CN111269878B - 一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用。该培养基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal为基础培养基，还包括以下组分：B27，N2，血清替代物，谷氨酸盐,非必需氨基酸,双抗,β‑巯基乙醇，LCDM,WNT通路抑制剂和ROCK抑制剂。采用该培养基结合基质胶体系对人多能干细胞进行培养，可将其成功转化成人扩展多能干细胞。该培养基化学成分明确，可以逆转人多能干细胞命运，将人多能干细胞转化为具有双向嵌合能力的扩展多能干细胞，操作简单，具有良好的应用前景。

Description

一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其 应用

技术领域

本发明属于干细胞和再生医学领域，具体涉及一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用。

技术背景

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，存在两种不同类型的细胞，分别为全能(totipotent)细胞和多能(pluripotent)细胞。全能细胞具有最优越的发育潜能，能产生包括胚胎内和胚胎外组织在内的整个胚胎结构，而多能细胞只能发育为胚胎内组织。目前，桑葚胚之前的卵裂球被认为是全能的，在胚胎的第一个谱系特化过程中逐渐失去全能性并转变为多能性。多能性的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)或者诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)已经被建立并大量研究，而全能性细胞，尤其是人类全能性样细胞，能否在体外稳定维持是一个长期以来试图解决的问题。

在2017年，Yang等报道成功地在化合物小分子混合物培养基中维持了一种具有双向嵌合能力细胞。具体而言，他们发现由人LIF、GSK3抑制剂CHIR 99021、DiM和MiH(称为“LCDM”)组成的混合物培养基在有饲养层细胞支持下可以支持人传统ESC转化和维持立体克隆形态的扩展多能干细胞(extended pluripotent stem cell，EPSC)。这些细胞表现出广泛的发育可塑性，在嵌合体实验中不仅可以高效贡献于胚胎组织，还可以贡献于胚胎外组织。这一开拓性的工作，无论在发展潜力还是研究意义上，都产生了相比于其它多能干细胞不可替代的细胞类型。然而，该转化条件用到了小鼠来源的饲养层培养体系。饲养层细胞的存在会带来不确定因素，包括成分复杂性和不同批次之间的差异性，影响了进一步的分子机制探讨和潜在的临床应用。可见，建立不依赖饲养层细胞、成分明确、简单快速的体系获得扩展多能干细胞将极大拓展对于全能细胞的认识及将来的实际应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用。该培养基化学成分明确，可以逆转人多能干细胞命运，将人多能干细胞转化为具有双向嵌合能力的扩展多能干细胞，操作简单，具有良好的应用前景。

为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

提供一种将人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的培养基，所述培养基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal为基础培养基，含有以下组分：1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸盐,1％非必需氨基酸,1％双抗,0.1mMβ-巯基乙醇，10ng/mLrecombinant human LIF,1μM CHIR99021,2μM(S)-(+)-Dimethindene maleate,2μMMinocycline hydrochloride,0.5-5μM WNT通路抑制剂和1-10μM ROCK抑制剂。

