CN111304155A - 绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液 - Google Patents

绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液 Download PDF

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Abstract

本发明提供了绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液，属于细胞培养技术领域。培养液是以DMEM为基础培养液，还包括L‑谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、β‑巯基乙醇和LIF、bFGF和FBS。分离培养方法，将绵羊胚层组织块清洗后置于培养液中，对所述组织块针刺，挤压后收集培养液、离心，收集上清液再次离心，收集沉淀，重悬细胞，培养。分离的多潜能干细胞能稳定表达与多潜能干细胞特性相关标志基因，同时不表达或弱表达Cx40和Cx43。该方法的建立无论对干细胞的进一步深入研究还是对器官组织发育、疫病机理研究及其防控都具有重要的意义。

Description

绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培 养液
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液。
背景技术
干细胞是生命科学研究领域的炙热点，人们之所以对干细胞在发育、种质资源保护和疫病防控以及药物筛选都给予期望，是因为干细胞的生物学特性决定的。干细胞具有克隆性，自我更新性同时又是一种未成熟的可分化为多种细胞谱系的细胞。利用干细胞，可以给人类健康所面临的一系列重大挑战，如艾滋病、乙肝以及肿瘤防控等带来现实希望。在畜牧兽医领域，干细胞具有更加广阔的前景和经济价值，如在遗传育种以及在种质资源多样性中作为种子细胞，在动物疫病模型和药物筛选中作为理想的靶细胞。干细胞尤其是胚胎干细胞的来源一直是干细胞深入和系统研究的巨大障碍，Shinya Yamanaka等人创立了iPS细胞极大的拓展了干细胞的合理获得途径，因此荣获了2012年度诺贝生理医学奖。遗憾的是，科研人员均把注意力集中在干细胞的获得以及相关应用，对干细胞在机体组织中存在的状态鲜有研究和关注。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液，能有效从绵羊组织中分离游离态的多潜能干细胞，丰富干细胞的种类。
本发明提供的了一种用于分离绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的培养液，以DMEM为基础培养液，还包括以下含量的组分：体积百分含量1％～5％L-谷氨酰胺、体积百分含量1％～5％非必需氨基酸、体积百分含量1％～5％丙酮酸钠、体积百分含量0.01％～0.05％β-巯基乙醇和500～1000μg/mL白血病抑制因子、5～10ng/mL碱性成纤维因子和体积百分含量10％～18％胎牛血清。
优选的，还包括以下含量的组分：体积百分含量1％L-谷氨酰胺、体积百分含量1％非必需氨基酸、体积百分含量1％丙酮酸钠、体积百分含量0.01％β-巯基乙醇和600μg/mL白血病抑制因子、5ng/mL碱性成纤维因子和体积百分含量15％胎牛血清。
本发明提供了一种绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
1)切割绵羊胚层组织至组织块；
2)将所述组织块清洗后置于所述培养液中，对所述组织块针刺，挤压后收集培养液；
3)将步骤2)中收集的培养液离心，收集上清液；
4)将所述上清液再次离心，收集沉淀，用所述培养液重悬细胞，培养；
5)待长出细胞克隆后，消化至单细胞传代。
优选的，步骤1)中绵羊胚层组织包括外胚层来源的表皮、中胚层来源的肺脏、肾脏以及肌肉或内胚层来源的胰腺。
优选的，步骤1)中所述组织块的长×宽规格为2～3cm×2～3cm。
优选的，步骤2)中所述针刺的次数为10～20次/块；
所述挤压的次数为3～6次/块。
优选的，步骤3)中所述离心的转速为1000～1200rpm，所述离心的时间为5～8min。
优选的，步骤4)中再次离心的转速为2800～3200rpm，所述再次离心的时间为5～8min。
优选的，步骤4)中所述培养的温度为37℃，所述环境的湿度为饱和湿度；
所述培养时，环境的CO2浓度为5％；所述培养的时间为36～48h。
本发明能够提供一种从绵羊器官组织中分离培养呈游离态干细胞的方法，并成功从绵羊肺脏组织中获得了多潜能干细胞，实验证明，分离的多潜能干细胞能稳定表达Oct-4、SSEA-1、Nanog以及Tert等与多潜能干细胞特性相关标志基因，同时不表达或弱表达细胞间连接蛋白40(Connexin40,Cx40)和连接蛋白43(Connexin43,Cx43)。这表明采用本发明提供的分离培养方法能够获得在组织中呈游离态的多潜能干细胞，预示着动物机体组织中有可能存在更接近胚胎干细胞的细胞。这无论对干细胞的进一步深入研究还是对器官组织发育、疫病机理研究及其防控都具有重要的意义。
附图说明
图1为肺组织游离的原代P0代类干细胞形态图；
图2为肺组织游离的P2代类干细胞形态图；
图3为RT-PCR检测绵羊肺脏组织中多潜能干细胞特异性标志基因的表达的电泳图。
具体实施方式
本发明提供的了一种用于分离绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的培养液，以DMEM为基础培养液，还包括以下含量的组分：体积百分含量1％～5％L-谷氨酰胺、体积百分含量1％～5％非必需氨基酸、体积百分含量1％～5％丙酮酸钠、体积百分含量0.01％～0.05％β-巯基乙醇和500～1000μg/mL白血病抑制因子、5～10ng/mL碱性成纤维因子和体积百分含量10％～18％胎牛血清。
