效纯化心肌细胞亚群。
(a)使用与SIRPA抗体偶联的心房(CD181、CHRND)或心室(CD200、Jak2)特异性抗体纯化的心肌细胞的免疫细胞化学。从结果来看，很明显，SIRPA+/CHRND+、SIRPA+/JAK2-和SIRPA+/CD200-心房心肌细胞富集，具有超过85％的分选的心肌细胞对MLC2a呈阳性。相反地，SIRPA+/CHRND-、SIRPA+/JAK2+和SIRPA+/CD200+导致心室心肌细胞富集，纯度>90％。另一方面，CD181效率不高，因为大量SIRPA+/CD181+心肌细胞(～30％)也对心室标记物MLC2v呈染色阳性。(b)通过本研究中鉴定的各种抗体(CHRND、CD181、JAK2、CD200)纯化的心房(CTNT+MLC2A)和心室(CTNT+MLC2V)心肌细胞的细胞比例的图形表示。误差线表示标准偏差，n＝3次实验。与对照相比，对于克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)单向方差分析，*P<0.05和**P<0.01。
具体实施方式
示例1
材料和方法
一.用于向心肌细胞分化的人ES细胞和iPS细胞的细胞培养
本发明依赖于在Lian,X.等(2013)Nature protocols 8，162-175，doi:10.1038/nprot.2012.150中提出的方案，其内容通过引用合并于此。
将人ESC系(ES03和BJ iPS)在基质胶(Matrigel)(Corning，354248)上在无饲养层的条件下培养。将细胞维持在iPS-brew培养基(Miltenyi，130-104-368)中，并用胶原酶IV(1mg/ml)(Gibco，17104019)酶处理传代。为了使人ES细胞向心肌细胞分化，我们采用了Lian等3,4建立的方案。在本研究中，将hPSC衍生的心肌细胞培养直至初始收缩，然后收获进行分析。
(a).播种用于心肌细胞分化的人ES细胞
1.将ES细胞在有iPSC-Brew(Miltenyi Biotech，StemMACSTMiPS-Brew XF，人；目录号130-104-368)的6孔板上培养至80-90％融合度。
2.吸出培养基，并用PBS(Gibco；目录号20012-027)洗涤两次。
3.将0.5ml细胞消化液(accutase)(Innovative cell technologies；目录号12679-54)加至每个孔，并在37℃下孵育3-5分钟以获得单细胞悬浮液(需要定期敲击板)。
4.将2ml PBS加入每个孔中以稀释细胞消化液并洗出细胞。然后将细胞悬浮液收集在15ml的离心管(falcon tube)中并以1200rpm离心5分钟以获得细胞团块。
5.然后将细胞团块重悬于18ml补充有5μM的Y27632的iPSC-Brew中。
注意：开始的播种细胞密度对于有效的心脏分化至关重要。在分化开始之前的初始铺板密度和/或扩增时间可能需要针对不同的细胞系或扩增条件进行优化。(该时间点对应于第-4天)。
6.在第-3天、第-2天和第-1天，对6孔板的每个孔吸出培养基并用2ml室温iPSC-Brew替换。
关键步骤：确保在分化的第0天细胞融合度为85-90％。
(b).人ES细胞向心肌细胞的分化
1.第0天：制备在RPMI-1640培养基(Hyclone；目录号SH30027.01)+B27-胰岛素(Gibco：目录号A1895601)中的12μM的CHIR99021(Miltenyi Biotech；目录号130-103-926)。将3ml补充有CHIR99021的RPMI/B27-胰岛素加入6孔板的每个孔中。细胞在37℃、5％CO2下孵育1天。
2.第1天：从6孔板的每个孔中吸出培养基，并用3ml室温RPMI/B27-胰岛素(无CHIR99021)替换。细胞在37℃、5％CO2下孵育2天。
注意：如果观察到大量细胞死亡，则加满培养基(取决于细胞系)
3.第3天：制备在RPMI/B27-胰岛素中的5μM的IWP-2(Miltenyi Biotech；目录号130-105-027)。将3ml补充有IWP-2的RPMI/B27-胰岛素加入6孔板的每个孔中。细胞37℃、5％ CO2下孵育2天。
4.第5天：从6孔板的每个孔中吸出培养基，并用3ml RPMI/B27-胰岛素(无IWP-2)替换。细胞在37℃、5％ CO2下孵育2天。
注意：如果观察到大量细胞死亡，则加满培养基(取决于细胞系)
5.在第7天，从6孔板的每个孔中吸出培养基，用3ml RPMI/Neurobrew-21(Miltenyi Biotech；目录号130-093-566)替换。之后细胞在37℃、5％ CO2下孵育。
二.人ES细胞衍生的心肌细胞的分离
