CN104762265A - 一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法：本方法首先从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA片段，并以此为模版克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。
Description
技术领域：
本发明涉及干细胞工程、珍稀物种的保存和组织与细胞工程等领域。
技术背景：
山羊iPS细胞的产生过程中多能性转录因子的导入都需要合适的运载系统，而利用运载系统导入方式的高效性和安全性是iPS细胞制备技术的研究重点。现在运载系统的研究方法主要分为四类：基因插入不可删除型，包括逆转录病毒、组成型和诱导型慢病毒等。该方法是利用连接有多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc或Nanog、Lin28的病毒性载体感染293或293T细胞制备病毒质滴，后感染目的细胞制备iPS细胞。该载体在目的细胞中不可删除，可在目的细胞中随机整合；基因插入可删除型，包括转座子运载系统和cre-Lox改造的慢病毒。以piggyBac转座子运载系统为例，该方法利用携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的piggyBac转座载体，经转染试剂介导转染目的细胞以获得iPS细胞。该方法的运载系统可在目的细胞中自行删除，易导致插入突变；无基因插入型，包括质粒瞬时转染、腺病毒、RNA-仙台病毒等。以质粒瞬时转染为例，该方法利用体外构建的真核表达载体通过携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28等多能性转录因子直接转染目的细胞，通过多次反复转染以期获得iPS细胞。该方法制备周期长，操作繁琐，制备效率低；无核酸参与型，包括转录因子的蛋白质转染、小分子化合物诱导、microRNA和mRNA转染等。该方法的主要步骤是利用体外转录或体外翻译获得的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28等多能性转录因子的mRNA或蛋白质直接转染目的细胞，通过反复多次转染获得iPS细胞。该方法无DNA参与，安全性好、诱导效率高。目前，急需一种安全、便捷、高效的iPS细胞制备方法，来满足山羊iPS细胞试验的需要，从而加速山羊iPS细胞的研究进展。
发明内容：
针对目前山羊iPS细胞制备周期长、效率低且操作繁琐、安全性低等问题，本发明采用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的mRNA转染目的细胞的方法，具有制备周期短、安全性及制备效率高等优势。采用本方法，转染后第18天左右可获得山羊iPS细胞，诱导效率为1.15％左右，与传统方法比较发现，以目前常用的慢病毒载体制备山羊iPS细胞为例，制备周期缩短1-2天，制备效率提高两倍，并且获得的山羊iPS细胞的形态更加的与山羊胚胎干细胞类似。发明提出的快速安全制备山羊iPS细胞的方法具有巨大的应用前景，为山羊iPS细胞的研究提供了重要的技术保障。
本发明目的在于为人们提供一种新的制备山羊iPS细胞的方法。
本发明包括以下步骤：
1.从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA片段，并以此为模版克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。
2.构建pcDNA3.0-oct4、pcDNA3.0-sox2、pcDNA3.0-klf4和pcDNA3.0-c-myc真核表达载体，利用相应的限制性内切酶进行线性化处理。随后利用体外转录试剂盒进行体外转录。对该转录产物利用RNA纯化试剂盒进行纯化，以备后续转染用。
3.利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。
4.利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。
5.在显微镜下将视野内克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。
6.采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。
本发明的优越性在于：
1.制备周期短，制备效率及安全性高；
2.方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；
3.采用本方法，转染后第18天左右可获得山羊iPS细胞，诱导效率为1.15％左右，与传统方法比较发现，以目前常用的慢病毒载体制备山羊iPS细胞为例，制备周期缩短1-2天，制备效率提高两倍，并且获得的山羊iPS细胞的形态更加的与山羊胚胎干细胞类似。；
4.为偶蹄类动物iPS细胞的制备提供了新的方法，同时也为今后山羊iPS细胞后续研究提供了方法和途径；
5.该技术也适用于其它物种iPS细胞的制备，可用于珍贵物种的利用与开发。
具体实施方式
一、多能性转录因子的克隆
①总RNA提取
利用RNA提取试剂盒分别提取山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织的总RNA，提取步骤为：
(1)在用DEPC水处理过的研钵中分别加入50-100mg山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织样品，加入液氮迅速研磨至粉状，分别装入1.5mL EP管中，并分别快速加入1mL的Trizol，混匀后室温静止10分钟；
