MXPA03007175A

MXPA03007175A - Placenta de mamiferos postparto, su uso y celulas madres placentales extraidas de ella.

Info

Publication number: MXPA03007175A
Application number: MXPA03007175A
Authority: MX
Inventors: J Hariri Robert
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2002-02-13
Publication date: 2005-02-14
Also published as: EP2314673A1; US7255879B2; EP2336300A1; AU2002251935B2; NZ541541A; EP1362095A2; NZ527849A; EP2316919B1; EP2336300B1; CA2856986C; CA2856986A1; CA2438153C; EP2316919A1; US7468276B2; WO2002064755A3; EP2316918A1; US20030032179A1; EP2336299A1; EP1362095B1; CA2438153A1

Abstract

La presente invencion ofrece un metodo para extraer y recuperar celulas madres de tipo embrionico incluyendo, sin limitarse a ellas, celulas madres pluripotentes y multipotentes provenientes de placenta humana desangrada. La placenta es tratada para mover la sangre residual del cordon umbilical mediante la perfusion de placenta desangrada, de preferencia con una solucion anticoagulante, para remover las celulas residuales. Se recogen las celulas residuales y el liquido de perfusion de la placenta desangrada y las celulas madres embrionicas son separadas de las celulas residuales y del liquido de perfusion. La invencion ofrece tambien un metodo para utilizar la placenta aislada y perfusada como bioreactor en donde se propagan las celulas endogenas, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, celulas madres embrionicas. La invencion ofrece tambien metodos para la propagacion de celulas exogenas en un bioreactor placental y para la recoleccion de las celulas exogenas propagadas y moleculas bioactivas de ahi.

Description

I PLACENTA DE MAMÍFEROS POSTPARTO, SU USO Y CÉLULAS MADRES PLACENTALES EXTRAÍDAS DE ELLA 1.- INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a métodos para desangrar y perfusar una placenta después de su expulsión del útero, por ejemplo, después del parto. La presente invención se refiere a métodos para tratar y cultivar una placenta aislada para la propagación de células madres de tipo embriónico que se originan a partir de la placenta y fuentes exógenas . La presente invención se refiere además al uso de una placenta cultivada como bio-reactor para producir materiales biológicos o células de cultivo, tejidos y organoides. La presente invención se refiere también a la recolección y propagación de células madres y particularmente a la recolección de células madres de tipo embriónico y otras células madres pluripotentes provenientes de placentas. La presente invención se refiere a células madres de tipo embriónico que se originan de una placenta recogida después del parto. 2.- ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe un interés considerable para identificar, aislar y generar células madres humanas. Las células madres humanas son células precursoras totipotentes o pluripotentes capaces de generar varios linajes de células humanas maduras. Esta capacidad sirve como la base para la diferenciación celular y la especialización necesarias para el desarrollo de órganos y tej idos . Éxitos recientes en el transplante de tales células madres han proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o suplementar la médula ósea después de mieloablación debido a enfermedad, exposición a químicos tóxicos y/o radiaciones. Existe evidencia adicional que demuestra que las células madres pueden ser empleadas para repoblar muchos tejidos, y tal vez todos los tejidos, y restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. La aplicación de células madres en ingeniería tisular, administración de terapia génica y agentes terapéuticos celulares está avanzando también rápidamente. Muchos tipos diferentes de células madres de mamíferos han sido caracterizados. Por ejemplo, se conocen células madres embriónicas, células germinales embriónicas, células madres adultas u otras células madres dedicadas o células progenitoras . Ciertas células madres no solamente han sido aisladas y caracterizadas sino que han sido también cultivadas bajo condiciones que permiten la diferenciación hasta cierto punto. Permanece un problema básico, sin embargo, en el sentido que la obtención de cantidades suficientes y poblaciones de células madres humanas capaces de diferenciarse en todos los tipos de células es casi imposible. Las células madres no son abundantes. Son importantes para el tratamiento de una amplia variedad de trastornos, incluyendo malignidades, errores innatos del metabolismo, hemoglobinopatías, e inmunodeficiencias . Seria muy provechoso tener una fuente de más células madres embriónicas. La obtención de números suficientes de células madres humanas ha sido problemática por varias razones. Primero, el aislamiento de poblaciones de células madres que ocurren normalmente en tejidos adultos ha sido técnicamente difícil y costoso debido, en parte, a la cantidad muy limitada encontrada en la sangre y en tejidos. Segundo, la obtención de estas células a partir de embriones o tejido fetal, incluyendo abortos, ha planteado preocupaciones religiosas y éticas. La creencia generalizada que el embrión humano y el feto constituyen una vida independiente ha hecho que los gobiernos implantaran restricciones sobre el uso de tales fuentes para todos los propósitos, incluyendo la investigación médica. Fuentes alternativas que no requieren del uso de células obtenidas de tejido embriónico o fetal son por consiguiente esenciales para un avance adicional en el uso clínico de células madres. Sin embargo, existen pocas fuentes alternativas viables de células madres, especialmente células madres humanas y por consiguiente el suministro es limitado. Además, la cosecha de células madres a partir de fuentes alternativas en cantidades adecuadas para propósitos terapéuticos y de investigación es generalmente laboriosa, e incluye, por ejemplo, la cosecha de células o tejidos a partir de un sujeto o paciente donador, el cultivo y/o la propagación de células in vitro, disección etc. Por ejemplo, Caplan y colaboradores (Patente Norteamericana No. 5,486,359 titulada "Human mesenchymal stem cells" [Células madres mesenquimatosas humanas], expedida el dia 23 de enero de 1996) , divulga composiciones de células madres mesenquimatosas humanas (hMSC) derivadas de la médula ósea que sirven como los progenitores para linajes de células mesenquimatosas. Caplan y colaboradores divulgan que hMSCs son identificadas mediante marcadores específicos de superficie celular que son identificados con anticuerpos monoclonales . Composiciones de hMSC homogéneas son obtenidas por selección positiva de médula adherente o células periosteales libres de marcadores asociados ya sea con células hematopoyéticas o bien células mesenquimatosas diferenciadas. Estas poblaciones de células mesenquimatosas aisladas presentan características epitópicas asociadas con células madres mesenquimatosas, tienen la capacidad de regenerarse en cultivo sin diferenciación y tienen la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimatosos específicos cuando están inducidas in vitro o colocadas in vivo en el sitio de tejido dañado. El inconveniente de métodos de este tipo, sin embargo, es que requieren de la cosecha de médula o células periosteales de un donador, a partir de las cuales se deben subsecuentemente aislar las MSCs. Hu y colaboradores (WO 00/73421 titulado "Methods of Isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells" [Métodos de aislamiento, criopreservación, y uso terapéutico de células epiteliales amnióticas humanas], publicada el día 7 de diciembre de 2000) divulgan células epiteliales amnióticas humanas derivadas de placenta al momento del parto que son aisladas, cultivas, crioconservadas para uso futuro, o inducidas a la diferenciación. Según Hu y colaboradores, una placenta es cosechada inmediatamente después del parto y la membrana amniótica separada del chorión, por ejemplo, por disección. Las células epiteliales amnióticas son aisladas de la membrana amniótica según técnicas estándares de aislamiento de células. Las células divulgadas pueden ser cultivadas en varios medios, expandidas en cultivo, crioconservadas o inducidas a la diferenciación. Hu y colaboradores divulgan que las células epiteliales amnióticas son multipotentes (y posiblemente pluripotentes) , y pueden diferenciarse en tejidos epiteliales tales como epitelio de superficie córnea o epitelio vaginal. El inconveniente de estos métodos, sin embargo, es que requieren de mucho trabajo y el rendimiento en células madres es muy bajo. Por ejemplo, para obtener un número suficiente de células madres para propósitos terapéuticos o de investigación típicos, células epiteliales amnióticas deben ser aisladas primero del amnión por disección y técnicas de separación de células, después cultivadas y expandidas in vítro. La sangre del cordón umbilical (sangre del cordón) es una fuente alternativa conocida de células madres progenitoras hematopoyéticas . Las células madres provenientes de la sangre del cordón umbilical son crioconservadas rutinariamente para su uso en reconstitución hematopoyética, un procedimiento terapéutico ampliamente utilizado empleado en transplantes de médula ósea y otros trasplantes relacionados (véase, por ejemplo, Boyse y colaboradores, US 5,004,681, "Preservation of Fetal and Neonatal Hematopoietin Stem and Progenitor Cells of the Blood" [Conservación de Células Madres y Progenitoras de Hematopoyetina Fetal y Neonatal Provenientes de la Sangre], Boyse y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5,192,553, titulada "Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use" [Aislamiento y conservación de células madres y progenitoras hematopoyéticas fetales y neonatales de la sangre y métodos de uso terapéutico] , expedida el día 9 de marzo de 1993) . Técnicas convencionales para la recolección de sangre del cordón umbilical se basan en el uso de una aguja o cánula la cual se emplea con la ayuda de la gravedad para drenar sangre del cordón umbilical a partir de la placenta (es decir, desangrar) (Boyse y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5,192,553, expedida el día 9 de marzo de 1993; Boyse y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5,004,681, expedida el día 2 de abril de 1991; Anderson, Patente Norteamericana No. 5,372,581, titulada Method and Apparatus for Placental Blood Collection [Método y aparato para la recolección de sangre placental] , expedida el dia 13 de diciembre de 1994; Hessel y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5,415,665, titulada Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method [Dispositivo y método para sujetar, cortar y recoger sangre del cordón umbilical], expedida el día 16 de mayo de 1995) . La aguja o cánula es colocada habitualmente en la vena umbilical y la placenta es sometida masaje suave para ayudar a drenar la sangre del cordón umbilical de la placenta. Después, sin embargo, la placenta drenada ha sido considerada como inútil y ha sido típicamente desechada. Una limitación principal de la obtención de células madres de la sangre del cordón umbilical, sin embargo, ha sido el volumen frecuentemente inadecuado de sangre de cordón umbilical que se obtiene lo que resulta en números insuficientes de células para reconstituir efectivamente la médula ósea después de trasplante . Naughton y colaboradores (Patente Norteamericana No. 5,962,325 titulada "Three-dimensional stromal tissue cultures" [Cultivo de tejidos estromales tridimensionales], expedida el día 5 de octubre de 1999) divulga que células fetales, incluyendo células de tipo fibroblasto y progenitores de condrocitos pueden obtenerse a partir del cordón umbilical o tejido de placenta o sangre de cordón umbilical. Naughton y colaboradores (Patente Norteamericana No. 5,962,325) divulgan que tales células estromales fetales pueden ser utilizadas para preparar un tejido estromal "genérico" o cartilaginoso. Naughton y colaboradores divulgan también que un tejido estromal "específico" puede ser preparado mediante la inoculación de una matriz tridimensional con fibroblastos derivados de un individuo particular que recibirá después las células y/o tejidos cultivados en cultivo de conformidad con los métodos divulgados. El inconveniente de un enfoque de este tipo, sin embargo, es que requiere de mucho trabajo. Según los métodos divulgados por Naughton y colaboradores, para recuperar células estromales fetales del cordón umbilical o de la placenta se requiere de la disección de estos tejidos, de la trituración del tejido en pedazos y de la separación. Además, para obtener cantidades adecuadas de células estromales fetales de la sangre de cordón umbilical, así como el cordón umbilical y placenta, se requiere de expansión adicional ex vivo.

Métodos actualmente disponibles para la expansión ex vivo de poblaciones de células requieren también de mucho trabajo. Por ejemplo, Emerson y colaboradores (Emerson y colaboradores, Patente Norteamericana No. 6,326,198 titulada "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cells cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells" [Métodos y composiciones para la replicación ex vivo de células madres para la optimización de cultivo de células progenitoras hematopoyéticas y para el incremento de metabolismo, secreción de GM-CSF y/o secreción de IL-6 secreción de células estromales humanas], expedida el dia 4 de diciembre de 2001) ; divulgan métodos, y condiciones de medio de cultivo para el cultivo ex vivo de células madres humanas, y/u optimización de células madres progenitoras hematopoyéticas humanas. Según los métodos divulgados, las células madres humanas o células progenitoras derivadas de médula ósea son cultivadas en un medio de cultivo liquido el cual es reemplazado, de preferencia perfusado, ya sea continuamente o en forma periódica, a un régimen de 1 mi de medio por mi de cultivo durante aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. Productos metabólicos son removidos y se reponen los nutrientes agotados mientras se mantiene el cultivo bajo condiciones fisiológicamente aceptables.

