KR20050000400A - 줄기 및 전구 세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도 - Google Patents

줄기 및 전구 세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도 Download PDF

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KR20050000400A
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로버트제이. 하리리
스트링데이비드아이
찬카일더블유에이치
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셀진 코포레이션
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Abstract

본 발명은 포유류의 줄기 세포와 전구 세포 분화를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 포유류, 특히 인간의 줄기 세포가 특정 세포 또는 조직 계통을 따라 분화 및 성숙하는 것을 조절하고 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 특정 세포 및 조직 계통을 따라서 줄기 또는 전구 세포 군의 분화, 특히 산후 태반으로부터 생성되는 배아-유사 줄기 세포의 분화를 위하여 또는 초기 전구 세포가 과립구 계통으로 분화하는 것을 위하여 조절하는 특정 작은 유기분자의 용도에 관련된다. 최종적으로, 본 발명은 이식 및 다른 의학적 치료에 있어서 그러한 분화된 줄기 및 전구 세포의 용도와 관련된다.

Description

줄기 및 전구 세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도{Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof}
인간 줄기 및 전구 세포의 식별, 분리 및 발생에 많은 관심이 있다. 줄기 세포는 다양한 성숙 세포 계통을 생산할 수 있는 토티포텐트(totipotential) 또는 플루리포텐트(pluripotential) 전구 세포이고, 전구 세포는 특정 세포계통의 세포를 생산할 수 있는 세포이다. 이러한 능력은 기관 및 조직 발달에 필요한 세포 분화 및 특정화의 기초로서 역할한다.
줄기 및 전구 세포를 이식하는데 있어서 최근의 성공은 질병, 유독한 약품 및/또는 방사선 노출로 인한 마이엘로압레이션(myeloablation) 후의 골수의 재건 및/또는 보충을 위한 새로운 임상적인 도구를 제공하였다. 줄기 세포가 많은, 전체는 아닐지라도, 조직을 재증식시키고 생리학적 및 해부학적 기능을 회복하는데 사용될 수 있는 것을 나타내는 그 이상의 증거가 존재한다. 조직 공학, 유전자 치료, 전달 및 세포 치료학에서 줄기 세포의 적용이 또한 빠르게 발전하고 있다.
많은 다른 유형의 포유류 및 전구 줄기 세포가 특정지워졌다. 예를 들면, 배아 줄기 세포, 배아 종자(germ) 세포, 성인 줄기 세포 또는 수임(committed) 줄기 세포 또는 전구 세포가 알려졌다. 특정 줄기 세포는 분리 및 특정되었을 뿐만 아니라, 정해진 정도까지 분화가 허용되는 조건 하에서 배양되었다. 그러나, 근본적인 문제가 남아있다; 즉, 조혈 전구 세포와 같은 줄기 세포 및 전구 세포의 분화를 제어하거나 조절하기가 어렵다. 현재, 이러한 세포들의 분화를 조절하는 현존하는 방법은 조잡하고 조절되지 않아서, 세포가 원하지 않는 시간에 원하지 않는 세포 유형으로 분화된다. 또한, 결과물인 세포의 수득율도 일반적으로 낮다.