(2)用标准为4℃、12000rpm的冰冻离心机离心10min，移上清至新的EP管中，加200μL氯仿用力反复摇晃15s，25℃下放置3min后用同样标准离心15min；
(3)将EP管中上面的水相移到另外一个新管中，加400μL异丙醇，混匀，室温放置15min，然后以相同标准离心10min；
(4)弃上清液，加1mL用DEPC水处理的75％乙醇洗涤RNA，然后以相同标准离心5min；
(5)弃去乙醇，在空气中干燥5min，加入20μL的去离子甲酰胺，轻轻吹吸几次，将RNA完全溶解，并分装后-80℃保存；
②RT-PCR反应
将上述总RNA利用反转录试剂盒反转录获得cDNA片段，并以此为模版，利用高保真primer star mix酶、上下游引物，克隆Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列，其中，扩增体系为：模板1ul，上下游引物各1ul，酶12.5ul，d2H2O 9.5ul；反应条件：94℃预变性2min，94℃变性1min，退火30sec(其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c-Myc退火温度为60℃)，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
③克隆产物与T载体连接
扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段后与pMD19-Tsimple克隆载体连接：条件为16℃，16h；
④感受态细胞的制备及转化
(1)感受态细胞制备：挑取在LB固体培养基上生长的受体菌单菌落，按照1:100的比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取250uL培养过夜受体菌接种于25mL LB液体培养基中剧烈振摇培养至OD600值0.5左右，将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min，在4℃，5000rpm离心10min，弃去上清，将管倒置一边液体流尽；用冰预冷的0.1mol/LCaCl210mL重悬沉淀，冰上放置30min；4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清，加入2mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2和80％甘油混合液重悬，并冰上放置。分装后-70℃保存备用；
(2)转化：取制备好的感受态细胞DH5α，迅速放于冰上融化，将10μL连接反应产物加入200μL的感受态细胞中，轻轻旋转以混匀，冰中放置45min；42℃热激45-90s，快速将离心管转移到冰浴中，细胞冷却2-3min；每管加入800μL LB液体培养基，于37℃轻微振荡培养1h；超净台中将200μL菌液涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，均匀涂板，37℃恒温培养12-16h；
⑤菌液PCR、单双酶切、测序鉴定
挑取平板上的阳性菌落，将单菌落接种到含氨苄青霉素的1ml LB培养基中，180rpm摇床培养4-6h，吸取菌液进行PCR检测，反应体系如下：
反应条件：94℃预变性2min；94℃变性1min，退火30sec(其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c-Myc退火温度为60℃)，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；
将菌液PCR鉴定正确的条带，根据转录因子各自引入的酶切位点，分别采用EcoR I、XhoI、XbaI进行单酶切与双酶切，将酶切鉴定正确的进行测序，将含正确插入片段的重组质粒命名为pMD19-T-Oct4、pMD19-T-Sox2、pMD19-T-Klf4和pMD19-T-c-Myc；
二、真核表达载体的构建
用EcoRI和XhoI限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19-T-Oct4、pMD19-T-Sox2、pMD19-T-c-Myc质粒，用EcoRI和Hind III限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19-T-Klf4质粒，胶回收目的片段，同时用相对应的限制性内切酶双切pcDNA3.0载体，胶回收目的载体，用T4DNA连接酶16℃条件下连接16h，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、单双酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pcDNA3.0-Oct4、pcDNA3.0-Sox2、pcDNA3.0-Klf4和pcDNA3.0-c-Myc，并进行测序鉴定；
三、体外转录
①质粒准备
将测序正确的pcDNA3.0-Oct4、pcDNA3.0-Sox2、pcDNA3.0-Klf4、pcDNA3.0-c-Myc和pcDNA3.0-EGFP重组质粒按照1：1000的比例接种到10ml含有氨苄青霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养14-16h，待菌液浑浊、发白，且OD值约为0.6时，4℃、8000rpm离心3min收集菌体，利用质粒小提试剂盒进行小提；
②质粒线性化
利用XhoI、XbaI限制性内切酶进行线性化处理，线性化条件为37℃水浴3h，利用DNA纯化试剂盒对线性化处理后的产物进行纯化，最终获得各质粒的浓度范围为：200-500ng/uL；