将人PSC衍生的心肌细胞用磷酸盐缓冲溶液(PBS)(Gibco，20012027)洗涤，并与细胞消化液(Bio Laboratories，A1110501)在37℃下孵育5分钟，以获得单细胞悬液。将细胞共染色或三倍染色以分离SIPRA+心房特异性心肌细胞或SIRPA+心室特异性心肌细胞。为了分离纯的心肌细胞，用SIRPα/βPE-cy7(Biolegend，323808)或SIRPα/βPE(MiltenyiBiotech，130-099-783)抗体对细胞染色。随后，用CD181-APC(Miltenyi Biotech，130-115-949)或CHRND(Invitrogen，PA5-71562)抗体分离SIRPA+心房特异性心肌细胞，而用CD200-VioBright FITC(Miltenyi Biotech，130-106-064)或JAK2(Life Technologies，PA511267)抗体分离SIRPA+心室特异性心肌细胞。对于未共轭的CHRND和JAK2抗体，接着分别使用驴抗兔IgG alexa fluor 594(Invitrogen，A21207)或488(Invitrogen，A21206)以1：1000的稀释度二次染色1小时。SIRPα/βPE-cy7、SIRPα/βPE、CD181-APC和CD200-VioBright FITC染色以1：150稀释度进行，而CHRND和JAK2染色以1：60稀释度进行。所有染色均在由PBS中的5％胎牛血清(FBS)(Hyclone，sv30160.03)和2％牛血清白蛋白(BSA)(GEHealthcare K41-001)组成的封闭缓冲液中在37℃下进行90分钟。随后使用BD FACSAriaTMII系统通过FAC纯化染色的心肌细胞。
三.结合剂
根据本公开内容的结合剂可以是基于非抗体的结合剂或抗体或包括抗体可变区的蛋白质。
典型的基于非抗体的结合剂包括肽、拟肽、核酸适体、肽适体、树状物和有机小分子。
核酸适体(适宜的寡聚体)是能够形成二级和/或三级结构的核酸分子，其提供与分子靶标结合的能力。适体库是例如通过将随机的寡核苷酸克隆到载体(或在RNA适体的情况下为表达载体)中产生的，其中随机序列的两侧伴以提供PCR引物结合位点的已知序列。例如，使用SELEX(指数富集的配体系统进化)来选择具有增加的活性的适体。用于产生和/或筛选适体库的合适的方法例如在Elloington和Szostak，Nature 346：818-22，1990中描述。
用于合成小的有机化合物的技术将根据化合物而有很大不同，但是这样的方法对于本领域技术人员是众所周知的。在一个实施例中，使用信息学从已知化合物中选择合适的化学构建块，以产生组合库。例如，QSAR(定量构效关系)建模方法使用化合物结构的线性回归或回归树来确定适用性。化学计算集团公司(Chemical Computing Group,Inc.)(加拿大蒙特利尔)的软件使用对活性化合物以及非活性化合物的高通量筛选的实验数据，以创建概率QSAR模型，随后将其用于选择先导化合物。二进制QSAR方法基于形成“描述符”的化合物的三个特征性质：部分电荷、摩尔折射率(键相互作用)和logP(分子的亲脂性)，这样的化合物具有如下可能性：特定化合物将执行或不执行所需功能。每个原子在分子中都有表面积，并且其具有与之关联的这三个性质。确定在一定范围内具有部分电荷的化合物的所有原子，并求和表面积(Van der Walls表面积描述符)。然后，二进制QSAR模型用于创建活动模型或ADMET模型，其用于构建组合库。因此，在初始筛选中鉴定的先导化合物可用于扩展被筛选的化合物的列表，从而鉴定出高活性化合物。
特别优选的结合剂是抗体或其抗原结合片段或包括抗体可变区的蛋白质。如本文所用，术语“抗体”是指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个表位识别位点，与诸如CD200、JAK2、CD181或CHRND等靶标和/或其表位和/或其免疫原性片段和/或其(例如糖基化的)修饰形式结合的免疫球蛋白分子。该术语不仅涵盖完整的多克隆抗体或单克隆抗体，还涵盖变体、包含具有所需特异性的表位识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体以及包括所需特异性的表位识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。
术语“抗原结合片段”或“包括抗体可变区的蛋白质”应被理解为是指保留与诸如CD200、JAK2、CD181或CHRND等靶标结合的能力的抗体的任何片段。这类片段通常包括Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链抗体(例如scFv)、单结构域抗体(例如dAb)。制备这些片段的方法是本领域已知的。参见例如Harlow和Lane，《抗体：实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual)》，冷泉港实验室，纽约(1988)，通过引用并入本文。
