CN110438065A - 一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法,包括如下步骤:1)人诱导性多能干细胞在mTeSR1培养基中维持培养,以80~90%的密度在基质胶包覆的六孔板种板,mTeSR1培养液中加入Y27632;2)种板24hr后开始诱导分化,诱导分化之初在培养液中加入DMEM/F12培养基;3)分化第2天抽吸培养基,加入DMEM/F12培养基,然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞,在分化第0~2天,3~5天或5~8天加入重组蛋白GREM1,然后检测细胞表面标志物,即得CD34+和CD31+内皮祖细胞。采用本发明的诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法能够高效地获得CD34+和CD31+双阳性的内皮祖细胞,效率高达22.4~34.7%。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞诱导分化技术领域,尤其是一种诱导人诱导性多能干细胞分化为CD34+和CD31+内皮祖细胞的方法。
背景技术
现行体外的干细胞向心血管系细胞的分化诱导方法主要是利用了胚胎发育的机制,模拟胚胎心脏发育的过程。脊椎动物胚胎发育初级阶段,心脏和血管组织均可以识别。当三胚层的胚囊形成时,中胚层的祖细胞、心肌祖细胞和血管祖细胞,受不同的诱导信号触发激活,开始向心脏和血管的发育【1】。细胞间的信号传递和转录因子的调控作用等高度保守的分子机制促进了中胚层的心脏和血管发生。其中三个生长因子家族被认为是控制中胚层形成和心血管系统的重要因素:BMP、Wnt和成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor,FGF)家族【2】。
文献报道,早期胚胎向中胚层分化通过Wnt/β-catenin通路完成,BMP信号通路拮抗Wnt/β-catenin的激活【3】,而Gremlin1则抑制BMP信号通路,影响干/祖细胞增殖,促进hiPSCs向中胚层分化【4】。在中胚层发育中,BMP4是一个关键调节因子,也决定了内皮和造血细胞分化方向【5】。BMP4能有效地诱导中胚层的体外分化,而BMP4及其下游分子Smad5的基因缺失导致血管发育缺陷和胚胎早期坏死【6】。另外,内胚层分泌的VEGF也是血管生成的一个重要刺激信号。VEGF与其受体VEGFR2结合能促进内皮细胞生长和增殖【7】。然而,现有技术中并未出现能高效地诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮组细胞的方法。
发明内容
基于上述问题,本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能高效地诱导人诱导性多能干细胞分化为CD34+和CD31+内皮祖细胞的方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法,包括如下步骤:
1)人诱导性多能干细胞在mTeSR1培养基中维持培养,以80~90%的密度在基质胶包覆的六孔板种板,mTeSR1培养液中加入Y27632;
2)种板24hr后开始诱导分化,诱导分化之初在培养液中加入DMEM/F12培养基;
3)分化第2天抽吸培养基,加入DMEM/F12培养基,然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞,在分化第0~2天,3~5天或5~8天加入重组蛋白GREM1,然后检测细胞表面标志物,即得CD34+和CD31+内皮祖细胞。
优选地,所述Y27632的加入量为10μM。
优选地,所述步骤2)中DMEM/F12培养基含有CHIR99021和抗坏血酸;更优选地,所述DMEM/F12培养基含有6μM CHIR99021和60mg/ml抗坏血酸。
优选地,所述步骤3)中DMEM/F12培养基含有抗坏血酸;更优选地,所述抗坏血酸的浓度为60mg/ml。