Kraus y colaboradores (Kraus y colaboradores, Patente Norteamericana No. 6,338,942, titulada "Selective expansión of target cell populations" [Expansión selectiva de poblaciones de células objetivo], expedida el dia 15 de enero de 2002) divulgan que una población objetivo predeterminada de células puede ser expandida selectivamente mediante la introducción de una muestra inicial de células a partir de la sangre de cordón umbilical o sangre periférica en un medio de crecimiento, causando que las células de la población de células objetivo se dividen, y poniendo en contacto las células en el medio de cultivo con un elemento de selección que comprende moléculas de unión con afinidad especifica (como por ejemplo anticuerpo monoclonal para CD34) para una población predeterminada de células (como por ejemplo células CD34) , con el objeto de seleccionar células de la población objetivo predeterminada a partir de otras células en el medio de cultivo. Rodgers y colaboradores (Patente Norteamericana No. 6,335,195 titulada "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation" [Método para promover la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y mesenquimatosas] , expedida el dia 1 de enero de 2002) divulgan métodos para el cultivo ex vivo de células madres hematopoyéticas y mesenquimatosas y la inducción de proliferación y diferenciación de células especificas para linaje mediante el cultivo en presencia de angiotensinógeno, angiotensina I (AI), análogo de AI, fragmentos de AI asi como análogos de los mismos, angiotensina II (AII) , análogos de AII, fragmentos de AII asi como análogos de los mismos, o bien AT2 de AII agonista de receptor de tipo 2, ya sea solos o en combinación con otros factores de crecimiento y citocinas. Las células madres son derivadas de la médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón umbilical. El inconveniente de tales métodos, sin embargo, es que tales métodos ex vivo para inducir la proliferación y diferenciación de células madres requieren de mucho tiempo, de conformidad con lo divulgado arriba, y resultan también en rendimientos bajos de células madres. Naughton y colaboradores (Patente Norteamericana No. 6,022,743 titulada "Three-dimensional culture of pancreatic parenchymal cells cultured living stromal tissue prepared in vitro" [Cultivo tridimensional de células parenquimatosas pancreáticas cultivadas en tejido estromal vivo preparado in vi tro] , expedida el dia 8 de febrero de 2000) divulgan un sistema de cultivo tisular en donde las "Three-dimensional stromal tissue cultures" [Cultivo de tejidos estromales tridimensionales] , expedida el dia 5 de octubre de 1999) divulga que o células progenitoras (por ejemplo, células estromales tales como las derivadas de células de cordón umbilical, células placentales, células madres mesenquimatosas o células fetales) son propagadas en soporte tridimensional en vez de monocapa bidimensional/ por ejemplo en un recipiente de cultivo, por ejemplo, frasco o plato. Debido a restricciones en cuanto a la recolección y uso de células madres, y al número inadecuado de células que se recogen típicamente de la sangre de cordón umbilical, las células madres son muy escasas. Las células madres tienen el potencial de enfriarse en el tratamiento de una amplia gama de trastornos incluyendo malignidades, errores innatos del metabolismo, hemoglobinopatías, e inmunodeficiencias . Existe una necesidad crítica de una fuente fácilmente accesible de grandes números de células madres humanas para varios propósitos terapéuticos y otros propósitos relacionados. La presente invención se enfoca a la resolución de esta necesidad y a otros propósitos. 3.- COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una placenta de mamífero, de preferencia de ser humano, que después de la expulsión del útero ha sido tratada y cultivada para producir células madres multipotentes (por ejemplo, células progenitoras dedicadas) , células madres de tipo embriónico y otros materiales biológicos. En particular, la presente invención ofrece métodos para perfusar y desangrar una placenta después del parto. La presente invención proporciona métodos para desangrar y perfusar una placenta bajo condiciones estériles durante un período cuando menos dos horas hasta mas de cuarenta y ocho horas después de la expulsión de la placenta del útero. En una modalidad preferida, la placenta es sometida a perfusión con una solución que contiene factores para incrementar el desangrado, como por ejemplo factores anticoagulantes. En otra modalidad, la placenta es sometida a perfusión con una solución que contiene factores para incrementar las condiciones estériles como por ejemplo agentes antimícrobianos y ¦ antivirales . En una modalidad preferida, la placenta es sometida a perfusión con una solución que contiene factores de crecimiento. Tales soluciones que contienen factores de crecimiento y otros componentes de cultivo pero sin anticoagulantes se conocen como una solución de cultivo. En otra modalidad preferida de la invención, la placenta es sometida a perfusión para remover la sangre, células residuales, proteínas y cualquier otro material residual. La placenta puede ser procesada para remover residuos de materiales. La perfusión se efectúa normalmente con un perfusado apropiado durante un período de por lo menos dos horas hasta más de veinticuatro horas. En varias modalidades adicionales de la invención, la placenta es sometida a perfusión durante por lo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas antes de la recolección de las células madres. El perfusado recogido a partir de cualquiera de estos puntos de tiempo puede también proporcionar una fuente de células madres de tipo embriónico. Se entenderá que la primera recolección de sangre de la placenta se conoce como sangre de cordón umbilical que contiene predominantemente células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y CD38+. Dentro de las primeras veinticuatro horas de perfusión después del parto, células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y CD38-pueden se aisladas de la placenta junto con células CD34+ y CD38-. Después de aproximadamente veinticuatro horas de perfusión, células CD34- y CD38- pueden se aisladas de la placenta junto con las células mencionadas arriba. La presente invención se refiere a una placenta aislada que ha sido desangrada y perfusada bajo condiciones estériles. En una modalidad preferida, la invención ofrece una placenta aislada que ha sido desangrada y sometida a perfusión para remover todas las células residuales y cultivadas durante un periodo de dos a veinticuatro horas después de la expulsión del útero. La presente invención ofrece también una placenta aislada que ha sido tratada y cultivada para resultar en un órgano viable capaz de producir células madres de tipo embriónico, células progenitoras, asi como otros materiales biológicos . La presente invención se refiere a un aparato para la producción de células madres que comprende una placenta de mamífero cosechada después del parto que ha sido desangrada y sometida a perfusión, un medio para incubar o cultivar la placenta; y un medio para detectar células madres. En otra modalidad, el aparato de la presente invención comprende además un dispositivo de recolección y/o un medio para separar las células recogidas. En otra modalidad, el aparato de la invención comprende además un medio para monitorear y ajustar las condiciones de cultivo y la recolección de células . La presente invención ofrece también métodos para incubar y cultivar una placenta desangrada aislada bajo condiciones apropiadas para permitir la producción de células madres de tipo embriónico que se originan a partir de la placenta. De conformidad con la presente invención células madres de tipo embriónico son obtenidas a partir de una placenta después de la expulsión del útero. La placenta es desangrada y sometida a perfusión durante un periodo de por lo menos dos a veinticuatro horas para remover todas las células residuales. La placenta desangrada es después cultivada bajo condiciones apropiadas para permitir la producción de células madres endógenas que se originan a partir de la placenta, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, células madres de tipo embriónico y células madres pluripotentes o multipotentes . En una modalidad preferida, la placenta desangrada es cultiva en presencia de factores de crecimiento, como por ejemplo PDGF y EGF.

La presente invención ofrece además métodos para tratar y cultivar una placenta asilada para su uso como bio-reactor para la propagación de células madres endógenas originadas a partir de la placenta. La presente invención ofrece métodos para tratar y cultivar una placenta aislada para su uso como un bio-reactor para la propagación de células exógenas y materiales biológicos/ por ejemplo, anticuerpos, proteínas, oligonucleótidos, hormonas, virus, citocinas y enzimas. La presente invención ofrece también la propagación y recolección de células madres de tipo embriónico y otras células madres pluripotentes y multipotentes a partir de placentas. La placenta cultivada puede ser utilizada de manera repetida como bio-reactor y puede ser cultivada en un período de días, meses o hasta años. La placenta cultivada puede ser mantenida por remoción periódica o continua de una parte de un medio de cultivo o un fluido de perfusión que es introducido en el sistema y a partir del cual se puede recuperar las células propagadas o los materiales biológicos producidos, y se puede reemplazar con medio fresco o líquido de perfusado. En otra modalidad, la invención ofrece un método para utilizar la placenta aislada y perfusada como bio-reactor en donde se propagan células endógenas, incluyendo, pero sin limitarse a estos ejemplos, células madres de tipo embriónico, células progenitoras , células pluripotentes y células muítipotentes . Las células endógenas propagadas en el bio-reactor placental pueden ser recogidas y/o moléculas bio-activas pueden ser recuperadas del perfusado, medio de cultivo o a partir de las células placentales mismas. En otra modalidad, la invención ofrece un método para utilizar la placenta aislada y perfusada como bio-reactor en donde se propagan las células exógenas . De conformidad con esta modalidad, la invención se refiere a una placenta aislada que contiene una célula no derivada de la placenta, en donde el injerto de dicha célula en la placenta puede estimular la placenta para que produzca células madres de tipo embriónico o en donde la célula injertada produce señales como por ejemplo citocinas y factores de crecimiento, que pueden estimular la placenta para que produzca células madres. De conformidad con esta modalidad, la placenta puede ser injertada con células que son placentales por origen, obtenidas a partir del infante asociado con la placenta. En otra modalidad, la placenta puede ser injertada con células que no tienen un origen placental, obtenidas a partir de los padres o hermanos del infante asociado con la placenta. Las células exógenas propagadas en el bio-reactor placental pueden ser recogidas y/o moléculas bio-activas pueden ser recuperadas a partir del perfusado, medio de cultivo, o a partir de las células placentales mismas. La presente invención ofrece células madres de tipo embriónico que se originan a partir de una placenta. Las células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden ser caracterizadas por la medición de cambios en cuanto a morfología y adores de superficie celular empleando técnicas como por ejemplo citometría de flujo e inmunocitoquímica, y midiendo cambios en la expresión génica utilizando técnicas como por ejemplo reacción en cadena de polimerasa. En una modalidad de la invención, tales células madres de tipo embriónico pueden ser caracterizadas por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-. SSEA4-, 0CT-4+, y ABC-p+ . En una modalidad preferida, tales células madres de tipo embriónico pueden ser caracterizadas por la presencia de marcadores de superficie celular 0CT-4+ y APC-p+. Células madres de tipo embriónico que se originan a partir de la placenta tienen características de células madres embriónicas pero no son derivadas del embrión. En otras palabras, la invención abarca células oct-4+ y ABC-p+ que son células madres no diferenciadas aisladas de placenta sometida a perfusión postparto. Tales células son tan versátiles (por ejemplo, pluripotentes) como las células madres embriónicas humanas. Como se mencionó arriba, numerosas células madres pluripotentes o multipotentes diferentes pueden ser aisladas de la placenta perfusada en diferentes puntos de tiempo, por ejemplo, células hematopoyéticas CD34+/CD38+, CD34+/CD38-, y CD34-/CD38-. De conformidad con los métodos de la presente invención, la placenta humana es utilizada post-parto como la fuente de células madres de tipo embriónico . En otra modalidad, la presente invención ofrece un método para aislar otras células madres de tipo embriónico y/o multipotentes o pluripotentes a partir de un extracto o perfusado de una placenta desangrada. La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las células madres de tipo embriónico de la presente invención. La presente invención se refiere además a una población homogénea aislada de células madres placentales humanas que tiene el potencial de diferenciar entre todos los tipos de células. La invención abarca también composiciones farmacéuticas que tienen concentraciones elevadas (o bien poblaciones grandes) de células madres hematopoyéticas homogéneas que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, células CD34+/CD38-; y células CD34-/CD38-, una o varias de estas poblaciones celulares pueden emplearse con células hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical o en mezcla con células hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical, es decir, células hematopoyéticas CD34+/CD38+ para transplante y otros usos. Las células madres obtenidas por los métodos de la invención tienen múltiples usos en transplante para tratar o prevenir una enfermedad. En una modalidad de la invención, son utilizadas para renovar y repoblar tejidos y órganos, reemplazando asi o reparando tejidos enfermos, órganos enfermos o partes enfermas de los mismos . 3.1.- DEFINICIONES Como se emplea aqui, el término "bio-reactor" se refiere a un sistema ex vivo para propagar células, producir o expresar materiales biológicos y cultivar o hacer crecer tejidos celulares, organoides, virus, proteínas, polinucleótidos y microorganismos. Como se emplea aquí, el término "célula madre embriónica" se refiere a una célula derivada de la masa celular interna de un blastocistos (por ejemplo, un embrión humano de 4 a 5 días de edad) y que es pluripotente . Como se emplea aquí, el término "célula madre de tipo embriónico" se refiere a una célula que no es derivada de la masa celular interna de un blastocisto. Como se emplea aquí, una "célula madre de tipo embriónico" puede referirse a una "célula madre placental". Una célula madre de tipo embriónico es de preferencia pluripotente. Sin embargo, las células madres que pueden ser obtenidas a partir de la placenta incluyen células madres de tipo embriónico, células multipotentes, y células progenitoras dedicadas. De conformidad con los métodos de la presente invención, células madres de tipo embriónico derivadas de la placenta pueden ser recogidas de la placenta aislada una vez que ha sido desangrada y sometida a perfusión durante un periodo de tiempo suficiente para remover las células residuales . Como se emplea aquí, el término "desangrado" o "desangrada", cuando se utiliza con relación a la placenta, se refiere a la remoción y/o drenaje de sustancialmente la totalidad de la sangre de cordón umbilical de la placenta. De conformidad con la presente invención, el desangrado de la placenta puede lograrse por ejemplo, pero sin limitarse a estos casos, por drenaje, eflujo inducido por gravedad, masajes, bombeo, etc. En una modalidad preferida, el desangrado de la placenta puede lograrse además por perfusión, enjuague de la placenta con un fluido que puede o no contener agentes, como por ejemplo anticoagulantes, para ayudar al desangrado de la placenta. Como se emplea aqui, el término "perfusar" o "perfusión" se refiere al acto de vaciar o hacer pasar un fluido sobre un órgano o tejido o bien a través de un órgano o tejido, de preferencia el pasaje de un fluido a través de un órgano o tejido con fuerza suficiente o con presión adecuada para remover las células residuales como por ejemplo, células no fijadas a partir del órgano o tejido. Como se emplea aqui, el término "perfusado" se refiere al fluido recogido después de su pasaje a través de un órgano o tejido. En una modalidad preferida el perfusado contiene uno o varios anticoagulantes.