术语“单克隆抗体”是指能够与相同抗原以及优选与抗原中相同表位决定簇结合的同质抗体群。该术语无意就抗体的来源或其制备方式进行限制。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的部分与来源自特定物种(例如鼠科动物，如小鼠)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源自另一物种(例如灵长类动物，如人)或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这些抗体的片段(只要它们表现出所需的生物学活性)中的相应序列相同或同源(美国专利号4,816,567；和Morrison等(1984)Proc.Natl Acad.Sci USA 87:6851-6855)。
术语“人源化抗体”应被理解为是指通常使用重组技术制备的具有表位结合位点的嵌合分子，表位结合位点来源自来自非人类物种的免疫球蛋白以及基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的其余免疫球蛋白结构。抗原结合位点优选包括来自非人抗体的互补决定区(CDR)，其被移植到人抗体可变结构域中的适当构架区和来自人抗体的其余区中。表位结合位点可以是野生型或由一个或多个氨基酸取代修饰。众所周知，重链和轻链的可变区均包含三个互补决定区(CDR)，互补决定区根据所讨论的表位而变化并确定结合能力，其侧翼是四个构架区(FR)，构架区在特定物种中相对保守，并且推测为CDR提供了支架。当针对特定表位制备非人抗体时，可通过将来源自非人抗体的CDR移植到在待修饰的人抗体中存在的FR上来“重塑”或“人源化”可变区。该方法的应用在本领域是已知的。
四.免疫细胞化学
使用相应抗体进行免疫细胞化学分析：制造商建议的稀释度的小鼠抗心肌肌钙蛋白T(Abcam，ab8295)，MLC2a(Zuellig Pharma，565496)和MLC2v(Zuellig Pharma，565497)。简要地说，首先收获细胞并用PBS洗涤一次。用4％多聚甲醛(Axil Scientific，09154-56)固定细胞30分钟，然后视需要用0.2％ Triton X(Bio-Rad，161-0407)透化。然后在室温下用5％ FBS和1％ BSA的PBS封闭细胞30分钟。以相应的稀释度添加一抗，并在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤一次后，细胞在黑暗中与1：1000稀释的Alexa Fluor 488(Invitrogen，A21206)或Alexa Fluor 594(Invitrogen，A21207)二抗在室温下孵育60分钟。细胞核用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(AAT Bio，17510)复染色。在荧光显微镜(Nikon TS-100)下观察细胞，并用Olympus fluoview FV1000共聚焦显微镜成像。
五.RNA分离和定量PCR
对于培养的细胞样品，收获2×106细胞，并在800μl的TRIzol试剂(LifeTechnologies，10296028)中裂解。样品在室温下静置5分钟，然后加入160μl氯仿(KentoChemicals，07278-00)。通过在4℃下以12,000×g离心15分钟来实现相分离。之后，将水相转移至干净的1.5ml微量离心管(Eppendorf tube)中。加入等体积的异丙醇(Merck，67-63-0)，RNA样品在室温下再沉淀10分钟。通过在4℃下以12,000×g离心15分钟使沉淀的RNA样品成团块。对于cDNA合成，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，4368813)将RNA样品(500ng)逆转录以获得cDNA。在补充表1中提供了引物序列。在ABI Viia7实时PCR系统上，使用SYBR Green Master Mix试剂(Applied Biosystems，4385614)进行定量PCR(qPCR)分析。阈值循环(Ct)确定为≥35。每个实验至少重复两次。从三个独立的实验中获得qPCR实验中平均值的标准偏差(s.d.)。
六.统计
定量PCR值表示为平均值±s.d.。使用基于假设正态分布的双边学生t检验对结果进行了统计显著性检验。p值>0.05被认为具有统计学意义。
结果与讨论
1.在衍生自人多能干细胞(hPSC)定向分化的心肌细胞中的异质性