按上述方案，所述WNT通路抑制剂为IWR-endo-1；所述ROCK抑制剂为Y-27632。

按上述方案，所述培养基还包括EZH2抑制剂。

按上述方案，所述EZH2抑制剂为GSK126，在培养基中的浓度为0.5-5μM。

按上述方案，所述培养基还包括糖酵解抑制剂，主要用于人多能干细胞向扩展多能干细胞转变的晚期阶段，所述晚期阶段为扩展多能性维持过程阶段。

按上述方案，所述糖酵解抑制剂为2-DG或ATA，其中2-DG在培养基中的浓度为0.5-10mM，ATA在培养基中的浓度为10-100μM。

按上述方案，所述人多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

提供一种将人多能干细胞转化成人扩展多能干细胞的培养方法，采用上述培养基对人多能干细胞进行培养，将其转化成人扩展多能干细胞。

按上述方案，具体包括以下步骤：

1)使用mTeSR1做基础培养基，加入1％双抗,人多能干细胞于1：100稀释比例的基质胶上培养；

2)步骤1)中人多能干细胞培养1-3d待人多能干细胞长成小克隆时换用上述培养基，此为P1代，此时细胞长而排布整齐；

3)步骤2)所得P1代在上述培养基中继续培养1d后使用TrypLE传代，1:3传入1:(30-50)稀释比的基质胶上；

4)当细胞覆盖80-90％培养板底面积时(即细胞克隆间有相互接触可能时)及时传代，将传代比例从1：3逐渐降至1:10-20，传入1:(30-50)稀释比的基质胶上，至细胞克隆小而立体，无异质性，即转化完全成功。

按上述方案，还包括扩展多能性维持过程阶段，具体为：扩展多能干细胞转化完成后，选用上述培养基继续培养，维持扩展多能性状态。

本发明有益效果为：

1)本发明提供的培养基成分明确，性能稳定，可以逆转人多能干细胞命运，将人多能干细胞在无饲养层细胞的培养条件下转化为具有胚内胚外双向嵌合能力的扩展多能干细胞，可以推进研究人早期胚胎发育模型的发展，也有助于更好的理解早期胚胎发育过程中的关键性分子决策，对于再生医学的研究以及基于干细胞的诊疗技术也至关重要，具有良好的应用前景。

2)培养基中进一步加入EZH2抑制剂，可以大大促进早期转变阶段中扩展多能干细胞的出现，并缩短转化时间，与不加EZH2抑制剂相比，转化时间可缩短一半左右，且在培养过程中无需挑克隆或ReLeSR^TM传代，简化操作，大大提高了转化效率。

3)培养基中进一步加入糖酵解抑制剂，可用于人多能干细胞转化成扩展多能干细胞后维持阶段，减少克隆形态异质性问题，提高稳定性，便于长期培养。

4)本发明提供的将人多能干细胞转化成扩展多能干细胞的培养方法，采用成分明确的专用培养基，将人多能干细胞简单快速的转化为扩展多能干细胞，同时提高基质胶浓度后可以更好地维持扩展多能干细胞的状态，使其形态更立体，培养更稳定，异质性更小。

附图说明

图1为实施例1中转变过程结果图。

图2为实施例1中荧光显示人EPSC中内源性GFP表达情况。

图3为实施例1中荧光显示注射进小鼠8细胞胚胎后48小时人EPSC中内源性GFP表达情况。

图4为实施例1中胚胎免疫荧光显示GFP与胚胎内组织和胚胎外组织共表达情况。

图5为实施例1-2和对比例1培养P6代后形态结果。

图6为实施例1-2和对比例1中数据统计分析显示转变早期过程中立体克隆形态数量变化。

图7为实施例1-2和对比例1中荧光定量PCR显示转变早期阶段小分子处理后基因表达对比情况。

图8为实施例3-5和对比例2中形态结果显示细胞克隆情况。

图9为实施例3-5和对比例2中数据统计分析显示转变后期稳定过程中立体克隆形态数量变化。

其中图5-7中，control为实施例1；GSK126组为实施例2；GSK-J1为对比例1；图8-9中，NT显示不额外添加小分子的实施例3；2-DG组为加入2-DG的实施例4；ATA组为加入ATA的实施例5；vehicle组为对比例2。