③体外转录
利用mMESSAGET7Ultra Kit试剂盒对纯化产物进行体外转录，将mMESSAGET7Ultra Kit中的试剂置于冰上解冻，以下步骤均在冰上操作：
(1)mRNA“加帽”
在PCR管中依次加入以下试剂：
并用无核酸酶的水补充至20uL，温和的混合上述反应溶液，在37℃条件下水浴2h；
向上述PCR管中添加1uL TURBO DNase，混合均匀，37℃条件下水浴15min；(2)mRNA“加尾”
在PCR管中依次加入以下试剂：
向上述管中添加4ul E-PAP，轻轻混合，终体积为100ul，并在37℃条件下水浴30-45min；
(3)mRNA纯化
对“加尾”和“加帽”处理后的mRNA利用MEGAclearTMKit进行mRNA纯化，收集纯化后的mRNA，利用NANO DROP分光光度仪检测其浓度和OD值，最终获得各mRNA的浓度范围为：100-500ng/uL；
四、山羊及小鼠胎儿成纤维细胞的分离
从屠宰场采回山羊胎儿，用含双抗的PBS溶液(青链霉素为100万单位/L)冲洗三次，置于培养皿中，去除胎儿的四肢、头部、内脏、骨骼，余下组织用含双抗的PBS冲洗数次后置于新的培养皿中，用眼科剪刀剪碎，加入上述体积2.5倍的0.25％胰酶消化，随后移至西林瓶中，并置于37℃水浴锅中消化30min，中间每隔10分钟震荡西林瓶，吸取西林瓶中上部液体，加入其体积2.5倍的含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，依次用100目、200目尼龙网筛过滤消化产物，1000rpm离心5-10min，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整密度至1-10×106个/ml，在100mm细胞培养皿中加入细胞悬液，然后放入37℃、5％CO2浓度培养箱中培养，待原代细胞生长至90-100％的汇合度时，用0.25％胰酶消化传代，弃去原先培养基，用PBS溶液清洗3遍，添加1.5mL 0.25％胰酶消化细胞，然后用含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，将细胞吹打成单细胞悬液后1000rpm离心6-8min，收集沉淀物，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整好细胞密度，放入37℃、5％CO2浓度培养箱中培养，小鼠胎儿成纤维细胞的分离方法同上；
五、饲养层细胞的制备
取出分离冻存的GEF细胞和MEF细胞，快速解冻并用含10％FBS的高糖DMEM培养，待细胞汇合度达90％时，用含10ug/mL丝裂霉素C的高糖DMEM培养液处理2.5-3.0h，随后用0.25％的胰酶消化细胞，以血球计数板计数，将5×104mL-1MEF细胞和5×104mL-1GEF细胞混合均匀并接种于0.1％明胶包被的12孔板中，用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养细胞，并在接种前2-3h更换为设计的山羊iPS细胞培养液；
六、细胞培养液的配制
向500mL KnockoutDMEM培养基中加入100mL血清替代物、0.293g L-谷氨酰胺、5mL非必需氨基酸、1uLβ-巯基乙醇、5mg bFGF、5×105U LIF，使培养液的最终组分及浓度为：KnockoutDMEM、20％血清替代物、1mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、10ng/mL bFGF、1000U/mLLIF；
七、mRNA的转染
在24孔板中，利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，按照脂质体2000：mRNA＝1：1(1uL与1uG)的比例转染接种密度为70％左右的GEF细胞，并记录此时GEF细胞的总数，间隔24h连续转染5次后，GEF细胞经0.25％胰酶消化后传至预先准备好饲养层的孔板中，用细胞培养液培养，隔天换液，直至出现山羊iPS细胞；
八、诱导效率的计算
将诱导获得的山羊iPS细胞用AKP染色试剂盒染色，记录AKP阳性克隆个数，利用以下公式计算诱导效率：诱导效率(％)＝AKP阳性克隆数(个)/转染前GEF细胞总数(个)；
九、山羊iPS细胞的形态特征识别
在显微镜下将视野内克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落；
十、iPS细胞的挑取与传代
待培养皿或培养瓶中的细胞汇合度达80％-90％时，用胰酶消化，按照1：3-5的比例传代，传代的细胞要接种到铺有新饲养层的孔板内培养，1个iPS集落的细胞团接种1个孔，间隔1d换液，并观察集落形态，分散的iPS细胞继续培养4-6d，此时出现的iPS细胞集落记为F1，用相同的方法对其分离、传代，并接种于饲养层上，再出现的iPS细胞集落记为F2，依次类推，直至建立山羊iPS细胞系。
Claims (1)
1.一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法，其特征在于：包括如下步骤：
一、多能性转录因子的克隆
①总RNA提取
利用RNA提取试剂盒分别提取山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织的总RNA，提取步骤为：
(1)在用DEPC水处理过的研钵中分别加入50-100mg山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织样品，加入液氮迅速研磨至粉状，分别装入1.5mL EP管中，并分别快速加入1mL的Trizol，混匀后室温静止10分钟；