较早的报道已经证明，人多能干细胞(hPSC)和胚胎干细胞(ESC)定向分化的效率和可重复性是获得患者特异性心血管细胞的途径。通过在体外构建特定细胞类型的疾病模型和药物筛选工具，对心血管疾病建模的研究对研究心脏发育至关重要。在这项研究中，使用Lian等人3,4报道的先前公开的方案，我们生成了由不同心肌细胞细胞类型(如心房细胞、心室细胞和起搏细胞)组成的心肌细胞(图1a)。为了我们研究的目的，将心肌细胞培养直至初始收缩，然后进行荧光激活细胞分选(FACS)，以基于心肌细胞特异性标记物SIRPAα/β的表达纯化心肌细胞(图1b)。从结果(图1b、图1c)可以明显看出，尽管GiWi心肌细胞定向分化方法分别从ES03细胞和BJ iPS细胞中获得了36％和32％的SIRPA+心肌细胞，但分选的细胞中少数是心肌肌钙蛋白T(cTnT)阴性，表明SIRPA也可能对早期心肌细胞前体染色。此外，对SIRPA+细胞的基因表达分析表明，纯化的心肌细胞具有异质性，例如对心房或心室心肌细胞特异的标记物(例如MLC2a和MLC2v)均被上调。
2.通过MARIS方法鉴定心房和心室特异性细胞表面标记物
在本文中，我们通过荧光激活细胞分选(FACS)示出，当对MLC2a和MLC2v细胞内标记物共同染色时，ES03和BJ衍生的心肌细胞在体外均由不同细胞类型组成，如心房细胞和心室细胞(图2a)。根据FACS数据估计，富集的心室心肌细胞相比心房心肌细胞的差异倍数分别约为12.5和11.5，这表明GiWi定向分化方法导致心室细胞比心房细胞数量高。为了促进细胞表面标记物的鉴定，我们采用了MARIS(细胞内分选后分析RNA方法)技术5，然后进行RNA测序。获得了心房心肌细胞和心室心肌细胞的转录组图谱，并鉴定了前50种差异表达的细胞表面标记物(图2b、图2c)。表1中的细胞表面标记物是从图2(c)获得的。
3.验证用于纯化心肌细胞亚群的特异性细胞表面标记物
为了验证通过我们的生物信息学分析鉴定出的细胞表面标记物的列表，我们测试了一些在诸如CXCR1(也称为CD181)和CHRND等心房心肌细胞(图3a)或诸如CD200和Jak2等心室心肌细胞(图2c)上特异表达的标记物。
为此，我们使用FACS分离了SIRPA+细胞，然后分别基于CD181和CHRND细胞表面标记物的表达选择了心房特异性心肌细胞(图3a)。CD181阳性和CHRND阳性心肌细胞群通过定量聚合酶链反应(qPCR)进行了进一步验证。如预期的那样，转录物图谱分析表明，与未分选的心肌细胞群相比，富集的CD181和CHRND阳性心肌细胞群显示出心房特异性基因(MYL7，也称为MLC2a)的明显更高的表达(图3a)。
同样地，为了进一步测试分离的心室特异性心肌细胞的能力，我们使用FACS分离了SIRPA+细胞，然后依次分离了表达CD200和JAK2的心肌细胞(图3b)。我们证明了CD200和Jak2均是心室心肌细胞的特异性标记物，使用qPCR分析进一步验证了它们，示出了与未分选的心肌细胞群相比，CD200或JAK2阳性心肌细胞显示出MYL2基因(也称为MLC2v)的明显更高的水平(图3b)。这些结果进一步支持了图2中我们的RNA测序数据，其中CD181和CHRND仅在心房心肌细胞中表达，而CD200和JAK2仅在心室心肌细胞中表达。
为了进一步验证筛选后的细胞表面标记物对心肌细胞亚群(心房或心室)的分离和免疫细胞化学具有特异性，我们进行了免疫染色，使用对CHRND、CD181、JAK2或CD200呈阳性/阴性的心肌细胞(SIRPA阳性)示出了MLC2a(心房的)和MLC2v(心室的)的表达。图4中的结果证明，与SIRPA偶联的单一抗体(CHRND、CD200或JAK2)能够富集心房心肌细胞或心室心肌细胞。从数据中可以明显看出，SIRPA+/CHRND+、SIRPA+/JAK2-和SIRPA+/CD200-富集心房心肌细胞，其中超过85％的分选的心肌细胞对MLC2a呈阳性。相反地，SIRPA+/CHRND-、SIRPA+/JAK2+和SIRPA+/CD200+导致心室心肌细胞的富集，纯度>90％。另一方面，由于SIRPA+/CD181+对MLC2a和MLC2v均呈染色阳性，因此CD181可能不是区分心房心肌细胞或心室心肌细胞的良好表面标记物(图4)。
4.治疗用途
本发明还提供了本发明的心肌细胞在增强需要这种治疗的人类患者或其他受试者的心肌的组织维持或修复中的用途。
为了确定细胞组合物用于治疗性施用的适用性，首先在动物模型中测试细胞。可以向免疫缺陷动物施用细胞。经过一段时间的再生后收获组织，并评估组织是否仍然存在。细胞可以用可检测标记(例如绿色荧光蛋白)来标记。所施用细胞的存在可以通过免疫组织化学或ELISA来评估。
可以通过评估从本发明的细胞的治疗确保的心脏恢复程度来确定适用性。例如，通过放置预冷的铝棒使其与左心室前壁的表面接触，或者通过将在液氮中冷却的30-50mm铜盘探针放置在左心室前壁上，可以对心脏进行冷冻损伤。通过结扎左主冠状动脉可诱发梗塞。损伤位点用本公开内容的细胞制剂来治疗，并且心脏组织通过组织学来检查受损区域中细胞的存在。可以通过确定左心室舒张末压、发展压、压力上升率和压力衰减率等参数来监测心脏功能。
