CN116004521A - 一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用 - Google Patents
一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用，所述培养基包括：DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38MAPK抑制剂。本发明创造性地将包括DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38MAPK抑制剂的培养基用于鸡肌源性干细胞体外增殖，使用包含有上述六种成分的培养基进行鸡肌源性干细胞体外增殖培养，细胞增殖率、存活率高，肌管分化状态好。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用。
背景技术
细胞培养肉技术作为新兴的替代蛋白生产技术，有低碳环保、减少病原体传播、减少抗生素使用、避免动物福利问题等多方面优势，为肉类生产提供了新的途径。肌源性干细胞是骨骼肌中具有干性的细胞，对动物的肌肉生长发育和再生起到关键的作用，也是目前细胞培养肉的种子细胞。细胞培养肉是依据动物肌肉生长修复的原理，在体外进行干细胞培养获得的肉类，该技术不需要进行动物养殖，而是直接细胞工厂化生产肉类。细胞培养肉的体外生产技术主要分为种子细胞获得与扩增，细胞富集后的诱导分化，进而促使大部分细胞分化形成肌肉组织。
CN114958730A公开了一种肌肉干细胞增殖培养基、分化培养基及其应用。包括添加有3，2’-二羟基黄酮的肌肉干细胞增殖培养基，添加有槲皮素的肌肉干细胞分化培养基。采用肌肉干细胞增殖培养基在体外短期培养猪肌肉干细胞时增殖速度显著提高，培养3天得到的细胞数量是正常培养基的1.35倍；在肌肉干细胞分化培养基中诱导分化5天，细胞的分化能力显著上升，肌肉特异性表蛋白肌球蛋白重链表达量显著上升。该发明还提供所述培养基的应用，以及基于该发明所述培养基制备培养肉的方法，提高肌肉干细胞在体外短期培养的扩增数量及分化能力，有利于培养肉的生产。
CN110938582A公开一种可提高细胞增殖活性的培养基，所述培养基是在基础培养基中加入细胞增殖活性组合物溶液配制而成，所述细胞增殖活性组合物由马齿笕提取物和茵陈提取物组成，所述细胞增殖活性组合物溶液是将马齿笕提取物和茵陈提取物溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成。该发明提供的培养基不仅具有刺激细胞增殖的功效，而且在不添加双抗的基础上还能有效减少细胞污染率。
传统肉类生产方式是以消耗大量粮食和水资源、严重污染环境为代价的。随着经济发展、人口大幅增加，肉制品需求正快速增加，传统肉类生产方式已越来越难以满足人类需求。因此研发体外促进肌源性干细胞增殖的培养基，制备高效、环保、可持续的细胞培养肉，以满足未来人类的肉品供应，是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基，所述培养基包括：
DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38MAPK抑制剂。
DMEM基础培养基是由Dulbecco改良的Eagle培养基，含有各种氨基酸和葡萄糖，其特点主要包括：(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍；(3)含有糖酵解途径中的重要物质-丙酮酸；(4)含有微量的铁离子。DMEM基础培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。
胎牛血清常用于细胞的体外培养，在提供维持细胞指数生长的激素、补充基础培养基不能提供的营养物质和缓冲酸碱平衡等方面起到重要的作用。
GlutaMAX添加剂是一种稳定的L-谷氨酰胺的替代品，与添加L-谷氨酰胺相比，GlutaMAX添加剂可显著减少有毒氮的积累，可改善细胞活力和细胞生长，可在更宽泛的温度范围下稳定的保存，GlutaMAX添加剂广泛的应用于哺乳动物细胞的贴壁和悬浮培养。
NEAA(Non-Essential Amino Acids)，即MEM非必需氨基酸溶液，包括L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸7种非必需氨基酸，能有效改善细胞培养基配比，降低细胞培养时细胞自身生产非必需氨基酸的副作用，促进细胞增殖代谢，是细胞培养中常用的添加剂之一。
bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)，即碱性成纤维细胞生长因子，是一种传递发育信号，促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，具有强烈的血管生成作用。在体外培养中，bFGF不仅能刺激细胞的增殖和迁移，而且可以诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。