优选地,所述GREM1的加入浓度为0.25~1.5μg/ml,优选为0.25~0.5μg/ml,最优选为0.25μg/ml。本申请的发明人经多次试验发现,添加重组蛋白GREM1:加入0.25μg/mlRb-GREM1,CD34/CD31双阳性细胞从对照组(12.66±1.29)%增加到(33.03±1.65)%;加入0.5、0.75、1.5μg/ml Rb-GREM1,CD34/CD31双阳性细胞分别增加到(26.53±1.04)%,(22.40±1.03)%和(22.93±1.47)%。
优选地,所述GREM1的加入时间为分化开始第5~8天。需要说明的是,本申请的发明人经多次试验发现,分别在分化开始第0-2天,3-5天,5-8天加入GREM1,结果发现第5-8天加入GREM1能够显著提高分化效率。
综上所述,本发明的有益效果为:
采用本发明的诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法能够高效地获得CD34+和CD31+双阳性的内皮祖细胞,效率高达22.4~34.7%。
附图说明
图1是hiPSC诱导内皮祖细胞的特性检测结果图,其中A是hiPSCs向内皮祖细胞在单一分化培养基中明确的、无生长因子的分化方案示意图;B显示hiPSCs和hiPSCs诱导的内皮祖细胞的形态学特征;C显示用CD34、CD31、VEGFR2、CD144染色证实内皮祖细胞;D显示采用qRT-PCT检测hiPSCs标志物、Oct4、Nanog和Sox2的基因表达以及检测内皮祖细胞标志物CD34、CD31、VEGFR2和CD144的基因表达;F显示流式细胞仪检测内皮祖细胞CD34/VEGFR2或CD34/CD144的共表达;G显示内皮祖细胞CD31、CD34、VEGFR2或CD144蛋白的WB表达;数据为三个独立实验的平均值±SEM。*p<0.05,标尺:100μm;
图2是在hiPSC-EPs细胞分化过程中表达GREM1的检测结果图,A显示采用qPCR检测GREM1表达;B显示采用WB法测定GREM1蛋白表达;C是量化数据分析结果;D显示HiPSCs进行分化,连续分化天收集RNA样本,用qPCR检测GREM1及相关基因的表达情况,采用qPCR法分析huipsc相关基因,采用qPCR法分析内皮祖相关基因;数据为三个独立实验的平均值±SEM,*p<0.05,标尺:100μm;
图3显示在第1阶段,GREM1的下调增加了内皮祖细胞的分化,其中,A显示采用qPCR检测GREM1mRNA表达情况,B显示GREM1蛋白经WB测定并定量,C是量化数据分析结果,采用流式细胞仪检测CD34/CD31、VEGFR2/CD144的内皮祖细胞标志物;E显示siGREM1-EPCs或siCtr-EPCs中CD34/CD31、VEGFR2/CD144的定量数据,检测siGREM1-EPs或siCtr-EPCs对Ac-LDL的摄取;G显示量化数据分析结果,在siGREM1-EPCs或siCtr-EPCs中检测到H.管的形成;I显示量化数据分析结果;数据为三个独立实验的平均值±SEM,*p<0.05,标尺:100μm;
图4显示在第1阶段抑制GREM1促进细胞增殖,其中,A显示免疫荧光法检测Ki67表达;B为量化数据分析结果;C显示流式细胞仪检测细胞周期;D是量化数据分析结果;数据为三个独立实验的平均值±SEM,*p<0.05,标尺:100μm;
图5显示在第2阶段,GREM1的下调抑制了EPCs的分化,其中,A为流式细胞仪检测内皮祖细胞CD34/CD31、VEGFR2/CD144标志物的结果图;B是流式细胞仪检测siGREM1-EPCs或siCtr-EPCs中CD34/CD31、VEGFR2/CD144的定量数据,检测siGREM1-EPCs或siCtr-EPCs对Ac-LDL的摄取;D是量化数据分析结果;E显示检测siGREM1-EPCs或siCtrl-EPCs的成管情况;F为量化数据分析结果;数据为三个独立实验的平均值±SEM,*p<0.05,标尺:100μm;
图6显示在第2阶段,抑制GREM1的表达抑制细胞增殖,但促进细胞凋亡,其中,A是免疫荧光法检测Ki67表达结果图;B是量化数据分析结果;C显示流式细胞仪检测细胞周期;D为量化数据分析结果;E显示采用PI/AnnexinV检测细胞凋亡;F是量化数据分析结果;数据为三个独立实验的平均值±SEM,*p<0.05,标尺:100μm;