通过以允许它们移植或迁移到预期组织位点并重建或再生功能缺陷区域的方式施用，本发明的心肌细胞可以用于人类受试者或其他受试者的组织重建或再生。可以使用适合于将能够重构心脏功能的细胞直接施用到心脏的腔室、心包或心肌内部的所需位置的特殊装置。可以通过冠状动脉内注射，例如注射入冠脉循环，将细胞施用到受体心脏。也可以通过肌内注射入心脏壁来施用细胞。心肌细胞可以作为细胞悬液或使用心脏腔室特异性心肌细胞以工程心脏组织/补片的形式来施用。(有关其他潜在应用，参考评论[4])
根据本公开内容的方法适合作为治疗对象的受试者包括患有各种急性或慢性心脏病况的受试者，包括冠心病、心肌病、心内膜炎、先天性心血管缺陷和充血性心力衰竭。
在一个示例中，向患有心肌梗塞的受试者施用本公开内容的富集的心肌细胞。例如，注射的细胞迁移到梗塞的心肌。心肌细胞组装到心肌组织中，导致梗塞的心肌的修复或再生。
在另一个示例中，向患有心力衰竭的受试者施用本公开内容的富集的心肌细胞，其中架置(mount)对至少部分地恢复心脏功能有效。心力衰竭可以被认为是凋亡介导的心肌细胞损失的进行性疾病，其最终导致心肌功能能力受损。
可以通过临床公认的标准来监测治疗效果，如疤痕组织占的面积减少或疤痕组织的血运重建，以及心绞痛的频率和严重程度；或发展压、收缩压、舒张末压、Δ压力/Δ时间、射血分数、患者的活动能力和生活质量的改善。
根据上述方法中的任何一种，用本发明的富集细胞群的受试者的治疗可以与诸如外科手术等其他程序结合使用。
5.药物组合物
本公开内容的纯化的心肌细胞可以以药物组合物的形式提供，其包括载体或赋形剂。组合物的赋形剂或其他要素的选择可以根据用于施用的途径和装置进行调整。
术语“载体”和“赋形剂”是指本领域常规使用的物质组合物，以促进活性化合物的存储、施用和/或生物活性(参见例如雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)，第16版，麦克出版公司(1980)。载体还可以减少活性化合物的任何不期望的副作用。合适的载体是例如稳定的，例如不能与载体中的其他成分发生反应。在一个示例中，在用于治疗的剂量和浓度下，载体不会在受者中产生明显的局部或全身不良反应。
载体或赋形剂可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙烯、二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来预防微生物的作用。最好还包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。也可以添加稳定剂以保护组合物免受治疗活性的损失。示例包括缓冲液、赖氨酸等氨基酸、诸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露醇等碳水化合物。
在另一个示例中，载体是培养基组合物，例如细胞在其中生长或悬浮的培养基组合物。例如，这样的培养基组合物在施用的受试者中不会引起任何不良影响。
示例性的载体和赋形剂不会不利地影响细胞的活力和/或细胞用作心肌细胞的能力。
在一个示例中，载体或赋形剂提供缓冲活性以将细胞和/或可溶性因子维持在合适的pH下从而发挥生物学活性，例如，载体或赋形剂为磷酸盐缓冲溶液(PBS)。PBS代表有吸引力的载体或赋形剂，因为它与细胞和因子的相互作用最小并且允许细胞和因子的快速释放，在这种情况下，本公开内容的组合物可以作为液体产生，以例如通过注射而直接应用到血流或者到组织或在组织周围或邻近组织的区域中。
该组合物还可以包括或伴随有一种或多种促进细胞的植入或功能运用的其他成分。合适的成分包括基质蛋白或凝胶聚合物，其支持或促进细胞或互补的细胞类型(尤其是内皮细胞)的粘附。
各种不同的支架可以成功地用于本公开内容的实践中。示例性的支架包括但不限于生物可降解支架。天然的可生物降解的支架包括胶原蛋白支架、纤连蛋白支架和层粘连蛋白支架。用于细胞移植支架的合适的合成材料应能够支持广泛的细胞生长和细胞功能。这样的支架也可以是可吸收的。合适的支架包括聚乙醇酸支架，例如，如Vacanti等.J.Ped.Surg.23:3-9 1988；Cima等.Biotechnol.Bioeng.38:145 1991；Vacanti等.Plast.Reconstr.Surg.88:753-9 1991所述的；或合成聚合物，如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。
在另一个示例中，可以在凝胶支架(如来自Upjohn公司的Gelfoam)中施用细胞。
纯化的心肌细胞可以以任何方便或实用的方式(例如悬浮、乳化、混合、包囊、吸收等)与载体或赋形剂组合。
本文所述的组合物可以单独施用或与其他细胞混合施用。可以与本公开内容的组合物一起施用的细胞包括但不限于其他专能或多能细胞或干细胞或者骨髓细胞。可以在施用前立即或不久将不同类型的细胞与本公开内容的组合物混合，或者可以在施用前将它们一起共同培养一段时间。