Como se emplea aquí, el término "célula exógena" se refiere a una célula "foránea", es decir, una célula heteróloga (es decir, una célula "no propia" derivada de una fuente otra que el donador placental) o bien una célula autóloga (es decir, una célula "propia" derivada del donador placental) , que se deriva de un órgano o tejido otro que la placenta. Como se emplea aqui, el término "organoide" se refiere a una agregación de uno o varios tipos de células ensamblados en apariencia superficial o en estructura real como cualquier órgano o glándula de un mamífero, de preferencia del cuerpo humano . Como se emplea aquí, el término "célula multipotente" se refiere a una célula que tiene la capacidad de crecer en cualquier subgrupo de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de mamífero. A diferencia de una célula pluripotente, una célula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos de células. Como se emplea aguí, el término "célula pluripotente" se refiere a una célula que tiene una versatilidad de diferenciación completa, es decir, la capacidad de crecer en cualquiera de los 260 tipos de células que contiene el cuerpo de un mamífero. Una célula pluripotente puede ser de auto-renovación, y puede permanecer dormida o quieta dentro de un tejido. A diferencia de una célula totipotente (por ejemplo, una célula de huevo diploide fertilizado) , una célula madre embriónica normalmente no puede formar un nuevo blastocistos . Como se emplea aqui, el término "célula progenitora" se refiere a una célula dedicada para diferenciarse en un tipo especifico de célula o para formar un tipo especifico de tejido. Como se emplea aqui, el término "célula madre" se refiere a una célula maestra que puede reproducirse de manera indefinida para formar las células especializadas de tejidos y órganos. Una célula madre es una célula con desarrollo pluripotente o multipotente . Una célula madre puede dividirse para producir dos células madres hijas, o bien una célula madre hija y una célula progenitora ("tránsito") , que prolifera después en células maduras, totalmente formadas del tejido . Como se emplea aqui, el término "célula totipotente" se refiere a una célula que puede formar un embrión completo (por ejemplo, un blastocisto) . 4.- BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una vista en corte transversal de la canulación de la vena y arteria de una placenta para perfusar la placenta y recoger después el perfusado. Las Figuras 2a-e son esquemas que muestran la recolección, sujeción, perfusión, recolección y almacenamiento de una placenta desangrada y sometida a perfusión. La Figura 3 es un esquema en corte transversal de una placenta perfusada en un dispositivo para su uso como bio-reactor . La Figura 4 es un esquema de selección para clasificar células, incluyendo células madres de tipo embriónico, recuperadas de una placenta sometida a perfusión. 5.- DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El solicitante ha descubierto de manera inesperada que la placenta, después del parto, contiene células quiescentes que pueden ser activadas si la placenta es procesada apropiadamente después del parto. Por ejemplo, después de la expulsión de la matriz, la placenta es desangrada lo más rápidamente posible para evitar o minimizar la apóptosis. Subsecuentemente, tan pronto como sea posible después del desangrado de la placenta, dicha placenta es sometida a perfusión para remover sangre, células residuales, proteínas, factores y otros materiales presentes en el órgano. Residuos de materiales pueden también ser removidos de la placenta. La perfusión prosigue normalmente con un perfusado apropiado durante por lo menos dos horas hasta más de veinticuatro horas. En modalidades adicionales, la placenta es sometida a perfusión durante por lo menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas. En otras palabras, esta invención se basa por lo menos en parte del descubrimiento que las células de una placenta post-parto pueden ser activadas por desangrado y perfusión durante un período suficiente de tiempo. Por consiguiente, la placenta puede ser fácilmente utilizada como una fuente rica y abundante de células madres de tipo embriónico, dichas células pueden ser utilizadas para investigación, incluyendo descubrimiento de fármacos, tratamiento y prevención de enfermedades, especialmente intervenciones quirúrgicas de tipo trasplante o terapias, y para la generación de células dedicadas, tejidos y organoides . Además, de manera sorprendente e inesperada, las células madres de placentales humanas producidas por la placenta desangrada, perfusada y/o cultivada son células madres pluripotentes que pueden ser fácilmente diferenciadas en cualquier tipo deseado de células. La presente invención se refiere a métodos para tratar y cultivar una placenta aislada para su uso como bio-reactor para la producción y propagación de células madres de tipo embriónico que se originan a partir de la placenta o bien a partir de fuentes exógenas. La presente invención se refiere también al uso de una placenta cultivada como bio-reactor para producir materiales biológicos, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, anticuerpos, hormonas, citocinas, factores de crecimiento y virus. La presente también se refiere a métodos para recoger y asilar las células madres y materiales biológicos a partir de una placenta cultivada. La presente invención de refiere a métodos para perfusar y desangrar una placenta aislada una vez que ha sido expulsada del útero para remover todas las células residuales. La invención se refiere además al cultivo de la placenta aislada y desangrada bajo condiciones apropiadas para permitir la producción y propagación de células madres de tipo embriónico . La presente invención ofrece un método para extraer y recuperar células madres de tipo embriónico, incluyendo sin limitarse a estos ejemplos, células madres pluripotentes o multipotentes, a partir de una placenta humana desangrada. Las células madres de tipo embriónico tienen características de las células madres embriónicas pero no se derivan del embrión. Tales células son tan versátiles (por ejemplo, pluripotentes) como las células madres embriónicas humanas. De conformidad con los métodos de la invención, la placenta humana es utilizada post-parto como la fuente de células madres de tipo embriónico. De conformidad con los métodos de la invención células madres de tipo embriónico son extraídas a partir de una placenta drenada a través de una técnica de perfusión que utiliza cualquiera de la arteria umbilical y vena umbilical o ambas. La placenta es de preferencia drenada por exsanguinación y recolección de sangre residual (por ejemplo, sangre de cordón umbilical residual; . La placenta drenada es después procesada de tal manera que se establezca un entorno de bio-reactor natural ex vivo en donde células madres de tipo embriónico dentro de la parénquima y el espacio extravascular son reclutadas . Las células madres de tipo embriónico migran en la microcirculación vacia, drenada en donde, de conformidad con los métodos de la invención, son recogidas, de preferencia por lavado en un recipiente de recolección por perfusión. 5.1. MÉTODOS PARA AISLAR Y CULTIVAR LA PLACENTA 5.1.1. Pre-Tratamiento de Placenta De conformidad con los métodos de la presente invención, una placenta humana es recuperada poco después de su expulsión después del parto, y en ciertas modalidades, la sangre de cordón umbilical en la placenta es recuperada. En ciertas modalidades, la placenta es sometida a un proceso de recuperación de sangre de cordón umbilical convencional. Dicha recuperación de sangre de cordón umbilical puede obtenerse comercialmente, por ejemplo, LifeBank Inc., Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry y Cryocell. La sangre de cordón umbilical puede ser drenada poco después de la expulsión de la placenta. Después del parto, la placenta es drenada de la sangre de cordón umbilical. La placenta almacenada puede encontrarse bajo condiciones estériles ya sea a temperatura ambiente o bien a una temperatura dentro de un rango de 5 a 25°C (centígrados) . La placenta puede almacenarse durante un periodo de más de cuarenta y ocho horas, y con mayor preferencia durante un periodo de cuatro a veinticuatro horas antes de la perfusión de la placenta para remover la sangre de cordón umbilical residual. Típicamente, una placenta es transportada desde la sala de parto a otra ubicación, por ejemplo, un laboratorio para la recuperación de la sangre de cordón umbilical y/o drenaje y perfusión. La placenta es transportada de preferencia en un dispositivo de transporte estéril, térmicamente aislado (manteniendo la temperatura de la placenta dentro de un rango de 20-28°C), por ejemplo, mediante la colocación de la placenta con cordón umbilical próximo sujetado, en una bolsa de plástico cerrada estéril, que se coloca después en un recipiente aislado, como se muestra en las Figuras 2a-e. De preferencia, la placenta es entregada al laboratorio de cuatro a veinticuatro horas después del parto. La placenta es recuperada de preferencia después de la expulsión bajo condiciones asépticas y almacenada en una solución anticoagulante a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados) . Soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, una solución de heparina o warfarina de sodio puede emplearse. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante comprende una solución de heparina (1% peso/peso en solución 1:1000) . La placenta drenada es de preferencia almacenada durante no más de 36 horas antes que las células madres de tipo embriónico sean recogidas. La solución que es utilizada para perfusar la placenta para remover las células residuales puede ser la misma solución utilizada para perfusar y cultivar la placenta para la recuperación de células madres . Cualquiera de estos perfusados pueden ser recogidos y utilizados como fuente de células madres de tipo embriónico. En ciertas modalidades, el cordón umbilical próximo es sujetado, de preferencia de 4 a 5 centímetros a partir de inserción en el disco placental antes de la recuperación de sangre de condón umbilical. En otras modalidades, El cordón umbilical próximo es sujetado después de la recuperación de sangre de cordón umbilical pero antes de procesamiento adicional de la placenta. Técnicas convencionales para la recolección de sangre de cordón umbilical pueden utilizarse. Típicamente, se utiliza una aguja o una cánula, con la ayuda de la gravedad, para drenar la sangre de cordón umbilical de la placenta (es decir, desangrar) (Óbice y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5, 192,553, expedida el día 9 de Marzo de 1993; Boyse y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5, 004, 681, expedida el día 2 de Abril de 1991; Anderson, Patente Norteamericana No. 5,372,581, titulada "Method and apparatus for placental blood collection" [Método y aparato para la recolección de sangre placental], expedida el día 13 de diciembre de 1994; Hessel y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5,415,665, titulada "Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method" [Dispositivo y método para sujetar, cortar, y recoger sangre de cordón umbilical] , expedida el día 16 de Mayo de 1995) . La aguja o la cánula es habitualmente colocada en la vena umbilical y la placenta es sometida a masaje para ayudar a drenar la sangre de cordón umbilical de la placenta. En una modalidad preferida, la placenta es recuperada de una paciente por consentimiento informado y se toma también una historia médica completa de la paciente antes, durante o después del embarazo y se asocia con la placenta. Estos registros médicos pueden ser utilizados para coordinar subsecuentemente el uso de la placenta o de las células madres cosechadas a partir de ella. Por ejemplo, las células madres placentales humanas pueden ser fácilmente utilizadas para medicina personalizada para el infante en cuestión, los padres, los hermanos u otros familiares. De hecho, las células madres placentales humanas son más versátiles que la sangre de cordón umbilical. Sin embargo, se observará, que la invención incluye la adición de células madres placentales humanas producidas por placenta de sangrado, perfusada y/o cultivada a la sangre de cordón umbilical de la misma placenta y cordón umbilical o de placenta y de- cordón umbilical diferentes. La sangre de cordón umbilical resultante tendrá una concentración incrementada/una población mayor de células madres humanas y por consiguiente es más útil para trasplante, por ejemplo, para trasplantes de médula ósea. 5.1.2. Desangrada de placenta y remoción de células residuales La invención ofrece un método para recuperar células madres o progenitoras, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, células madres de tipo embriónico, de una placenta que es desangrada, es decir, totalmente drenada de la sangre de cordón umbilical que permanece después del parto y/o un procedimiento de recuperación de sangre de cordón umbilical convencional. De conformidad con los métodos de la invención, la placenta es desangrada y sometida a perfusión con un fluido de perfusión acuoso adecuado, por ejemplo, un fluido isotónico acuoso en el cuál esta disuelto un anticoagulante (por ejemplo, heparina, arfari a sódica) . Dichos fluido isotónicos acuosos para perfusión son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una solución de cloruro de sodio 0.9 N. El fluido de perfusión comprende de preferencia el anticoagulante, por ejemplo, heparina o warfarina sódica, en una concentración suficiente para prevenir la formación de coágulos de sangre de cordón umbilical residual. En una modalidad específica, una concentración de 1 a 100 unidades de heparina se emplea, de preferencia una concentración de 1 a 10 unidades de heparina por mi. En una modalidad, inhibidores de apóptosis, por ejemplo, removedores de radicales libres, especialmente removedores de radicales libres de oxigeno, pueden emplearse durante e inmediatamente después del desangrado y entonces estos agentes pueden ser lavados de la placenta. De conformidad con esta modalidad de la invención la placenta aislada puede estar almacenada bajo condiciones hipotérmicas con el objeto de prevenir o inhibir la apóptosis. De conformidad con los métodos de la invención, la placenta es desangrada por pasaje del fluido de la perfusión a través de la arteria umbilical y de la vena umbilical o bien de ambas, utilizando un flujo por gravedad en la placenta. La placenta es de preferencia orientada (por ejemplo, suspendida) de tal manera que la arteria umbilical y la vena umbilical se encuentran en el punto más alto de la placenta. En una modalidad preferida, la arteria umbilical y la vena umbilical están conectadas simultáneamente, como se muestra en la figura 1, a una pipeta la cuál esta conectada a través de un conector flexible a una depósito del fluido de perfusión. El fluido de perfusión es pasado a través de la vena umbilical y de la arteria y recogido en un recipiente abierto adecuado a partir de la superficie de la placenta que estuvo unida al útero de la madre durante el embarazo. El fluido de perfusión puede también ser introducido a través de la abertura en el cordón umbilical y se permite su flujo o su perculación fuera de las aberturas en la pared de la placenta que comunica con la pared uterina materna. En una modalidad preferida, el cordón umbilical próximo es sujetado durante la perfusión y de manera más preferida, dicho cordón umbilical es sujetado dentro de 4-5 centímetros de la inserción del cordón umbilical en el disco placental. En una modalidad, se utiliza una cantidad suficiente de fluido de perfusión lo que resultará en la remoción de la totalidad de la sangre de cordón umbilical residual y la recolección subsecuente o recuperación de células placentales, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, células madres de tipo embriónico y células progenitoras, que permanecen en la placenta después de la remoción de la sangre de cordón umbilical. Se ha observado que cuando el fluido de perfusión es recogido primero de una placenta durante el proceso de desangrado, el fluido es coloreados con células sanguíneas rojas residuales de la sangre de cordón umbilical. El fluido de perfusión tiende a ser más claro conforme avanza la perfusión y conforme las células de sangre de cordón residual son lavadas fuera de la placenta. En general, de 30 a 100 mi (mililitros) de fluido de perfusión es una cantidad adecuada para desangrar la placenta y para recuperar la población inicial de células de tipo embriónico de la placenta, pero se puede utilizar una cantidad mayor o menor de fluido de perfusión según los resultados observados. 5.1.3. Cultivo de placenta Después de desangrado y cuando ha pasado un tiempo suficiente de perfusión de la placenta, las células madres de tipo embriónico son observadas raigrando en la microcirculación desangrada y perfusada de la placenta en donde, según los métodos de la invención, son recogidos. De preferencia, por lavado en un recipiente de recolección por perfusión. La perfusión de la placenta aislada no solamente sirve para remover la sangre de cordón umbilical residual sino también para proporcionar a la placenta los nutrientes apropiados, incluyendo oxigeno. La placenta puede ser cultivada y perfusada con una solución similar que se emplea para remover las células de sangre de cordón umbilical residual, de preferencia, sin adición de agentes anticoagulantes . En ciertas modalidades de la invención, la placenta drenada, desangrada es cultivada como un bioreactor, es decir, un sistema ex vivo para propagar células o para producir materiales biológicos. El número de células propagadas o el nivel de material biológico producido en el bioreactor placental es mantenido en un estado continuo de crecimiento equilibrado por remoción periódica o continua de una parte del medio de cultivo o fluido de perfusión que es introducido en el bioreactor placental, y a partir del cuál se pueden recuperar las células propagadas o los materiales biológicos producidos. Se en medio fresco o fluido de perfusión fresco al mismo régimen o en la misma cantidad. El número y tipo de células propagadas pueden ser monitoreados fácilmente mediante la medición de cambios en cuanto a la morfología y marcadores de superficie de células utilizando técnicas estándares de detección de células, por ejemplo citometría de flujo, clasificación de células, inmunocitoquímica (por ejemplo, tinción con anticuerpos específicos para marcadores celulares o específicos para tejidos), clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , clasificación de células activadas magnéticas (MACS) , por examen de la morfología de células utilizando microscopía de luz o confocal, o bien medición de cambios en la expresión génicas utilizando técnicas bien conocidas tales como reacción en cadena de polimerasa y perfil de expresión génica. En una modalidad, las células pueden ser clasificadas empleando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) . La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluyendo células, con base en las propiedades fluorescentes de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165) . La excitación láser de porciones fluorescentes en las partículas individuales resulta en una pequeña carga eléctrica que permite la separación electromagnética de partículas positivas y negativas de una mezcla. En una modalidad, anticuerpos específicos para marcadores de superficie de células o ligandos son etiquetados con etiquetas fluorescentes distintas. Las células son procesadas a través del clasificador de células, permitiendo la separación de las células con base en su capacidad para unir los anticuerpos utilizados. Partículas clasificadas por FACS pueden ser depositadas directamente en los pozos individuales de placas de 96 pozos o placas de 384 pozos para facilitar su separación clonación. En otra modalidad, perlas pueden ser utilizadas para separar las células. Las células pueden ser clasificadas empleando una técnica de clasificación de células activadas magnéticas (MACS) como un método para separar partículas con base en su capacidad de unirse a perlas magnéticas (diámetro 0.5-100 um) . Varias modificaciones útiles pueden ser efectuadas en las microesferas magnéticas, incluyendo la adición covalente de anticuerpos que reconoce específicamente una molécula de superficie de fase de célula o hapteno. Un campo magnético es aplicado después para manipular físicamente las perlas seleccionadas. Las perlas son después mezcladas con las células para permitir la unión. Las células son después pasadas a través de un campo magnético para separar las células que tienen marcadores de superficie celular. Estas células pueden ser después aisladas y mezcladas de nuevo con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de superficie de célula adicionales. Las células son después pasadas a través de un campo magnético, aislado las células que se unen a ambos anticuerpos. Tales células pueden ser diluidas en platos separados, por ejemplo platos de microtitulación para aislamiento clonal. En modalidades preferidas, la placenta a utilizar como bioreactor de desangrada y lavada bajo condiciones estériles de tal manera que se remueva cualquier contaminante celular no adherente y coagulado adentro. La placenta es después cultivada en condiciones asépticas en un recipiente u otro contenedor adecuado y sometida a perfusión con una solución de perfusión (por ejemplo, una solución salina normal, por ejemplo solución amortiguada con fosfato ("PBS") ) con o sin un anticoagulante, por ejemplo, heparina, warfarina sódica, coumarina, bishidroxicoumarina) , y/o con o sin un agente antimicrobiano (por ejemplo, ß-mercaptoetanol (0.1 mM) ; antibióticos, por ejemplo, estreptomicina (por ejemplo, a 40-100 µg/ml) , penicilina (por ejemplo, a 40 U/ml) , anfotericina B (por ejemplo, a 0.5 µg/ml) . El perfusado efluente comprende tanto perfusado circulado que ha fluido a través de la circulación placental, como el perfusado extravasado que exuda de las paredes de los bazos sanguíneos en los tejidos aledaños de la placenta o bien que pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos hacia los tejidos aledaños de la placenta. El perfusado efluente es recogido, y de preferencia se recogen tanto el perfusado circulado como el perfusado extravasado, de preferencia en receptáculo estéril. Alteraciones de las condiciones en las cuales se mantiene la placenta y de la naturaleza del perfusado pueden efectuarse para modular el volumen y la composición del perfusado efluente. Tipos de células son después aisladas del perfusado recogido mediante el empleo de técnicas conocidas por parte de los expertos en la materia, por ejemplo, pero sin limitarse a estos ejemplos, centrifugación por gradiente de densidad, separación magnética de células, citómetría de flujo, separación de células por afinidad o bien técnicas de adhesión diferencial. En una modalidad, una placenta es colocada en un recipiente estéril y lavada con 500 mi de solución salina normal amortiguada con fosfato. El fluido de lavado es después desechado. La vena umbilical es después canulada con una cánula, por ejemplo, una cánula de plástico o TEFLON®, la cuál esta conectada a un aparato de conexión estéril, por ejemplo tubo estéril. El aparato de conexión estéril está conectada a un múltiple de perfusión, como se muestra en las figura 3. El recipiente que contiene la placenta es después cubierto y la placenta es mantenida a temperatura ambiente (20-25° C) durante un período de tiempo deseado, de preferencia de 2 a 24 horas, y de preferencia no más que 48 horas. La placenta puede ser perfusada continuamente, con volúmenes iguales de perfusado introducidos y el perfusado efluente removido o recogido. Alternativamente, la placenta puede ser perfusada periódicamente, por ejemplo, cada 2 horas o bien las 4, 8, 12, y 24 horas, con un volumen de perfusado, por ejemplo, 100 mi de perfusado (solución salina normal estéril suplementado con o sin 1000 u/1 de heparina y/o EDTA y/o CADA (creatina fosfato dextrosa) ) . En el caso de perfusión periódica, se introducen y remueven volúmenes de preferencia iguales de perfusado del entorno de cultivo de la placenta de tal manera que un volumen estable de perfusado bañe la placenta todo el tiempo. El perfusado efluente que sale de la placenta, por ejemplo, en la superficie opuesta de la placenta, es recogido y procesado para aislar células madres de tipo embriónico, células progenitoras u otras células de interés. Se pueden emplear varios medios como fluido de perfusión para cultivar la placenta, por ejemplo, DMEM, F-12, MLA, RPMI, Fisher, Escore, COI y combinaciones de los mismos, suplementados con suero fetal bovino (FBS) , suero humano entero (CSS) , o bien suero de cordón umbilical humano recogido al momento del parto. El mismo fluido de perfusión utilizado para desangrar la placenta de sangre cordón residual puede ser utilizado para cultivar la placenta, sin adición de agentes anticoagulantes. En ciertas modalidades, las células madres de tipo embriónico son inducidas a propagarse en el bioreactor de placenta mediante la introducción de nutrientes, hormonas, vitaminas, factores de crecimiento o cualquier combinación de los mismos, en la solución de perfusión. Suero y otros factores de crecimiento pueden agregarse a la solución o medio de perfusión de propagación. Factores de crecimiento son habitualmente proteínas e incluyen, sin limitarse a estos: citocinas, linfocinas, interferones, factores de estimulación de colonias (CSFs) , interferones, quimiocinas, e interleucinas . Otros factores de crecimiento que pueden ser utilizados incluyen factores de crecimiento hematopoyéticos humanos recombinantes que incluyen ligandos, factores de células madres, trombopoyetina (Tpo) , factores de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento de fibroblasto básico, factor de crecimiento derivado de placenta asi como factor de crecimiento epidérmico. Los factores de crecimiento inducidos en la solución de perfusión pueden estimular la propagación de células madres de tipo embriónico no diferenciadas, células progenitoras dedicadas, o bien células diferenciales (por ejemplo, células hematopoyéticas diferenciadas) . Los factores de crecimiento pueden estimular la proporción de materiales biológicos y moléculas bioactivas incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, inmunoglobulinas , hormonas, enzimas o factores de crecimiento de conformidad con lo descrito previamente. En una modalidad de la invención, la placenta es utilizada como bioreactor para propagar células endógenas (es decir, células que se originan de la placenta) , incluyendo, pero sin limitarse a estos ejemplos, varios tipos de células madres de tipo embriónico pluripotentes y/o totipotentes y linfocitos. Para utilizar la placenta como bioreactor, puede ser cultivada durante varios periodos de tiempo bajo condiciones estériles mediante perfusión con solución de perfusado de conformidad con lo divulgado aquí. En modalidades especificas, la placenta es cultivada durante por lo menos 12, 24, 36 o 48 horas, o bien durante 3-5 días, 6-10 días, o bien durante una a dos semanas. En una modalidad preferida, la placenta es cultivada durante 48 horas. La placenta cultivada debe ser "alimentada"' periódicamente para remover el medio gastado, despoblar las células liberadas, y agregar medio fresco. La placenta cultivada debe almacenarse bajo condiciones estériles con el objeto de reducir la posibilidad de contaminación y mantenida bajo presión intermitente y periódica con el objeto de crear condiciones que mantienen un suministro adecuado de nutrientes hacia las células de la placenta. Se reconocerá que la perfusión y el cultivo de la placenta pueden efectuarse de manera automatizada y computarizada para eficiencia y capacidad incrementada. En otra modalidad, la placenta es procesada para remover la totalidad de las células proliferantes endógenas, por ejemplo, células madres de tipo em riónico, y para permitir la introducción y la propagación de células foráneas (es decir, exógenas) en el entorno de la placenta perfusada. La invención contempla una amplia gama de células madres o progenitoras que pueden ser cultivados en el bioreactor placental, incluyen, pero sin limitarse a estos ejemplos, células madres de tipo embriónico, células madres mesenquimatosas, células estromales, células endoteliales, hepatocitos, queratinocitos, y células madres o progenitoras de un tipo de célula particular, tejido u órgano incluyendo, pero sin limitarse a estos ejemplos, neuronas, mielina, músculo, sangre, médula ósea, piel, piel, corazón, tejido conectivo, pulmón, riñon, hígado, y páncreas (por ejemplo, células de isleta pancreáticas) . Fuentes de células madres mesenquimatosas incluyen médula ósea, saco vitelino embriónico, placenta, cordón umbilical, piel fetal y adolescente, y sangre. Las células de médula ósea pueden ser obtenidas a partir de la cresta iliaca, fémur, tibia, espina dorsal, costilla y otros espacios medulares .