나아가, 치료 또는 연구 목적으로 인간 줄기 세포를 충분하게 얻는 것이 문제이다. 정상적으로 성인 조직에서 발생하는 일군의 줄기 또는 전구 세포의 분리는 기술적으로 어렵고, 부분적으로 혈액 또는 조직에서 발견되는 줄기 또는 전구 세포의 제한된 양 및 골수 흡입물을 얻는데 포함되는 중요한 불편함으로 인해 비싸다. 일반적으로, 치료 및 연구 목적을 위해 충분한 양으로 대안적인 근원으로부터 줄기 및 전구 세포를 수집하는 것은, 예를 들면 제공 대상물 또는 환자로부터 세포 또는 조직을 수집하고, 배양 및/또는 시험관내 세포의 증식, 해부 등을 포함하여 일반적으로 힘이 든다. 낙태아를 포함하는 배아 또는 태아조직으로쿠터 이러한 세포의 획득은 특히 줄기 세포에 관해서는 종교적 및 윤리적 관심이 생겼다. 인간 배아 및 태아는 독립적인 삶을 구성한다는 널리 고정된 믿음은 의료적인 연구를 포함한 모든 목적에 있어서 그러한 근원의 사용에 정치적인 제한을 생겨나게 했다. 따라서 배아 또는 태아조직으로부터 발생된 세포의 사용을 요하지 않는 대안적인 근원이 임상적으로 줄기 세포의 사용에서 그 이상의 진보를 위해 요구된다. 그러나, 줄기 또는 전구 세포, 특히 인간 줄기 또는 전구 세포의 가능한 대한적인 근원은 거의 없으며, 따라서 공급이 제한적이다.
Hu 등 (WO00/73421 "Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells", 2000년 12월 7일 공개)은 추후 사용을 위하여 분만에서 분리되고 배양되고 냉동보존되고 또는 분화하기 위해유도된 태반으로부터 기인한 인간 양막 상피세포를 개시한다. Hu 등에 따르면, 태반은 분만 후 즉시 수집되고, 양막은 예를 들면 절개에 의해 융모막으로부터 분리된다. 양막 상피 세포는 표준 세포 분리법에 따라서 양막으로부터 분리된다. 개시된 세포는 다양한 배지에서 배양되고, 배양에서 확장되고, 냉동보존되고 또는 분화가 유도될 수 있다. Hu 등은 양막 상피세포가 멀티포턴트(그리고 가능한 플루리포텐트한)하고, 각막표면상피 또는 질상피와 같은 상피조직으로 분화할 수 있다는 것을 개시한다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 그들이 힘이들고, 줄기 세포의 수득률이 매우 낮다는 것이다.
세포군의 생체 밖 확장에 대한 일반적으로 유용한 방법은 또한 힘이든다. 예를 들면, Emerson 등은(Emerson et al., 미국특허 제6,326,198호, 제목 "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells", issued December 4, 2001); 인간 줄기 세포 분열 및/또는 인간 조혈 전구 줄기 세포의 최적화에 대한 생체 밖 배양에 대한 방법과 배양 배지조건을 개시한다. 개시된 방법에 따라, 골수로부터 기인한 인간 줄기 세포 또는 전구 세포는 연속적으로 또는 정기적으로, 약 24 내지 48시간 주기 당 배양 ml당 배지 1ml의 속도로 교체되고, 바람직하게는 관류되는 액체 배양 배지에서 배양된다. 생리학적으로 가능한 조건하에서 배양을 유지하면서, 대사 산물은 제거되어지고 고갈된 영양분은 다시 채워진다.
Kraus 등은(Kraus et al., 미국특허 제6,338,942호, 제목 "Selective expansion of target cell populations", issued January 15,2002) 미리 정해진 표적 세포군은 세포의 출발 샘플을 탯줄 혈액 또는 말초 혈액으로부터 성장 배지에 주입하고, 표적 세포 군의 세포를 분열되게 하고, 세포(CD34 세포와 같은)의 미리 정해진 군에 대한 특정 친화성을 갖는 결합하는 분자(CD34에 대한 단클론 항체)를 포함하는 선택 원소와 성장 배지 내 세포들을 접촉함으로써 선택적으로 확장될 수 있다고 개시한다.
Rodgers 등은 (미국특허 제6,335,195호, 제목 "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation", issued January 1, 2002) 조혈 및 중간엽 줄기 세포의 체외 배양과 안지오텐시노겐(angiotensinogen), 안지오텐신 I (AI), AI 유사물, AI 조각 및 이들의 유사물, 안지오텐신 II (AII), All 유사물, All 조각 또는 이들의 유사물 또는 All AT2 유형 2 수용체 작용제의 존재 하에서 단독으로 또는 다른 성장 인자 및 사이토카인과 병용하여 성장에 의한 계통-특정 세포 증식 및 분화의 유발에 대한 방법을 개시한다. 줄기 세포는 골수, 말초 혈액 또는 탯줄 혈액으로부터 기인된다. 그러나, 이러한 방법들의 단점은 줄기 세포의 증식과 분화를 유발하는 이러한 체외적인 방법은 앞서 설명한 바와 같이 시간이 많이 소비되고, 또한 결과로서 줄기 세포이 낮은 수율이 나타난다는 것이다.
