ES2689804T3 - Composiciones de subpoblaciones de cardiomiocitos - Google Patents

Abstract

Un método para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares a partir de una muestra que comprende cardiomiocitos, comprendiendo el método los pasos de a) poner en contacto dicha muestra i) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49e acoplado a un fluoróforo, por lo tanto, una marcación más fuerte (CD49ealto) de los cardiomiocitos ventriculares de dicha muestra que los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo) de dicha muestra, o ii) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49f acoplado a un fluoróforo, por lo tanto, una marcación más fuerte (CD49falto) de los cardiomiocitos auriculares de dicha muestra que los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo) de dicha muestra, b) poner en contacto dicha muestra con un agente que permite la marcación específica de cardiomiocitos, comarcando de este modo los cardiomiocitos, donde dicho agente es un fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos acoplado a un fluoróforo o un colorante específico para mitocondrias. c) enriquecer, aislar, detectar y/o analizar dichas células comarcadas determinando un nivel de expresión de proteína CD49e y/o CD49f sobre la superficie celular de dichas células comarcadas, en donde la expresión de CD49ealto o CD49fbajo es indicativa de cardiomiocitos ventriculares y la expresión CD49ebajo o CD49falto es indicativa de cardiomiocitos auriculares.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones de subpoblaciones de cardiomiocitos Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de los cardiomiocitos, en particular a los cardiomiocitos auriculares y ventriculares, a métodos para la separación, detección, enriquecimiento, aislamiento y a los usos de estas células.

Antecedentes de la invención

Los corazones están formados por diferentes poblaciones celulares, tales como cardiomiocitos, fibroblastos, células endoteliales y de músculo liso. Los cardiomiocitos auriculares y ventriculares son de especial interés en la investigación del corazón y la medicina regenerativa. Están localizados naturalmente en el corazón de los mamíferos y también pueden derivarse de otros tipos de células, por ejemplo, células madre, por señales inductivas. Varias proteínas intracelulares como proteínas musculares y/o factores de transcripción se han descrito como expresadas diferencialmente en cardiomiocitos auriculares o ventriculares; los cardiomiocitos auriculares se caracterizan, por ejemplo, por expresión génica de Myl7, Fgf12, Sln, Gja5, Nppa, Tbx5, los cardiomiocitos ventriculares se caracterizan, por ejemplo, por expresión génica de Hey2, Irx4, Lbh, Myh7.

En el desarrollo del ratón, el corazón de cuatro cámaras está formado por el día embrionario (E) 10.5. La secuencia de eventos morfológicos coincide con la expresión restringida en la cámara de proteínas sarcoméricas individuales en cardiomiocitos de aurículas y ventrículos. Como lo describe Chuva de Sousa Lopes SM et al. ((2006) Dev Dyn 235(7): 1994-2002), el ARNm de la proteína del músculo intracelular auricular, la cadena ligera de la miosina 2a (MLC-2a), es altamente expresado en las aurículas, débilmente expresado en el trabeculado e indetectable en el miocardio compactado de los ventrículos desde E14.5 en adelante. La expresión opuesta se describe para el ARNm de la proteína del músculo intracelular ventricular (MLC-2v), que se encontró que se expresaba en ambos ventrículos pero estaba ausente en las aurículas. Después del nacimiento, la expresión de ambos marcadores está aún más restringida a las aurículas o los ventrículos. Hasta la fecha, la expresión de proteínas intracelulares enriquecidas en cardiomiocitos auriculares o ventriculares no se pudo correlacionar con marcadores de superficie celular correspondientes que permiten el enriquecimiento celular selectivo de cardiomiocitos auriculares o ventriculares. Por lo tanto, actualmente es imposible purificar cardiomiocitos auriculares y ventriculares de poblaciones de células mixtas, así como de poblaciones mixtas de cardiomiocitos por medio de procedimientos de separación celular basados en marcadores de superficie celular.

Se sabe que los patrones de expresión de genes cardíacos clave durante la diferenciación de células madre pluripotentes (PSC) in vitro reflejan estrechamente su expresión endógena durante la cardiogénesis in vivo y los cardiomiocitos derivados de PSC comparten características funcionales con los cardiomiocitos embrionarios (Hescheler et al., 1997) Cardiovasc Res. 36: 149-162). Un problema importante sigue siendo la heterogeneidad de las poblaciones celulares generadas por los protocolos de diferenciación in vitro. Además de contaminar los no cardiomiocitos, la mayoría de los protocolos de diferenciación generan una mezcla de subpoblaciones de cardiomiocitos, como cardiomiocitos auriculares, ventriculares y de marcapasos. Aunque se han informado protocolos de diferenciación que favorecen la generación de subpoblaciones de cardiomiocitos, no se han descrito ni la generación de subpoblaciones de cardiomiocitos puros ni el enriquecimiento basado en marcadores de superficie de subpoblaciones individuales. Los cardiomiocitos generalmente se identifican mediante análisis de inmunofluorescencia basados en anticuerpos, usando anticuerpos contra factores de transcripción específicos de cardiomiocitos o proteínas sarcoméricas o mediciones electrofisiológicas. Todas las proteínas específicas de subtipo conocidas están localizadas intracelularmente y así evitan el aislamiento de células viables, porque los anticuerpos no pueden unirse a componentes intracelulares sin destruir las células por permeabilización para permitir la penetración del anticuerpo, limitando así el análisis corriente abajo y evitando el uso de subpoblaciones de cardiomiocitos viables.

Aunque se han descrito marcadores de superficie celular generales de cardiomiocitos primarios y derivados de PSC, incapaces de discriminar entre cardiomiocitos auriculares y ventriculares, y se ha realizado el enriquecimiento basado en marcador de superficie, por ejemplo, con cardiomiocitos humanos derivados de PSC, aún hacen falta métodos para la separación de cardiomiocitos primarios o derivados de PSC en subpoblaciones de cardiomiocitos auriculares y ventriculares por medio de métodos de purificación de células basadas en marcadores de superficie.

Se han descrito procedimientos experimentales independientes de marcadores de superficie celular para enriquecer cardiomiocitos de poblaciones de células mixtas, pero todavía no se puede discriminar entre cardiomiocitos auriculares y ventriculares: 1) Separación física en función del tamaño: los cardiomiocitos se acumulan en una capa específica de un gradiente de Percoll. Este método es laborioso, da purezas del 75-90% y un rendimiento celular muy débil. 2) Genes informadores fluorescentes o de resistencia a antibióticos que son dirigidos por promotores específicos de subtipo o

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cardiomiocitos, por ejemplo, cadena ligera de miosina (Bizy et al. (2013) Stem Cell Res 11: 1335-1347). Esto produce >90% de cardiomiocitos después de selección de FACS o selección de antibióticos, pero requiere una modificación genética de cada línea celular o de ratón y no es ampliamente aplicable ni útil para la traducción clínica. 3) Balizas moleculares que emiten una señal de fluorescencia cuando se hibridan con ARNm diana, como troponina T cardiaca o cadenas ligeras de miosina (Ban et al. (2013) Circulation 128: 1897-1909). Este método requiere nuevamente la modificación (genética) de las células mediante la transfección de las respectivas balizas moleculares. 4) Alta abundancia de mitocondrias celulares es una característica común de los cardiomiocitos primarios. Por lo tanto, el etiquetado intracelular de cardiomiocitos con tintes mitocondriales como MitoTracker Red ha sido descrito como una herramienta para enriquecer cardiomiocitos por FACSorting (Hattori et al. (2010) Nat Methods 7: 61-66), pero resultó ser útil solo en cardiomiocitos primarios que acumulaban un gran número de mitocondrias. 5) La selección metabólica de cardiomiocitos cultivados por intercambio de glucosa con lactato en el medio de cultivo se ha descrito como un medio para enriquecer los cardiomiocitos (Tohyama et al. (2013) Cell Stem Cell 12: 127-137); las principales desventajas de este método son un largo período de selección (varios días) así como recuperaciones débiles de cardiomiocitos.

Ninguno de estos métodos puede usarse para enriquecer selectivamente las subpoblaciones de cardiomiocitos, es decir, cardiomiocitos auriculares y ventriculares a partir de poblaciones de células mixtas.

Además, se han identificado varios marcadores de superficie celular en cardiomiocitos primarios o derivados de PSC, pero no en subpoblaciones de cardiomiocitos auriculares o ventriculares y, por lo tanto, no son adecuados para la discriminación de cardiomiocitos auriculares y ventriculares. La mayoría de los marcadores de superficie celular descritos hasta ahora se expresan en cardiomiocitos, así como en cardiomiocitos no cardiacos, como CD106 (VCAM-

1), CD166 (ALCAM), CD340 (ErbB2) y CD61 (Integrina beta-3). Stuart Walsh ((2010) Dissertation, Lund University; ISBN 93-59-7) identificó a VCAM-1 (CD106) como marcador de la superficie celular de los cardiomiocitos por análisis por citometría de flujo de la expresión del promotor alfa-MHC-eGFP en células embrionarias del corazón del ratón. La clasificación FACS reveló que >97% de las células clasificadas con CD106+/CD31 de embriones del día 10.5-11.5 también eran positivas para la proteína del músculo cardíaco Troponina T. Las células clasificadas expresaron proteínas estructurales específicas del corazón que incluyen alfa-MHC, MLC-2a y MLC-2v, lo que indica que este marcador de superficie celular etiqueta los cardiomiocitos auriculares y ventriculares y no permite el aislamiento específico del subtipo. Los anticuerpos contra VCAM-1 podrían usarse también para purificar una mezcla de cardiomiocitos de tipo ventricular y de marcapasos derivados de PSCs humanos. (Uosaki et al. (2011) PLoS One 6: e23657). Hirata et al. ((2006) Cells Tissues Organs 184: 172-80) identificaron ALCAM (CD166) como marcador de superficie general para cardiomiocitos en corazones de ratón entre los días embrionarios 8.25 y 10.5 mediante análisis por inmunofluorescencia. Además, Rust et al. ((2009) Regen Med 4: 225-237) utilizaron el enriquecimiento basado en anticuerpos de cardiomiocitos derivados de PSC humanos positivos para ALCAM. Sin embargo, la expresión de ALCAM no puede usarse para discriminar entre subpoblaciones de cardiomiocitos.

Aunque todavía no se ha descrito explícitamente para el enriquecimiento de cardiomiocitos basado en anticuerpos, se conoce la expresión de CD340 (ErbB2) y ErbB4 en cardiomiocitos primarios y humanos/de ratón del miocardio funcional (por ejemplo, Pentassuglia and Sawyer (2009) Exp Cell Res 315: 627-637). Se describe la expresión de varios miembros de la familia de integrinas en cardiomiocitos: alfa-1, alfa-3, alfa-5 (CD49e), alfa-6 (CD49f), alfa-7, alfa- 9 y alfa-10, así como subunidades beta beta-1, beta-3 (CD61) y beta-5 se expresaron en cardiomiocitos primarios o derivados de PSC. Los principales heterodímeros de integrina en la superficie de los cardiomiocitos son alfa-5/beta-1 y alfa v/beta-3 (Ross and Borg (2001) Circ Res 88: 1112-1119). La caracterización de la distribución de miembros de la familia de integrinas basada en la hibridación in situ (ARNm) y el análisis inmunohistoquímico (proteína) encontró una alta expresión de la integrina alfa-6 (CD49f) en las aurículas durante el desarrollo. La integrina alfa-6 está ausente de la capa compacta de los ventrículos, pero es altamente expresada en las trabéculas ventriculares desde E15 en adelante. Además, la expresión de integrina alfa-6 en el endocardio alcanza un pico en E18, incluidas todas las células endoteliales coronarias. Extracardialmente, se encontró alfa-6 en el endotelio, el epitelio y el tejido nervioso (Hierck et al., (1996) Dev Dyn 206: 100-111). Estos datos indican claramente una expresión simultánea de integrina alfa-6 en cardiomiocitos auriculares y ventriculares, así como no cardiomiocitos durante el desarrollo del corazón. Hace falta un análisis de células individuales así como una correlación directa de la expresión de integrina alfa-6 con subpoblación de cardiomiocitos específica, expresión de proteínas intracelulares (por ejemplo, MLC-2a) en la misma célula. Además, no se proporcionan datos sobre el desarrollo de tecnología utilizando patrones de expresión de integrina para el desarrollo de estrategias de separación celular para el enriquecimiento selectivo de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares.