本发明提供的培养液以DMEM为基础培养液。本发明对所述DMEM的配方没有特殊限制，采用本领域所熟知的DMEM培养基配方即可。
本发明提供的培养液包括L-谷氨酰胺。按质量百分比计，所述L-谷氨酰胺优选为1％。当L-谷氨酰胺的浓度低于1％时，细胞生长明显缓慢。
本发明提供的培养液包括非必需氨基酸。按质量百分比计，所述非必需氨基酸优选为1％。当非必需氨基酸的浓度低于1％时，细胞生长明显缓慢。本发明对所述非必需氨基酸的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的所述非必需氨基酸即可。
本发明提供的培养液包括丙酮酸钠。按质量百分比计，所述丙酮酸钠优选为1％。当丙酮酸钠的浓度低于1％时，细胞生长明显缓慢。本发明对所述丙酮酸钠的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的丙酮酸钠即可。在本发明实施例中，所述L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠均为配置好的商品，液体，购自GIBCO公司，规格为100×。
本发明提供的培养液包括β-巯基乙醇。按体积百分比计，所述β-巯基乙醇优选为0.01％。虽然β-巯基乙醇的含量要求较低，但是当培养基中省略β-巯基乙醇后造成细胞生长速度下降，因此β-巯基乙醇有促进细胞分裂生长的作用。本发明对所述β-巯基乙醇的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的β-巯基乙醇即可。
本发明提供的培养液包括白血病抑制因子。所述白血病抑制因子优选为600μg/mL。所述白血病抑制因子的作用是维持干细胞特性,抑制其分化。本发明对所述白血病抑制因子的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的白血病抑制因子即可。
本发明提供的培养液包括碱性成纤维因子。所述碱性成纤维因子优选为5ng/mL。所述碱性成纤维因子的作用为促进干细胞增值。本发明对所述碱性成纤维因子的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的碱性成纤维因子即可。
本发明提供的培养液包括胎牛血清。按体积百分比计，所述胎牛血清优选为15％。所述胎牛血清的作用是提供干细胞增值生长所需的营养。本发明对所述胎牛血清的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的胎牛血清即可。
本发明提供了一种绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
1)切割绵羊胚层组织至组织块；
2)将所述组织块清洗后置于所述培养液中，对所述组织块针刺，挤压后收集培养液；
3)将步骤2)中收集的培养液离心，收集上清液；
4)将所述上清液再次离心，收集沉淀，用所述培养液重悬细胞，培养；
5)待长出细胞克隆后，消化至单细胞传代。
本发明切割绵羊胚层组织至组织块。绵羊胚层组织优选包括外胚层来源的表皮、中胚层来源的肺脏、肾脏以及肌肉或内胚层来源的胰腺。本发明对所述绵羊胚层组织的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的绵羊胚层组织即可。所述组织块的长×宽规格优选为2～3cm×2～3cm。
得到组织块后，本发明将所述组织块清洗后置于所述培养液中，对所述组织块针刺，挤压后收集培养液。
在本发明中，所述针刺的次数优选为10～20次/块。所述针刺时使用的针没有特殊限制，采用本领域常见的解剖针即可。所述针刺有利于使组织块上形成针孔，游离状态的多潜能干细胞容易从针孔中释放至培养液中。所述挤压的次数优选为3～6次/块。所述挤压优选轻柔挤压，防止将组织块挤碎。所述挤压有利于加速游离状态的多潜能干细胞容易从针孔中释放至培养液中。
挤压后，本发明将收集的培养液离心，收集上清液。所述离心的转速优选为1000～1200rpm，更优选为1000rpm。所述离心的时间优选为5～8min，更优选为6min。所述离心的目的是去除针刺和挤压过程中从组织块脱落的细胞团块。
得到上清液后，本发明将所述上清液再次离心，收集沉淀，用所述培养液重悬细胞，培养。
在本发明中，所述再次离心的转速优选为2800～3200rpm，更优选为3000rpm。所述再次离心的时间优选为5～8min，更优选为6min。所述培养的温度优选为37℃，所述环境的湿度优选为饱和湿度；所述培养时，环境的CO2浓度优选为5％；所述培养的时间优选为36～48h。
待长出细胞克隆后，消化至单细胞传代。
在本发明中，所述消化用生物酶优选包括胰酶。所述胰酶的质量浓度优选为0.05％。所述消化的时间优选为30秒，所述消化的温度优选为37℃。本发明对所述传代的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的传代方法即可。
本发明对培养的呈游离态的多潜能干细胞进行基因扩增，结果发现，分离的细胞能稳定表达Oct-4、SSEA-1、Nanog以及Tert等与多潜能干细胞特性相关标志基因，同时不表达或弱表达细胞间连接蛋白40(Connexin40,Cx40)和连接蛋白43(Connexin43,Cx43)，这说明本发明分离培养得到的细胞为多潜能干细胞。所述分离培养方法的建立，无论对干细胞的进一步深入研究还是对器官组织发育、疫病机理研究及其防控都具有重要的意义。
下面结合实施例对本发明提供的绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
培养液的配制
DMEM(GIBCO)+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+0.01％β-巯基乙醇+500μg/mL LIF(白血病抑制因子)+5ng/mL bFGF(碱性成纤维因子)+10％)FBS(胎牛血清)。
将上述组分混合后除菌，得到培养液备用。