要施用的细胞的确切数量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重和性别以及要治疗的病况的程度和严重程度。
在某些情况下，在开始细胞治疗之前药理学上免疫抑制受试者和/或降低受试者对细胞组合物的免疫应答是合乎需要的或适当的。减少或消除对移植细胞的免疫应答的手段是本领域已知的。或者，可以对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。
在另一个示例中，可以将纯化的心肌细胞与其他有益的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起施用。当与其他药剂施用时，它们可以在单一药物组合物中一起施用或在分开的药物组合物中与其他药剂同时或按顺序(在其他药剂施用之前或之后)施用。
本发明还提供用于根据任何示例的本文所述的方法中的医疗装置，或者当用于根据任何示例的本文所述的方法时，本发明还提供医疗装置。例如，本公开内容提供了注射器或导管或其他合适的递送装置，其包括纯化的心肌细胞或根据本公开内容的组合物。可选地，注射器或导管与说明书一起包装以用于根据任何示例的本文所述的方法中。
尽管在前述说明中已经描述了本发明的优选实施例，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节进行许多变化或修改。
参考文献
1.Burridge,P.W.,Keller,G.,Gold,J.D.&Wu,J.C.Production of de novocardiomyocytes:human pluripotent stem cell differentiation and directreprogramming.Cell stem cell 10,16-28,doi:10.1016/j.stem.2011.12.013(2012).
2.Laflamme,M.A.&Murry,C.E.Regenerating the heart.Nature biotechnology23,845-856,doi:10.1038/nbt1117(2005).
3.Lian,X.et al.Robust cardiomyocyte differentiation from humanpluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wntsignaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 109,E1848-1857,doi:10.1073/pnas.1200250109(2012).
4.Lian,X.et al.Directed cardiomyocyte differentiation from humanpluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fullydefined conditions.Nature protocols 8,162-175,doi:10.1038/nprot.2012.150(2013).
5.Hrvatin,S.,Deng,F.,O'Donnell,C.W.,Gifford,D.K.&Melton,D.A.MARIS:method for analyzing RNA following intracellular sorting.PloS one 9,e89459,doi:10.1371/journal.pone.0089459(2014).

Claims (11)

1.一种用于从样品中的人多能干细胞分化的心肌细胞的异质群中区别和分离心肌细胞亚群的方法，该方法包括：
(a)使样品与第一试剂接触以提供第一心室心肌细胞群和/或与第二试剂接触以提供第二心房心肌细胞群，所述第一试剂与选自由JAK2和CD200组成的组的细胞表面标记物特异性结合，所述第二试剂与CHRND特异性结合；以及
(b)分离与试剂结合的细胞，
其中所述第一试剂和所述第二试剂中的每一种与抗SIRPA的结合剂偶联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：在分离心肌细胞群之前，产生人多能干细胞的培养物并引起样品中人多能干细胞分化成心肌细胞的异质群。
3.根据权利要求1所述的方法，其中结合剂是抗体或其片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体用可检测部分标记。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可检测部分选自由荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分、酶促部分和第二抗体组成的组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中分离的细胞包括具有至少85％纯度的细胞群。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中使用荧光激活细胞分选法分离心肌细胞群。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞是ES03细胞和/或BJiPS细胞。