(2)用标准为4℃、12000rpm的冰冻离心机离心10min，移上清至新的EP管中，加200μL氯仿用力反复摇晃15s，25℃下放置3min后用同样标准离心15min；
(3)将EP管中上面的水相移到另外一个新管中，加400μL异丙醇，混匀，室温放置15min，然后以相同标准离心10min；
(4)弃上清液，加1mL用DEPC水处理的75％乙醇洗涤RNA，然后以相同标准离心5min；
(5)弃去乙醇，在空气中干燥5min，加入20μL的去离子甲酰胺，轻轻吹吸几次，将RNA完全溶解，并分装后-80℃保存；
②RT-PCR反应
将上述总RNA利用反转录试剂盒反转录获得cDNA片段，并以此为模版，利用高保真primer star mix酶、上下游引物，克隆Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列，其中，扩增体系为：模板1ul，上下游引物各1ul，酶12.5ul，d2H2O 9.5ul；反应条件：94℃预变性2min，94℃变性1min，退火30sec,其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c-Myc退火温度为60℃，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
③克隆产物与T载体连接
扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段后与pMD19-Tsimple克隆载体连接：条件为16℃，16h；
④感受态细胞的制备及转化
(1)感受态细胞制备：挑取在LB固体培养基上生长的受体菌单菌落，按照1:100的比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取250uL培养过夜受体菌接种于25mL LB液体培养基中剧烈振摇培养至OD600值0.5左右，将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min，在4℃，5000rpm离心10min，弃去上清，将管倒置一边液体流尽；用冰预冷的0.1mol/LCaCl2 10mL重悬沉淀，冰上放置30min；4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清，加入2mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2和80％甘油混合液重悬，并冰上放置。分装后-70℃保存备用；
(2)转化：取制备好的感受态细胞DH5α，迅速放于冰上融化，将10μL连接反应产物加入200μL的感受态细胞中，轻轻旋转以混匀，冰中放置45min；42℃热激45-90s，快速将离心管转移到冰浴中，细胞冷却2-3min；每管加入800μL LB液体培养基，于37℃轻微振荡培养1h；超净台中将200μL菌液涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，均匀涂板，37℃恒温培养12-16h；
⑤菌液PCR、单双酶切、测序鉴定
挑取平板上的阳性菌落，将单菌落接种到含氨苄青霉素的1ml LB培养基中，180rpm摇床培养4-6h，吸取菌液进行PCR检测，反应体系如下：菌液模板1μL,
rTaq酶0.5μL,dNTP 2μL,10×buffer 2μL,Primer F 1μL,Primer R 1μL,d2H2O 12.5μL,总体积20μL；
反应条件：94℃预变性2min；94℃变性1min，退火30sec(其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c-Myc退火温度为60℃)，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；
将菌液PCR鉴定正确的条带，根据转录因子各自引入的酶切位点，分别采用EcoR I、XhoI、XbaI进行单酶切与双酶切，将酶切鉴定正确的进行测序，将含正确插入片段的重组质粒命名为pMD19-T-Oct4、pMD19-T-Sox2、pMD19-T-Klf4和pMD19-T-c-Myc；
二、真核表达载体的构建
用EcoRI和XhoI限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19-T-Oct4、pMD19-T-Sox2、pMD19-T-c-Myc质粒，用EcoRI和Hind III限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19-T-Klf4质粒，胶回收目的片段，同时用相对应的限制性内切酶双切pcDNA3.0载体，胶回收目的载体，用T4 DNA连接酶16℃条件下连接16h，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、单双酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pcDNA3.0-Oct4、pcDNA3.0-Sox2、pcDNA3.0-Klf4和pcDNA3.0-c-Myc，并进行测序鉴定；
三、体外转录
①质粒准备
将测序正确的pcDNA3.0-Oct4、pcDNA3.0-Sox2、pcDNA3.0-Klf4、pcDNA3.0-c-Myc和pcDNA3.0-EGFP重组质粒按照1：1000的比例接种到10ml含有氨苄青霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养14-16h，待菌液浑浊、发白，且OD值约为0.6时，4℃、8000rpm离心3min收集菌体，利用质粒小提试剂盒进行小提；
②质粒线性化