El documento WO2011/157029A1 describe procesos de diferenciación para la generación de cardiomiocitos. La adición de ácido retinoico (RA) da como resultado una mayor generación de cardiomiocitos auriculares, el bloqueo del (RAi) da como resultado una mayor generación de cardiomiocitos ventriculares. En general, los procesos descritos en el documento WO2011/157029A1 conducen a la pureza de los cardiomiocitos del 50.7% (RA) y del 64.7% (RAi),

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respectivamente. Pero no se describe ningún proceso sobre cómo aislar estas células diferenciadas de dichas diferenciaciones.

El documento WO2011/005930A1 divulga métodos y composiciones para reparar el miocardio dañado utilizando células derivadas de tejido cardíaco humano expandido que no expresan telomerasa. Las células humanas derivadas de tejido cardíaco expresan al menos uno de los siguientes marcadores: CD49e, CD105, CD59, CD54, CD90, CD34 y CD117. Pero el documento WO2011/005930A1 no hace una diferenciación de los subtipos de cardiomiocitos.

Brancaccio et al. (1998, Cell Adhesion and Communication, vol.5: 193-205) describe que la integrina alfa5 (CD49e) se expresa en cardiomiocitos de aurículas y ventrículos. La integrina alfa 6 (CD49f) se expresa en los cardiomiocitos auriculares, mientras que en los ventrículos se localiza preferentemente en los vasos y el endocardio.

La incapacidad actual para enriquecer los cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares de poblaciones celulares mixtas que contienen cardiomiocitos y no cardiomiocitos o preparaciones de cardiomiocitos que contienen mezclas de subpoblaciones de cardiomiocitos mediante un método de enriquecimiento basado en marcador de superficie, impide el uso de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares para aplicaciones corriente abajo como:

a) metodologías individuales de criba de fármacos en cardiomiocitos auriculares o ventriculares enriquecidos

b) terapia de reemplazo celular usando subpoblaciones de cardiomiocitos enriquecidos, por ejemplo, cardiomiocitos de tipo ventricular para el trasplante al ventrículo, cardiomiocitos de tipo auricular para el trasplante a la aurícula

c) caracterización de la aparición del subtipo de cardiomiocitos durante el desarrollo del corazón

d) direccionamiento selectivo de subpoblaciones de cardiomiocitos para terapia génica y aplicaciones de administración de fármacos, usando, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla específicos del subtipo de cardiomiocito

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un método para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y ventriculares.

Resumen de la invención

La presente divulgación proporciona el uso de marcadores de superficie celular para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de subpoblaciones de cardiomiocitos. Un método basado en marcadores de superficie celular para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de subpoblaciones de cardiomiocitos es un método moderado para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de, por ejemplo, subpoblaciones de cardiomiocitos viables y no modificados. Se descubrió que estos marcadores de superficie celular son específicos para los cardiomiocitos auriculares y ventriculares. La presente invención proporciona adicionalmente composiciones de subpoblaciones de cardiomiocitos así como usos de las mismas que pueden obtenerse mediante el método descrito en el presente documento, en donde dicha composición contiene al menos 90% de células positivas a alfa-actinina.

Sorprendentemente, se encontró que:

1) CD49e (integrina alfa-5), es un marcador de superficie para los cardiomiocitos auriculares y ventriculares y permite el enriquecimiento correspondiente de las subpoblaciones de cardiomiocitos primarios y derivados de PSC.

2) CD49f (integrina alfa-6) es un marcador de superficie para los cardiomiocitos auriculares y ventriculares y permite el correspondiente enriquecimiento de las subpoblaciones de cardiomiocitos primarios y derivados de PSC.

3) CD61 (integrina beta-3) es un marcador de superficie para cardiomiocitos murinos derivados de células madre y permite el enriquecimiento de cardiomiocitos murinos derivados de PSC.

4) CD112 (Nectin-2), CD146 (MCAM) y CD340 (ErbB2) son marcadores de superficie generales para cardiomiocitos y permiten el enriquecimiento de subpoblaciones de cardiomiocitos primarios y derivados de PSC.

5) La marcación combinatoria de cardiomiocitos con un anticuerpo contra un marcador de superficie de cardiomiocitos general, por ejemplo, CD340, más un anticuerpo contra CD49e o CD49f, permite la detección y el enriquecimiento específicos de subtipos con altas purezas.

6) Un cribado basado en anticuerpos de no cardiomiocitos en suspensiones primarias de células cardíacas y suspensiones celulares derivadas de PSC revelaron siguientes marcadores de superficie de los cardiomiocitos no- cardiacos: Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326. Los no cardiomiocitos dentro de poblaciones de células mixtas que comprenden cardiomiocitos y no cardiomiocitos se pueden eliminar mediante el agotamiento basado en anticuerpos

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de no cardiomiocitos que se dirigen a los marcadores superficiales antes mencionados de los cardiomiocitos. Por lo tanto, los cardiomiocitos "intactos", es decir, los cardiomiocitos que no están marcados con anticuerpos, son enriquecidos. A partir de esta población de cardiomiocitos "intactos", las subpoblaciones de cardiomiocitos se pueden aislar selectivamente usando anticuerpos/ligandos contra/para los marcadores de superficie específicos de subtipo, es decir, CD49e y CD49f.

Se identificaron estos marcadores de superficie celular que permiten, por ejemplo, enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis específico de anticuerpos/ligando de subpoblaciones de cardiomiocitos y/o cardiomiocitos de poblaciones de células mixtas, así como marcadores de superficie, expresados específicamente en no cardiomiocitos, permitiendo el enriquecimiento "intacto" de los cardiomiocitos. El uso del enriquecimiento basado en marcadores de superficie de subpoblaciones de cardiomiocitos permitirá por primera vez la caracterización individual y el uso de, por ejemplo, subpoblaciones de cardiomiocitos viables y/o no modificadas, por ejemplo, en investigación cardíaca y de traslación, así como aplicaciones terapéuticas celulares.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1: Identificación y aislamiento de cardiomiocitos murinos por CD340.

A: Según lo determinado por citometría de flujo, CD340 se encontró expresado por cardiomiocitos murinos en diferentes etapas embrionarias (E11.5 - E17.5), pero se reguló por disminución después del nacimiento (P2).

B: Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de células CD340+ de corazones de ratón embrionarios (E15.5) dio como resultado una purificación eficiente de cardiomiocitos (95% alfa-actinina+) en la fracción CD340+.

Figura 2: Expresión diferencial de subpoblaciones de cardiomiocitos CD49e y CD49f identificadas de corazones embrionarios murinos (E13.5).

A: El examen de marcador de superficie basado en anticuerpos de corazones de ratón embrionarios (E13.5), separados mecánicamente en la fracción auricular y ventricular, identificó CD112, CD146, CD49e y CD49f como nuevos marcadores de superficie de los cardiomiocitos. Sorprendentemente, la marcación de anticuerpos de CD49e y CD49f mostró intensidades de fluorescencia específicas de subpoblaciones con una señal de fluorescencia más fuerte en cardiomiocitos ventriculares para CD49e (CD49ealto) y una señal CD49f (CD49falto) más fuerte en cardiomiocitos auriculares. B: La comarcación de corazones embrionarios de ratón (E13.5) con anticuerpos contra CD49e o CD49f y anticuerpos contra proteínas musculares específicas de aurícula o ventrículo, demuestra claramente que las subpoblaciones CD49faltoy CD49fbajo corresponden a la expresión de MLC-2a y MLC-2v, respectivamente. En oposición a esto, la subpoblación CD49ealto corresponde a MLC-2v+ mientras que la subpoblación CD49ebajo corresponde a MLC-2a+.

Figura 3: Expresión diferencial de subpoblaciones de cardiomiocitos CD49f identificadas de corazones murinos a lo largo del desarrollo (E11.5 - P2) según lo determinado por citometría de flujo.

Figura 4: Enriquecimiento selectivo de subpoblaciones de cardiomiocitos.

A: Estrategia de aislamiento 1: Combinación de anticuerpos contra los marcadores de superficie CD340 y CD49f para identificar específicamente los cardiomiocitos auriculares y ventriculares (E15.5, P2).

B: Estrategia de aislamiento 2: Preenriquecimiento en cardiomiocitos por agotamiento de cardiomiocitos basado en anticuerpos seguido por marcación basado en anticuerpos del marcador de superficie CD49f para identificar específicamente los cardiomiocitos auriculares y ventriculares (P2).

C: Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de corazones murinos mediante la combinación de los marcadores de superficie CD340 y CD49f (E15.5). El reanálisis por citometría de flujo de las subpoblaciones aisladas reveló una purificación eficiente de los cardiomiocitos (>95%) en ambas subpoblaciones. Además, la subpoblación CD49falto se enriqueció específicamente para células MLC-2a+ (desde 9% hasta 70%) mientras que la subpoblación CD49fbajo se enriqueció para células MLC-2v+ (94%).

D: Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de corazones murinos de acuerdo con la estrategia 1 (E15.5) y de acuerdo con la estrategia 2 (P2) resultó repetidamente en una purificación eficiente de cardiomiocitos con enriquecimiento significativo de células MLC-2a+ de hasta 70% en la subpoblación CD49falto.

E: El análisis por microarreglos, de corazones murinos CD49falto y CD49fbajo (E15.5, P2), reveló genes reguladores auriculares que se regulan positivamente en la subpoblación CD49falto. Se encontró que los genes marcadores específicos de ventrículo están regulados positivamente en la subpoblación CD49fbajo.

Figura 5: Identificación de marcadores de superficie en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes.

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A: Los cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias murinas (mESC) eran células MLC-2a+ y coexpresaron CD49f, CD61, CD340 y CD146 según se determinó por citometría de flujo.

B: Estrategia de aislamiento 1: Combinación de los marcadores de superficie CD340 y CD49f para aislar específicamente los cardiomiocitos derivados de mESC.

C: Estrategia de aislamiento 2: Preenriquecimiento en cardiomiocitos por agotamiento de cardiomiocitos a base de anticuerpos seguido por marcación del marcador de superficie CD49f para aislar los miocardiocitos derivados de mESC.

D: Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas eran células MLC-2a+ y coexpresaban CD49f, CD49e y CD340.

Descripción detallada de la invención

Inesperadamente, los inventores encontraron que los antígenos (marcadores de superficie celular), CD49f y CD49e se expresan y definen subpoblaciones de cardiomiocitos, es decir, cardiomiocitos auriculares y ventriculares. Por lo tanto, el etiquetado combinado de CD49e o CD49f con un agente, por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno, que se une a un marcador de cardiomiocitos general (por ejemplo, CD340, CD61, CD146, CD112) permite el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares de poblaciones de células mixtas.