p38信号通路是细胞内重要的信号通路，它在许多生物学反应包括细胞周期调控、细胞增殖、发育、分化、衰老、凋亡、免疫反应及肿瘤发生中起重要作用，p38 MAPK抑制剂通过结合到p38 MAPK与ATP结合的位置抑制p38 MAPK的催化活性及后续HSP27的磷酸化，从而抑制MAPKAPK-2的激活，调控p38信号通路。在体外培养中p38 MAPK抑制剂可以提高卫星细胞的分化能力。
本发明创造性地将包括DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38 MAPK抑制剂的培养基用于鸡肌源性干细胞体外增殖，其中胎牛血清、bFGF与NEAA三种成分相辅相成，在促进细胞增殖、改善细胞分化状态方面具有协同增效的作用；此外，P38MAPK抑制剂、GlutaMAX添加剂和NEAA组合应用，在促进鸡肌源性干细胞增殖与分化方面具有协同增效的作用，使用包含有DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38 MAPK抑制剂成分的培养基进行鸡肌源性干细胞体外增殖培养，细胞增殖率、存活率高，肌管分化状态好。
优选地，所述胎牛血清占培养基的质量百分数为15-25％。
所述15-25％中的具体数值可以选择15％、17％、19％、21％、23％或25％等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述GlutaMAX添加剂占培养基的质量百分数为0.05-2％。
所述0.05-2％中的具体数值可以选择0.05％、0.5％、0.7％、0.9％、1.1％、1.3％、1.5％、1.7％或2％等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述NEAA占培养基的质量百分数为0.05-2％。
所述0.05-2％中的具体数值可以选择0.05％、0.5％、0.7％、0.9％、1.1％、1.3％、1.5％、1.7％或2％等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养基中bFGF的浓度为5-15ng/mL。
所述5-15ng/mL中的具体数值可以选择5ng/mL、7ng/mL、9ng/mL、11ng/mL、13ng/mL或15ng/mL等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养基中p38 MAPK抑制剂的浓度为1-10μM。
所述1-10μM中的具体数值可以选择1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述DMEM基础培养基包括KnockOut DMEM培养基、DMEM高糖型培养基或DMEM/F12型培养基中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括KnockOutDMEM培养基和DMEM高糖型培养基的组合、DMEM高糖型培养基和DMEM/F12型培养基的组合、KnockOut DMEM培养基和DMEM/F12型培养基的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述DMEM基础培养基为KnockOut DMEM培养基。
本发明中所述DMEM基础培养基特定选择KnockOut DMEM培养基时，鸡肌源性干细胞的增殖与分化效果更好。
第二方面，本发明提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法使用的培养基包括如第一方面所述的用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基。
优选地，所述鸡肌源性干细胞体外培养方法包括如下步骤：
分离鸡肌源性干细胞，置于如第一方面所述的培养基中培养。
优选地，所述分离鸡肌源性干细胞的具体操作为：
处死鸡后，取鸡胸肌组织，切碎，加酶处理，离心，沉淀重悬，种皿，贴壁生长的即为所述鸡肌源性干细胞。
优选地，所述酶包括胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶。
优选地，所述胰蛋白酶处理的时间为3-10min。
所述3-10min中的具体数值可以选择3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中胰蛋白酶的处理时间仅需3-10min即可，与常规需要30min左右的肌源性干细胞胰蛋白酶处理时间不同，处理时间更短，更高效，处理后的细胞的增殖与分化状态更好。
优选地，所述离心的具体操作包括：先以100-300g的转速下离心，后在800-1200g的转速下离心；
所述100-300g中的具体数值可以选择100g、150g、200g、250g或300g等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述800-1200g中的具体数值可以选择800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g或1200g等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中分离的鸡骨骼肌组织使用胰蛋白酶处理后先在低转速下去除残留骨骼肌块状组织，随后在高转速下去除较小的组织碎片，这种离心程序在有效去除残留组织的情况下，减少离心操作对细胞的损伤，有利于后续细胞的增殖与分化。