图10为实施例6中诱导多能干细胞转化为扩展多能干细胞的具体过程图。

图11为实施例6中实时定量PCR分析结果。

图12为实施例6-7和对比例3培养P8代后的形态结果。

图13为实施例8-10培养后形态结果及其量化图。

图14为实施例8-10实时定量PCR分析结果。

其中图12中，control为实施例6；GSK126组为实施例7；GSK-J1为对比例3；图13-14中，NT显示不额外添加小分子的实施例8；2-DG组为加入2-DG的实施例9；ATA组为加入ATA的实施例10。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1.提供一种人胚胎干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基，所述培养基以体积比1:1混合的knockout DMEM/F12和NeuroBasal做基础培养基，还包括1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸盐,1％非必需氨基酸,1％双抗,0.1mMβ-巯基乙醇，recombinanthuman LIF(10ng/mL),CHIR99021(1μM),(S)-(+)-Dimethindene maleate(2μM),Minocycline hydrochloride(2μM),IWR-endo-1(1μM),Y-27632(2μM)，其中上述组分中百分比为体积百分比，单位μM中的M代表mol/L。

2.一种人胚胎干细胞转变为扩展多能干细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：

1)使用mTeSR1做基础培养基，加入1％双抗,人胚胎干细胞于1：100稀释比例的基质胶上培养。

2)步骤1)中人胚胎干细胞培养2-3d待人胚胎干细胞扩增成为小克隆时换用上述培养基，自此多能干细胞开始转化，细胞开始大量死亡，形态出现显著变化此时细胞形态为细长条状，并且排布紧密有极性(此为P1代)，细胞增殖速度加快，若克隆间即将有接触(此时细胞覆盖约90％培养板底面积)，则立即对其传代处理。

3)弃去旧培养基后用DPBS漂洗细胞后，加入1mL TrypLE消化液于37℃条件下消化处理2分钟。加入等体积DF12(5％KSR)终止消化作用，并轻柔吹打贴壁的细胞，室温条件下1000rpm离心3分钟。弃去上清液并加入1mL新鲜的上述细胞培养基，轻柔吹打重悬细胞，以1：2比例加入新铺1：30稀释比例基质胶(matrigel)培养孔中，最后放到培养箱中于37℃，5％CO2浓度条件下培养细胞，此代定为EPS细胞第2代，培养过程中每24小时需更换一次培养基。

4)P2代细胞开始有扩展多能干细胞出现，此时细胞状态为小而立体的克隆(转化前期会出现立体克隆但不易维持)，细胞密度很高，但彼此又不接触，但若细胞克隆开始有接触时需立刻传代(不受培养天数限制)，此时传代比例为1:4。

5)P3代细胞和P2代相比，形态较为平铺，但仍存在小而立体的克隆，细胞异质性增强(转化中期细胞会经历立体向平铺，平铺细胞向立体细胞转变过程)，待细胞克隆间有相互接触可能时及时传代(约3d)，此时可以采用ReLeSR^TM消化液去除分化细胞或在体式镜下手动挑选克隆样细胞进行传代。此后传代周期逐渐固定为3d(主要传代周期还是看细胞的生长状态，固定传代周期对细胞的稳定维持有利)，传代比例逐渐降低至1:7-1:10，至培养的细胞克隆均为小而立体细胞，几乎无异质性时，传代比例固定为1：10-1:20,克隆形态为立体。

6)至此，人胚胎干细胞向扩展多能干细胞的转化彻底完成。

3.人EPSC中内源性GFP表达检测：

将内源稳定性表达绿色荧光蛋白GFP的人扩展多能干细胞注射进小鼠8细胞阶段的胚胎中，荧光显微镜下目测明场与GFP信号，统计成功注射胚胎数目。

24h后，小鼠胚胎发育至囊胚初期，在荧光显微镜下明场观察胚胎发育情况，FITC通道下目测GFP绿色荧光亮度的胚胎数目。选取1～2个视野拍照。

48h后，小鼠胚胎发育至囊胚晚期，部分胚胎会进入孵化阶段。在荧光显微镜下明场观察胚胎发育情况，FITC通道下目测GFP绿色荧光亮度的胚胎数目。选取1～2个视野拍照。单独挑选仍然带有GFP绿色荧光的胚胎，取一小部分胚胎进行胚胎免疫荧光检测。