Métodos para la destrucción, ablación o remoción selectiva de células proliferantes o de división rápida de un tejido u órgano son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, métodos para el tratamiento de cáncer o tumor. Por ejemplo, la placenta perfusada puede ser irradiada con radiación electromagnética, UV, rayos X, radiación gamma o beta con. el objeto de erradicar todas las células endógenas viables restantes. Las células foráneas a propagar son introducidas en el bioreactor placental irradiado, por ejemplo, por perfusión. 5.2. RECOLECCIÓN DE CÉLULAS A PARTIR DE LA PLACENTA De conformidad con lo divulgado arriba, después de la exsanguinación y perfusión de la placenta, las células madres de tipo embriónico migran en la microcirculación vacia, drenada, en donde, de conformidad con los métodos de la presente invención, son recogidos, de preferencia por recolección del perfusado efluente en un recipiente de recolección. En modalidades preferidas, las células cultivadas en la placenta son aisladas del perfusado efluente utilizando técnicas conocidas por parte de los expertos en la materia, por ejemplo, centrifugación por gradiente de densidad, separación magnética de células, citometria de flujo, u otros métodos de separación y clasificación de células bien conocidas en la técnica, y dichas células son clasificadas, por ejemplo, según el esquema presentado en la figura 4. En una modalidad especifica, las células recogidas de la placenta son recuperadas del perfusado efluente por centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, lo que permite la separación de las células de los residuos contaminantes y plaquetas. Las pellas de células son resuspendidas en un medio libre de suero IMDM que contiene 2U/ml de heparina y 2 mM de EDTA (Gibco BRL, NY) . La fracción de células raononucleares totales fue aislada empleando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de conformidad con el procedimiento recomendado por el fabricante y la fracción de células mononucleares fue resuspendida. Las células fueron contadas empleando un hemocitómetro . La viabilidad fue valuada por exclusión de azul tripano. El aislamiento de las células se logra mediante la "tripsinización diferencial", empleando una solución de tripsina al 0.05% con EDTA al 0.2% (Sigma, St . Louis MO) . Una tripsinización diferencial fue posible puesto que las células de fibroblastoides se desprendieron de la superficie de plástico dentro de un periodo de aproximadamente 5 minutos mientras que las demás poblaciones adherentes requirieron de una incubación de más de 20-30 minutos. Las células de fibroblastoides desprendidas fueron cosechadas después de la tripsinización y neutralización de tripsina, utilizando una solución neutralizante de tripsina (TNS, Bio Whittaker) . Las células fueron lavadas en H.DMEM y resuspendidas en MSCGM. En otra modalidad, la placenta aislada es perfusada durante un periodo de tiempo sin recolección de perfusado de tal manera que la placenta puede ser perfusado durante 2, 4, 6, 8, 10, 12, 20 y 24 horas o hasta siete días antes de la recolección del perfusado. En otra modalidad, células cultivadas en el bioreactor de placenta son aislados de la placenta por disección física de las células fuera de la placenta. En otra modalidad, las células cultivadas en el bioreactor de placenta son aisladas a partir de la placenta mediante la disociación de los tejidos de la placenta o una porción de los mismos, y mediante la recuperación de las células cultivadas por métodos conocidos en la técnica de separación o clasificación de células, por ejemplo, centrifugación por gradiente de densidad, separación magnética de células, citometría de flujo, etc. En una modalidad preferida, la perfusión de la placenta y la recolección del perfusado efluente se repiten una o dos veces durante el cultivo de la placenta hasta que el número de células nucleadas recuperadas se encuentre por debajo de 100 células/ml. Los perfusados son combinados y sometidos a centrifugación ligera para remover plaquetas, residuos y membranas de células desnucleadas . Las células nucleadas son entonces aisladas por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y después de lavado, resuspendidas en H.DMEM. Para aislar las células adherentes, se colocan alícuotas de 5-10 x 10ó células en cada uno de varios frascos T-75 y las células son cultivadas con un medio de cultivo de células madres mesenquimatosas comercialmente disponible (MSCGM) obtenidas de BioW ittaker, y colocadas en un incubador de cultivo tisular (37° C, 5% C02) . Después de 10 a 15 días, las células no adherentes son removidas de los frascos por lavado con PBS. El PBS es después reemplazado por MSCGM. Los frascos son examinados de preferencia diariamente para determinar la presencia de varios tipos de células adherentes y en particular para identificar y expandir grupos de células de fibroblastoides . En otras modalidades, las células recogidas de la placenta son crioconservadas para su uso posterior. Métodos de crioconservación de células, tales como células madres, son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, la crioconservación utilizando los métodos de Boyse y colaboradores (Patente Norteamericana No. 5,192,553, expedida el día 9 de Marzo de 1993) o bien Hu y colaboradores (WO 00/73421, publicada el día 7 de Diciembre de 2000) . 5.3 POBLACIONES DE CÉLULAS OBTENIDAS DE LA PLACENTA O CULTIVADAS EN LA PLACENTA Células madres de tipo embriónico obtenidas de conformidad con lo métodos de la invención pueden incluir células pluripotentes, es decir, células que tienen una versatilidad de diferenciación completa, que son de autorenovación, y pueden permanecer durmientes o quiescentes dentro del tejido. Las células madres que pueden ser obtenidas a partir de la placenta incluyen células madres de tipo embriónico, células pluripotentes, células progenitoras dedicadas, y células de fibroblastoides . La primera recolección de sangre de la placenta se conoce como sangre de cordón umbilical que contiene predominantemente células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y CD38+. Dentro de las primeras 24 horas de perfusión posparto, se pueden aislar de la placenta altas concentraciones de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y CD38-, junto con altas concentraciones de células progenitoras hematopoyéticas CD34- y CD38+. Después de aproximadamente 24 horas de perfusión, se pueden aislar concentraciones altas de células CD34- y CD38- de la placenta junto con las células mencionadas arriba. La placenta perfusada aislada de la presente invención ofrece una fuente de grandes cantidades de células madres enriquecidas por células madres CD34+ y CD38-y células madres CD34- y CD38+. La placenta aislada que ha sido sometida a perfusión durante veinticuatro horas o más ofrece una fuente de grandes cantidades de células madres enriquecidas en cuanto a células madres CD34- y CD38-. En una modalidad preferida, células madres de tipo embriónico obtenidas por los métodos de la presente invención son células madres viables, quiescentes, pluripotentes, que existen dentro de la placenta humana madura y que pueden recuperarse después de un parto exitoso y expulsión de placenta, lo que resulta en la recuperación de hasta un billón de células nucleadas que proporcionan de 50-100 millones de células madres multipotentes y pluripotentes. Las células madres placentales humanas ofrecidas por la placenta son sorprendentemente de tipo embriónico, por ejemplo, la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular ha sido identificado para estas células: SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+ . De preferencia, las células madre de tipo embriónico de la presente invención se caracterizan por la presencia de marcadores de superficie de células OCT-4+ y ABC-p+ . Asi, la invención abarca células madres que no han sido aisladas ni obtenidas de otra forma de una fuente embriónica sino que pueden ser identificadas a través de los marcadores siguiente: SSAE3-, SSAE4-, OCT-4+ y ABC-p+. En una modalidad, las células madres placentales humana no expresan antigeno MHC clase 2. Las células madres aisladas de la placenta son homogéneas y estériles. Además, las células madres son fácilmente obtenidas en una forma adecuada para su administración a los seres humanos, es decir, son de grado farmacéutico. Las células madres de tipo embriónico preferidas obtenidas por los métodos de la invención pueden ser identificados por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: 0CA-4+ y ABC-pt. Además, la invención abarca células madres embriónicas que tienen los marcadores siguientes : CD10+, CD38-, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, 0CT-4+ y ABC-P+ . Tales marcadores de superficie celular son determinados rutinariamente según métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por citometria de flujo, seguido por lavado y tinción con antimarcador de superficie celular. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD-34 o CD-38, células pueden ser lavadas en PBS y después teñidas doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluoresceina anti-CD38 (Becton Dickinson, ountain, Vie , CD) . En otra modalidad, células cultivadas en el bioreactor de placenta son identificadas y caracterizadas por un ensayo de unidad de formación de colonias, que se conoce comúnmente en la técnica, por ejemplo medio Mesen Cult™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, Columbia Británica). Las células madres de tipo embriónico obtenidas por los métodos de la invención pueden ser inducidas a la diferenciación a lo largo de linajes celulares específicos, incluyendo adipogénicos, condrogénicos, osteogénicos , hematopoyéticos , miogénicos, vasogénicos, neurogénicos, y hepatogénicos . En ciertas modalidades, células madres de tipo embriónico obtenidas de conformidad con los métodos de la invención son inducidas a la diferenciación para su uso en trasplante y protocolos de tratamiento ex vivo. En ciertas modalidades, células madres de tipo embriónico obtenidas por métodos de la invención son inducidas a la diferenciación en un tipo particular de células y manipuladas genéticamente para proporcionar un producto génico terapéutico. En una modalidad especifica, células madres de tipo embriónico obtenidas por los métodos de la invención son incubadas con un compuesto in vitro que induce a diferenciación, seguido por trasplante directo de las células diferenciales a un sujeto. Asi, la invención abarca métodos para diferenciar las células madres placentales humanas empleando medio de cultivo estándares. Además, la invención abarca células hematopoyéticas , células neuronales, células de fibroblasto, células de filamento, células mesenguimatosas asi como células hepáticas. Células madre de tipo embriónico pueden también ser cultivadas adicionalmente después de la recolección de la placenta utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante cultivo en células alimentadoras, por ejemplo fibroblastos irradiados que se obtienen de la misma placenta que las células madres de tipo embriónico o bien de otras fuentes humanas o no humanas, o bien en medios acondicionados obtenidos de cultivos de tales células alimentadoras con el objeto de obtener cultivos continuos de largo plazo de células madre de tipo embriónico. Las células madres de tipo embriónico pueden también ser expandidas, ya sea dentro de la placenta antes de la recolección a partir del bioreactor placental o bien in vítro después de la recuperación a partir de la placenta. En ciertas modalidades, las células madres de tipo embriónico a expandir son expuestas a un agente que suprime la diferenciación celular o bien son cultivadas en presencia de un agente que suprime la diferenciación celular. Tales agentes son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, polipéptidos Delta-1 de ser humano y Serrate-1 de ser humano (Véase Sakano y colaboradores, Patente Norteamericana No. 6,337,387 titulada "Differentiation-suppresive polypeptide" [Polipéptido de supresión por diferenciación] , expedida el dia 8 de Enero de 2002), factor inhibidor de leucemia (LIF) y factor de células madres. Métodos para la expansión de poblaciones celulares son también conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Emerson y colaboradores, Patente Norteamericana No. 6,326,198 titulada "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cell, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells" [Métodos y composiciones para la replicación ex vivo de células madres, para la optimización de cultivo de células progenitoras hematopoyéticas, y para incrementar el metabolismo, secreción de GM-CSF y/o secreción de IL-6 de células estromales humana], expedida el dia 4 de Diciembre del 2001; Kraus y colaboradores, Patente Norteamericana No. 6,338,942, titulada "Selecti e expansión of target cell populations" [Expansión selectiva de poblaciones celulares blanco] , expedida el dia 15 de Enero de 2002) . Las células madres de tipo embriónico pueden ser evaluadas en cuanto a su viabilidad, potencial de proliferación, y longevidad utilizando técnicas estándares conocidas, por ejemplo, ensayos de exclusión de azul tripano, ensayo de absorción de diacetato de fluoresceina, ensayo de absorción de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad) ; asi como ensayo de absorción de timidina, ensaye de proliferación de células MTT (para evaluar la proliferación). La' longevidad puede ser determinada por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la determinación del número máximo de duplicación de población en un cultivo extendido.