图7显示重组蛋白GREM1的阶段特异性添加影响内皮祖细胞的分化和维持,其中,A为分化第0-2,2-5天或5天加入重组蛋白GREM1,流式细胞仪检测CD34/CD31的结果图;B显示CD34/31的量化数据;C为VEGFR2/CD144采用流式细胞仪检测结果图;D显示VEGFR2/CD144的量化数据;E为第5-8天加入不同浓度的重组蛋白GREM1,流式细胞仪检测CD34/CD31结果图,还检测了F.VEGFR2/CD144;G显示CD34/31的量化数据;H显示了VEGFR2/CD144的量化数据;数据为三个独立实验的平均值±SEM;*p<0.05;标尺:100μm;
图8显示重组蛋白GREM1在5-8天促进细胞增殖,激活下游通路,其中A为免疫荧光法检测Ki67表达结果图;B是量化数据分析结果;C是流式细胞仪检测细胞周期结果图;D是量化数据分析结果;E是免疫印迹法测定GREM1及其相关蛋白的结果图;F是GREM1在内皮祖细胞分化和维持过程中的作用示意图模型,Endo GREM1:内源性GREM1;数据为三个独立实验的平均值±SEM;*p<0.05;标尺:100μm。
具体实施方式
在一些实施例中,本发明的诱导人诱导性多能干细胞分化为CD34+和CD31+内皮祖细胞的方法,包括如下步骤:
1)hiPSCs(即人诱导性多能干细胞)细胞在mTeSR1培养基中维持培养,以80-90%的密度在基质胶包覆的六孔板种板,mTeSR1培养液中加入10μM Y27632;
2)种板后24hr开始诱导分化,Day0在培养液中加入含有6μM CHIR99021(Selleckchem)和60mg/ml抗坏血酸(Sigma,A8960)的DMEM/F12培养基;
3)分化第2天抽吸培养基,加入60mg/ml抗坏血酸DMEM/F12培养基,然后每天更换含有60mg/ml抗坏血酸DMEM/F12培养基来维持细胞,分别在分化0-2天,3-5天,5-8天加入GREM1,检测细胞表面标志物,即得CD34+和CD31+内皮祖细胞。
结果发现5-8天加入GREM1能够显著提高分化效率;0.25μg/ml Rb-GREM1,CD34/CD31双阳性细胞从对照组(12.66±1.29)%增加到(33.03±1.65)%;加入0.5、0.75、1.5μg/ml Rb-GREM1阳性细胞分别增加到(26.53±1.04)%、(22.40±1.03)%和(22.93±1.47)%(参见图7E,7G)。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明,本发明中的实验方法均为常规方法。本发明中使用的重组蛋白GREM1是商品化重组蛋白,R&D SYSTEMS Recombinant Human Gremlin,货号5190-GR-050。
下面对本发明中涉及的一些实验方法进行必要的介绍。
(一)细胞培养
本发明使用了四种不同的多能细胞系。两株诱导多能干细胞(hiPSCs)(Cai等,2013),两株人胚胎干细胞(hESC)系(H1,H9)(Li WQ et al.,2018)。hiPSC或hESCs在mTeSR1培养基中维持培养,以80-90%的密度在基质胶包覆的六孔板种板,mTeSR1培养液中加入10μM Y27632。种板后24hr开始诱导分化,Day0在培养液中加入含有6μM CHIR99021(Selleckchem)和60mg/ml抗坏血酸(Sigma,A8960)的DMEM/F12培养基。分化第2天抽吸培养基,加入60mg/ml抗坏血酸DMEM/F12培养基。然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞。
(二)小干扰RNA敲低实验
HiPSCs或hESCs维持培养和传代。干扰前按照5×104细胞/cm2种板。mTeSR1培养液中加入10μM Y27632。培养过夜后,使用lipofectamine RNAi MAX转染试剂(Thermo FisherScientific)在mTeSR1培养基中转染相应的siRNA 7小时。在基因敲除实验中,用50pmolsiRNA(siG000026585;RiboBio、广州、中国)。siRNA-GREM1序列:(sense)5’CAUCGAUUUGGAUUAAGCC dTdT 3’;
(anti-sense)序列:3’dTdT GUAGCUAAACCUAAUUCGG 5’。
(三)免疫荧光实验