先将圆底96孔板中1个孔中加入200μl新鲜的4％多聚甲醛,用口吸管将收集的胚胎置于溶液中，室温固定1小时或4℃过夜固定；每孔加入200μl含0.1％Tween 20和0.01％Triton X-100的PBS中，固定完后，口吸管依次转移胚胎至孔中分别洗涤三次，每次5分钟，摇床上缓慢摇动；加入200μl含0.5％Triton X-100的PBS溶液，口吸管转移胚胎至该孔中，室温透膜30分钟；每孔加入200μl含0.1％Tween 20和0.01％Triton X-100的PBS中，透膜结束后，口吸管依次转移胚胎至孔中分别洗涤三次，每次5分钟，摇床上缓慢摇动；加入200μl含0.03％Triton X-100+10％驴血清的PBS，口吸管转移胚胎至该孔中，室温1h或者4度过夜进行封闭；加入100-150μl含有一抗的封闭液，封闭结束后，口吸管转移胚胎至该孔中，4℃过夜孵育；每孔加入200μl含0.1％Tween 20和0.01％Triton的PBS中，一抗孵育结束后，口吸管依次转移胚胎至孔中分别洗涤三次，每次5分钟，摇床上缓慢摇动；加入100μl-150μl含有二抗的封闭液，封闭结束后，口吸管转移胚胎至该孔中，室温避光孵育1小时；每孔加入200μl含0.1％Tween 20和0.01％Triton的PBS中，二抗孵育结束后，口吸管依次转移胚胎至孔中分别洗涤三次，每次5分钟，摇床上缓慢摇动；取一个干净的载玻片，一个干净的盖玻片，四个角上少量蘸取羊毛脂，防止胚胎挤压破碎。上面滴加一滴含有DAPI的防猝灭的液滴，口吸管转移胚胎至该液滴中，轻轻将盖玻片均匀压片；显微镜下观察并拍照。本研究中用到的一抗如下：Anti-CDX2(ZA-0520，1:200，中杉金桥)；Anti-OCT4(SC5279，1:200，SANTACRUZ)。本研究中用到的荧光二抗如下：DoαMs TRITC(1:200，Jackson ImmunoResearch)；DoαRb TRITC(1:200，Jackson ImmunoResearch)；DoαMs FITC(715-095-150，1:200，JacksonImmunoResearch)；核染料：DAPI(罗氏，USA)。

图1为本实施例中中转变过程结果图，结果显示：转化的胚胎干细胞的克隆形态是扁平状(p0)，随后进入转化阶段，细胞在中期克隆变为小而立体克隆，但边缘仍有许多分化细胞(P2-P9)，至后期转化完成此时扩展多能干细胞形态为规则的小而立体克隆(P19)，并且在之后仍能稳定培养至P35甚至更后，方便后续实验。

图2为本实施例中荧光显示人EPSC中内源性GFP表达情况，图中可以看出内源表达GFP的人胚胎干细胞可以在基质胶体系中转变为立体克隆形态的扩展多能干细胞。

图3为本实施例中免荧光显示注射进小鼠8细胞胚胎后48小时人EPSC中内源性GFP表达情况，图中显示带有GFP标记的扩展多能干细胞可以参与小鼠囊胚发育。

图4为本实施例中胚胎免疫荧光显示GFP与胚胎内组织和胚胎外组织共表达情况，胚胎染色可见扩展多能干细胞内源表达的荧光蛋白GFP分别与胚胎内组织(内细胞团-OCT4)和胚胎外组织(滋养外胚层-CDX2)共染的情况，说明扩展多能干细胞在小鼠囊胚阶段既发育为胚胎内组织，又发育为胚胎外组织。

在人胚胎干细胞向扩展多能干细胞细胞转变过程中，出现多处立体克隆的形态。本实施例中使用高浓度基质胶体系优化人扩展多能干细胞转变过程，观察由人胚胎干细胞转变而来的扩展多能干细胞的发育潜能，由图2-4结果可知，得到了既能够发育为胚胎内组织、又能够发育为胚胎外组织的扩展多能干细胞。