En ciertas modalidades, la diferenciación de células madres o células progenitoras cultivadas en la placenta desangrada, perfusada y/o cultivada es modulada empleando un agente o composiciones farmacéuticas que comprenden una dosis y/o varias dosis efectivas a través de una administración única o de administraciones múltiples, para ejercer un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciación de una célula recogida de la placenta. Agentes que pueden inducir la diferenciación de células madres o progenitoras son bien conocidas en la técnica, e incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, Ca2÷, EGF, aFGF, bFGF, PDGF, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , TGF-ß, citocinas (por ejemplo, IL-la, IL-?ß, lFN-?, TEN), ácido retinoico, transferina, hormonas (por ejemplo, andrógeno, estrógeno, insulina, prolactina, triyodotironina, hidrocortisona, dexametasona) , butirato sódico, TPA, DMSO, MF, DMF, elementos de matriz (por ejemplo, colágena, laminina, sulfato de heparina, Matrigel™) , o combinaciones de los mismos. Agentes que suprimen la diferenciación celular son también bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, polipéptidos Delta-1 de ser humano y Serrate-1 de ser humano (véase, Sakano y colaboradores, Patente Norteamericana No. 6,337,387 titulada "Differentiation-suppressive polypeptide" [Polipéptido de diferenciación-supresión] , expedida el dia 8 de enero de 2002) , factor inhibidor de leucemia (LIF) , asi como factor de células madres . El agente utilizado para modular la diferenciación puede ser introducido en el bio-reactor placental para inducir la diferenciación de las células cultivadas en la placenta. Alternativamente, el agente puede ser utilizado para modular la diferenciación in vitro después de la recolección o remoción de las células a partir de la placenta. La determinación que una célula madre se ha diferenciado en un tipo particular de células puede lograrse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo cambios en cuanto a morfología y marcadores de superficie celular empleando técnicas tales como citometría de flujo o inmunocitoquímica (por ejemplo, tinción de células con anticuerpos específicos para tejidos o específicos para marcadores celulares), por examen de la morfología de células utilizando microscopía de luz o confocal, o bien mediante la medición de cambios en técnicas que utilizan la expresión génica bien conocidas, como por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa y determinación de perfil de expresión génica. En otra modalidad, las células cultivadas en la placenta son estimuladas para producir moléculas bio-activas como por ejemplo, inmunoglobulinas, hormonas, enzimas. En otra modalidad, las células cultivadas en la placenta son estimuladas para proliferar como por ejemplo, por administración de eritropoyetina, citocinas, linfocinas, interferonas, factores de estimulación de colonias (CSF's), interferonas, quimiocinas, interleucinas, factores de crecimiento hematopoyéticos humanos recombinantes, incluyendo ligandos, factores de células madres. Trombopoyetina (Tpo) , interleucinas, asi como factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento. En otra modalidad, células cultivadas en la placenta son manipuladas genéticamente ya sea antes de la recolección o bien después de la recolección a partir de la placenta, empleando, por ejemplo, un vector viral como por ejemplo, un vector adenoviral o retroviral, o bien mediante la utilización de medios mecánicos tales como absorción mediada por Ixposomas o química del ADN. Un vector que contiene un transgen puede ser introducido en una célula de interés por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, transformación, transducción, electroporación, infección, microinyección, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación de fosfato de calcio, Ixposomas, LIPOFECTIN™, fusión de lisosoma, lípidos catiónicos sintéticos, uso de una pistola génica o de un transportador de vector de ADN, de tal manera que el transgen sea transmitido a las células hijas, por ejemplo, las células madres de tipo embriónico hijas o células progenitoras producidas por la división de una célula madre de tipo embriónico. Para varias técnicas para la transformación o transfección de células de mamífero, véase Keown y colaboradores, 1990, Met ods Enzymol . 185:527-37; Sambrook y colaboradores, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación Molecular, Un Manual de Laboratorio] , Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. De preferencia, el transgen es introducido empleando cualquier técnica en la medida en que no destruye la membrana nuclear de la célula ni otras estructuras celulares genéticas existentes. En ciertas modalidades, el transgen es insertado en el material genético nucleico por microinyección. La microinyección de células y estructuras celulares se conocen comúnmente y es practicada en la técnica. Para transfección estable de células de mamífero cultivadas, como por ejemplo cultivo de células en una placenta, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. La eficiencia de integración depende del vector y de la técnica de transfección que se utiliza. Con el objeto de identificar y seleccionar integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable, (por ejemplo, para resistencia a los antibióticos) es generalmente introducido en la célula madre de tipo embriónico huésped junto con la secuencia de gen de interés. Marcadores seleccionados preferidos incluyen los que proporcionan resistencia a los fármacos como por ejemplo, G413, hidromicina y metotrexato. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por selección farmacológica (por ejemplo, células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán mientras que las demás morirán) . Tales métodos son especialmente útiles en el caso de métodos que incluyen la recombinación homologa en células de mamíferos (por ejemplo, en células madres de tipo embriónico) antes de la introducción o transplante de las células recombinantes en un sujeto o paciente. Varios sistemas de selección pueden ser utilizados para seleccionar células de tipo embriónico huéspedes transformadas. En particular, el vector puede contener ciertos marcadores detectables o seleccionables . Otros métodos de selección incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, la selección de, otro marcador como por ejemplo: el gen de timidina quinasa de virus de herpes simple (Wigler y colaboradores, 1977, Cell 11:223), el gen de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026), y el gen de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y colaboradores, 1980, Cell 22:817) pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Asimismo, una resistencia antimetabolito puede ser utilizada como la base de selección para los genes siguientes: dhfr, que proporciona resistencia al metotrexato (Wigler y colaboradores, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que ofrece resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 78:2072); neo, que proporciona resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin y colaboradores, 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e hygro, que proporciona resistencia a higromicina (Santerre y colaboradores, 1984, Gene 30:147). El transgen puede integrarse en el genoma de al célula de interés, de preferencia por integración aleatoria. En otras modalidades, el transgen puede ser integrar por un método dirigido, por ejemplo, por recombinación homologa dirigida (es decir, "introducción" o "desactivación" de un gen de interés en el genoma de una célula de interés) , Chappel, Patente Norteamericana No. 5,272,071; y publicación PCT No. WO 91/06667, publicada el dia 16 de mayo de 1991; Patente Norteamericana No. 5,464,764; Capecchi y colaboradores, expedida el dia 7 de noviembre de 1995; Patente Norteamericana No. 5,627,059, Capecchi y colaboradores, expedida el dia 6 de mayo de 1997; Patente Norteamericana No. 5,487,992, Capecchi y colaboradores, expedida el dia 30 de enero de 1996) . Métodos para generar células que tienen modificaciones génicas enfocadas a través de recombinación homologa son conocidas en la técnica. El constructo comprende por lo menos una porción de un gen de interés con una modificación genética deseada e incluye a regiones de homología con el locus blanco, es decir, la copia endógena del gen enfocado en el genoma del huésped. Constructos de ADN para integración aleatoria, en contraste con los utilizados para recombinación homologa no tienen que incluir regiones de homología para mediar la recombinación. Se pueden incluir marcadores en el constructo de enfoque o constructo aleatorio para efectuar una selección positiva y negativa para inserción del transgen. Para crear una célula recombinante homologa, por ejemplo, una célula madre de tipo embriónico recombinante homologa, una célula placental endógena o una célula exógena cultivada en la placenta, un vector de recombinación homologa se prepara en donde un gen de interés se encuentra flanqueado en sus extremos 5' y 3' por secuencias génicas que son endógenas para el genoma de la célula enfocada, con el objeto de permitir la recombinación homologa entre el gen de interés portado por el vector y el gen endógeno en el genoma de la célula enfocada. Las secuencias de adicionales de ácido nucleico de flanco tienen una longitud suficiente para una recombinación homologa exitosa con el gen endógeno en el genoma de la célula enfocada. Típicamente, se incluyen en el vector varios kilobases de ADN de flanco (tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' ) . Métodos para construir vectores de recombinación homologa así como animales recombinantes homólogos a partir de células madres recombinantes son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51: 503; Bradley, 1991, Curr. Opin.