El uso de solo un fragmento de unión a antígeno, específico para el antígeno CD49e o CD49f es suficiente para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares a partir de una muestra que contiene solo cardiomiocitos (por ejemplo, muestra enriquecida). La eliminación de no cardiomiocitos procedentes de una muestra mixta que comprende cardiomiocitos y no cardiomiocitos (que da como resultado una muestra preenrriquecida) se puede realizar marcando los no cardiomiocitos con combinaciones de fragmentos de unión a antígeno específicos para marcadores de superficie celular de cardiomiocitos no seleccionados del grupo que consiste en marcadores de superficie Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326, siempre que para los no cardiomiocitos derivados de PSC, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD66a, CD38, CD49b, Sca-1 o CD105 y al menos un marcador de superficie celular sea CD326 o CD15, o siempre que para neonatal no cardiomiocitos, al menos un marcador de superficie celular es CD31, CD105 o CD146 y los otros marcadores de superficie celular son CD45, CD51 y CD90.2.

La presente invención describe que CD49e y CD49f son marcadores de superficie celular para subpoblaciones de cardiomiocitos. Encontramos alta expresión de CD49e (CD49ealto) y expresión débil de CD49f (CD49fbajo) en los cardiomiocitos ventriculares, mientras que CD49f se expresa fuertemente (CD49falto) y CD49e se expresa débilmente (CD49ebajo) en cardiomiocitos auriculares. En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de antígenos CD49e y/o CD49f como marcadores de selección (marcadores de selección positiva) para enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares. Aunque ambos marcadores se expresan en ambas subpoblaciones, se pueden diferenciar por la fuerza de expresión de los marcadores, respectivamente. Cualquier método conocido por los expertos en la técnica, que permita medir la diferenciación de la fuerza de expresión de los marcadores de superficie en las células, puede ser adecuado para el uso de antígenos CD49e y/o CD49f para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de subpoblaciones de cardiomiocitos como se pretende en la presente descripción. Una tecnología estándar, que permite diferenciar las intensidades de las señales que se correlacionan con el nivel de expresión de la proteína de las células es la tecnología de citometría de flujo como FACS®.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares a partir de una muestra que comprende cardiomiocitos, comprendiendo el método los pasos

a) poner en contacto dicha muestra mezclada

i) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49e acoplado a un fluoróforo, por lo tanto, una marcación más fuerte (CD49ealto) de los cardiomiocitos ventriculares de dicha muestra que los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo) de dicha muestra, o

ii) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49f acoplado a un fluoróforo, por lo tanto, una marcación más fuerte (CD49falto) de los cardiomiocitos auriculares de dicha muestra que los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo) de dicha muestra,

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b) poner en contacto dicha muestra con un agente que permite la marcación específica de cardiomiocitos, comarcando de ese modo los cardiomiocitos, donde dicho agente es un fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos acoplado a un fluoróforo o un colorante específico para mitocondrias como el MitoTracker Red permeable a las células,

c) enriquecer, aislar, detectar y/o analizar dichas células comarcadas determinando un nivel de expresión de proteína CD49e y/o CD49f en la superficie celular de dichas células comarcadas, en donde la expresión de CD49ealto o CD49fbajo es indicativa de ventricular los cardiomiocitos y la expresión CD49ebajo o CD49falto son indicativos de cardiomiocitos auriculares.

El enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de dichas células comarcadas determinando un nivel de expresión de la proteína CD49e y/o CD49f en la superficie celular de dichas células comarcadas se puede realizar, por ejemplo, por citometría de flujo.

El fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos se selecciona del grupo que consiste en marcadores de superficie celular CD61, CD146, CD112 y CD340.

Más preferentemente, el fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos es CD340.

El antígeno CD61 es un marcador de superficie celular específico para cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes de ratón.

El antígeno CD146 es un marcador de superficie celular específico para cardiomiocitos cardíacos de ratón embrionarios y cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes de ratón.

El antígeno CD112 es un marcador de superficie celular específico para cardiomiocitos cardíacos de ratón embrionarios. El antígeno CD340 es un marcador de superficie celular específico para cardiomiocitos cardíacos de ratón, cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes de ratón, cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas.

La muestra que comprende cardiomiocitos es cualquier célula que comprende una muestra que comprende cardiomiocitos y no cardiomiocitos tales como una preparación de corazón, un cultivo in vitro que comprende cardiomiocitos de células madre de tejidos o de células madre o de células madre adultas o pluripotentes.

El acoplamiento del fluoróforo al fragmento de unión al antígeno puede ser directo o indirecto, por ejemplo, a través de la interacción biotina-estreptavidina.

El fragmento de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o fragmento del mismo.

Los cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares pueden ser células de mamífero; preferentemente son células murinas o humanas.

La puesta en contacto de la muestra que comprende cardiomiocitos con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49e o CD49f y con un agente, que permite la marcación específica de cardiomiocitos, puede realizarse simultáneamente o posteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el enriquecimiento, el aislamiento, la detección y/o el análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares a partir de una muestra, que está preenrriquecida para cardiomiocitos, comprendiendo el método los pasos de

a) poner en contacto dicha muestra preenrriquecida

i) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49e acoplado a una etiqueta, por lo tanto marcado más fuerte (CD49ealto) de los miocardiocitos ventriculares de dicha muestra preenriquecida que los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo) de dicha muestra preenriquecida, o

ii) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49f acoplado a una etiqueta, marcando de ese modo de manera más fuerte los cardiomiocitos auriculares (CD49falto) de dicha muestra preenriquecida que los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo) de dicha muestra preenriquecida,

b) enriquecer, aislar, detectar y/o analizar las células marcadas de dicha muestra preenriquecida determinando un nivel de expresión de proteína CD49e y/o CD49f en la superficie de dichas células marcadas, en donde la expresión de CD49ealto o CD49fbajo es indicativa de cardiomiocitos ventriculares y CD49ebajo o CD49falto es indicativo de cardiomiocitos auriculares.

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El enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de dichas células marcadas determinando un nivel de expresión de proteína CD49e y/o CD49f en la superficie celular de dichas células marcadas se puede realizar, por ejemplo, por citometría de flujo.

Las células aisladas en la etapa b) pueden ser los cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares.

El fragmento de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o fragmento del mismo.

Los cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares pueden ser células de mamífero; preferentemente son células murinas o humanas.

El acoplamiento de la etiqueta al fragmento de unión a antígeno puede ser directo o indirecto, por ejemplo, a través de la interacción biotina-estreptavidina.

Dicha muestra, que se enriquece previamente para los cardiomiocitos, se puede generar mediante un proceso de selección negativa de cardiomiocitos realizada mediante citometría de flujo o separación celular magnética.

Dicho proceso puede comprender los pasos de

I) poner en contacto una muestra no enriquecida que comprende no cardiomiocitos y cardiomiocitos con combinaciones de fragmentos de unión a antígeno específicos para marcadores de superficie celular de cardiomiocitos no acoplados a etiquetas, marcando así los no cardiomiocitos,

II) aislar los no cardiomiocitos marcados de dicha muestra no enriquecida,

en donde dichas combinaciones de fragmentos de unión a antígenos específicos para marcadores de superficie celular de no cardiomiocitos cardiacos se seleccionan del grupo que consiste en marcadores superficiales Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326, con la condición de que para los no cardiomiocitos derivados de PSC, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD66a, CD38, CD49b, Sca-1, o CD105 y al menos un marcador de superficie celular es CD326 o CD15, o con la condición de que para los neonatos no cardiomiocitos, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD105 o CD146 y en los otros marcadores de superficie celular sean CD45, CD51 y CD90.2.

Los procesos de una selección negativa de cardiomiocitos pueden ser, por ejemplo, un método de citometría de flujo o un método de separación de células magnéticas. Pero cualquier otro método que sea adecuado para el preenriquecimiento en cardiomiocitos de la muestra que comprende cardiomiocitos y otras células puede emplearse para el preenriquecimiento. Dicho otro método puede ser, por ejemplo, centrifugación en gradiente de Percoll o uso de medios específicos que promueven la supervivencia de los cardiomiocitos (por ejemplo, medio enriquecido en lactato).

Dicha etiqueta puede ser, por ejemplo, un fluoróforo, un hapteno como la biotina o una perla. La perla puede ser, por ejemplo, una perla magnética, por ejemplo, una microperla paramagnética utilizable, por ejemplo, en la tecnología MACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania).

Dicho aislamiento de dichas células marcadas se puede realizar, por ejemplo, mediante tecnología de citometría de flujo como FCAS® (BD Biosciences) o una tecnología de separación celular magnética como MACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania).

Se puede realizar simultánea o posteriormente el contacto de una muestra mixta que comprende cardiomiocitos y no cardiomiocitos con fragmentos de unión a antígeno específicos para marcadores de superficie de no cardiomiocitos seleccionados del grupo que consiste en marcadores de superficie Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326, con la condición de que, para los no cardiomiocitos derivados de PSC, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD66a, CD38, CD49b, Sca-1 o CD105 y al menos un marcador de superficie celular es CD326 o CD15, o con la condición de que para los neonatales no cardiomiocitos, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD105 o CD146 y en el otro los marcadores de superficie celular son CD45, CD51 y CD90.2, y con un antígeno que se une al fragmento específico para el antígeno CD49e o CD49f.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición de cardiomiocitos auriculares que puede obtenerse mediante el método descrito en el presente documento, en donde dicha composición contiene al menos el 90% de células positivas para alfa-actinina. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición de cardiomiocitos ventriculares que puede obtenerse mediante el método descrito en el presente documento, en donde dicha composición contiene al menos un 90% de células positivas a alfa-actinina.

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En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una composición de cardiomiocitos auriculares o ventriculares que puede obtenerse mediante el método descrito en el presente documento, en donde dicha composición contiene al menos un 90% de células positivas a alfa-actinina.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso del marcador de superficie celular CD61 como marcador de selección (marcador de selección positiva) para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes de ratón.

Los cardiomiocitos derivados de células madre de ratón se pueden generar mediante métodos como se describe en el ejemplo 4.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso del marcador de superficie celular CD146 como marcador de selección (marcador de selección positiva) para el enriquecimiento, aislamiento, detección y o análisis de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes de corazón de ratón y de ratón embrionarias. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes de corazón de ratón y de ratón embrionarias se pueden generar mediante métodos como se describe en los ejemplos 1-4.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso del marcador de superficie celular CD112 como marcador de selección (marcador de selección positiva) para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos de corazón de ratón embrionarios. Los cardiomiocitos de corazón de ratón embrionarios pueden generarse por métodos como se describe en los ejemplos 1-3.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para el enriquecimiento (o preenriquecimiento) en cardiomiocitos a partir de una muestra que comprende cardiomiocitos y no cardiomiocitos, comprendiendo el método

I) poner en contacto dicha muestra que comprende no cardiomiocitos y cardiomiocitos cardiacos con combinaciones de fragmentos de unión a antígeno específicos para marcadores de superficie celular de no cardiomiocitos acoplados a etiquetas, marcando así los no cardiomiocitos,

ii) aislar los no cardiomiocitos marcados de dicha muestra no enriquecida,

en donde dichas combinaciones de fragmentos de unión a antígeno específicos para marcadores de superficie celular de no cardiomiocitos cardiacos se seleccionan del grupo que consiste en marcadores superficiales Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326, con la condición de que para PSC-derivados no cardiomiocitos, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD66a, CD38, CD49b, Sca-1, o CD105 y al menos 1 marcador de superficie celular es CD326 o CD15, o con la condición de que para los neonatales no cardiomiocitos, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD105 o CD146 y en los otros marcadores de superficie celular sean CD45, CD51 y CD90.2.