实施例2

1.提供一种将人胚胎干细胞转变为扩展多能干细胞的培养基，该培养基使用体积比1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal做基础培养基，还包括1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸盐,1％非必需氨基酸,1％双抗,0.1mMβ-巯基乙醇，recombinanthuman LIF(10ng/mL),CHIR99021(1μM),(S)-(+)-Dimethindene maleate(2μM),Minocycline hydrochloride(2μM),IWR-endo-1(1μM),Y-27632(2μM)，GSK126(1μM)。

2.一种将人胚胎干细胞转变为扩展多能干细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体步骤如下：

1)使用mTeSR1做基础培养基，加入1％双抗,人胚胎干细胞于1：100稀释比例的基质胶上培养。

2)步骤1)中人胚胎干细胞培养2-3d待人胚胎干细胞扩增成为小克隆时换用上述培养基，自此多能干细胞开始转化，细胞开始大量死亡，形态出现显著变化此时细胞形态为细长条状，并且排布紧密有极性(此为P1代)，细胞增殖速度加快，若克隆间即将有接触(此时细胞覆盖约90％培养板底面积)，则立即对其传代处理。

3)弃去旧培养基后用DPBS漂洗细胞后，加入1mL TrypLE消化液于37℃条件下消化处理2分钟。加入等体积DF12(5％KSR)终止消化作用，并轻柔吹打贴壁的细胞，室温条件下1000rpm离心3分钟。弃去上清液并加入1mL新鲜的上述细胞培养基，轻柔吹打重悬细胞，以1：2比例加入新铺1：30稀释比例基质胶(matrigel)培养孔中，最后放到培养箱中于37℃，5％CO2浓度条件下培养细胞，此代定为EPS细胞第2代，培养过程中每24小时需更换一次培养基。

4)P2代细胞开始有扩展多能干细胞出现，此时细胞状态为小而立体的克隆(转化前期会出现立体克隆但不易维持)，细胞密度很高，但彼此又不接触，但若细胞克隆开始有接触时需立刻传代(不受培养天数限制)，此时传代比例为1:4。

5)P3代细胞和P2代相比，形态较为平铺，但仍存在小而立体的克隆，细胞异质性增强(转化中期细胞会经历立体向平铺，平铺细胞向立体细胞转变过程)，待细胞克隆间有相互接触可能时及时传代(约3d)(无需采用ReLeSR^TM消化液去除分化细胞或在体式镜下手动挑选克隆样细胞可直接进行传代)。此后传代周期逐渐固定为3d(主要传代周期还是看细胞的生长状态，固定传代周期对细胞的稳定维持有利)，传代比例逐渐降低至1:7-1:10，至培养的细胞克隆均为小而立体细胞，几乎无异质性时，传代比例固定为1：10-1:20,克隆形态为立体。