实施例2
培养液的配制
DMEM(GIBCO)+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+0.02％β-巯基乙醇+1000μg/mL LIF(白血病抑制因子)+10ng/mL bFGF(碱性成纤维因子)+18％)FBS(胎牛血清)。
将上述组分混合后除菌，得到培养液备用。
实施例3
培养液的配制
DMEM(GIBCO)+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+0.05％β-巯基乙醇+800μg/mL LIF(白血病抑制因子)+8ng/mL bFGF(碱性成纤维因子)+15％FBS(胎牛血清)。
将上述组分混合后除菌，得到培养液备用。
实施例4
于10cm培养皿中，切割绵羊外胚层来源的表皮形成约2～3cm的方块组织，D-PBS洗3遍，换成实施例1制备的培养液8mL，针刺，挤压后收集培养液于15mL离心管中，在1000rpm条件下离心6min去除杂质，取上清于另一15mL离心管中，在3000rpm条件下离心6min，弃上清，用培养液8mL缓慢重悬沉淀，转置10cm培养皿中于37℃、5％CO2的饱和湿度条件下培养36h。待长出细胞克隆后，用0.05％胰酶消化成单细胞进行传代和保存。收集第2、5、6、9、11代细胞用于后续实验。
实施例5
于10cm培养皿中，切割中胚层来源的肺脏形成约2～3cm的方块组织，D-PBS洗3遍，换成实施例2制备的培养液8mL，针刺，挤压后收集培养液于15mL离心管中，在1000rpm条件下离心6min去除组织块脱落的杂质，取上清于另一15mL离心管中，在3000rpm条件下离心6min，弃上清，培养液8mL缓慢重悬，转置10cm培养皿中于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养48h。待长出细胞克隆后，用0.05％胰酶消化至单细胞进行传代和保存。收集第2、5、6、9、11代细胞用于后续实验。
实施例6
于10cm培养皿中，切割绵羊外胚层来源的表皮，中胚层来源的肺脏、肾脏以及肌肉或内胚层来源的胰腺分别形成约2～3cm的方块组织，D-PBS洗3遍，换成实施例3制备的培养液8mL，针刺，挤压后收集培养液于15mL离心管中，在1000rpm条件下离心6min去除细胞团块杂质，取上清于另一15mL离心管中，在3000rpm条件下离心6min，弃上清，培养液8mL缓慢清洗，转置10cm培养皿中于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养42h。待长出细胞克隆后，用0.05％胰酶消化至单细胞进行传代和保存。收集第2、5、6、9、11代细胞用于后续实验。
培养细胞结果见图1～图2。图1为肺组织游离的原代P0代类干细胞形态图；图2为肺组织游离的P2代类干细胞形态图。
实施例7
通过PCR方法检测绵羊肺组织干细胞第2、5、6、9、11代以下基因的表达：Oct-4、Nanog、SSEA-1、Tert、Cx40、Cx43等，内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，引物信息见表。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析并照相。
表1扩增基因的引物信息
Figure BDA0002287768420000071
Figure BDA0002287768420000081
PCR反应体系组成见表2。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002287768420000082
PCR反应的扩增程序见表3。
表3 PCR反应的扩增程序
Figure BDA0002287768420000083
将PCR扩增后得到的扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结果见图3。由图3可知，绵羊肺脏组织干细胞能稳定表达多潜能干细胞特异性标志基因，而不能表达细胞间连接蛋白Cx40、Cx43，说明本发明提供的分离培养方法能够分离培养得到呈游离状态的多潜能干细胞。
对比例1
培养液的配制
DMEM(GIBCO)+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+0.01％β-巯基乙醇+500μg/mL LIF(白血病抑制因子)+5ng/mLbFGF(碱性成纤维因子)+10％)FBS(胎牛血清)。
将上述组分混合后除菌，得到培养液备用。
按照实施例4的方法进行分离培养。采用上述培养液对多潜能干细胞进行培养，会使细胞群体倍增时间比实施例4的培养时间增加约2小时。
对比例2
培养液的配制
DMEM(GIBCO)+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+1000μg/mL LIF(白血病抑制因子)+10ng/mLbFGF(碱性成纤维因子)+18％)FBS(胎牛血清)。
将上述组分混合后除菌，得到培养液备用。
按照实施例4的方法进行分离培养。采用上述培养液对多潜能干细胞进行培养，会使细胞群体倍增时间比实施例4的培养时间增加约1.6小时。
对比例3
采用实施例2制备的培养液，按照实施例4的方法进行分离培养，不同之处在于，更换培养液后省略针刺和挤压的操作，其他步骤均相同。结果表明，省略针刺和挤压操作无法从组织块中获得游离的多潜能干细胞单细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古自治区农牧业科学院
<120> 绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggtgtcagc caacgactat c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaccacata ctcagcacca g 21