Las células logradas mediante los métodos de la presente invención se pueden cultivar analizadas y/o trasplantadas después del enriquecimiento de acuerdo con todos los métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención.

El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra que comprende cardiomiocitos y no cardiomiocitos en cualquier proporción o una mezcla de subpoblaciones de cardiomiocitos, como cardiomiocitos auriculares y ventriculares. Preferencialmente, las células son viables. La viabilidad de las células se logra utilizando los marcadores de superficie celular de la presente invención. La muestra también puede comprender células fijadas, que pueden usarse para la posterior extracción de ácidos nucleicos, orgánulos o proteínas. Las muestras pueden ser de humanos o animales, especialmente mamíferos que incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, cerdos, ganado, perros, monos. Tejido derivado del corazón, por ejemplo, se pueden usar células de corazón completo o regiones cardíacas especiales, cualquier célula derivada de composición celular, preferiblemente células madre embrionarias (ES) o células derivadas de células pluripotentes inducidas (iPS) que comprenden subpoblaciones de cardiomiocitos. El término "muestra mixta" tal como se usa en el presente documento se refiere específicamente a una muestra que comprende cardiomiocitos y no cardiomiocitos en cualquier relación o una mezcla de subpoblaciones de cardiomiocitos, como cardiomiocitos auriculares y ventriculares que se pueden obtener, por ejemplo, mediante una preparación de tejido cardíaco disociado o mediante la derivación de cardiomiocitos de otros tipos de células, por ejemplo, a partir de células madre mediante estímulos inductivos, por ejemplo, moléculas pequeñas, citoquinas, factores de crecimiento, antibióticos o sobreexpresión de genes o ARN seleccionados. El término "muestra que está preenriquecida en cardiomiocitos" se refiere a una muestra, que está enriquecida para cardiomiocitos. El enriquecimiento puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, que permita el enriquecimiento

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de poblaciones celulares específicas. Dichos métodos son, por ejemplo, métodos de agotamiento celular usando separación de células magnéticas (fracción intacta) o FACS (marcador de superficie dependiente o marcador de superficie independiente (mitocondrias, balizas moleculares, indicadores moleculares) u otros procedimientos experimentales independientes de marcador de superficie como la separación física basada en el tamaño (los cardiomiocitos se acumulan en una capa específica de un gradiente de Percoll) y el uso de medios especiales como medios con glucosa reducida que contienen abundantes niveles de lactato.

La invención se ilustra principalmente aislando subpoblaciones de cardiomiocitos de tejido de corazón de ratón disociado. Sin embargo, abarca el aislamiento de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares de cualquier población de células mixtas de mamíferos en general usando fragmentos de unión a antígeno único, tales como anticuerpos o combinaciones de los mismos, como se describe en este documento. A modo de ejemplo, se describe en el Ejemplo 4 que los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes de ratón y humanos están marcados por los mismos antígenos identificados en tejido de corazón de ratón disociado. Todos los procedimientos de las realizaciones de la presente invención y las composiciones obtenibles mediante los métodos también pueden ser de origen humano o de cualquier otra especie que no sea el ratón.

El término "marcador", como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno celular que se expresa específicamente por un cierto tipo de célula. Preferentemente, el marcador es un marcador de superficie celular, de modo que se puede realizar el enriquecimiento, el aislamiento y/o la detección de células vivas. Los marcadores pueden ser marcadores de selección positivos tales como CD49e y/o CD49f como se usan en el presente documento o pueden ser marcadores de selección negativos tales como Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326 como se usan en este documento. Los antígenos celulares que se expresan intracelularmente, por ejemplo, las proteínas estructurales o musculares o los factores de transcripción son marcadores analíticos utilizados para identificar cardiomiocitos y/o subpoblaciones de los mismos, pero no pueden usarse para el enriquecimiento de células viables.

El término "bajo" se refiere a un nivel de expresión de las moléculas respectivas, tales como los marcadores de superficie CD49e, CD49f o CD340, por una célula particular o población de células dentro de una muestra que es baja en comparación con el nivel de expresión de esa molécula por la población de células que comprende la totalidad de la muestra que se analiza. Por ejemplo, CD49fbajo se refiere a un nivel de expresión de CD49f por una célula particular o población de células dentro de la muestra que es baja en comparación con el nivel de expresión de CD49f por la población de células que comprende la totalidad de la muestra que se analiza. Más particularmente, el término "bajo" puede referirse a una población distinta de células que expresa una molécula particular a un nivel que es más bajo que el expresado por una o más poblaciones distintas dentro de una muestra. El término "alto" tiene un significado correspondiente. Adicionalmente, el término "expresado más fuerte" como se usa en el presente documento se correlaciona con el término "alto" y los términos "más débil expresado" como se usa en este documento o "menos expresado" como se usa en este documento se correlacionan con el término "bajo". Por ejemplo, CD49e es más fuerte expresado en los cardiomiocitos ventriculares (CD49ealto) que en los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo), es decir, hay más moléculas de CD49e en la superficie celular de los cardiomiocitos ventriculares que auriculares. Por lo tanto, el marcaje de ambas subpoblaciones de cardiomiocitos dentro de una muestra conduce a una marcación más fuerte (por ejemplo, marcaje de fluorescencia) de los cardiomiocitos ventriculares que auriculares. La subpoblación de cardiomiocitos ventriculares se define, por lo tanto, como CD49ealto, y la subpoblación de cardiomiocitos auriculares como CD49ebajo. A modo de ejemplo, la mayor expresión de CD49e en cardiomiocitos ventriculares en comparación con la menor expresión de CD49e en cardiomiocitos auriculares se muestra en un análisis por citometría de flujo de la figura 2B. Correspondiente es la situación del nivel de expresión para CD49f como se muestra a modo de ejemplo en las figuras 2B, 3, 4A-C.

El término "expresión" como se usa en este documento se refiere indistintamente a la expresión de un gen o producto génico, que incluye la proteína codificada. La expresión de un producto génico puede determinarse, por ejemplo, mediante un inmunoensayo que usa anticuerpos que se unen a la proteína. Por ejemplo, una tecnología adecuada para determinar el nivel de proteínas, por ejemplo, las proteínas de superficie celular CD49e y CD49f, es la tecnología de citometría de flujo.

Alternativamente, la expresión de un gen puede determinarse mediante, por ejemplo, medición de los niveles de ARNm.

El término "cardiomiocito" o "cardiomiocitos" como se usa en el presente documento se refiere a células de músculo estriado que contienen sarcómero, que se encuentran naturalmente en el corazón de mamíferos, en oposición a las células de músculo esquelético. Los cardiomiocitos se caracterizan por la expresión de moléculas especializadas, por ejemplo, proteínas como la cadena pesada de miosina, cadena ligera de miosina, alfa-actinina cardíaca. Los cardiomiocitos también se pueden generar a partir de otros tipos de células mediante señales inductivas, por ejemplo, medios especiales, moléculas pequeñas, factores de crecimiento, citoquinas, sobreexpresión de genes o ARN

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seleccionados. El término "cardiomiocito" como se usa en el presente documento es un término general que comprende cualquier subpoblación de cardiomiocitos o subtipo de cardiomiocitos, por ejemplo, cardiomiocitos auriculares, ventriculares y marcapasos.

El término "no cardiomiocito" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier célula o población de células en una preparación celular que no cumple los criterios de un "cardiomiocito" tal como se define y usa en este documento.

Los términos "subpoblación de cardiomiocitos" o "subtipo de cardiomiocitos" se usan indistintamente y se refieren a cardiomiocitos auriculares o ventriculares o a ambos. Los cardiomiocitos auriculares están presentes de manera natural en las aurículas del corazón, mientras que los cardiomiocitos ventriculares están presentes de forma natural en los ventrículos del corazón. Además, los cardiomiocitos auriculares y ventriculares también pueden generarse a partir de otras células mediante señales inductivas, por ejemplo, medios especiales, moléculas pequeñas, factores de crecimiento, citoquinas, sobreexpresión de genes o ARN seleccionados. Los cardiomiocitos auriculares se caracterizan por cualquier criterio definido en este documento para los cardiomiocitos, pero se especifican adicionalmente mediante la expresión de ciertas moléculas intracelulares, como proteínas codificadas por ciertos genes, por ejemplo, Myl7, Fgf12, Sln, Gja5, Nppa, Tbx5. Los cardiomiocitos ventriculares se caracterizan por cualquier criterio definido aquí para cardiomiocitos, pero se especifican adicionalmente por expresión de ciertas moléculas intracelulares, como proteínas codificadas por ciertos genes, por ejemplo, Hey2, Irx4, Lbh, Myh7.

Los términos "cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares no modificados" o "subpoblación de cardiomiocitos no modificados" como se usan en el presente documento se refieren a una célula o población de células respectivas dentro de una muestra que no se manipuló o modificó transitoria ni permanentemente, por ejemplo, por transfección de moléculas, por ejemplo, moléculas que contienen ADN o ARN, balizas moleculares, colorantes sensibles al voltaje o colorantes específicos de mitocondrias.

Las células enriquecidas, aisladas, detectadas y/o analizadas por el método de la presente invención pueden ser cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares no modificados viables. Pero las células enriquecidas, aisladas, detectadas y/o analizadas mediante el método de la presente invención también pueden ser cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares modificados o manipulados viables. Pero las células enriquecidas, aisladas, detectadas y/o analizadas por el método de la presente invención también pueden ser cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares no modificados o modificados/manipulados fijados.

El término "retiro/eliminación " como se usa en el presente documento se refiere a un proceso de selección negativa que separa los cardiomiocitos deseados (intactos) de los no cardiomiocitos no deseados, por ejemplo, marcando con fragmentos de unión a antígeno específicos para no cardiomiocitos tal como se define y usa en este documento o mediante el uso de métodos de agotamiento físico, por ejemplo, centrifugación en gradiente Percoll o mediante el uso de medios especiales (por ejemplo, medios ricos en lactato sin glucosa) o mediante el uso de moléculas de ADN o ARN o balizas moleculares marcando específicamente no cardiomiocitos y permitiendo su agotamiento mediante un procedimiento de separación celular, por ejemplo, clasificación de células magnéticas o FACS.

El término "etiqueta", como se usa en el presente documento, se refiere al acoplamiento del fragmento de unión al antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, a otras moléculas, por ejemplo, partículas, fluoróforos, haptenos como la biotina, o superficies más grandes tales como platos de cultivo y placas de microtitulación. En algunos casos, el acoplamiento da como resultado la inmovilización directa del fragmento de unión a antígeno, por ejemplo, si el fragmento de unión a antígeno está acoplado a una superficie más grande de un plato de cultivo. En otros casos, este acoplamiento da como resultado la inmovilización indirecta, por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno acoplado directa o indirectamente (a través de, por ejemplo, biotina) a una perla magnética se inmoviliza si dicha perla se retiene en un campo magnético. En casos adicionales, el acoplamiento del fragmento de unión a antígeno a otras moléculas da como resultado no una inmovilización directa o indirecta, sino que permite el enriquecimiento, la separación, el aislamiento y la detección de células de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, si el fragmento de unión a antígeno está acoplado a un fluoróforo que luego permite la discriminación de células marcadas más fuertes, células marcadas más débiles y células no marcadas, por ejemplo, a través de métodos de citometría de flujo, como FACSorting, o microscopía de fluorescencia.