9.一种分离的心肌细胞群，其通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法分离，其中所述分离的心肌细胞群包括具有JAK2和CD200表面标记物的第一心室心肌细胞群和/或具有CHRND表面标记物的第二心房心肌细胞群。
10.一种药物组合物，包括治疗有效量的根据权利要求9所述的第一心室心肌细胞群或第二心房心肌细胞群以及药学上可接受的载体。
11.一种试剂盒，包括与包含JAK2、CD200和CHRND的心肌细胞表面标记物中的每一种特异性结合的结合剂，这些结合剂与抗SIRPA的结合剂偶联，以及包括用于区别和分离心肌细胞亚群的说明书。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114222588A (zh) 2019-08-12 2022-03-22 雷杰纳荣制药公司 巨噬细胞刺激1受体(mst1r)变体及其用途
WO2023134715A1 (zh) * 2022-01-12 2023-07-20 中国医学科学院阜外医院 心肌细胞的分离试剂和分离方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272325A (zh) * 2008-11-17 2011-12-07 威拉赛特公司 用于疾病诊断的分子表达谱的方法和组合物
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
CN104774804A (zh) * 2010-06-13 2015-07-15 中国科学院生物物理研究所 由干细胞制备心肌细胞的方法和组合物及其用途
WO2016131137A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 University Health Network Methods for making and using sinoatrial node-like pacemaker cardiomyocytes and ventricular-like cardiomyocytes
WO2016201129A1 (en) * 2015-06-09 2016-12-15 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for enrichment of cells
WO2017207576A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 Miltenyi Biotec Gmbh Process for generation, identification and isolation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and cardiomyocyte subpopulations
WO2018224983A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Centro Cardiologico Monzino Spa Method for the isolation of subpopulations of cardiac progenitor cells and related uses in the medical field

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110030072A1 (en) * 2008-12-04 2011-02-03 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of immunodeficiency genes in animals
JP2015527889A (ja) * 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
ES2689804T3 (es) * 2013-11-20 2018-11-15 Miltenyi Biotec Gmbh Composiciones de subpoblaciones de cardiomiocitos