利用XhoI、XbaI限制性内切酶进行线性化处理，线性化条件为37℃水浴3h，利用DNA纯化试剂盒对线性化处理后的产物进行纯化，最终获得各质粒的浓度范围为：200-500ng/uL；
③体外转录
利用mMESSAGET7 Ultra Kit试剂盒对纯化产物进行体外转录，将mMESSAGET7 Ultra Kit中的试剂置于冰上解冻，以下步骤均在冰上操作：
(1)mRNA“加帽”
在PCR管中依次加入以下试剂：T7 2×NTP/ARCA 10uL,10×T7 ReactionBuffer 2uL,linear template DNA 0.1-1uG,T7 Enzyme Mix 2uL,并用无核酸酶的水补充至20uL，温和的混合上述反应溶液，在37℃条件下水浴2h；
向上述PCR管中添加1uL TURBO DNase，混合均匀，37℃条件下水浴15min；
(2)mRNA“加尾”
在PCR管中依次加入以下试剂：上述混合物20uL，Nuclease-free Water 36uL，5×E-PAP Buffer 20uL，25mM MnCl2，10uL，ATP Solution 10uL，总体积96uL；
向上述管中添加4ul E-PAP，轻轻混合，终体积为100ul，并在37℃条件下水浴30-45min；
(3)mRNA纯化
对“加尾”和“加帽”处理后的mRNA利用MEGAclearTMKit进行mRNA纯化，收集纯化后的mRNA，利用NANO DROP分光光度仪检测其浓度和OD值，最终获得各mRNA的浓度范围为：100-500ng/uL；
四、山羊及小鼠胎儿成纤维细胞的分离
采集山羊胎儿，用含双抗的PBS溶液，青链霉素为100万单位/L，冲洗三次，置于培养皿中，去除胎儿的四肢、头部、内脏、骨骼，余下组织用含双抗的PBS冲洗数次后置于新的培养皿中，用眼科剪刀剪碎，加入上述体积2.5倍的0.25％胰酶消化，随后移至西林瓶中，并置于37℃水浴锅中消化30min，中间每隔10分钟震荡西林瓶，吸取西林瓶中上部液体，加入其体积2.5倍的含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，依次用100目、200目尼龙网筛过滤消化产物，1000rpm离心5-10min，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整密度至1-10×106个/ml，在100mm细胞培养皿中加入细胞悬液，然后放入37℃、5％CO2浓度培养箱中培养，待原代细胞生长至90-100％的汇合度时，用0.25％胰酶消化传代，弃去原先培养基，用PBS溶液清洗3遍，添加1.5mL 0.25％胰酶消化细胞，然后用含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，将细胞吹打成单细胞悬液后1000rpm离心6-8min，收集沉淀物，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整好细胞密度，放入37℃、5％CO2浓度培养箱中培养，小鼠胎儿成纤维细胞的分离方法同上；
五、饲养层细胞的制备
取出分离冻存的GEF细胞和MEF细胞，快速解冻并用含10％FBS的高糖DMEM培养，待细胞汇合度达90％时，用含10ug/mL丝裂霉素C的高糖DMEM培养液处理2.5-3.0h，随后用0.25％的胰酶消化细胞，以血球计数板计数，将5×104mL-1MEF细胞和5×104mL-1GEF细胞混合均匀并接种于0.1％明胶包被的12孔板中，用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养细胞，并在接种前2-3h更换为设计的山羊iPS细胞培养液；
六、细胞培养液的配制
向500mL KnockoutDMEM培养基中加入100mL血清替代物、0.293g L-谷氨酰胺、5mL非必需氨基酸、1uLβ-巯基乙醇、5mg bFGF、5×105U LIF，使培养液的最终组分及浓度为：KnockoutDMEM、20％血清替代物、1mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、0.1mmol/L β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF、1000U/mLLIF；
七、mRNA的转染
在24孔板中，利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，按照脂质体2000：mRNA＝1：1(1uL与1uG)的比例转染接种密度为70％左右的GEF细胞，并记录此时GEF细胞的总数，间隔24h连续转染5次后，GEF细胞经0.25％胰酶消化后传至预先准备好饲养层的孔板中，用细胞培养液培养，隔天换液，直至出现山羊iPS细胞；
八、诱导效率的计算
将诱导获得的山羊iPS细胞用AKP染色试剂盒染色，记录AKP阳性克隆个数，利用以下公式计算诱导效率：诱导效率(％)＝AKP阳性克隆数(个)/转染前GEF细胞总数(个)；
九、山羊iPS细胞的形态特征识别
在显微镜下将视野内克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落；
十、iPS细胞的挑取与传代
待培养皿或培养瓶中的细胞汇合度达80％-90％时，用胰酶消化，按照1：3-5的比例传代，传代的细胞要接种到铺有新饲养层的孔板内培养，1个iPS集落的细胞团接种1个孔，间隔1d换液，并观察集落形态，分散的iPS细胞继续培养4-6d，此时出现的iPS细胞集落记为F1，用相同的方法对其分离、传代，并接种于饲养层上，再出现的iPS细胞集落记为F2，依次类推，直至建立山羊iPS细胞系。
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