细胞在4%(v/v)多聚甲醛中固定20min,室温孵育30min,PBS中加入0.1%(v/v)Triton X-100、山羊血清和1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA;Sigma)。接下来,将细胞在4℃下孵育过夜,用CD31(1:200;CST,Massachusetts,USA);CD34(1:200;Abcam,Cambridge,UK);CD144(1:50;SantaCruz,Texas,USA);VEGFR2(1:200;CST,Massachusetts,USA).AlexaFluor 488或Alexa Fluor 594二抗(1∶1000,抗兔或抗鼠;加入Invitrogen),室温避光孵育1小时,加DAPI(1:1000;Sigma)。显微镜下观察细胞。
(四)成管实验
为了评价血管的生成,在0.4ml EGM-2培养基(Lonza)中,将1×105个细胞种入24孔预涂基质凝胶的组织培养板(BD Bioscience)中。培养24小时后,光镜观察管的形成。
(五)Dil-ac-LDL摄取实验
为评估细胞摄入Dil-ac-LDL的能力,将细胞与含有10μg/毫升Dil-ac-LDL的EGM-2培养液37℃,持续孵育4小时。细胞冲洗3次,然后用荧光显微镜检查DiI-Ac-LDL的摄取情况。
实施例1 GREM1在hiPSCs向内皮祖细胞分化和维持过程中的阶段特异性表达
在本实施例中,按照以下方案诱导分化,包括两个步骤:第一步是用CHIR99021诱导未分化的hiPSCs向中胚层分化2天;第二步,用DMEM/F12培养基加抗坏血酸诱导内皮祖细胞生长3天,然后继续维持细胞(图1A);克隆生长的hiPSCs转化为内皮祖细胞(图1B);分化第5天,免疫荧光法检测内皮祖细胞表面标志物CD34、CD31、VEGFR2和CD144的表达(图1C);采用qPCR检测基因表达。
实验结果显示,分化后干细胞标志物OCT4、Nanog和SOX2均下降(图1D)。相反,内皮祖细胞标志物CD34、CD31、CD144和VEGFR2增加(图1E)。
此外,还利用流式细胞仪鉴定了内皮祖细胞,结果显示,CD34/CD31的双阳性率为28.77%,VEGFR2/CD144的双阳性率为26.88%(图2F)。发现这四种蛋白,尤其是CD34和VEGFR2在内皮祖细胞中的表达明显增加(图1G)。QPCR结果显示,从hiPSCs向内皮祖细胞分化后,GREM1QPCR明显增加(图2A)。WB结果显示hiPSCs中不存在GREM1蛋白表达,而内皮祖细胞中存在高水平的GREM1表达(图2B,2C)。
此外,每天检测分化过程中的mRNA表达。前两天(第1阶段)几乎没有GREM1表达,随后GREM1mRNA表达增加(第2阶段),并在第8天达到峰值(第3阶段)。与BMP4相比,BMP2和BMP7的表达相对较低。在前两天,BMP4保持适度表达。在第4天达到第一个高峰,然后下降。BMP4表达在第8天达到第二个高峰。BMPR2的表达与BMP4一致(图2D)。hiPSCs标志物表达下降(图2E),内皮祖细胞标志物表达增加(图2F)。
实施例2 第1阶段(分化的0-2天)敲低GREM1增加了hiPSCs向EPCs分化
为了检测GREM1的作用,使用si-GREM1敲除GREM1表达。QPCR结果显示,si-GREM1的效率在80%以上(图3A)。WB结果证实了GREM1在蛋白水平上的下调(图3B,图3C)。
当GREM1在第0天至第2天被敲除时,第2天的FACS结果显示CD34/CD31从(7.21±0.57)%增加到(10.31±0.53)%,VEGFR2/CD144从(8.66±0.40)%增加到(11.98±0.75)%(图3D,3E)。siGREM1组Ac-LDL摄取增加(图3F,3G)。siGREM1组的成管也增加(图3H,3I)。
同时,在这一阶段,GREM1的下调促进了细胞增殖。Ki67表达的免疫荧光显示,每高倍镜视野阳性细胞从(37.00±6.97)%增加到(68.79±6.69)%(图4A,4B)。细胞周期显示,si-GREM1组G1期细胞比率下降,S期细胞比率上升(图4C,4D)。
实施例3 第2阶段(分化的2-5天)GREM1的敲低抑制了hiPSCs向EPCs分化
从第2天到第5天,GREM1表达量下降,第5天CD34/CD31的表面标志物从(19.17±0.52)%下降到(13.51±0.38)%,VEGFR2/CD144从(15.60±0.49)%下降到(11.33±0.58)%(图5A,5B)。siGREM1组的dil-ac-LDL摄取和成管功能下降(图5C、5D、5E、5F)。