El término "partícula", como se usa en el presente documento, se refiere a una fase sólida tal como partículas coloidales, microesferas, nanopartículas o perlas. Los métodos para la generación de tales partículas son bien conocidos en el campo de la técnica. Las partículas pueden ser partículas magnéticas. Las partículas pueden estar en una solución o suspensión o pueden estar en un estado liofilizado antes del uso en la presente invención. La partícula liofilizada se reconstituye luego en un regulador conveniente antes de poner en contacto la muestra por procesar con respecto a la presente invención.

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El término "magnética" en "partícula magnética" como se usa en el presente documento se refiere a todos los subtipos de partículas magnéticas que pueden prepararse con métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, especialmente partículas ferromagnéticas, partículas superparamagnéticas y partículas paramagnéticas. Los materiales "ferromagnéticos" son muy susceptibles a los campos magnéticos y son capaces de retener las propiedades magnéticas cuando se elimina el campo. Los materiales "paramagnéticos" tienen solo una susceptibilidad magnética débil y cuando el campo se elimina pierden rápidamente su magnetismo débil. Los materiales "superparamagnéticos" son altamente susceptibles magnéticamente, es decir, se vuelven fuertemente magnéticos cuando se colocan en un campo magnético, pero, al igual que los materiales paramagnéticos, pierden rápidamente su magnetismo.

El término "fragmento de unión a antígeno" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier unidad estructural que se une preferentemente a la molécula diana deseada de la célula, es decir, el antígeno.

El término "unidad estructural" comprende, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos policlonales o monoclonales, que pueden generarse por métodos bien conocidos por las personas expertas en la técnica. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, por ejemplo, murino, rata, oveja, humano. Para fines terapéuticos, si se van a usar fragmentos de unión a antígeno no humanos, estos se pueden humanizar mediante cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos modificados (por ejemplo, oligómeros, anticuerpos reducidos, oxidados y marcados).

El término "anticuerpo" comprende tanto moléculas intactas como fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Adicionalmente, el término "fragmento de unión a antígeno" incluye cualquier unidad estructural distinta de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se une preferentemente a la molécula diana deseada de la célula. Unidades estructurales adecuadas incluyen, sin limitación, oligonucleótidos conocidos como aptámeros que se unen a moléculas diana deseadas (Hermann and Patel (2000) Science 289: 820825), carbohidratos, lectinas o cualquier otra proteína de unión a antígeno (por ejemplo, interacción receptor-ligando). El enlace (acoplamiento) entre el anticuerpo y la etiqueta o partícula puede ser covalente o no covalente. Un enlace covalente puede ser, por ejemplo, el enlace a grupos carboxilo en perlas de poliestireno, o a grupos NH2 o SH2 en perlas modificadas. Un enlace no covalente es, por ejemplo, mediante biotina-avidina o una partícula acoplada a fluoróforo unida a un anticuerpo antifluoróforo. Los métodos para acoplar anticuerpos a partículas, fluoróforos, haptenos como biotina o superficies más grandes tales como placas de cultivo son bien conocidos por el experto en la técnica. Para eliminación, enriquecimiento, aislamiento o selección, en principio, se puede utilizar cualquier tecnología de clasificación. Esto incluye, por ejemplo, cromatografía de afinidad o cualquier otra técnica de separación dependiente de anticuerpos conocida en la técnica. Cualquier técnica de separación dependiente de ligando conocida en la técnica puede usarse junto con técnicas de separación positivas y negativas que se basan en las propiedades físicas de las células.

Una tecnología de clasificación especialmente potente es la clasificación de células magnéticas. Los métodos para separar células magnéticamente están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Invitrogen, Stem cell Technologies, en Cellpro, Seattle o Advanced Magnetics, Boston. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden acoplar directamente a partículas de poliestireno magnético como Dynal M 450 o partículas magnéticas similares y se usan, por ejemplo, para la separación celular. La tecnología Dynabeads no se basa en columnas, sino que estas perlas magnéticas con células adheridas disfrutan de la cinética de la fase líquida en un tubo de muestra, y las células se aíslan colocando el tubo en una gradilla magnética. Sin embargo, en una realización preferida para enriquecer, clasificar y/o detectar subpoblaciones de cardiomiocitos a partir de una muestra que contiene cardiomiocitos de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos monoclonales se usan junto con micropartículas superparamagnéticas coloidales que tienen un revestimiento orgánico, por ejemplo, polisacáridos (tecnología de clasificación celular activada magnéticamente (MACS®) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania)). Estas partículas (NanoBeads o MicroBeads) pueden conjugarse directamente con anticuerpos monoclonales o usarse en combinación con anti-inmunoglobulina, avidina o MicroBeads específicos de antihaptenos. La tecnología MACS permite que las células se separen incubándolas con nanopartículas magnéticas recubiertas con anticuerpos dirigidos contra un antígeno de superficie particular. Esto hace que las células que expresan este antígeno se unan a las nanopartículas magnéticas. Después, la solución celular se transfiere a una columna situada en un campo magnético fuerte. En este paso, las células se unen a las nanopartículas (que expresan el antígeno) y permanecen en la columna, mientras que otras células (que no expresan el antígeno) fluyen. Con este método, las células se pueden separar positiva o negativamente con respecto a los antígenos particulares. En caso de una selección positiva, las células que expresan los antígenos de interés, que están unidos a la columna magnética, se lavan a un recipiente separado, después de eliminar la columna del campo magnético. En el caso de una selección negativa, el anticuerpo utilizado se dirige contra antígenos de superficie, que se sabe que están presentes en células que no son de interés. Después de la aplicación de la solución de células/nanopartículas magnéticas sobre la columna, las células que expresan estos

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antígenos se unen a la columna y se recoge la fracción que atraviesa, ya que contiene las células de interés. Como estas células no están marcadas por un anticuerpo acoplado a nanopartículas, están "intactas". El procedimiento se puede realizar utilizando un etiquetado magnético directo o un etiquetado magnético indirecto. Para el etiquetado directo, el anticuerpo específico está directamente acoplado a la partícula magnética. El etiquetado indirecto es una alternativa conveniente cuando el etiquetado magnético directo no es posible o no se desea. Para esta estrategia de etiquetado se puede usar un anticuerpo primario, un anticuerpo monoclonal o policlonal específico, una combinación de anticuerpos primarios, dirigidos contra cualquier marcador de superficie celular. El anticuerpo primario puede ser no conjugado, biotinilado o conjugado con fluoróforo. La marcación magnética se logra luego con MicroBeads anti- inmunoglobulina, MicroBeads anti-biotina o MicroBeads anti-fluoróforo. El método de la presente invención permite tanto la marcación magnética directa como la marcación magnética indirecta con el objetivo de a) la eliminación de cardiomiocitos de una población celular mixta o b) el enriquecimiento de cardiomiocitos y subtipos de cardiomiocitos de una población de células mixtas (véase Ejemplos 1-4).

El término "agente", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula, que permite la marcación específica de las células diana, es decir, los cardiomiocitos dentro del método de la presente invención. El agente puede ser, por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos, un colorante específico para mitocondrias, ADN de cardiomiocitos específicos o moléculas de ARN o balizas moleculares introducidas en células individuales o una población de células, o colorantes sensibles al voltaje como colorantes de aminonaftilén-etilpiridinio sustituido.

El término "composición sustancialmente pura de cardiomiocitos auriculares o ventriculares" como se usa en el presente documento se refiere a una composición celular que contiene al menos 70%, más preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95% de células positivas para alfa-actinina en la fracción de células diana. Dependiendo del uso del antígeno CD49e o CD49f para el enriquecimiento, así como la selección para la subpoblación CD49ealto o CD49falto o CD49ebajo o CD49fbajo dentro de la población de células positivas para alfa-actinina, la proporción de cardiomiocitos auriculares es de al menos 70%, la proporción de los cardiomiocitos ventriculares es al menos del 90%. Normalmente, los cardiomiocitos se integran en una red de diferentes tipos de células in vivo. Para que sean accesibles a las técnicas de enriquecimiento y clasificación, el tejido debe disociarse antes de utilizar dichos métodos. En la presente invención, el tejido cardíaco o los cuerpos embrioides derivados de células madre pluripotentes o el cultivo de células monocapa se tratan enzimáticamente usando, por ejemplo, el kit de disociación neonatal del corazón MACS® o el kit de disociación del cuerpo embrionario MACS® (Miltenyi Biotec). La composición celular se disocia mecánicamente de forma adicional manualmente o con un instrumento que permite la disociación automática de tejido, por ejemplo, el disociador gentleMACS™ (Miltenyi Biotec). También se pueden usar otros métodos que permiten la generación de una suspensión viable de células individuales de tejido de corazón o cuerpos embrioides o células de cultivo de células monocapa y son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las subpoblaciones de cardiomiocitos y/o cardiomiocitos que pueden obtenerse mediante los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para etapas posteriores tales como investigación, diagnóstico, aplicaciones farmacológicas o clínicas conocidas por la persona experta en la técnica. La purificación de subpoblaciones de cardiomiocitos de la variedad de otros tipos de células en el corazón así como en cultivos de diferenciación de células madre pluripotentes es un requisito previo para el análisis in vitro molecular, bioquímico o electrofisiológico. Las células pueden tomarse en cultivo usando un medio optimizado para esta aplicación. En la presente invención, las células aisladas se sembraron en placas de cultivo de tejidos multipozos recubiertas con fibronectina y se mantuvieron en una atmósfera humidificada (5% de CO2, 95% de aire) a 37°C durante al menos 24 h usando DMEM con glutamina estable (Miltenyi Biotec) complementado con 10% de FBS. Tales cultivos de subtipo de cardiomiocitos se pueden usar para estudiar, por ejemplo, desarrollo cardíaco, especificación del subtipo de cardiomiocitos, maduración de cardiomiocitos, proliferación de cardiomiocitos, señalización celular o para realizar mediciones electrofisiológicas para la investigación de la actividad eléctrica de los cardiomiocitos.

Las subpoblaciones de cardiomiocitos enriquecidos también pueden usarse antes y/o después del cultivo celular como una composición farmacéutica en la terapia, por ejemplo, terapia celular, o prevención de enfermedades. La composición farmacéutica puede trasplantarse en un animal o ser humano, preferentemente un paciente humano. La composición farmacéutica puede usarse para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades en mamíferos, especialmente seres humanos, incluyendo posiblemente la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición farmacéutica al mamífero. La enfermedad puede ser cualquier enfermedad, que puede tratarse y/o prevenirse mediante la presencia de cardiomiocitos y/o mediante el aumento de la concentración de las células relevantes en/cerca de el lugar relevante, es decir, el corazón. La enfermedad tratada y/o tratada preventivamente puede ser cualquier trastorno cardíaco, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la pérdida de cardiomiocitos como resultado de isquemia o inflamación aguda/crónica. El tratamiento puede ser el trasplante de subpoblaciones de cardiomiocitos enriquecidos al lugar relevante del corazón. Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se pueden administrar de una manera apropiada a la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de la administración estarán determinadas por factores tales como la condición del paciente

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y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis apropiadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos.