Bio/Technol. 2: 823-29; y Publicaciones PCT Nos. WO 90/11354, WO 91/01140 y WO 93/04169) . En una modalidad, el genoma de la célula exógena cultivada en la placenta de conformidad con los métodos de la invención es un objetivo de enfoque génico a través de recombinación homologa o bien a través de integración aleatoria. En una modalidad especifica, los métodos de Bonadio y colaboradores (Patente Norteamericana No. 5,942,496, titulada "Methods and compositions for múltiple gene transfer into bone cells" [Métodos y composiciones para transferencia de genes múltiples en células óseas] , expedida el día 24 de agosto de 1999; y PCT W095/22611, titulada "Methods and compositions for simulating bone cells" [Métodos y composiciones para estimular células óseas] , publicada el dia 24 de agosto de 1995) se utilizan para introducir ácidos nucleicos en una célula de interés, como por ejemplo una célula madre, célula progenitora, o célula exógena cultivada en la placenta, por ejemplo, células progenitoras óseas. 5.4- USOS DE PLACENTA CULTIVADA COMO BIO-REACTOR Células placentales desangradas y/o cultivadas pueden ser utilizadas como bio-reactor para el cultivo de células, tejidos y órganos. El mesodermo placental proporciona un entorno estromal ideal, incluyendo abundancia de moléculas pequeñas y factores de crecimiento, lipopolisacáridos, y proteínas de matriz extracelulares, que son necesarios para la organogénesis y la neogénesis tisular. En una modalidad, la invención ofrece un método para utilizar la placenta perfusada aislada como bio-reactor para la propagación de células exógenas . De conformidad con esta modalidad, la invención se refiere a una placenta aislada que contiene una célula no derivada de la placenta, en donde el injerto de dicha célula en la placenta puede estimular la placenta para que produzca células madres de tipo embriónico, o bien en donde la célula injertada produce señales como por ejemplo citocinas y factores de crecimiento, que pueden estimular la placenta para que produzca células madres. La placenta puede ser injertada con células no placentales en origen obtenidas de los padres, hermanos u otros familiares consanguíneos del infante asociado con la placenta. En otra modalidad, la placenta asilada puede ser injertada con células que no son placentales en cuanto a su origen, obtenidas a partir de un individuo que no es el infante, ni está relacionado con el infante. De la misma manera, las células, tejidos, organoides y órganos que son propagados y cultivados en la placenta pueden ser transplantados al infante asociado con la placenta, padres, hermanos u otros familiares consanguíneos de dicho infante o en un individuo no relacionado con el infante. En una modalidad de la presente invención, la placenta puede ser poblada por cualquier tipo particular de células y utilizada como bio-reactor para el cultivo ex vivo de células u órganos. Tales cultivos de células, tejidos u órganos pueden ser cosechados empleando protocolos de tratamiento ex vivo o transplante. En esta modalidad, la placenta es procesada para remover la totalidad de las células endógenas y para permitir la introducción y propagación de células foráneas (es decir, exógenas) en el entorno de la placenta perfusada. Métodos para la remoción de las células endógenas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la placenta perfusada es irradiada con radiaciones electromagnéticas, UV, rayos X, rayos gamma o beta para erradicar todas las células endógenas viables restantes. En una modalidad, una exposición sub-letal a radiaciones, por ejemplo, de 500 a 1500 CGy puede emplearse para conservar la placenta pero erradicar las células indeseadas . Para datos internacionales sobre radiaciones ionizantes letales vs . no letales, véase, Capitulo 5 "Biophysical and Biological Effects of Ionizing Radiation" [Efectos Biofisicos y Biológicos de las Radiaciones Ionizantes] del Departamento de Defensa de los Estados Unidos de América. Las células foráneas de interés para su propagación en el bio-reactor placental irradiado son introducidas después, por ejemplo, por perfusión vascular o bien inyección intra-parenquimatosa directa. En otra modalidad, el bio-reactor puede ser utilizado para producir y propagar órganos, tejidos o células quiméricas novedosos. Tales quimeras pueden ser creadas empleando células placentales y uno o varios tipos de células adicionales como materiales iniciales en el bio-reactor. La interacción, o bien "reacción cruzada" entre los diferentes tipos de células puede inducir patrones de expresión distintos de cualquiera de los tipos de células iniciales. En una modalidad, por ejemplo, una quimera autóloga es generada mediante la propagación de células placentales autólogas de paciente en un bio-reactor con otro tipo de células derivado del mismo paciente. En otra modalidad, por ejemplo, una quimera heteróloga puede ser generada por adición de células de paciente, es decir, células sanguíneas, a un bio-reactor que tiene células placentales heterólogas. En otra modalidad, células placentales pueden ser derivadas de un paciente, y un segundo tipo de células de un segundo paciente. Células quiméricas son después recuperadas las cuales tienen una característica fenotípica y/o genética diferente de cualquiera de las células iniciales. En una modalidad específica, las células heterólogas son del mismo haplotipo, y las células quiméricas son re-introducidas en el paciente. En otras modalidades, el bio-reactor puede ser utilizado para un crecimiento incrementado de un tipo particular de célula, ya sea de origen nativo o sintético, o bien para la producción de un producto específico de tipos celulares . Por ejemplo, en una modalidad, el bio-reactor placental puede ser utilizado para estimular las células de isletas pancreática para que produzcan insulina. El bio-reactor es especialmente provechoso para la producción de proteínas de mamífero terapéuticas cuya eficacia terapéutica puede depender de una modificación post-traducción apropiada. Así, el bio-reactor es útil para la producción de proteínas terapéuticas, factores de crecimiento, citocinas y otras moléculas terapéuticas naturales o recombinantes, como por ejemplo eritropoyetina, interleucinas, e interferones, pero sin limitarse a estas moléculas. En otra modalidad, el bio-reactor puede ser utilizado para propagar células manipuladas genéticamente para proporcionar un producto de gen terapéutico, y empleadas para producción a gran escala de producto recombinante . En una modalidad, por ejemplo, el reactor puede ser utilizado para incrementar la producción de anticuerpos. La placenta puede ser poblada con células productoras de anticuerpos, como por ejemplo hibridomas, que producen anticuerpos monoclonales específicos, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular. Los hibridomas pueden ser obtenidos por cualquier técnica, incluyendo, pero sin limitarse a estas técnicas, la técnica de ibridoma de Kohler y Milstein (1975), Nature 256, 495-497; y Patente Norteamericana No. 4,376,110), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor y colaboradores, 1983, Immunology Today 4, 72; Colé y colaboradores, 1983, Proc. Nati, Acad. Sci. USA 80, 2026-2030), y la técnica de EBV hibridoma (Colé y colaboradores, 1985, "Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy" [Anticuerpos Monoclonales Y Terapia Contra el Cáncer] , Alan R. Liss, Inc. páginas 77-96) . Hibridoraas que producen inAb pueden ser cultivados en el bio-reactor para que produzcan altos títulos de mAbs. De manera alternativa, cuando un antígeno es desconocido, el bio-reactor puede ser utilizado para generar anticuerpos específicos para un tipo de particular de células, que puede ser utilizado después para identificar el antígeno desconocido. Por ejemplo, anticuerpos pueden ser generados contra un antígeno específico para tumor desconocido en un paciente con cáncer mediante el cultivo de una muestra de sangre entera a partir de un paciente con cáncer, expandiendo las células en un bio-reactor, y después tamizando los anticuerpos que reaccionan específicamente contra anticuerpos que reaccionan específicamente contra células de tumor del paciente . En otra modalidad, el bio-reactor puede ser utilizado para producir virus en cultivo y para tamizar agentes antivirales en cultivo. Este método es especialmente interesante para el caso de los virus, como por ejemplo parvovirus y virus de inmunodeficiencia humana, que son difíciles de propagar en condiciones de cultivo celular.

El bio-reactor puede también ser utilizado como soporte para tamizar moléculas terapéuticas que modulan la actividad de un tipo particular de células, como por ejemplo la actividad de expresión de un producto génico de interés o la activación de una via de transducción de señales. En esta modalidad, un tipo de célula de interés puede ser cultivado y expandido en el bio-reactor. La célula puede ser una célula que ocurre naturalmente, o bien una célula manipulada para expresar un producto de gen recombinante . El bio-reactor es después puesto en contacto con unas moléculas terapéuticas candidatas, como por ejemplo moléculas pequeñas, no péptidos, anticuerpos, etc., o bien bibliotecas de tales moléculas terapéuticas candidatas. Las células son después analizadas para determinar la presencia de un cambio en una actividad deseada en presencia o ausencia de la molécula terapéutica candidata. Por ejemplo, dicha actividad deseada puede ser un incremento o una disminución de la tasa de crecimiento, y cambio en la expresión génica, o bien un cambio en la unión o absorción de la molécula terapéutica candidata. Varios tipos de métodos son probablemente particularmente convenientes y/o útiles para agentes de prueba de tamizado. Estos métodos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, métodos que miden la unión de un compuesto, métodos que miden un cambio en la capacidad de las células de interactuar con un anticuerpo o ligando, y métodos que miden la actividad o expresión de proteína "reportera", es decir, una enzima u otra proteína detectable o seleccionable que ha sido colocada bajo el control de una región de control de interés. Así, en una modalidad preferida, tanto compuestos que ocurren naturalmente como compuestos sintéticos "por ejemplo, bibliotecas de pequeñas moléculas o péptidos) pueden ser tamizados por actividad terapéutica. Los ensayos de tamizado pueden ser utilizados para identificar compuestos y composiciones incluyendo péptidos y moléculas orgánicas que no son proteínas que modulan una actividad específica para un tipo de células. Compuestos recombinantes, sintéticos y por otra parte exógenos pueden tener una capacidad de unión y, por consiguiente pueden ser candidatos para agentes farmacéuticos. Alternativamente, las proteínas y compuestos incluyen componentes celulares endógenos que interactúan con los genes identificados de las proteínas in vivo. Tales componentes endógenos pueden proporcionar nuevos blancos para intervenciones farmacéuticas y terapéuticas . En otra modalidad de la invención, la placenta es utilizada como un bioreactor para la propagación de células endógenas (es decir, células que se originan a partir de la placenta) , incluyendo, pero sin limitarse a estos ejemplos, varios tipos de células madres de tipo embriónico pluripotentes y/o totipotentes y linfocitos . En una modalidad, la placenta es incubada durante varios períodos de tiempo con una solución de perfusado de conformidad con lo divulgado aquí. Tales células endógenas de origen placental pueden ser transformadas para expresar de manera recombinante un gen de interés, para expresar mutaciones, y/o pueden ser manipuladas para borrar un locus genético, empleando una tecnología de "knock out". Por ejemplo, un gen blanco endógeno puede ser borrado por desactivación o "knocking out" del gen blanco o su promotor utilizando recombinación homologa enfocada (por ejemplo, véase Smithies y colaboradores, 1985, Nature 317, 230-234; Thomas & Capecc i, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson y colaboradores, 1989, Cell 5, 313-321; que se incorporan aquí por referencia en su totalidad). Por ejemplo, un gen blanco mutante, no funcional (o bien una secuencia de ADN totalmente no relacionada) flanqueado por ADN homólogo al gen blanco endógeno (ya sea las regiones codificadoras o las regiones reguladoras del gen blanco) puede emplearse, con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar células que expresan el gen blanco in vivo. La inserción del constructo de ADN, a través de una recombinación homologa enfocada, resulta en la desactivación del gen blanco. Tales enfoques pueden ser utilizados para remover, reemplazar o alterar la expresión génica de interés en células, tejido, y/u órganos. Este enfoque puede ser utilizado para alterar el genotipo de una célula, tejido u órgano, que puede ser introducido en un sujeto humano.

En otra modalidad, una célula de placenta puede ser inducida a diferenciarse en un tipo de célula particular, ya sea in vivo o ex vivo, por ejemplo, células madres de tipo em riónico pluripotentes pueden ser inyectadas en un órgano dañado, y para neogénesis de órgano y reparación de lesión in vivo. Dicha lesión puede deberse a tales condiciones y trastornos que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, infarto del miocardio, trastorno de ataques, esclerosis múltiple, apoplejía, hipotensión, paro cardiaco, isquemia, inflamación, perdida de la función cognoscitiva relacionada con la edad, daño por radiación, parálisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Leigh, demencia por SIDA, perdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad renal isquémica, trauma cerebral o de la médula espinal, desvío corazón-pulmón, glaucoma, isquemia retinal, o bien trauma retinal. Las células madres de tipo embriónico aisladas de la placenta pueden utilizarse, en modalidades específicas, en una terapia de reemplazo de enzima autóloga o heteróloga para tratar condiciones o enfermedades específicas incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, enfermedades de almacenamiento lisosomal, por ejemplo, síndromes de Tay-Sachs, Niemitían-Pick, Fabry, Gaucher, Hunter, y Hurler, así como otras gangliosidosis, mucopolisacaridosis , y glicogenesis .