优选地，所述离心的具体操作包括：先以100-300g的转速下离心3-8min，后在800-1200g的转速下离心3-8min。
所述100-300g中的具体数值可以选择100g、150g、200g、250g或300g等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述3-8min中的具体数值可以选择3min、4min、5min、6min、7min或8min等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述800-1200g中的具体数值可以选择800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g或1200g等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述3-8min中的具体数值可以选择3min、4min、5min、6min、7min或8min等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的培养基的制备方法，所述制备方法的具体步骤包括：
混合DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38 MAPK抑制剂，制得所述用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基。
本发明所涉及的DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38MAPK抑制剂仅需简单的混合后即可制得如第一方面所述的培养基，该制备方法工艺简单，适宜工业放大。
第四方面，本发明提供如第一方面所述的培养基、如第二方面所述的鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法或如第三方面所述的制备方法在鸡肌源性干细胞体外增殖和/或分化的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明创造性地将包括DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38 MAPK抑制剂的培养基用于鸡肌源性干细胞体外增殖，其中胎牛血清、bFGF与NEAA三种成分相辅相成，在促进细胞增殖、改善细胞分化状态方面具有协同增效的作用；此外，P38MAPK抑制剂、GlutaMAX添加剂和NEAA组合应用，在促进鸡肌源性干细胞增殖与分化方面具有协同增效的作用，使用包含有DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38 MAPK抑制剂成分的培养基进行鸡肌源性干细胞体外增殖培养，细胞增殖率、存活率高，肌管分化状态好。
2.本发明所涉及的DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38MAPK抑制剂仅需简单的混合后即可制得如第一方面所述的培养基，该制备方法工艺简单，适宜工业放大。
附图说明
图1为测试例2中实施例1(A)、实施例5(B)、实施例6(C)、对比例1(D)、对比例4(E)、对比例5(F)对应的鸡肌源性干细胞增殖显微镜结果图，图中比例尺为100μm。
图2为测试例3中实施例1(A)、实施例4(B)、对比例2(C)、对比例3(D)、对比例6(E)、对比例7(F)、对比例8(G)、对比例9(H)、对比例10(I)、对比例11(J)、对比例12(K)对应的鸡肌源性干细胞分化MyHC免疫荧光染色结果图，图中比例尺为100μm。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。
下述实施例所涉及的KnockOut DMEM培养基为购自Thermo Fisher Scientific货号为10829018的产品；DMEM/F12型培养基为购自Thermo Fisher Scientific货号为C11330500BT的产品；DMEM高糖型培养基为购自Thermo Fisher Scientific货号为C11995500BT的产品；胎牛血清为VISTECH品牌，货号为SE100-B的产品，GlutaMAX添加剂为购自Thermo Fisher Scientific货号为35050-061的产品，NEAA为购自Thermo FisherScientific货号为11140-050的产品，bFGF为PeproTech品牌，货号为100-18B的产品，三抗(青霉素-链霉素-两性霉素)为碧云天品牌货号为C0224的产品，p38 MAPK抑制剂为购自selleck公司货号为SB203580的产品。
实施例1
本实施例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，具体步骤包括：
(1)细胞增殖培养基配制：
将20％胎牛血清、1％ GlutaMAX添加剂、1％ NEAA、10ng/mL bFGF和10μM p38MAPK抑制剂，按照使用方法，分别解冻，在超净台中按添加量加入50mL离心管中混匀，加入KnockOut DMEM培养基补齐100％，再次混匀，密封，备用，制得所述用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基。