Realizaciones

Los métodos que permiten el uso de marcadores de selección positivos o negativos para enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de células son, por ejemplo, métodos de separación de células magnéticas, inmunodeposición, métodos de citometría de flujo tales como FACS®y clasificación FACS. Los fragmentos de unión a antígeno se pueden marcar con etiquetas tales como partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, haptenos como la biotina o fluoróforos. Los fragmentos de unión a antígeno se pueden inmovilizar, por ejemplo, colocándolos en la superficie de las placas de cultivo o etiquetándolos con partículas como perlas magnéticas o fluoróforos.

En una realización de la presente invención, el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo anti-CD49e acoplado a un fluoróforo. La muestra (mixta) que comprende cardiomiocitos es, por ejemplo, un tejido cardíaco disociado de, por ejemplo, una fuente humana o murina o una población de células cultivadas in vitro de, por ejemplo, una fuente humana o de ratón. Para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares de dicha muestra, en primer lugar, dicha muestra se marca con dicho anticuerpo anti-CD49e acoplado a un fluoróforo (marcador de selección positiva para subtipos de cardiomiocitos). Los cardiomiocitos ventriculares son más fuertes marcados por dicho anticuerpo (CD49ealto) en comparación con los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo) de dicha muestra debido a un mayor nivel de expresión de CD49e en la superficie celular de los cardiomiocitos ventriculares. En segundo lugar, dicha muestra se comarca con un fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos acoplado a otro fluoróforo, por ejemplo, anticuerpo anti-CD340. Usando un dispositivo de citometría de flujo como FACS®, las células doblemente marcadas (comarcadas) pueden distinguirse de las células no marcadas o únicas. Además, y esencialmente para la presente invención, los cardiomiocitos ventriculares marcados más fuertes (CD49ealto) se pueden distinguir de los cardiomiocitos auriculares marcados más débiles (CD49ebajo) (diferenciando entre baja y alta expresión de CD49e). Por lo tanto, dependiendo de la potencia de la marcación de las células diana, es decir, las subpoblaciones de cardiomiocitos, las células comarcadas se pueden enriquecer, aislar, detectar y/o analizar. Si los cardiomiocitos ventriculares son las células diana, entonces las células marcadas más fuertes (CD49ealto) se enriquecen, se aíslan, se detectan y/o se analizan. Si los cardiomiocitos auriculares son las células diana, entonces las células marcadas más débiles (CD49ebajo) están enriquecidas, aisladas, detectadas y/o analizadas. El cultivo de estas células conduce a una población de células subtipo de cardiomiocitos que muestra solo un bajo porcentaje de no cardiomiocitos contaminantes (<5%) (véase el Ejemplo 2).

En otra realización de la presente invención, el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo anti-CD49f acoplado a un fluoróforo. La muestra (mixta) que comprende cardiomiocitos es, por ejemplo, un tejido cardíaco disociado de, por ejemplo, una fuente humana o murina o una población de células cultivadas in vitro de, por ejemplo una fuente humana o de ratón. Para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos de dicha muestra, en primer lugar dicha muestra se marca con dicho anticuerpo anti-CD49f acoplado a un fluoróforo (marcador de selección positiva para subtipos de cardiomiocitos). Los cardiomiocitos auriculares están marcados de forma más fuerte (CD49falto) por dicho anticuerpo en comparación con los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo) de dicha muestra debido al mayor nivel de expresión de CD49f en la superficie celular de los cardiomiocitos auriculares. En segundo lugar, dicha muestra mezclada se comarca con un fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos acoplado a otro fluoróforo, por ejemplo, anticuerpo anti-CD340. Usando un dispositivo de citometría de flujo como FACS®, las células doblemente marcadas (comarcadas) pueden distinguirse de las células no marcadas o únicas. Además, y esencialmente para la presente invención, los cardiomiocitos auriculares marcados más fuertes (CD49falto) se pueden distinguir de los cardiomiocitos ventriculares marcados más débiles (CD49fbajo) (que diferencian entre la expresión baja y alta de CD49f). Por lo tanto, dependiendo de la fuerza de la marcación de las células diana, es decir, las subpoblaciones de cardiomiocitos, las células comarcadas se pueden enriquecer, aislar, detectar y/o analizar. Si los cardiomiocitos auriculares son las células diana, entonces las células marcadas más fuertes (CD49falto) se enriquecen, se aíslan, se detectan y/o se analizan. Si los cardiomiocitos ventriculares son las células diana, entonces las células marcadas más débiles (CD49fbajo) se enriquecen, se aíslan, se detectan y/o se analizan. El cultivo de estas células conduce a una población de células del subtipo de cardiomiocitos que muestra solo un bajo porcentaje de contaminantes no cardiomiocitos (<5%) (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3).

En otra realización de la presente invención, el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo anti-CD49e o CD49f acoplado a un fluoróforo. La muestra (mixta) que comprende cardiomiocitos es, por ejemplo, un tejido cardíaco disociado de, por ejemplo, una fuente humana o murina o una población de células cultivadas in vitro de, por ejemplo una fuente humana o de ratón. Para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos de dicha muestra, primeramente dicha muestra se marca con dicho anticuerpo anti-CD49e o CD49f acoplado a un fluoróforo (marcador de selección positiva para cardiomiocitos). En segundo lugar, dicha muestra es comarcada con un colorante

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específico para mitocondrias tal como el MitoTracker Red permeable a las células. Usando un dispositivo de citometría de flujo como FACS®, las células doblemente marcadas (comarcadas) pueden distinguirse de las células no marcadas o únicas.

En otra realización de la presente invención, el fragmento de unión a antígeno es, por ejemplo, un anticuerpo anti- CD49e acoplado a una etiqueta. La etiqueta puede ser un fluoróforo. La muestra es una muestra preenriquecida en cardiomiocitos. Para enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de subtipos de cardiomiocitos de dicha muestra preenriquecida en cardiomiocitos, dicha muestra se marca con dicho anticuerpo anti-CD49e acoplado a un fluoróforo (marcador de selección positiva para subtipos de cardiomiocitos). Los cardiomiocitos ventriculares están marcados de forma más fuerte (CD49ealto) por dicho anticuerpo en comparación con los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo) de dicha muestra debido al mayor nivel de expresión de CD49e en la superficie celular de los cardiomiocitos ventriculares. Usando un dispositivo de citometría de flujo como FACS®, las células marcadas se pueden distinguir de las células no marcadas. Además, y esencial para la presente invención, los cardiomiocitos ventriculares marcados más fuertes (CD49ealto) se pueden distinguir de los cardiomiocitos auriculares marcados más débiles (CD49ebajo) (diferenciando entre células que expresan CD49e baja y alta). Por lo tanto, dependiendo de la fuerza de la marcación de las células diana, es decir, las subpoblaciones de cardiomiocitos, las células marcadas pueden enriquecerse, aislarse, detectarse y/o analizarse. Si los cardiomiocitos ventriculares son las células diana, entonces las células marcadas más fuertes (CD49ealto) se enriquecen, se aíslan, se detectan y/o se analizan. Si los cardiomiocitos auriculares son las células diana, entonces las células marcadas más débiles (CD49ebajo) están enriquecidas, aisladas, detectadas y/o analizadas. El proceso análogo se realiza utilizando el anticuerpo anti CD49f.

En otra realización de la presente invención, el fragmento de unión a antígeno es, por ejemplo, un anticuerpo anti- CD49f acoplado a una etiqueta. La etiqueta puede ser una partícula magnética tal como una MicroBead (Miltenyi Biotec GmbH). La muestra es una muestra preenriquecida en cardiomiocitos. Para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos de dicha muestra, primeramente dicha muestra se marca con dicho anticuerpo anti-CD49f acoplado a un MicroBead (marcador de selección positiva para subtipos de cardiomiocitos). Los cardiomiocitos auriculares son marcados de forma más fuerte (CD49falto) por dicho anticuerpo en comparación con los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo) de dicha muestra debido al mayor nivel de expresión de CD49f en la superficie celular de los cardiomiocitos auriculares. La concentración de anticuerpos anti-CD49f acoplados a la perla magnética usada para marcar las células de dicha muestra se elige para concentraciones que son suficientemente altas para marcar los cardiomiocitos auriculares (CD49falto) pero son suficientemente bajas para conducir a un etiquetado no detectable (o al menos etiquetado insignificante) de los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo). Las células diana, en este caso los cardiomiocitos auriculares, pueden enriquecerse, aislarse, detectarse y/o analizarse utilizando una tecnología de separación celular magnética tal como la tecnología MACS®. El proceso análogo se realiza usando el anticuerpo anti CD49e. Usando el anticuerpo anti CD49e, las células diana son los cardiomiocitos ventriculares, que pueden enriquecerse, aislarse, detectarse y/o analizarse utilizando una tecnología de separación celular magnética tal como la tecnología MACS®.

El preenriquecimiento de cardiomiocitos de las muestras enriquecidas mencionadas anteriormente puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, que permita el enriquecimiento de tipos celulares específicos. Dichos métodos son, por ejemplo, procedimientos experimentales independientes de marcador de superficie como separación física basada en tamaño (los cardiomiocitos se acumulan en una capa específica de un gradiente de Percoll) o mediante el uso de medios especiales (por ejemplo, glucosa agotada, medios ricos en lactato) o mediante moléculas de ADN o ARN o las balizas moleculares etiquetan específicamente no cardiomiocitos y permiten su agotamiento mediante un procedimiento de separación celular, por ejemplo, clasificación de células magnéticas o FACS.

En otra realización de la presente invención, dicha muestra preenriquecida se genera mediante un método de agotamiento celular. Una muestra no enriquecida que contiene no cardiomiocitos y cardiomiocitos cardiacos se pone en contacto con combinaciones de fragmentos de unión a antígenos específicos para marcadores de superficie celular de cardiomiocitos no acoplados a etiquetas, etiquetando de este modo los no cardiomiocitos. Dichas combinaciones de fragmentos de unión a antígeno específicos para marcadores de superficie de no cardiomiocitos se seleccionan del grupo que consiste en marcadores de superficie Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326 con la condición de que, para PSC-derivados de no cardiomiocitos, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD66a, CD38, CD49b, Sca-1 o CD105 y al menos un marcador de superficie celular sea CD326 o CD15, o con la condición de que para los no cardiomiocitos neonatales, al menos un marcador de superficie celular sea CD31, CD105 o CD146 y en los otros marcadores de superficie celular sea CD45, CD51 y CD90.2.

Los fragmentos de unión a antígeno pueden ser anticuerpos específicos para los antígenos mencionados anteriormente. La etiqueta puede ser una partícula magnética tal como una MicroBead (Miltenyi Biotec GmbH). Usando una tecnología de separación celular magnética tal como MACS®, los no cardiomiocitos marcados se retienen

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en una columna magnética, pero los no cardiomiocitos marcados, es decir, intactos, están en el flujo continuo. Entonces el flujo es la muestra preenriquecida. Si la etiqueta es un fluoróforo, entonces la tecnología de separación utilizada es, por ejemplo, una tecnología de citometría de flujo como FACS®.

En otra realización de la presente invención, se genera una composición sustancialmente pura de subpoblaciones de cardiomiocitos que contiene al menos 90% de células positivas para alfa-actinina, es decir, cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares.