En otras modalidades, las células pueden ser utilizadas como ve iculo transgen autólogo o heterólogo en terapia génica para corregir errores innatos del metabolismo, adrenoleucodistrofia, fibrosis cística, enfermedad de almacenamiento de glicógeno, hipotiroidismo, anemia de células calciform.es, síndrome Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria (PKÜ) , porfirias, enfermedad de urina de jarabe de maple, homocistinuria, mucoplisacárido nosis, enfermedad granulomatosa crónica y tirosinemia así como enfermedad de Tay/Sachs o bien para tratar cáncer, tumores u otras condiciones patológicas . En otra modalidad, las células pueden ser utilizadas en la terapia de regeneración y reemplazo de tejido autólogo y heterólogo o bien protocolos que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, el tratamiento de defectos epiteliales de la cornea, reparación de cartílago, dermabrasion facial, membranas mucosales, membranas timpánicas, forros intestinales, estructuras neurológicas (por ejemplo, retina, retina, neuronas auditorias en membrana basilar, neuronas olfactorias en eptitelio olfactorio) , reparación de quemaduras y heridas para lesiones traumáticas de la piel, o bien para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos. Los grandes números de células madre e tipo embriónico y/o células progenitoras que se obtienen utilizando los métodos de la invención, podría reducir, en ciertas modalidades, la necesidad de granes donaciones de médula ósea. Aproximadamente 1 x 10H a 2 x 108 células mononucleares por kilogramo de peso de paciente deben infusarse para injerto en un trasplante de médula ósea (es decir, aproximadamente 70 mi de médula en el caso de un donador de 70 kg) . Para obtener 70 mi se requiere de una duración intensa y una perdida significativa de sangre en el proceso de donación. En una modalidad especifica, células provenientes de una pequeña donación de médula ósea (por ejemplo, 7-10 mi) podrían ser expandidas por propagación en un bioreactor placental antes de la infusión a un receptor. Además, un pequeño número de células madres y células progenitoras circulan normalmente en la corriente sanguínea. En otra modalidad, tales células madres exógenas o bien células progenitoras exógenas son recogidas por feresis, un procedimiento en el cuál la sangre es retirada, uno o varios componentes son removidos selectivamente, y el resto de la sangre es re-infusado en el donador. Las células exógenas recuperadas por feresis son expandidas por propagación en un bioreactor placental eliminando así la necesidad de donación entera de médula ósea. En otra modalidad, la expansión de células exógenas en un bioreactor placental se utiliza como tratamiento adicional además de quimioterapia. La mayoría de los agentes de quimioterapia utilizados para enfocar y destruir células cancerosas actúan mediante el hecho de matar todas las células que están proliferando, es decir, las células que se están dividiendo. Puesto que la médula ósea es uno de los tejidos con mayor proliferación en el cuerpo, en células madres hematopoyéticas son frecuentemente dañadas o destruidas por agentes de quimioterapia y por consiguiente la producción de células sanguíneas baja o se detiene. La quimioterapia debe ser suspendida a intervalos para permitir que el sistema hematopoyético del paciente rellene el suministro de células sanguíneas antes de reanudar el tratamiento con quimioterapia. Puede requerirse de un período de un mes para que las células madres antes quiescentes empiecen a proliferar e incrementen el número de células sanguíneas blancas a niveles aceptables de tal manera que se pueda reanudar el tratamiento con quimioterapia (cuando se destruyen otra vez las células madres de la médula ósea. Mientras que las células sanguíneas se regeneran entre tratamientos de quimioterapia, sin embargo, el cáncer tiene tiempo para crecer y posiblemente volverse más resistente a los fármacos de la quimioterapia debido a selección natural. Por consiguiente, entre mayor es la duración de la quimioterapia y más corta es la duración entre los tratamientos, mayores son las probabilidades de matar exitosamente las células cancerosas. Para acortar el tiempo entre los tratamientos de quimioterapia, células madres de tipo embriónico o células progenitoras recogidas de conformidad con los métodos de la invención pueden ser introducidos en el paciente. Este tratamiento reduce el tiempo durante el cuál el paciente presenta un número bajo de células sanguíneas y por consiguiente permite reanudar más rápidamente el tratamiento de quimioterapia. Las células madres de tipo embriónico, células progenitoras, células foráneas, o bien células manipuladas obtenidas a partir de una placenta de conformidad con los métodos de la invención pueden utilizarse en la fabricación de un tejido u órgano in vivo. Los métodos de la invención abarcan la utilización de células obtenidas a partir de la placenta, por ejemplo, células madres de tipo embriónico, células progenitoras, o bien células progenitoras o madres foráneas para sembrar una matriz y su cultivo bajo condiciones apropiadas para permitir la diferenciación de las células y la población de la matriz. Los tejidos y órganos obtenidos por los métodos de la invención pueden ser utilizados para varios propósitos, incluyendo propósitos de investigación y propósitos terapéuticos. 5.5 USOS DE CÉLULAS MADRES DE TIPO EMBRIÓNICO Las células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden ser utilizadas para una amplia gama de protocolos terapéuticos en donde un tejido u órgano del cuerpo es incrementado, reparado o reemplazado mediante injerto, trasplante o infusión de una población de células deseadas, por ejemplo, una población de células madres o una población de células progenitoras . Las células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden ser utilizadas para reemplazar o incrementar los tejidos existentes, para introducir nuevos tejidos o tejidos alterados o bien para unir tejidos o estructuras biológicas. Las células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden también ser sustituidas por células madres embriónicas en protocolos terapéuticos en donde células madres embriónicas se utilizaría típicamente. En una modalidad preferida de la invención, células madres de tipo embriónico y otras células madres de la placenta pueden utilizarse como trasplantes hematopoyéticos autólogos y halógenos, incluyendo de tipo HLA correspondido y no correspondido. De conformidad con el uso de células madres de tipo embriónico como trasplantes hematopoyéticos alogénicos, puede ser necesario tratar el huésped para reducir el rechazo inmunológico de las células del donador, tales como lo que se describe en la patente norteamericana No. 5,800,539, expedida el día 1 de Septiembre de 1998; y la Patente Norteamericana No. 5, 806,529, expedida el día 15 de Septiembre de 1998, ambos incorporándose aquí por referencia. Por ejemplo, células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden ser utilizados en protocolos de trasplante terapéutico, por ejemplo para incrementar o reemplazar células madres o células progenitoras del hígado, páncreas, riñon, pulmón, sistema nervioso, sistema muscular, hueso, médula ósea, timo, bazo, tejido mucosal, gónadas, o cabello. Células madres de tipo embriónico pueden ser utilizadas en lugar de clases especificas de células progenitoras (por ejemplo, condrocitos, hepatocitos, células hematopoyéticas, células parenquimatosas pancreáticas, neuroblastos, células progenitoras de músculo, etc.) en protocolos terapéuticos o protocolos de investigación en donde se utilizarían típicamente células progenitoras . Células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden ser utilizados para incrementar, reparar o reemplazar cartílago, tendón, o ligamentos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, prótesis (por ejemplo, prótesis de cadera) son revestidas con constructos de tejido de cartílago de reemplazo cultivados a partir de células madres de tipo embriónico de la invención. En otras modalidades, articulaciones (por ejemplo, rodilla) son reconstruidas con constructo de tejido de cartílago cultivado a partir de células madres de tipo embriónico. Constructos de tejido de cartílago pueden también emplearse en intervención quirúrgica reconstructiva principal para diferentes tipos de articulación (para protocolos, véase, por ejemplo, Resnick, D . , y Ni ayama, G., 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders [Diagnostico de trastornos de hueso y articulaciones], segunda edición, W.B. Saunders Co.). Las células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden ser utilizadas para reparar daño a tejidos y órganos que resultan de una enfermedad. En dicha modalidad, un paciente puede recibir células madres de tipo embriónico para regenerar o restaurar tejidos u órganos que han sido dañados como consecuencia de enfermedad, por ejemplo, incrementar el sistema inmune después de quimioterapia o radiación, reparar el tejido cardiaco después de un infarto del miocardio. Las células madres de tipo embriónico de la presente invención pueden ser utilizadas para incrementar o reemplazar células de médula ósea en trasplante de médula ósea. Trasplantes de médula ósea autóloga o alogénica humana se utilizan actualmente como terapias para enfermedades tales como leucemia, linfoma y otros trastornos que amenazan la vida. El inconveniente de estos procedimientos, sin embargo, es que una gran cantidad de médula ósea de donador debe ser removida para asegurar una cantidad suficiente de células para el injerto. Las células madres de tipo embriónico recogidas de conformidad con los métodos de la presente invención pueden ofrecer células madres y células progenitoras que reducen la necesidad de grandes donaciones de médula ósea. De conformidad con los métodos de la presente invención se podría obtener también una pequeña donación de médula ósea para ampliar el número de células madres y células progenitoras mediante cultivo y expansión en la placenta antes de infusión o trasplante a un receptor. Las células madres de tipo embriónico aisladas a partir de la placenta pueden ser utilizadas, en modalidades específicas, en una terapia de reemplazo de enzimas autólogas o heterólogas para tratar enfermedades o condiciones específicas incluyendo, sin limitarse a estos dos ejemplos enfermedades de almacenamiento lisosomal, por ejemplo síndrome de Tay-Sachs, Niemann-Pick, Fabry, Gaucher, Hunter, Hurler así como otras gangliosidosis mucopolisacaridosis, y glicogenoses . En otras modalidades, las células pueden ser utilizadas como vehículos de transgen autólogo o heterólogo en terapia génica para corregir errores innatos del metabolismo, por ejemplo adrenoleucodistrofia, fibrosis cística, enfermedad de almacenamiento de glicógeno, hipotiroidismo, anemia de células falciformes, síndrome de Pearson, síndrome de Pempe, fenilcetonuria (PKU) , así como enfermedad de Tay-Sachs, porfirias, enfermedad de orina de jarabe de maple, homocistinuria, mucopolisacárido nosis, enfermedad granulomatosa crónica y tirosinemia o bien para tratar 73 cáncer, tumores u otras condiciones patológicas. En otras modalidades, las células pueden ser utilizadas en terapia o protocolos de regeneración de reemplazo de tejido autólogo o heterólogo, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, el tratamiento de defectos epiteliales de la córnea, reparación de cartílago, dermabrasión facial, membranas mucosales, membranas timpánicas, forros intestinales, estructuras neurológicas (por ejemplo, retina, neuronas auditorias en membrana basilar, neuronas olfatorias en epitelios olfatorios), reparación de heridas y quemaduras para lesiones traumáticas de la piel, implante de cuero cabelludo (cabello, o bien para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos. Los grandes números de células madres de tipo embriónico y/o células progenitoras que se obtienen utilizando los métodos de la invención pueden reducir, en ciertas modalidades, la necesidad de grandes donaciones de médula ósea. Aproximadamente l X 108 a 2 x l08 células mononucleares de médula ósea por kilogramo de peso del paciente deben infusarse para injerto en un trasplante de médula ósea (es decir, 70 de médula en el caso de un donador de 70 kg) . Para obtener 70 mi se requiere de una donación intensa y una perdida importante de sangre en el proceso de donación. En una modalidad especifica, células provenientes de una pequeña donación de médula ósea (por ejemplo 7-10 mi) podrían ser expandidas por propagación en un bioreactor placental antes de la infusión en un receptor. En otra modalidad, las células madres de tipo embriónico pueden ser utilizadas en un tratamiento suplementario además de la quimioterapia. La mayoría de los agentes de quimioterapia utilizados para enfocar y destruir células cancerosas actúan mediante el hecho de matar todas las células que están proliferando, es decir, células que están en un proceso de división. Puesto que la médula ósea es uno de los tejidos que está proliferando con mayor actividad en el cuerpo, las células madres hematopoyéticas son frecuentemente dañadas o destruidas por agentes de quimioterapia y por consiguiente disminuye o se suspende la producción de células sanguíneas. La quimioterapia debe por consiguiente ser suspendida a intervalos para permitir que el sistema hematopoyético del paciente llene de nuevo el suministro de células sanguíneas antes de la reanudación de la quimioterapia. Puede requerirse de un mes o más para que las células madres antes quiescentes proliferen y hasta que se eleve el número de células sanguíneas blancas hasta niveles aceptables de tal manera que pueda reanudarse la quimioterapia (cuando a través, las células madres de médula ósea son destruidas) . Mientras que se están regenerando las células sanguíneas entre cada tratamiento de quimioterapia, el cáncer tiene tiempo de crecer y posiblemente volverse más resistente a los fármacos de quimioterapia debido a la selección natural. Por consiguiente, entre más tiempo se administre la quimioterapia y entre más corta es la duración entre los tratamientos, mayores son las probabilidades de una muerte exitosa de las células cancerosas. Para acortar el tiempo entre los tratamientos de quimioterapia, células madres de tipo embriónico o células progenitoras recogidas de conformidad con los métodos de la invención pueden ser introducidas en el paciente. Dicho tratamiento reduce el tiempo durante el cuál el paciente presenta un número bajo de células sanguíneas y por consiguiente permite una reanudación más pronta del tratamiento de quimioterapia. En otra modalidad, las células madres placentales humana pueden ser utilizadas para tratar o prevenir enfermedades genéticas, por ejemplo enfermedad granulomatosa crónica. 5.6 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden una dosis y/o varias dosis efectivas al ser administradas ya sea una sola vez o bien varias veces antes del trasplante o después del trasplante de células madres progenitoras humanas acondicionadas o no acondicionadas, ejerciendo un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciación de células madres progenitoras pluripotentes y multipotentes humanas de origen placental en células linaje mesodérmico y/o hematopoyético . De conformidad con esta modalidad, las células madres de tipo em riónico de la presente invención pueden ser formuladas como inyectables (por ejemplo, PCT WO 96/39101, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . En una modalidad alternativa, las células y tejidos de la presente invención pueden ser formulados utilizando hidrogenes polimerizables o de reticulación de conformidad con lo descrito en las patentes norteamericanas Nos. 5,709,854; 5,516,532; 5,654,381; que se incorporan aqui por referencia en su totalidad. 6. EJEMPLO 6.1. EJEMPLO 1: ANÁLISIS DE TIPO DE CÉLULAS RECUPERADAS DE PERFUSADO DE PLACENTA DRENADO Este ejemplo describe el análisis de tipos de células que se recuperan del perfusado efluente de una placenta cultivada de conformidad con los métodos de la invención. Veinte mi de una solución salina amortiguada fosfatasa (PBS) fueron agregados al liquido de perfusión y se recogió una porción de 10 mi la cuál fue centrifugada durante 25 minutos a 3000 revoluciones por minuto. El efluente fue dividido en cuatro tubos y colocado en un baño de hielo, se agregó 2.5 mi de una solución sérica de becerro fetal al 1% (FCS) en PBS y los tubos fueron centrifugados (140 minutos x 10 g (aceleración de la gravedad) ) . La pella fue resuspendida en 5 mi de FCS al 1% y se combinaron dos tubos. Los mononucleocitos totales fueron calculados por adición de los linfocitos totales y de los monocitos totales, y después multiplicando el resultado por el volumen total de suspensión celular. La tabla siguiente divulga los tipos de células que se obtuvieron por perfusión de una placenta cultivada de conformidad con los métodos descritos arriba. Leucocitos Linfocitos % MID% GRA% 1000/ml CB 10.5 43.2 8 48.8 (sangre de cordón umbilical) PP 12.0 62.9 18.2 18.9 (perfusado de placenta, temperatura ambiente) PP2 11.7 56.0 19.2 24.8 Perfusado de placenta, 37° C) Volumen El número de- total células CB 60 mi 6.3 X 108 ( sangre de cordón umbilical) PP 15 mi 1.8 X 10ó (perfusado de placenta, temperatura ambiente) PP2 30 mi 3.5 X 10ó Perfusado de placenta, 37° C) Las muestras de PP fueron después de Fxcoll. El número total de células de PP después de Ficoll fue de 5.3 X 10B y el número CB antes de procesamiento es 6.3 X 10°. Linfocitos 5 indica el porcentaje de linfocitos; MID% indica el porcentaj de células sanguíneas blancas de rango medio; y GRA% indica el porcentaje de granulocitos . ; 6.2. ANÁLISIS DE CÉLULAS OBTENIDAS POR PERFUSIÓN E INCUBACIÓN DE PLACENTA El siguiente ejemplo describe un análisis obtenidas por perfusión e incubación de placenta de conformidad con los métodos de la invención. 6.2.1. MATERIALES ? MÉTODOS Donadores de placenta fueron reclutados a partir de madres embarazadas que- participaron en programas privados de banco de sangre de cordón umbilical y que proporcionaron su consentimiento informado permitiendo el uso de la placenta desangrada después de la recuperación del cordón umbilical para- propósitos de investigación. Los datos de los donadores pueden ser confidenciales . Estos donadores permitieron también el uso de datos generados a partir del procesamiento normal de sus muestras de cordón umbilical para crioconservación. Esto permitió una comparación entre la composición de la sangre de cordón umbilical recogida y el perfusado efluente recuperado utilizando el método experimental descrito abajo. Después del desangrado del cordón umbilical, la sangre proveniente del cordón umbilical y de la placenta es almacenado a- temperatura ambiente y suministrada al laboratorio dentro de un plazo de cuatro a veinticuatro horas, de conformidad con los métodos descritos arriba, la-placenta fue colocada en recipiente estéril, aislado, a temperatura ambiente y entregada al laboratorio dentro de cuatro horas a partir del parto. Las placentas fueron desechadas si, al revisarlas se encontró evidencias de daño físico, por ejemplo fragmentación del órgano o avulsión de vasos umbilicales. Las placentas fueron mantenidas a temperatura ambiente (23 ± 2o C) o bien, refrigerada (4o C) en recipientes estériles durante 2 a 20 horas. Periódicamente, las placentas fueron inmersas y lavadas en solución salina estéril a una temperatura de 25 ± 3o C para remover la sangre o residuos visibles en la superficie. El cordón umbilical fue transectado aproximadamente a 5 cm de su inserción en la placenta y los vasos umbilicales fueron canulados con catéteres de TEFLON® o polipropileno conectados a una trayectoria de fluido estéril que permite una perfusión bi-direccional de la placenta y la recuperación del fluido efluente. Los métodos descritos arriba- permitieron efectuar todos los aspectos de acondicionamiento placental, perfusión y recolección de efluente bajo condiciones atmosféricas ambientes controladas así como monitoreo en tiempo real de la presión intravascular y regiones de flujo, temperaturas de núcleo y perfusado y volúmenes de efluentes recuperados. Un rango de protocolos de acondicionamiento fue también evaluado durante un período de 24 horas después del parto, y la composición celular del fluido efluente fue realizado por citometría de flujo, microscopía de luz y ensayos de unidades formadoras de colonias. 6.2.2. ACONDICIONAMIENTO PLACENTAL Placentas de donadores fueron procesadas a temperatura ambiente dentro de un período de 12 a 24 horas después del parto. Antes del procesamiento, las membranas fueron removidas y el sitio materno de lavado para remover la sangre residual. Los vasos umbilicales fueron canulados con catéteres elaborados a partir de agujas Butterfly de calibre 20 que se utilizan para la toma de muestras de sangre. Las placentas de las donadoras fueron mantenidas bajo varias condiciones tales como mantenimiento a 5-37° C, 5% CC , pH 7.2 a 7.5, de preferencia- pH 7.45, en un intento para simular y sostener entornos fisiológicamente compatibles para la proliferación y el reclutamiento de células madres de tipo embriónico residual. La cánula fue enjuagada con un medio libre de suero IMDM (GiboBRI, NY) que contenia 2U/ml de heparina (Elkins-Sinn, NJ) . La perfusión de la placenta prosiguió a un régimen de 50 mi por minuto hasta la-recolección de aproximadament 150 mi de perfusado. Este volumen de perfusado fue marcado "fracción temprana". Una-perfusión continua de la placenta- al mismo régimen resultó en la recolección de- una segunda- fracción de aproximadamente 150 mi y fue marcada "fracción tardía-"'. Durante el transcurso del procedimiento, la placenta- fue- sometida- a masaje suave para ayudar al proceso de perfusión y para ayudar a recuperar el material células. El fluido efluente fue recogido del circuito de perfusión tanto por drenaje por gravedad como por aspiración a través de la cánula arterial. Placenta fueron después perfusadas con medio Eagle modificado por Dulbecco (H.DMDM) heparinizado (2U/ml) a un régimen de 15 ml/minuto durante 10 minutos y los perfusados fueron recogidos de los sitios maternos dentro de una hora y se contaron las cé-lulas nucleadas . Los procedimiento de perfusión y colección fueron repetidos una o dos veces hasta que el número de células nucleadas recuperadas cayo por debajo de 100/ml. Los perfusados fueron agrupados y sometidos a centrifugación ligera para remover plaquetas, residuos y membranas de células desnucleadas . Las células nucleadas fueron después asiladas por centrifugación en gradiente densidad Ficoll-hypaque y después de lavado resuspendidas en H.DMEM. Para aislar las células adherentes, alícuotas de 5-10 x 105 células fueron colocadas en cada uno de varios frascos T-75 y cultivadas con medio de- cultivo de células madres mesenquimatosas comercialmente disponibles (MSCGM) obtenida en Bio Whittake-r, y colocadas en un incubador de- cultivo tisular (37° C, 5% C02) · Después de 10 a 15 días, las células no adherentes fueron removidas por lavado con PBS, lo que fue después reemplazado por MSCGM. Los frascos fueron examinados diariamente para determinar la- presencia- de varios tipos decélulas adherentes y en particular para identificar y expandir los grupos de células de fibroblastoides . 6.2.3. RECUPERACIÓN Y AISLAMIENTO DE CÉLULAS Células fueron recuperadas a- partir de- perfusados por centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Este procedimiento sirvió para- separar células de residuos contaminantes y plaquetas . Las pellas de células fueron resuspendidas en medio libre de suero IMDM que contenia 2U/ml de eparina y 2mM de EDTA (GibcoBRI, NY) . La fracción total de células mononucleares fue aislada utilizando Lymphoprep (Nycome Pharma, Oslo, Noruega) de conformidad con el procedimiento recomendado por el fabricante y la fracción de- células mononucleares fue resuspendida. Células fueron contadas empleando un hemocitómetro . L viabilidad fue evaluada por exclusión de azul tripano. El aislamiento de células mesenquimatosas fue logrado por "tripsinización diferencial", utilizando una solución de 0.05% de tripsina con 0.2% EDTA (Sigma, St . Louis, MO) . La tripsinización diferencial fue posible puesto que las células de fibroblastoides se desprendieron de superficies plásticas dentro de un periodo de aproximadamente 5 minutos mientras que las demás poblaciones adherentes requirieron de un periodo de incubación de más que 20-30 minutos. Las células de fibroblastoides desprendidas fueron cosechadas después de tripsinización y neutralización con tripsina, utilizando una solución de neutralización de tripsina (TNS; Bio Whittaker) . Las células fueron lavadas en H.DMEM y resuspendidas en MSCGM. Se efectúo una- citometria de flujo utilizando un instrumento FACSCalibur de Becton-Dickinson y anticuerpos monoclonales marcados con FITC y PE (mAbs) , seleccionados con base en marcadores conocidos para CSC (células madres mesenquimatosas) derivadas de médula ósea, fueron comprados en BID. y Caltag laboratories (South San Francisco, CA) , y anticuerpos SH2, SH3, SH4 que producen hibridomas fueron obtenidas y se detectaron las reactividades de los mAbs en sus sobrenadantes cultivados por anticuerpos anti-ratón de cabra F(ab) '2 marcados con FITC o PE. Se efectúo una diferenciación de de linaje utilizando medio de cultivo de mantenimiento e inducción disponibles en el comercio (Bio Whittaker) , empleados de conformidad con las instrucciones del fabricante. 6.2.4, AISLAMIENTO DE CÉLULAS MADRES DE TIPO EMBRIÓNICO PLACENTALES Un examen microscópico de las células adherentes en los frascos de cultivo reveló tipos de células morfológicamente diferentes. Células en forma de huso, células redondas con granes núcleos y vacuolas pequeñas perinucleare-s numerosas asi como células en forma de- estrellas con varias proyecciones {a través de una de- las cuáles las células en forma de estrella estaban fijadas sobre- el frasco) fueron observadas adhiriéndose sobre los frascos de cultivo. Aún cuando no se- hicieron intentos para caracterizar adicionalmente estas células adherentes, células similares fueron observadas en un cultivo de- médula- ósea, cordón umbilical y sangre- periférica, y por consiguiente- se consideraron que no eran de tipo células madres por naturaleza. Las células de fibroblastoides, que aparecen al final como grupos, fueron candidatas a MSC (células madres mesenquimatosas) y fueron aisladas por tripsinización diferencial y subcultivadas en frascos secundarios. Una microscopía de fase de las células redondeadas, después de tripsinización, reveló que- las c lulas presentaban un alto nivel de granulación; no eran distinguibles de las MSC derivadas de médula- ósea- producidas en el laboratorio o compradas en Bio hittaker. Cuando fueron subcultivadas, las células madres de tipo embriónico derivadas de placenta, en contraste con su fase anterior, se adhirieron dentro de unas horas, asumieron una- forma- de fibroblastoide característica, y formaron un patrón de crecimiento idéntico a las MSC derivadas de médula ósea- de referencia-. Durante el subcultivo y la realimentación, además, las células mononucleares unidas de fueron lavadas y los cultivos permanecieron homogéneos y sin contaminantes visibles de células no fribroblastoides . 6.2.5, RESULTADOS La expresión de CD-34, CD-38, y otros marcadores de superficie asociados en células mononucleares purificadas o de fracción temprana y fracción tardía fue evaluada por citometria- de flujo. Las células- recuperadas, clasificadas, lavadas en PBS y después teñidas doblemente con un ficoeritrina antiCD34 e isotiocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) .