(2)鸡肌源性干细胞分离
7日龄内的鸡，颈部脱臼致死，酒精擦拭，用灭菌的大剪刀剖开腹腔，取鸡两侧胸肌组织。鸡胸肌组织酒精浸泡10s，用含2％三抗的PBS缓冲液洗涤3次，过程中剔除筋膜、结缔组织、脂肪和血管等杂质，用小剪刀将肌肉组织剪碎。在0.1％胶原蛋白酶消化液中37℃解离组织30min，1000g离心5min去除消化液，再用0.25％胰蛋白酶消化液37℃解离组织5min，用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化，用20mL无菌注射器吹打15次。
4℃下，以转速100g离心5min后，收集上清液，再次以1000g的转速离心5min。弃上清液，使用PBS缓冲液重悬细胞，依次通过孔径为100μm和40μm细胞过滤器，随后1000g离心5min。PBS缓冲液洗涤1次，细胞沉淀与红细胞裂解液(ACK)孵育5min，使用含有2％三抗(青霉素-链霉素-两性霉素)的PBS缓冲液洗涤2次，分离得鸡肌源性干细胞。
(3)鸡肌源性干细胞体外增殖培养
将分离得到的鸡肌源性干细胞使用步骤(1)制得的培养基重悬，并计数，随后接种在提前用0.1％明胶包被过(0.1％明胶铺底30min)的10cm皿里，每个皿接种106个细胞，然后将培养皿放置于37℃、5％ CO2，95％湿度的培养箱中培养，贴壁生长的即为鸡肌源性干细胞。
实施例2
本实施例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，具体步骤包括：
(1)细胞增殖培养基配制：
将15％胎牛血清、0.05％ GlutaMAX添加剂、2％ NEAA、5ng/mL bFGF和10μM p38MAPK抑制剂，按照使用方法，分别解冻，在超净台中按添加量加入50mL离心管中混匀，加入KnockOut DMEM培养基补齐100％，再次混匀，密封，备用，制得所述用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基。
(2)鸡肌源性干细胞分离
7日龄内的鸡，颈部脱臼致死，酒精擦拭，用灭菌的大剪刀剖开腹腔，取鸡两侧胸肌组织。鸡胸肌组织酒精浸泡10s，用含2％三抗的PBS缓冲液洗涤3次，过程中剔除筋膜、结缔组织、脂肪和血管等杂质，用剪刀将肌肉组织剪碎。在0.1％胶原蛋白酶消化液中37℃解离组织30min，900g离心5min去除消化液，再用0.25％胰蛋白酶消化液37℃解离组织3min，用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化，用20mL无菌注射器吹打10次。
4℃下，以转速300g离心3min后，收集上清液，再次以800g的转速离心8min。弃上清液，使用PBS缓冲液重悬细胞，依次通过孔径为100μm和40μm细胞过滤器，随后1000g离心5min。PBS缓冲液洗涤1次，细胞沉淀与红细胞裂解液(ACK)孵育5min，含有2％三抗(青霉素-链霉素-两性霉素)的PBS缓冲液洗涤1次，分离得鸡肌源性干细胞。
(3)鸡肌源性干细胞体外增殖培养
将分离得到的鸡肌源性干细胞使用步骤(1)制得的培养基重悬，并计数，随后接种在提前用0.1％明胶包被过(0.1％明胶铺底30min)的10cm皿里，每个皿接种106个细胞，将培养皿放置于37℃、5％ CO2，95％湿度的培养箱中培养，贴壁生长的即为鸡肌源性干细胞。
实施例3
本实施例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，具体步骤包括：
(1)细胞增殖培养基配制：
将25％胎牛血清、2％ GlutaMAX添加剂、0.05％ NEAA、15ng/mL bFGF和1μM p38MAPK抑制剂，按照使用方法，分别解冻，在超净台中按添加量加入50mL离心管混匀，加入KnockOut DMEM培养基补齐100％，再次混匀，密封，备用，制得所述用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基。
(2)鸡肌源性干细胞分离
7日龄内的鸡，颈部脱臼致死，酒精擦拭，用灭菌的大剪刀剖开腹腔，取鸡两侧胸肌组织。鸡胸肌组织酒精浸泡9s，用含2％三抗的PBS缓冲液洗涤3次，过程中剔除筋膜、结缔组织、脂肪和血管等杂质，用剪刀将肌肉组织剪碎。在0.1％胶原蛋白酶消化液中37℃解离组织30min，1000g离心6min去除消化液，再用0.25％胰蛋白酶消化液37℃解离组织10min，用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化，用20mL无菌注射器吹打10次。
4℃下，以转速100g离心8min后，收集上清液，再次以1200g的转速离心3min。弃上清液，使用PBS缓冲液重悬细胞，依次通过孔径为100μm和40μm细胞过滤器，随后1000g离心5min。PBS缓冲液洗涤1次，细胞沉淀与红细胞裂解液(ACK)孵育5min，含有2％三抗(青霉素-链霉素-两性霉素)的PBS缓冲液洗涤2次，分离得鸡肌源性干细胞。
(3)鸡肌源性干细胞体外增殖培养