Según nuestro conocimiento, la presente invención revela por primera vez la posibilidad de enriquecer, aislar, detectar y/o analizar composiciones sustancialmente puras de subpoblaciones de cardiomiocitos por medio de métodos basados en marcadores de superficie celular como se describe en este documento. Por lo tanto, mediante el método de la presente invención se puede obtener una composición sustancialmente pura de subpoblaciones de cardiomiocitos que contienen al menos 90% de células positivas para alfa-actinina. Estas composiciones pueden usarse para etapas posteriores tales como aplicaciones de investigación, diagnóstico, farmacológicas o clínicas conocidas por los expertos en la técnica.

En otra realización de la presente invención, se genera una composición farmacéutica sustancialmente pura de subpoblaciones de cardiomiocitos que contiene al menos 90% de células positivas a alfa-actinina, es decir, cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares. Las subpoblaciones de cardiomiocitos enriquecidos pueden usarse, por ejemplo, antes y/o después del cultivo celular como una composición farmacéutica en la terapia, por ejemplo, terapia celular, o prevención de enfermedades.

Los componentes de separación celular necesarios para realizar los métodos descritos en el presente documento se pueden proporcionar como un kit. Cada kit contiene los componentes necesarios para realizar la separación de las células deseadas de una muestra que contiene subpoblaciones de cardiomiocitos. Un kit para enriquecimiento, aislamiento y/o detección de subpoblaciones de cardiomiocitos comprende a) un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49e o CD49f acoplado a una etiqueta; y opcionalmente b) un fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular específico de cardiomiocitos acoplado a una etiqueta; u opcionalmente c) fragmentos de unión a antígenos específicos para no cardiomiocitos acoplados a una etiqueta. Para usar en la clasificación de FAC, los fragmentos de unión a antígeno se acoplan a fluoróforos como se describe en este documento. Para uso en la clasificación de células magnéticas, los fragmentos de unión a antígeno se acoplan a partículas magnéticas como se describe en este documento. Las partículas magnéticas, por ejemplo MicroBeads, del kit, pueden estar en una solución o suspensión o pueden estar en un estado liofilizado antes de su uso en un método de la presente invención. La partícula liofilizada se reconstituye luego en un regulador conveniente antes de ponerse en contacto con la muestra que contiene las subpoblaciones de cardiomiocitos que se procesarán con respecto a la presente invención. El fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular específico de cardiomiocitos puede ser CD340, CD61, CD112, CD146 u otros marcadores de superficie de células de cardiomiocitos relevantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Detección basada en marcadores de superficie y aislamiento de cardiomiocitos durante el desarrollo del corazón murino

Con el fin de evaluar el patrón de expresión de CD340 (ErbB2) entre el día embrionario (E) 11.5 y el día postnatal (P) 2, se prepararon suspensiones de células individuales de corazones de ratón mediante disociación tisular manual o automática. Las células individuales se comarcaron con anticuerpos acoplados a APC o PE contra CD340, así como a un anticuerpo acoplado a FITC contra la proteína alfa-actinina intracelular del cardiomiocito de músculo y se analizaron mediante citometría de flujo (Figura 1A). En E11.5, CD340 se expresó virtualmente en todas las células del corazón murino aislado, incluyendo todos los cardiomiocitos. Durante el desarrollo posterior, CD340 se reguló por primera vez en los no miocitos, dando como resultado una detección exclusiva de CD340 en cardiomiocitos en E15.5. Después del nacimiento, la expresión en los cardiomiocitos también disminuyó (P2).

Para investigar si la marcación con CD340 podría servir como un marcador general para detectar o aislar cardiomiocitos murinos inmaduros, las células CD340+ se purificaron a partir de suspensiones de células únicas de corazones murinos E15.5 mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Figura 1 B). Las células individuales se marcaron con un anticuerpo anti-CD340 conjugado con PE y las compuertas de clasificación se fijaron a yoduro de propidio (PI) negativo, células CD340 positivas (cardiomiocitos) así como a células negativas a PI, CD340 negativas (no-miocitos). El reanálisis citométrico de flujo de las fracciones reveló una purificación de CM de hasta el 95% en la fracción de CD340+.

Ejemplo 2: Detección basada en marcadores superficiales de subpoblaciones de cardiomiocitos durante el desarrollo del corazón murino

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Como un sistema modelo para detectar marcadores de superficie de cardiomiocitos específicos de aurícula o ventrículo, se usaron corazones de ratón diseccionados mecánicamente en las fracciones de células auriculares y ventriculares. Se aislaron corazones de E13.5 murinos, se diseccionaron, se disociaron de forma independiente para formar suspensiones de células individuales y se cribaron en busca de marcadores de superficie. Se ensayaron aproximadamente 200 anticuerpos, que se dirigieron contra epítopos de superficie murinos, en suspensiones de células individuales. Como resultado, identificamos marcadores de superficie de cardiomiocitos generales, es decir, CD146 y CD112, coexpresados con marcadores de cardiomiocitos intracelulares alfa-actinina o troponina T cardíaca (Figura 2 A). Sorprendentemente, la criba de anticuerpos identificó dos anticuerpos que detectan los antígenos de superficie celular CD49e y CD49f como coexpresados con alfa-actinina o troponina T cardíaca, pero expresados diferencialmente en subpoblaciones de cardiomiocitos de aurículas y ventrículos. El epítopo de superficie CD49e se expresó con mayor fuerza en la subpoblación ventricular de cardiomiocitos (CD49ealto) que en la fracción auricular (CD49ebajo). Por el contrario, el antígeno de superficie CD49f se expresó más alto en la subpoblación auricular de cardiomiocitos (CD49falto; Figura 2A), y se expresó más débilmente en la subpoblación ventricular de cardiomiocitos (CD49fbajo; Figura 2B).

Para investigar adicionalmente el patrón de expresión de cardiomiocitos de CD49f y CD49e en cardiomiocitos auriculares y ventriculares, se marcaron suspensiones de células individuales de corazones murinos enteros (E13.5) con anticuerpos contra CD49f (Figura 2B, fila superior) o CD49e (Figura 2B, fila inferior) así como también anticuerpos contra alfa-actinina o contra las cadenas ligeras de miosina específicas de subtipo de cardiomiocitos (MLC) 2a y 2v. Como se muestra por citometría de flujo, todas las células alfa-actinina+ podrían dividirse en un flujo de CD49fbajo y una población de células CD49falto de acuerdo con la intensidad de fluorescencia. La expresión de CD49faltoy CD49fbajo correspondió a la expresión MLC-2a y MLC-2v, respectivamente, lo que indica fuerte expresión en cardiomiocitos auriculares y baja expresión en los ventriculares. El patrón de expresión de CD49e se oponía a CD49f, con una alta intensidad en células MLC-2v+ (población CD49ealta) y una intensidad más baja en células MLC-2a+ (población CD49ebaja), respectivamente, lo que indica una fuerte expresión en ventricular y baja expresión en cardiomiocitos auriculares.

Dado que se pudo demostrar que la expresión de CD49f permite la discriminación de los cardiomiocitos auriculares y ventriculares en corazones murinos E13.5, a continuación, se quiso caracterizar este patrón a lo largo del desarrollo del corazón murino (E11.5-P2). Se comarcaron suspensiones de células individuales de corazones completos o fracciones de tejido auricular y ventricular disectadas mecánicamente con un anticuerpo contra CD49f y un anticuerpo contra alfa-actinina (Figura 3). El análisis por citometría de flujo de la coexpresión (gráficos de densidad, fila superior) reveló que las células alfa-actinina+ se podían dividir en una población de células CD49fbajo y CD49falto de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia en todas las etapas investigadas. Esto también podría aclararse mediante histogramas de expresión de CD49f activada en células alfa-actinina+ que mostraban dos picos para la expresión de CD49f en corazones completos (flechas grises). Los histogramas de los cardiomiocitos auriculares y ventriculares, sin embargo, dieron como resultado solo un pico respectivo: pico CD49falto para los cardiomiocitos auriculares y un pico de CD49fbajo para los cardiomiocitos ventriculares.

Ejemplo 3: Aislamiento basado en marcadores superficiales de subpoblaciones de cardiomiocitos de corazón murino en desarrollo

En conjunto, estos hallazgos sugieren claramente que la combinación de anticuerpos contra un marcador de superficie específico y un subtipo de cardiomiocito específico permite la discriminación de los cardiomiocitos auriculares y ventriculares. Como se muestra por análisis por citometría de flujo de suspensiones de células individuales de corazones murinos comarcados (Figura 4A), los cardiomiocitos auriculares podrían eliminarse selectivamente de la mezcla de cardiomiocitos auriculares y ventriculares mediante aislamiento de células CD340+/CD49fbajo o podrían enriquecerse selectivamente por aislamiento de células CD340+/CD49falto. Esto fue cierto para los corazones prenatales (E15.5, fila superior) y postnatal (P2, fila inferior).

Para corazones murinos neonatales, también se encontró la opción de combinar una eliminación de no miocitos con base en anticuerpos con un marcador de superficie específico del subtipo de cardiomiocito para discriminar los cardiomiocitos auriculares y ventriculares y aislar posteriormente cualquier subpoblación de cardiomiocitos. Las suspensiones de células individuales de corazones murinos (P2) se marcaron con una mezcla de anticuerpos acoplados a microperlas contra marcadores de superficie que se expresaron específicamente en no miocitos del corazón neonatal, es decir CD31, CD45, CD51, CD90.2 (Figura 4B) La separación de células magnéticas dio lugar a las purezas de los cardiomiocitos en más del 95%. La comarcación de los cardiomiocitos enriquecidos permitió nuevamente la discriminación por citometría de flujo de los cardiomiocitos auriculares (células CD49falto) y ventriculares (células CD49fbajo).

Para probar las estrategias de separación, se usó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar subpoblaciones de cardiomiocitos (Figura 4C). Las suspensiones de células individuales de corazones murinos (E15.5)

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se comarcaron con un anticuerpo conjugado con PE contra CD340 y un anticuerpo conjugado con FITC contra CD49f. Las compuertas de clasificación se establecieron en negativo para yoduro de propidio (PI), positivo para CD340, células CD49 (cardiomiocitos ventriculares) así como negativo para células PI, positivo para CD340, células CD49falto (cardiomiocitos auriculares). El reanálisis citométrico de flujo de las fracciones reveló más del 95% de cardiomiocitos puros en ambas fracciones. Además, se pudo demostrar que la subpoblación CD49falto se enriqueció específicamente para células MLC-2a+ (del 9% del corazón completo hasta 70%), mientras que la subpoblación CD49fbajo se enriqueció para células MLC-2v+, es decir, cardiomiocitos ventriculares (94%) Estas tasas de purificación se reprodujeron en varios experimentos independientes (Figura 4-D, gráfico de barras a la izquierda, media ± DS, prueba t pareada **<0.01, ***<0.01 vs. no clasificadas, n=4).

Como se muestra en la Figura 4D (gráfico de barras derecho), se pudieron observar velocidades de purificación similares cuando los corazones P2 se preenriquecieron en cardiomiocitos y luego se clasificaron para las subpoblaciones de cardiomiocitos CD49falto y CD49fbajo. Esto produjo repetidamente un agotamiento de las células MLC-2a+ en la subpoblación CD49fbajo y un enriquecimiento de MLC-2a en la subpoblación CD49falto de hasta 70% (Figura 4D, gráfico de barras izquierdo, media ± SD, prueba t pareada <0.01 vs. no clasificadas, n=3). Las células aisladas se sembraron en placas de cultivo de 48 pozos recubiertas con fibronectina y se encontró que se contraían y unían adecuadamente cuando se analizaban 24 horas después. El análisis de inmunofluorescencia confirmó la estructura sarcomérica de las células y, por lo tanto, la purificación de los cardiomiocitos (Figura 4-C).