同时检测细胞增殖和凋亡。Ki67表达阳性细胞从(70.09±1.81)%下降到(35.00±2.50)%(图6A,6B)。细胞周期显示,si-GREM1组G1期细胞比率下降,S期细胞比率上升(图6C,6D)。PI/AnnexinV结果显示,双阳性率从(0.89±0.11)%上升到(7.58±0.37)%(图6E,6F)。
实施例4 重组蛋白GREM1在第1阶段(0-2天)和第2阶段(2-5)抑制内皮祖细胞分化。
相反,使用重组蛋白GREM1检测内皮祖细胞分化过程中GREM1的阶段性特异性作用。通过CD31/34共表达检测发现,0-2天添加GREM1显著降低内皮祖细胞生成((27.68±1.09)%vs.(1.49±0.12)%)。结合上述敲除GREM1的结果,发明人认为低表达GREM1在第1阶段是必要的。
分化第2-5天加入GREM1后,效率下降至(10.53±0.57)%(图7A,7B)。第5天添加GREM1并没有改变分化效率。VEGFR2/CD144的结果也有类似的变化(图7C,7D)。结合上述GREM1的下调结果,发明人认为在内皮祖细胞分化过程中,GREM1应保持精细的平衡。在第2阶段需要适当表达GREM1。
实施例5 重组蛋白GREM1在第3阶段(5-8天)促进内皮祖细胞的维持。
此外,还检测了GREM1在内皮祖细胞维持过程中的作用。GREM1从第5天添加到第8天。发明人发现表面标记物的表达明显增加。0.25μg/mlRb-GREM1CD34/CD31双阳性细胞增加(12.66±1.29)%(33.03±1.65)%。0.5、0.75、1.5μg/Rb-GREM1增加阳性细胞分别为(26.53±1.04)%,(22.40±1.03)%和(22.93±1.47)%(图7e,7g)。VEGFR2/CD144的结果也有类似的变化(图7F,7H)。
因为0.25μg/mlRb-GREM1最明显的刺激影响内皮祖细胞的维护,选择集中完成进一步的研究。Ki67表达阳性细胞从(34.56±1.55)%增加到(62.21±1.94)%(图8A,8B)。细胞周期显示,Rb-GREM1组G1期细胞比率下降,S期细胞比率上升(图8C,8D)。
为了确定GREM1调控内皮祖细胞维持的机制,评估了典型信号转导通路VEGFR2/Akt和VEGFR2/p42/44MAPK。发明人发现在第5-8天添加重组蛋白GREM1可以增加VEGFR2、Akt和p42/44MAPK的磷酸化水平,这在细胞增殖中起重要作用(图8E)。最后,绘制了GREM1在内皮祖细胞分化和维持过程中作用的模式图(图8F)。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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Claims (8)
1.一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法,包括如下步骤:
1)人诱导性多能干细胞在mTeSR1培养基中维持培养,以80~90%的密度在基质胶包覆的六孔板种板,mTeSR1培养液中加入Y27632;
2)种板24hr后开始诱导分化,诱导分化之初在培养液中加入DMEM/F12培养基;
3)分化第2天抽吸培养基,加入DMEM/F12培养基,然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞,在分化第0~2天,3~5天或5~8天加入重组蛋白GREM1,然后检测细胞表面标志物,即得CD34+和CD31+内皮祖细胞。
2.权利要求1的方法,其中所述Y27632的加入量为10μM。
3.权利要求1的方法,其中所述步骤2)中DMEM/F12培养基含有CHIR99021和抗坏血酸。
4.权利要求3的方法,其中所述DMEM/F12培养基含有6μM CHIR99021和60mg/ml抗坏血酸。
5.权利要求1的方法,其中所述步骤3)中DMEM/F12培养基含有抗坏血酸。
6.权利要求5的方法,其中所述抗坏血酸的浓度为60mg/ml。
7.权利要求1的方法,其中所述GREM1的加入浓度为0.25~1.5μg/ml。
8.权利要求1的方法,其中所述GREM1的加入时间为分化开始第5~8天。
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