6)至此，人胚胎干细胞向扩展多能干细胞的转化彻底完成。

3.实时荧光定量PCR检测mRNA相对表达情况的改变。

1)细胞总RNA提取

实验中采用美基生物HiPure Total RNA Mini Kit(双柱法)试剂盒提取细胞RNA，实验步骤操作如下：

将实施例1-2和对比例1中所培养的扩展多能干细胞细胞消化后收集离心沉淀，向沉淀中加入适量的Buffer RL(一般收集6孔板中一孔需要350μl，沉淀过多时则相应多加Buffer RL)，通过移液枪吹散沉淀，可放于－80℃保存；自冰箱中取出后，全程需要放置冰上，待融化后用移液枪吹打裂解液5-10次至底部白絮混匀为澄清，此步骤目的是打断基因组DNA；先把蓝色的gDNA过滤柱装在2mL收集管中，并标记好序号防止弄混。把细胞裂解液全部转移至gDNA过滤柱中。室温条件下以14,000g离心2min，去除基因组DNA；丢弃gDNA过滤柱。加入相同体积70％乙醇至2mL收集管的滤液中，使用移液枪吹打几次，以保证充分混匀；把白色的RNA过滤柱装在2mL收集管中。使用移液枪吸取≤700μl混合液至柱子中。12,000g离心1min，若混合液超过700μl则再重复此步骤一次；丢弃滤液，把柱子重新装回收集管。加入600μl Buffer RW1至柱子上。12,000g离心1min；丢弃滤液，把柱子重新装回收集管。加入已用乙醇稀释并混匀的600μl Buffer RW2至柱子中，12,000g离心1min，此步骤需要重复2次；倒弃废液，把柱子重新装回收集管。12,000g空转2分钟，此步骤目的是完全去掉RNA柱子上的液体，防止液体污染。

丢弃掉2mL收集管,再将柱子转移至干净RNase Free的1.5mL离心管，视沉淀量多少加入20-50μl RNase Free Water至柱子膜中央。冰上静置2分钟。12,000g离心1分钟，可以进行第二次洗脱。丢弃RNA过滤柱，将RNA样品保存于-80℃超低温冰箱。

2)cDNA的制备

上述提取的细胞总RNA测定其浓度和纯度，取1μg总RNA使用Biotool逆转录试剂盒获取cDNA。取出总的RNA放置于冰上，加入1μg RNA，随后加入4μl的5×qRT SuperMix，其余部分用RNase Free的水补足20μl总体积；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离至Ep管底部，使用普通Bio-rad的PCR仪进行反转录，反应条件为：25℃10min，42℃30min，85℃5min，之后于-20℃条件保存。

3)SYBR Green实时荧光定量PCR

取50ng上述反转录得到的cDNA，加入Biotool 2×SYBR Green qPCR Master Mix5μl，上游引物5μM，下游引物5μM，其余部分用RNase Free的水补足10μl总体积；使用Bio-rad的CFX384定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95℃5min，95℃15s，60℃30s，重复39个循环。实验结果使用△△CT方法对比管家基因GAPDH进行分析。

本研究中用到的引物：

GAPDH前向引物AATGAAGGGGTCATTGATGG，反向引物AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA；

NANOG前向引物CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA，反向引物CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC；

OCT4前向引物CAAAGCAGAAACCCTCGTGC，反向引物TCTCACTCGGTTCTCGATACTG；

KLF4前向引物ACCCACACAGGTGAGAAACC，反向引物ATGCTCGGTCGCATTTTTGG。

DNMT3L前向引物CGCCCCATGTAAGGACAAGT，反向引物ATCGGGTGCAATCAGGGTTT；

对比例1

具体操作同实施例1，不同之处在于，培养基中加入5μM与GSK126抑制作用相反的KDM6A/B抑制剂GSK-J1。

检测实施例1-2和对比例1中，立体克隆(扩展多能干细胞形态特征)的数量以及早期多能性、关键多能性、着床后多能性等基因的表达情况，具体结果如图5-7。

图5为实施例1-2和对比例1中形态结果显示P6代时细胞克隆情况，其中control为实施例1；GSK126组为实施例2；GSK-J1为对比例1；图中显示：在P6代，实施例2中细胞立体克隆数量明显增加，并且可稳定培养，说明加入GSK126后其转化速率有显著提升。

图6为实施例1-2和对比例1中数据统计分析显示转变早期过程中立体克隆形态数量变化；图中显示，实施例2中约15-20d时即出现75％以上的立体克隆，实施例2中立体克隆形态数目及频率明显较实施例1和对比例1更好，并且有显著性差异。