Para caracterizar adicionalmente la naturaleza de los tipos de células clasificadas, se recolectó un mínimo de 50.000 células por fracción directamente después de la clasificación y se realizó un análisis de expresión génica de las fracciones de células clasificadas de cuatro repeticiones biológicas usando Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarrays de un color. Para identificar los genes expresados diferencialmente, se realizó un ANOVA (p <0.05) y las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba de Tukey (p <0.05). Con base en un corte de cambio de 3.0 veces, y se encontró que 663 de 55,681 sondas se expresaron más alto en la fracción de células E15.5 CD49falto que en las células E15.5 CD49fbajo, se encontró que 256 sondas tenían una expresión menor. Similar a esto, 931 sondas se expresaron más alto en la fracción P2 CD49falto que en las células P2 CD49fbajo, 476 sondas fueron menos expresadas. Las sondas sobre y subreguladas diferían un poco entre las dos etapas de desarrollo, 329 sondas reguladas positivamente y 129 sondas reguladas negativamente en ambas etapas, que representaban un conjunto de genes marcadores para CD49fbajo y cardiomiocitosalt°. Como era de esperar, se observó una mayor expresión de genes marcadores auriculares (por ejemplo, Myl7, Fgf12, Sln, Gja5, Nppa, Tbx5) en la fracción CD49falt° mientras que los genes asociados con una identidad de miocitos ventriculares (por ejemplo, Hey2, Irx4, Lbh, Myh7) se encontraron en la fracción génica regulada a bajo. Una lista de marcadores seleccionados se presenta en la figura 4E. En conjunto, los resultados confirmaron y fortalecieron nuestra pretensión de identificar y aislar específicamente los cardiomiocitos auriculares mediante expresión CD49falta y purificar los cardiomiocitos ventriculares mediante el agotamiento de la población de CD49falto de corazones embrionario y postnatal.

Ejemplo 4: Detección basada en marcadores superficiales de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes

A continuación, se realizaron análisis por citometría de flujo para investigar la expresión del marcador de superficie de los cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias murinas (mESC) (Figura 5A). Las mESC se diferenciaron como cultivo de suspensión de cuerpo embrioide (EB) durante 10-16 días (con o sin selección de antibióticos). Las suspensiones de células individuales se comarcaron con anticuerpos contra CD49f, CD61, CD340 o CD146 y anticuerpos contra alfa-actinina o la proteína muscular del subtipo cardiomiocitario auricular, MLC-2a. Todas las células alfa-actinina+ derivadas de mESC expresaron conjuntamente CD49f, CD61, CD340 y CD146.

Los cardiomiocitos generados in vitro se caracterizaron por expresión CD49falta (Figura 5A-i). Además, la comarcación con el anticuerpo contra MLC-2a mostró el mismo patrón que sugiere que los cardiomiocitos generados eran todos de un fenotipo de cardiomiocito auricular (Figura 5A-ii). Esto también indicó que, de forma similar a la expresión CD49falta del tejido cardíaco murino, podría usarse para detectar específicamente y aislar células MLC-2a+ de cultivos de células madre murinas diferenciadas. Como el CD49f no era exclusivo para los cardiomiocitos, concluimos que se necesitaba un segundo marcador de superficie para aislar con éxito los miocardiocitos derivados de mESC. En un experimento de prueba de principio, FACS se usó para aislar cardiomiocitos (Figura 5 B). Las células CM7/1 se diferenciaron como cultivo en suspensión de EB durante 12 días. Las suspensiones de células individuales se comarcaron con un anticuerpo conjugado con PE contra CD340 y un anticuerpo conjugado con FITC contra CD49f. Las compuertas de clasificación se establecieron en negativa para yoduro de propidio (PI), positivo para CD340, células CD49fbajo así como negativo para PI, positivo para CD340, células CD49falto. El reanálisis por citometría de flujo de las fracciones reveló un enriquecimiento de cardiomiocitos del 1% a más del 70% en la población con CD49falto. Para la población de CD49fbajo se observó un ligero aumento en la frecuencia de cardiomiocitos (hasta 4%). A continuación, se probó si el agotamiento secuencial de los no cardiomiocitos y el enriquecimiento de las células CD49f+ aumentaría la eficacia del enriquecimiento de los cardiomiocitos (Figura 5-C). Las células CM7/1 se diferenciaron como cultivo en suspensión de EB hasta el día 11. Las células individuales se marcaron con anticuerpos conjugados con PE contra no

cardiomiocitos, es decir, CD15, CD326, CD105, seguido por marcación con microperlas anti-PE. La separación de células magnéticas, es decir, la eliminación de cardiomiocitos no condujo a un aumento del contenido de CM de 68 a 81%. Las células se marcaron luego con un anticuerpo CD49f acoplado a biotina seguido por marcación con microperlas anti-biotina. La separación magnética alcanzó una purificación de cardiomiocitos derivados de mESC de 5 68 a 90%.

Finalmente, se realizaron análisis por citometría de flujo con el fin de investigar la expresión del marcador de superficie de cardiomiocitos derivados de células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSC) (Figura 5D). Las células se cultivaron en monocapa hasta una confluencia del 90%. La diferenciación cardíaca fue inducida por el tratamiento con el inhibidor GSK3 CHIR99021 durante 24 horas y luego con el inhibidor Wnt IWP4 entre el día 3 y el día 5. Las células 10 se cultivaron con medio cambiado cada 2 o 3 días hasta el día 22. De forma similar a los cardiomiocitos auriculares de corazón embrionario o neonatal de ratón así como a los cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias de ratón, todos los cardiomiocitos derivados de hiPSC eran células MLC-2a+ y coexpresaban CD49f, CD49e y CD340 (Figura 5D-i, -ii, -iii, -iv), sugiriendo que la separación celular basada en una combinación de anticuerpos contra CD340 y CD49f o CD49e permite el enriquecimiento de cardiomiocitos positivos para MLC-2a derivados de células madre 15 pluripotentes humanas.

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un método para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares a partir de una muestra que comprende cardiomiocitos, comprendiendo el método los pasos de

   a) poner en contacto dicha muestra

   i) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49e acoplado a un fluoróforo, por lo tanto, una marcación más fuerte (CD49ealto) de los cardiomiocitos ventriculares de dicha muestra que los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo) de dicha muestra, o

   ii) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49f acoplado a un fluoróforo, por lo tanto, una marcación más fuerte (CD49falto) de los cardiomiocitos auriculares de dicha muestra que los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo) de dicha muestra,

   b) poner en contacto dicha muestra con un agente que permite la marcación específica de cardiomiocitos, comarcando de este modo los cardiomiocitos, donde dicho agente es un fragmento de unión a antígeno específico para un marcador de superficie celular de cardiomiocitos acoplado a un fluoróforo o un colorante específico para mitocondrias.

   c) enriquecer, aislar, detectar y/o analizar dichas células comarcadas determinando un nivel de expresión de proteína CD49e y/o CD49f sobre la superficie celular de dichas células comarcadas, en donde la expresión de CD49ealto o CD49fbajo es indicativa de cardiomiocitos ventriculares y la expresión CD49ebajo o CD49falto es indicativa de cardiomiocitos auriculares.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho agente que permite la marcación específica de cardiomiocitos es un fragmento de unión a antígeno específico para el marcador de superficie de células de cardiomiocitos CD340.
3. 3. Un método para el enriquecimiento, el aislamiento, la detección y/o el análisis de los cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares de una muestra, que está preenriquecida en cardiomiocitos, comprendiendo el método los pasos de

   a) poner en contacto dicha muestra preenriquecida

   i) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49e acoplado a una etiqueta, por lo tanto, marcación más fuerte (CD49ealto) de los miocardiocitos ventriculares de dicha muestra preenriquecida que los cardiomiocitos auriculares (CD49ebajo) de dicha muestra preenriquecida, o

   ii) con un fragmento de unión a antígeno específico para el antígeno CD49f acoplado a una etiqueta, marcación más fuerte de los cardiomiocitos auriculares (CD49ealto) de dicha muestra preenriquecida que los cardiomiocitos ventriculares (CD49fbajo) de dicha muestra preenriquecida,

   b) enriquecer, aislar, detectar y/o analizar las células marcadas de dicha muestra preenriquecida determinando un nivel de expresión de proteína CD49e y/o CD49f en la superficie de dichas células marcadas, en donde la expresión de CD49ealto o CD49fbajo es indicativa de cardiomiocitos ventriculares y CD49ebajo o CD49falto es indicativo de cardiomiocitos auriculares.
4. 4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha muestra, que se preenriquece previamente con respecto a cardiomiocitos, se genera mediante un proceso de selección negativa de cardiomiocitos realizada mediante citometría de flujo o separación de células magnéticas.
5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho proceso comprende los pasos de

   I) poner en contacto una muestra no enriquecida que comprende no cardiomiocitos y cardiomiocitos con combinaciones de fragmentos de unión a antígenos específicos para marcadores de superficie celular de cardiomiocitos no acoplados a etiquetas, marcando así los no cardiomiocitos,

   II) aislar los no cardiomiocitos marcados de dicha muestra no enriquecida,

   en donde dichas combinaciones de fragmentos de unión a antígenos específicos para marcadores de superficie celular de no cardiomiocitos se seleccionan del grupo que consiste en marcadores superficiales Sca-1, CD15, CD31, CD38, CD45, CD49b, CD49d, CD54, CD66a, CD73, CD90.1, CD90.2, CD105, CD117, CD138, CD140a, CD140b, CD184, CD326, con la condición de que para los no cardiomiocitos derivados de PSC, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD66a, CD38, CD49b, Sca-1, o CD105 y al menos un marcador de superficie celular es CD326 o CD15, o con la condición de que para los no cardiomiocitos de neonatos, al menos 1 marcador de superficie celular sea CD31, CD105 o CD146 y en los otros marcadores de superficie celular sean CD45, CD51 y CD90 .2.
6. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde en dicho método para el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis de cardiomiocitos auriculares y/o ventriculares a partir de una muestra que está preenriquecida en cardiomiocitos, dicha etiqueta es un fluoróforo, y en donde el enriquecimiento, aislamiento, detección y/o análisis se realiza por citometría de flujo.

   5 7. El método de la reivindicación 5, en donde en dicho proceso dicha etiqueta es una partícula magnética, y en donde

   dicho aislamiento de dichos cardiomiocitos no marcados de dicha muestra no enriquecida se realiza por clasificación de células magnéticas.
7. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo.

   10 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dichos cardiomiocitos auriculares y/o

   ventriculares son células humanas o murinas.
8. 10. Una composición de cardiomiocitos auriculares que puede obtenerse por el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha composición contiene al menos 90% de células positivas a alfa-actinina.
9. 11. Una composición de cardiomiocitos ventriculares que se puede obtener mediante el método de acuerdo con una 15 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha composición contiene al menos 90% de células positivas a

   alfa-actinina.
10. 12. Una composición farmacéutica que comprende cardiomiocitos auriculares que pueden obtenerse por el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha composición contiene al menos 90% de células positivas a alfa-actinina.

    20 13. Una composición farmacéutica que comprende cardiomiocitos ventriculares que pueden obtenerse por el método

    de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha composición contiene al menos 90% de células positivas a alfa-actinina.