将分离得到的鸡肌源性干细胞使用步骤(1)制得的培养基重悬，并计数，随后接种在提前用0.1％明胶包被过(0.1％明胶铺底30min)的10cm皿里，每个皿接种106个细胞，将培养皿放置于37℃、5％ CO2，95％湿度的培养箱中培养，贴壁生长的即为鸡肌源性干细胞。
实施例4
本实施例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于胰蛋白酶处理时间为30min，其余均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于将KnockOut DMEM培养基替换为DMEM/F12型培养基，其余均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于将KnockOut DMEM培养基替换为DMEM高糖型培养基，其余均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含胎牛血清，并将胎牛血清的质量份数使用KnockOut DMEM培养基补足，其余均与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含bFGF，并将bFGF的质量份数使用KnockOut DMEM培养基补足，其余均与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含NEAA，并将NEAA的质量份数按比例分配至胎牛血清，其余均与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含胎牛血清和NEAA，并将胎牛血清和NEAA的质量份数使用KnockOut DMEM培养基补足，其余均与实施例1相同。
对比例5
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含胎牛血清和bFGF，并将胎牛血清和bFGF的质量份数使用KnockOut DMEM培养基补足，其余均与实施例1相同。
对比例6
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含NEAA和bFGF，并将NEAA和bFGF的质量份数全部分配至胎牛血清，其余均与实施例1相同。
对比例7
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含P38 MAPK抑制剂，并将P38 MAPK抑制剂的质量份数按比例分配至GlutaMAX添加剂和NEAA，其余均与实施例1相同。
对比例8
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含GlutaMAX添加剂，并将GlutaMAX添加剂的质量份数按比例分配至NEAA和P38 MAPK抑制剂，其余均与实施例1相同。
对比例9
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含NEAA，并将NEAA的质量份数按比例分配至GlutaMAX添加剂P38MAPK抑制剂，其余均与实施例1相同。
对比例10
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含NEAA和GlutaMAX添加剂，NEAA和GlutaMAX添加剂的质量份数使用KnockOut DMEM培养基补足，其余均与实施例1相同。
对比例11
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含NEAA和P38 MAPK抑制剂，并将NEAA和P38 MAPK抑制剂的质量份数全部分配至GlutaMAX添加剂，其余均与实施例1相同。
对比例12
本对比例提供一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，所述培养方法与实施例1的区别仅在于培养基中不含GlutaMAX添加剂和P38 MAPK抑制剂，并将GlutaMAX添加剂和P38 MAPK抑制剂的质量份数全部分配至NEAA，其余均与实施例1相同。
测试例1
对实施例与对比例中鸡肌源性干细胞体外增殖情况进行评估。
细胞体外增殖情况评价方法：具体检测方法为CCK8实验，具体操作步骤如下：(1)取第3代鸡肌源性干细胞，使用0.1％胰蛋白酶消化后，加入各实施例或对比例的培养基重新悬浮，以2000个细胞每孔接种于涂有0.1％明胶的96孔板，每孔100μL。每个实施例或对比例6个重复，每板均有空白对照组(空白对照组加100μL培养基)。置于37℃、5％ CO2孵箱中培养。接种48h，每孔加入10μL CCK8溶液，37℃继续孵育2h后终止培养。用酶标仪在450nm处测定吸光度值，每组样品吸光值减去空白对照组吸光值后计算增殖差异率，增殖差异率＝各实施例或对比例在450nm处测定吸光度值/实施例1在450nm处测定吸光度值×100％。
表1
测试例2
取培养48h后的鸡肌源性干细胞置于显微镜下观察，对细胞体外增殖情况进行分析(图1)。
结果如图1所示，实施例1制得的鸡肌源性干细胞增殖效果好，细胞数目多，细胞成簇状生长，大多数为梭形和多边形。实施例5-6、对比例1、对比例4-5与实施例1相比，均出现了不同程度的细胞增殖速度的减慢，其中实施例5-6细胞增殖严重减慢，甚至出现大面积死亡的现象，对比例1、对比例4-5出现细胞变薄的现象，细胞增殖严重减慢。