图7为实施例1-2和对比例1中荧光定量PCR显示转变早期阶段小分子处理后基因表达对比情况，图中显示，实施例2中人早期胚胎的转录因子KLF4和DNMT3L表达量明显提高，大大促进早期转变阶段中扩展多能干细胞的出现，而在对比例1中反而被抑制表达。

图5-7表明了引入小分子GSK126抑制EZH2，可以大大促进早期转变阶段中扩展多能干细胞的出现，且显著缩短了转化时间。

实施例3-5和对比例2

1.人胚胎干细胞成功转化为扩展多能性干细胞后，由于一些不可控因素细胞开始有平铺或分化细胞出现，出现异质性，需要继续培养维持，具体步骤为：

1)取培养晚期并具有异质性的扩展多能性干细胞以相同密度铺于1:50稀释比的基质胶上，加入培养基(培养基具体组成见表1)，培养3d后(细胞克隆即将相互接触时)使用TrypLE进行传代，传代密度为1:10；

2)之后也保持约3d传代一次的传代周期，每次检测前计数1：50稀释比的基质胶，保证一致的细胞密度。

表1扩展多能性干细胞晚期维持阶段培养基

实例	培养基组分
		实施例3	实施例1培养基
实施例4	实施例1培养基+2-DG(2mM)
		实施例5	实施例1培养基+ATA(50μM)
对比例2	实施例1培养基+2.11μl/mL的1M氨水

其中所述实施例1培养基成分为：以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal做基础培养基，还包括1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸盐,1％非必需氨基酸,1％双抗,0.1mMβ-巯基乙醇，recombinant human LIF(10ng/mL),CHIR99021(1μM),(S)-(+)-Dimethindene maleate(2μM),Minocycline hydrochloride(2μM),IWR-endo-1(1μM),Y-27632(2μM)。

实施例5中，ATA溶于氨水中后再加入培养基中，ATA在氨水中的浓度为23.7mM；氨水浓度为1M。

对比例2主要用于对比实施例5中引入氨水后对培养基的影响。

2.结果

观察加入糖酵解抑制剂2-DG和ATA后立体克隆(扩展多能干细胞形态特征)的数量以及早期多能性、关键多能性、着床后多能性等基因的表达情况，结果见图8-10，其中NT显示不额外添加小分子的实施例3；2-DG组为加入2-DG的实施例4；ATA组为加入ATA的实施例5，vehicle组为对比例2。

图8为实施例3-5和对比例2中形态结果显示细胞克隆情况。图中显示，立体克隆形态明显，稳定均一性好。

图9为实施例3-5和对比例2中数据统计分析显示转变后期稳定过程中立体克隆形态数量变化。图中显示克隆形成总数量并无明显差异，证明不影响增殖，但出现频率有显著性差异；说明可更稳定的维持扩展多能干细胞状态。

图8-9结果显示，引入实施例中提供的小分子(抑制糖酵解)，可以大大促进转变后期阶段中扩展多能干细胞的稳定性。

实施例6

提供一种人诱导多能干细胞转化为扩展多能干细胞培养方法，具体步骤和培养过程中用到的培养基同实施例1，不同之处在于，以人诱导多能干细胞代替人胚胎干细胞。

图10为本实施例中诱导多能干细胞转化为扩展多能干细胞的具体过程，结果显示：转化的胚胎干细胞的克隆形态是扁平状(p0)，随后进入转化阶段，细胞在中期克隆变为小而立体克隆，但边缘仍有许多分化细胞(P2-P7)，至后期转化完成此时扩展多能干细胞形态为规则的小而立体克隆(P16)。

图11为本实施例中实时定量PCR分析显示人诱导多能干细胞转化为扩展多能干细胞后，在基因表达上更接近早期胚胎，其中胚胎植入前相关基因如KLF4,DNMT3L扩展多能干细胞的表达明显较诱导多能干细胞有上调，胚胎植入后基因如DUSP6,ZIC2的在扩展多能性细胞中的表达水平明显较诱导多能干细胞下调。