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272325A (zh) * 2008-11-17 2011-12-07 威拉赛特公司 用于疾病诊断的分子表达谱的方法和组合物
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
CN104774804A (zh) * 2010-06-13 2015-07-15 中国科学院生物物理研究所 由干细胞制备心肌细胞的方法和组合物及其用途
WO2016131137A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 University Health Network Methods for making and using sinoatrial node-like pacemaker cardiomyocytes and ventricular-like cardiomyocytes
WO2016201129A1 (en) * 2015-06-09 2016-12-15 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for enrichment of cells
WO2017207576A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 Miltenyi Biotec Gmbh Process for generation, identification and isolation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and cardiomyocyte subpopulations
WO2018224983A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Centro Cardiologico Monzino Spa Method for the isolation of subpopulations of cardiac progenitor cells and related uses in the medical field

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Differential Expression Levels of Integrin α6 Enable the Selective Identification and Isolation of Atrial and Ventricular Cardiomyocytes;Anne Maria Wiencierz et al.;《PLOS ONE》;第10卷(第11期);第1页倒数第1段，第2页第1段，材料和方法中"基于抗体的表面标志物筛选"，图1A，图4E *
Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions;Xiaojun Lian et al.;《Nat Protoc.》;第8卷(第1期);162–175 *
Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation;Irit Huber et al.;《The FASEB Journal》;第21卷;2551-2563 *
Pharmacological and molecular characterization of functional P2 receptors in rat embryonic cardiomyocytes;Kwok-Kuen Cheung et al.;《Purinergic Signalling》;第11卷;127–138 *
SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells;Nicole C Dubois et al.;《Nat Biotechnol.》;第29卷(第11期);1011–1018 *
Transcriptome-Guided Functional Analyses Reveal Novel Biological Properties and Regulatory Hierarchy of Human Embryonic Stem Cell-Derived Ventricular Cardiomyocytes Crucial for Maturation;Ellen Poon et al.;《PLOS ONE》;第8卷(第10期);1-13 *
人心房肌细胞的培养与鉴定;张荣庆等;《中华心血管病杂志》;第32卷(第9期);837-840 *

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