El aislamiento de las células fue logrado mediante el uso de separación magnética de células, por ejemplo, Auto Macs (Miltenyi) . De preferencia, se efectúa primero el aislamiento de células CD3 +. 6.3 EJEMPLOG MEDIO DE PERFUSIÓN El siguiente- ejemplo proporciona una fórmula de la solución de perfusado preferida para el cultivo de placentas aisladas Químico Fuente- Concentración Concentración madre final DMEM-LG GibcoBRL 11885-084 MCDB201 Sigma M-6770 disuelto pH a 7.2 En H20 filtro FCS Hyclone 100% 2% ITS Sigma 1-3146 lOOx lx o GibcoBRL 414C0-045 Pen&Strep GibcoBRL lOOx lx 15140-122 LA-BSA Sigma+Gibco 100x(l µg/ml 10ng/ml de LA BRL BSA de LA) Dexametasona Sigma D-2915 0.25 mM en 0.05µ? H20 Acido Sigma A-8960 1000x(100 mM) lx(0.1 mM) Ascórbico L PDGF(50 µg) R&D 220BD 10 µg/Ial en 10 ng/ml 4mM de HCl + 0.1% BSA EGF (200 g) Sigma E-9644 10 µ?/?a? en 10 ng/ml 10 iuM de HAc + 0.1% BSA- Químico 500 mi DMEM-LG 300 mi MCDB201 200 mi FCS 10 mi ITS 5 mi Pen&Strep 5 mi LA-BSA 5 mi Dexametasona 100 µ? Ácido 500 µ? Ascórbico L PDGF(50 µg) 500 µ? EGF (200 µg) 500 µ? La composición antes mencionada es un perfusado que puede ser utilizado en varias temperaturas para la- placenta a perfusión. Se observará que componentes adicionales tales como antibióticos, anticoagulante-s y otros factores de crecimiento pueden ser utilizados en el perfusado o medio de cultivo. La presente- invención no se limita en cuanto a su alcance a las modalidades especificas descritas aquí. De hecho varias modificaciones de la invención además de las descritas aqui, serán aparentes a los expertos en la materia a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones se contemplan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas . Todas las referencias mencionadas aqui se incorporan por referencia en su totalidad y para todos los propósitos en la misma- extensión que si cada- publicación individual, patente- o solicitud de patente estuviera especifica e individualmente indicada- como incorporándose por referencia- en su totalidad para todos los propósitos. La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe considerarse como la admisión que la presente invención no tiene derecho a preceder dicha publicación en virtud de invención previa.

Claims

REIVINDICACIONES Una placenta aislada de mamifero que ha sido desangrada y sometida a perfusión bajo condiciones estériles. La placenta de mamifero aislada de la reivindicación 1, en donde la solución utilizada para perfusar la placenta contiene una solución anticoagulante. La placenta de mamifero aislada de conformidad con la reivindicación 1, en donde la solución utilizada para perfusar la placenta contiene una solución antimicrobiana . La placenta de mamifero aislada de conformidad con la reivindicación 1 en donde la solución utilizada para perfusar la placenta contiene factores de crecimiento. La placenta de mamifero aislada de conformidad con la reivindicación 1, en donde la placenta es humana. La placenta de mamifero aislada de conformidad con la-reivindicación 1, que ha sido almacenada durante aproximadamente 2 a 24 horas después de la expulsión de-la placenta del útero. Una placenta de mamifero aislada que ha sido desangrada y perfusada e incubada bajo condiciones para permitir la producción de células madres de tipo embriónico y otras células madres multipotentes a partir de dicha placenta . La placenta de mamifero aislada de conformidad con la reivindicación 7, que ha sido incubada durante un período de aproximadamente 2 a 24 horas. 9. La placenta de mamífero aislada de conformidad con la reivindicación 7, que ha sido perfusada o incubad durante un período de aproximadamente 24 horas a más de 48 horas. 10. Una placenta de mamífero aislada, perfusada, que comprende células madres de tipo embriónico viables . 11. La placenta aislada de conformidad con la reivindicación 10, en donde las células madres son OCT- 4- y ABC-p+. 12. La placenta de mamífero aislada de conformidad con la reivindicación 1, que ha sido sometida a perfusión durante por lo menos dos horas. 13. La placenta de mamífero aislada de conformidad con la reivindicación 12 que ha sido sometida a perfusión durante por lo menos once horas . 14. La placenta de mamífero de conformidad con la reivindicación 10, en donde la placenta es recuperada después del parto . 15. La placenta de mamífero aislada de conformidad con la reivindicación 13, que ha sido perfusada durante por lo menos veinticuatro horas. 16. La placenta de mamífero aislada de conformidad con la reivindicación 10, en donde la placenta es perfusada con una solución que contiene factores de crecimiento. 17. La placenta de mamífero aislada de conformidad con la reivindicación 7 que ha sido sometida a perfusión con una solución que contiene factores de crecimiento . 18. La placenta de mamífero aislada de conformidad con la reivindicación 7, que es de ser humano. 19. Un método para cultivar una placenta de mamífero, que comprende la obtención de una placenta después de la expulsión del útero, desangrado de la placenta, y sometimiento de la placenta a perfusión bajo condiciones estériles. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la placenta es sometida a perfusión con una solución que contiene una solución anticoagulante. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la placenta es sometida a perfusión con una solución que contiene un agente antimicrobiano. 22. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la placenta es humana. 23. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la placenta ha sido almacenada durante un período de aproximadamente dos a aproximadamente veinticuatro horas después de la expulsión del útero. 24. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde dicha expulsión se efectúa al momento del parto. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde- la- placenta es almacenada a temperatura ambiente. 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la placenta es almacenada bajo refrigeración o bien condiciones de congelación. 27. Un método para cultivar una placenta de mamífero aislada que ha sido desangrada y sometida a perfusión, que comprende el cultivo de la placenta bajo condiciones que permiten la producción de células madres de tipo embriónico a partir de dicha placenta. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde el cultivo de la placenta comprende la perfusión de la placenta. 29. El método de conformidad con la reivindicación 27 o 28, en donde la placenta ha sido incubada durante un periodo de aproximadamente veinticuatro horas a cuarenta y ocho horas. 30. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la placenta ha sido sometida a perfusión durante por lo menos dos horas. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la placenta ha sido perfusada durante por lo menos once horas . 32. El mé-todo de conformidad con la reivindicación 31, en donde la placenta ha sido perfusada durante por lo menos veinticuatro horas. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde la placenta ha sido perfusada durante más de cuarenta y ocho horas. 34. El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde la placenta ha sido perfusada con una solución que contiene factores de crecimiento. 35. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la placenta es humana. 36. Una célula madre placental humana aislada que es OCT+4 y ABC-p+. 37. La célula madre de la reivindicación 35, en donde la célula es una célula humana. 38. Una célula madre placental de mamífero aislado que tiene por lo menos las características siguientes: CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4 y ABOp+ . 39. La célula madre placental aislada de la reivindicación 35, en donde dicha célula es SSEA3- y SSEA4-. 40. Una célula madre placental humana que ha sido aislada de una placenta humana obtenida después del parto después de desangrado y perfusión de dicha placenta durante por lo menos 11 horas. 41. Un aparato para la producción de células madres, que comprende: (a) una placenta de mamífero obtenida después del parto que ha sido desangrada y sometida a perfusión; (b) un medio para incubar o cultivar la placenta; y (c) un medio para detectar células madres. 42. El aparato de conformidad con la reivindicación 39 que comprende además un dispositivo de recolección para recoger células madres. 43. El aparato de conformidad con la reivindicación 39 que comprende además un medio para monitorear y ajustar las condiciones del cultivo. 44. El aparato de conformidad con la reivindicación 41, en donde se calcula el monitoreo y el ajuste. 45. El aparato de conformidad con la reivindicación 39 que comprende además un dispositivo de separación de células . 46. Un método para tratar una enfermedad en un ser humano que comprende la administración de una célula madre placental humana de la reivindicación 35, 37 ó 38. 47. Un método para trasplantar células madres, que comprende la administración a un paciente que requiere de dicho tratamiento de una célula madre placental humana de la reivindicación 35, 37 ó 38. 48. Una composición farmacéutica que compren una célula madre placental humana de la reivindicación 35, 37 ó 38. 49.1a composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46 que comprende además sangre placental o de cordón umbilical. 50. Una célula dedicada que ha sido diferenciada a partir de una célula madre placental humana de la reivindicación 35, 37 ó 38. 51. Una población homogénea, aislada de células madres placentales humanas que pueden diferenciarse en todos los tipos de células. 52. Una población homogénea de células madres placentales humanas viables que presentan por lo menos los siguientes marcadores de superficie celular: OCT-4+ y ABC-p+ . 53. Una población homogénea aislada de células madres placentales humanas que es multipotente . 54. Una placenta aislada que contiene una célula que ni es fetal ni es materna en cuanto a su origen. 55. Las células madres de la reivindicación 49 ó 51, en donde las células madres se originan a partir de una placenta . 56. Una composición adecuada para trasplante de médula ósea que comprende una población de células madres hematopoyéticas enriquecidas en células que son CD34+ y CD38-. 57. La composición de conformidad con la reivindicación 53, que comprende además sangre de cordón umbilical que tiene células que son CD34+ y CD38+. 58. Una composición adecuada para trasplante de médula ósea que comprende una población de células madres hematopoyéticas enriquecidas en células que son CD34- y CD38-. 59. La composición de conformidad con la reivindicación 54 que comprende además sangre de cordón umbilical que tiene células que son CD34+ y CD38+.