实施例7

提供一种人诱导多能干细胞转化为扩展多能干细胞培养方法，具体步骤和培养过程中用到的培养基同实施例2，不同之处在于，以人诱导多能干细胞代替人胚胎干细胞。

对比例3

提供一种人诱导多能干细胞转化为扩展多能干细胞培养方法，具体步骤和培养过程中用到的培养基同对比例1，不同之处在于，以人诱导多能干细胞代替人胚胎干细胞。

图12为实施例6-7和对比例3培养P8代后的形态结果，显示P8代时细胞克隆情况，Control为实施6，GSK126组为实施例7，GSKJ1组为对比例3，可看到加入GSK126后其转化速率有显著提升。

实施例8-10

人诱导多能干细胞成功转化为扩展多能性干细胞后，继续培养，由于一些不可控因素细胞开始有平铺或分化细胞出现，出现异质性，需要继续培养维持，具体步骤和所用培养基，实施例8同实施例3，实施例9同实施例4，实施例10同实施例5，不同之处在于，以人诱导多能干细胞代替人胚胎干细胞。

图13为实施例8-10培养后形态结果及其量化图，其中NT组代表实施例8，2DG组代表实施例9，ATA组代表实施例10；结果显示在转化后期加入糖酵解抑制剂2-DG/ATA有助于扩展多能干细胞克隆立体形态的维持。

图14为实施例8-10实时定量PCR分析，其中NT组代表实施例8，2DG组代表实施例9，ATA组代表实施例10；显示添加小分子2-DG和ATA后可提高扩展多能干细胞中早期胚胎发育相关基因如KLF4,DNMT3L的表达水平。

图10-14结果显示，本发明实施例中提供的人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基不仅能转化人胚胎干细胞，也能转化人诱导多能干细胞为扩展多能干细胞，并且EZH2抑制剂及糖酵解抑制剂对扩展多能干细胞培养的优化也在诱导多能干细胞向扩展多能干细胞中同样适用。

Claims (8)

1.一种将人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal为基础培养基，还包括以下组分：1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸盐， 1％非必需氨基酸,1％双抗,0.1mMβ-巯基乙醇，10ng/mL recombinant human LIF， 1μM CHIR99021， 2μM(S)-(+)-Dimethindenemaleate， 2μMMinocycline hydrochloride， 0.5-5μM WNT通路抑制剂和1-10μM ROCK抑制剂；其中所述培养基还包括EZH2抑制剂和/或糖酵解抑制剂。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述WNT通路抑制剂为IWR-endo-1；所述ROCK抑制剂为Y-27632。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述EZH2抑制剂为GSK126，在培养基中的浓度为0.5-5μM。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述糖酵解抑制剂为2-DG或ATA，其中2-DG在培养基中的浓度为0.5-10mM，ATA在培养基中的浓度为10-100μM。

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述人多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

6.一种将人多能干细胞转化成人扩展多能干细胞的培养方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的培养基对人多能干细胞进行培养，将其转化成人扩展多能干细胞。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)使用mTeSR1做基础培养基，加入1％双抗， 人多能干细胞于1：100稀释比例的基质胶上培养；

2)步骤1)中人多能干细胞培养1-3d待人多能干细胞长成小克隆时换上权利要求1-4任一项所述的培养基，此为P1代，此时细胞长而排布整齐；

3)步骤2)所得P1代继续培养1d后使用TrypLE传代，1:3传入1:(30-50)稀释比的基质胶上；

4)当细胞覆盖80-90％培养板底面积时及时传代，将传代比例从1：3逐渐降至1:10-20，传入1:(30-50)稀释比的基质胶上，至细胞克隆小而立体，无异质性，即转化完全成功。

8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，还包括扩展多能性维持过程阶段，具体为：扩展多能干细胞转化完成后，选用权利要求1-4任一项所述的培养基继续培养，维持扩展多能性状态。

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