测试例3
对实施例和对比例制得的鸡肌源性干细胞的分化状态进行评价。实施例与对比例步骤(3)制得的鸡肌源性干细胞长满培养皿后，加入含有2％马血清的DMEM/F12培养基，37℃、5％ CO2，95％湿度的培养箱中培养，每48h换液一次，分化4天后倒置显微镜下观察明场时的肌管，然后使用MyHC免疫荧光染色观察细胞形态变化，肌球蛋白重链即MyHC蛋白，与DAPI免疫染色后，染色结果可用来表征肌源性干细胞的分化水平。
MyHC免疫荧光染色的步骤为：细胞分化完成后去除培养基，用PBS缓冲液洗涤3次，加入4％多聚甲醛固定15min，将固定后的细胞用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，用Tritionx-100在25℃下通透15min，PBS缓冲液洗涤3次，每次5min。加入10％山羊血清于25℃中封闭1h，PBS缓冲液洗涤3次，每次5min。按照1：1000的比例将MyHC一抗(品牌abcam，货号ab51263)用3％的山羊血清稀释，加完MyHC一抗后，放到4℃的环境下孵育12h。第二天取出置于25℃的条件下复温，然后PBS缓冲液洗涤3次，每次5min。根据抗体的稀释倍数将二抗Anti-mouse IgG(H+L)，F(ab')2Fragment(Alexa Fluor 594Conjugate)(品牌CST，货号8890S)也同样用3％的山羊血清稀释，加完二抗后25℃避光1h，然后PBS缓冲液洗涤3次，每次5min。加入DAPI染料对细胞核进行染色，25℃避光5min后通过荧光显微镜观察并拍照记录。
结果表明：由表1数据和测试例3分化结果图2可知，实施例1中的鸡肌源性干细胞增殖效果好，经诱导后，分化肌管数量多(肌管融合率>90％)，结构完整，形态正常。实施例5-6、对比例1、对比例4-5细胞增殖缓慢，无法进行后续的分化操作。
实施例4与实施例1相比胰蛋白酶处理时长更长，但其增殖差异率低于实施例1，且分化肌管数量少，表明缩短胰蛋白酶的处理时间可以提高鸡肌源性干细胞的增殖速度和分化效果；实施例5、6分别将KnockOut DMEM培养基替换为DMEM/F12型培养基和DMEM高糖型培养基，其增殖差异率低于实施例1，且增殖速率缓慢无法进行后续的分化，表明DMEM基础培养基特定选择KnockOut DMEM培养基时，鸡肌源性干细胞的增殖和分化效果更好；
对比例1-6分别缺少bFGF、胎牛血清与NEAA三种成分中的一种成分或仅含其中的一种成分，对比例1、对比例3-5的细胞增殖差异率低于实施例1，虽然对比例2和对比例6的细胞增殖率较高，但是对比例2和对比例6肌管分化数量低于实施例1，表明bFGF、胎牛血清与NEAA三种成分在细胞增殖和细胞分化方面具有协同增效的作用，含有三种成分的培养基能够更好的促进鸡肌源性干细胞增殖和分化；
对比例7-12分别含有P38 MAPK抑制剂、GlutaMAX添加剂和NEAA三种成分的一种或仅含其中的一种成分，对比例7-12的增殖差异率低于实施例1，但细胞增殖下降不明显，综合对比例7-12组的细胞分化情况：对比例7-12的分化效果较实施例1差，其肌管存在分化数量少或肌管间存在间隙的情况，表明三种成分在鸡肌源性干细胞增殖与分化方面具有协同增效的作用，P38 MAPK抑制剂、GlutaMAX添加剂和NEAA三种成分配合使用可以促进细胞的增殖和分化效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基，其特征在于，所述培养基包括：
DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38MAPK抑制剂。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述胎牛血清占培养基的质量百分数为15-25％；
优选地，所述GlutaMAX添加剂占培养基的质量百分数为0.05-2％；
优选地，所述NEAA占培养基的质量百分数为0.05-2％；
优选地，所述培养基中bFGF的浓度为5-15ng/mL；
优选地，所述培养基中p38 MAPK抑制剂的浓度为1-10μM；
优选地，所述DMEM基础培养基包括KnockOut DMEM培养基、DMEM高糖型培养基或DMEM/F12型培养基中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述DMEM基础培养基为KnockOut DMEM培养基。
3.一种鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，其特征在于，所述鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法使用的培养基包括如权利要求1或2所述的用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基。
4.如权利要求3所述的鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，其特征在于，所述鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法包括如下步骤：