Claims (9)

1.一种用于分离绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的培养液，其特征在于，以DMEM为基础培养液，还包括以下含量的组分：体积百分含量1％～5％L-谷氨酰胺、体积百分含量1％～5％非必需氨基酸、体积百分含量1％～5％丙酮酸钠、体积百分含量0.01％～0.05％β-巯基乙醇和500～1000μg/mL白血病抑制因子、5～10ng/mL碱性成纤维因子和体积百分含量10％～18％胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，还包括以下含量的组分：体积百分含量1％L-谷氨酰胺、体积百分含量1％非必需氨基酸、体积百分含量1％丙酮酸钠、体积百分含量0.01％β-巯基乙醇和600μg/mL白血病抑制因子、5ng/mL碱性成纤维因子和体积百分含量15％胎牛血清。
3.一种绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)切割绵羊胚层组织至组织块；
2)将所述组织块清洗后置于权利要求1或2所述培养液中，对所述组织块针刺，挤压后收集培养液；
3)将步骤2)中收集的培养液离心，收集上清液；
4)将所述上清液再次离心，收集沉淀，用权利要求1或2所述培养液重悬细胞，培养；
5)待长出细胞克隆后，消化至单细胞传代。
4.根据权利要求3所述分离培养方法，其特征在于，步骤1)中绵羊胚层组织包括外胚层来源的表皮、中胚层来源的肺脏、肾脏以及肌肉或内胚层来源的胰腺。
5.根据权利要求3所述分离培养方法，其特征在于，步骤1)中所述组织块的长×宽规格为2～3cm×2～3cm。
6.根据权利要求3所述分离培养方法，其特征在于，步骤2)中所述针刺的次数为10～20次/块；
所述挤压的次数为3～6次/块。
7.根据权利要求3所述分离培养方法，其特征在于，步骤3)中所述离心的转速为1000～1200rpm，所述离心的时间为5～8min。
8.根据权利要求3所述分离培养方法，其特征在于，步骤4)中再次离心的转速为2800～3200rpm，所述再次离心的时间为5～8min。
9.根据权利要求3～8任意一项所述分离培养方法，其特征在于，步骤4)中所述培养的温度为37℃，所述环境的湿度为饱和湿度；
所述培养时，环境的CO2浓度为5％；所述培养的时间为36～48h。
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