分离鸡肌源性干细胞，置于如权利要求1或2所述的培养基中培养。
5.如权利要求4所述的鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，其特征在于，所述分离鸡肌源性干细胞的具体操作为：
处死鸡后，取鸡胸肌组织，切碎，加酶处理，离心，沉淀重悬，种皿，贴壁生长的即为所述鸡肌源性干细胞。
6.如权利要求5所述的鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，其特征在于，所述酶包括胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶。
7.如权利要求6所述的鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶处理的时间为3-10min。
8.如权利要求5-7中任一项所述的鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法，其特征在于，所述离心的具体操作包括：先以100-300g的转速下离心，后在800-1200g的转速下离心；
优选地，所述离心的具体操作包括：先以100-300g的转速下离心3-8min，后在800-1200g的转速下离心3-8min。
9.如权利要求1或2所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤包括：
混合DMEM基础培养基、胎牛血清、GlutaMAX添加剂、NEAA、bFGF和p38 MAPK抑制剂，制得所述用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基。
10.如权利要求1或2所述的培养基、如权利要求3-8中任一项所述的鸡肌源性干细胞体外增殖培养方法或如权利要求9所述的制备方法在鸡肌源性干细胞体外增殖和/或分化中的应用。
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN102965335A (zh) * | 2011-09-01 | 2013-03-13 | 北京清美联创干细胞科技有限公司 | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 |
| CN108220232A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-06-29 | 天津博奥科生物科技有限公司 | 一种基于胎牛血清的培养基的培养方法 |
| CN111304155A (zh) * | 2019-11-25 | 2020-06-19 | 内蒙古自治区农牧业科学院 | 绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液 |
| CN112553147A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-03-26 | 江南大学 | 一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用 |
| CN112592890A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-04-02 | 江南大学 | 一种促进肌肉干细胞增殖的方法 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102965335A (zh) * | 2011-09-01 | 2013-03-13 | 北京清美联创干细胞科技有限公司 | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 |
| CN108220232A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-06-29 | 天津博奥科生物科技有限公司 | 一种基于胎牛血清的培养基的培养方法 |
| CN111304155A (zh) * | 2019-11-25 | 2020-06-19 | 内蒙古自治区农牧业科学院 | 绵羊组织中呈游离态的多潜能干细胞的分离培养方法及培养液 |
| CN112553147A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-03-26 | 江南大学 | 一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用 |
| CN112592890A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-04-02 | 江南大学 | 一种促进肌肉干细胞增殖的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 关欣等: "细胞培养肉技术:研究进展与未来展望", 中国食品学报, vol. 22, no. 12, pages 2 * |
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