줄기 및 전구 세포는 암, 선천성 대사이상(inborn errors of metabolism), 혈색소병증 및 면역결핍증을 포함하는 다양한 장애의 치료에 사용되는 잠재력을 갖는다. 탯줄 혈액 또는 태반으로부터 줄기 세포를 포함하는 사용 및 연구의 하나의 중요한 분야는 골수 및 다른 관련된 이식에 대해서 적은 양의 세포를 발생시키는 그러한 세포를 사용해 왔다. 그러나. 현재까지, 실질적으로 많은 인간 CD34+또는 CD133+전구 세포와 같은 줄기 또는 전구 세포를 생산하는 방법을 기술한 사람은 없다. 특히, 많은 나중의 세포는 전구 세포를 사용하는 처리방법을 용이하게 할 것이다. 본 명세서에서 개시된 본 발명의 방법은 이러한 필요성을 제기한다.
비타민 A 및 레티노익 산(RA)과 같은 레티노이드는 줄기 세포의 분화에 영향을 주는 것으로 알려져 왔다. 예를 들면, 레티노익 산은 비정상적으로 수임된(committed)(만성 골수 백혈병) 조혈 줄기 세포의 증식을 억제하고(Nadkarni 등, 1984, Tumori 70: 503-505), 전골수구 백혈병 세포에서 분화 및 자가-재생 능력의 상실을 유발하는 것(Melchner 등, 1985, Blood 66 (6): 1469-1472)으로 알려졌다. 또한, 레티노익 산은 배아 줄기 세포로부터 신경의 분화를 유발하고, 자발 중배엽 분화를 억제하는 것으로 알려져 왔다(Slager et al., Dev. Genet. 1993; 14 (3): 212-24, Ray ET AL., 1997, J. Biol. Chem. 272 (30): 18702- 18708). 또한, 레티노익 산은 변환된 종자세포 전구체(Damjanov et al., 1993, Labor. Investig. 68 (2): 220-232), 태반세포 전구체(Yan et al., 2001, Devel. Biol. 235: 422-432) 및 내피 세포 전구체(Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468)의 분화를 유발하는 것으로 알려져 왔다. 그러나, 분화에 대한 레티노이드의 영향은 줄기 세포의 분화를 제어하는 조절할 수 있는 방법으로서 사용될 수 있도록 완전하게 이해되지는 않았다.
아미노프테린(aminopterin) 및 아메토프테린(amethopterin)(메토트렉세이트:methotrexate)와 같은 폴릭 산 유사물의 조혈 줄기 세포의 분화에 대한 영향은 연구되어져 왔다. 폴릭산 유사물들은 급성 림프모구 빈혈 및 다른 혈액 증식 장애 및 암에서 화학요법제로서 사용되고, 줄기 세포의 특정 군을 사멸시킴으로써 줄기 세포의 분화에 영향을 나타내었고(DeLoia et al., 1998, Human Reproduction 13 (4): 1063-1069), 따라서 환자에게 투여하기 위하여 다량의 줄기 세포의 분화를 조절하는 효과적인 도구는 아니다.
또한, 적혈구 생성인자, 키트 리간드(Kit ligand), M-CSF 및 GM-CSF와 같은 단백질 뿐만 아니라, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11과 같은 여러 사이토카인은 조혈 계통에서 특정 세포 유형으로 줄기 세포의 분화가 이루어지는 것이 알려졌으나(Dushnik-Levinson 등, 1995, Biol. Neonate 67:77-83), 이러한 과정은 잘 이해되지 않으며, 너무 조잡하고 막연하여 줄기 세포의 분화를 조절하는 조절가능한 방법에 대해 허용하지 못하고 여전히 남아있다.
현재까지, 어느 누구도 줄기 세포 또는 전구 세포의 분화에 있어서 하기 논의되는 PDE IV 억제제와 같은 화합물의 사용을 기술하지 않았다. 특히, 어느 누구도 CD34+ 전구 세포와 같은 전구 세포의 분화, 돌출세포 계통과 분리되어, 이식 면역 내성을 북돋우는데 유용한 능력을 조절하는 이러한 화합물의 사용을 밝힌 적은 없다. 마찬가지로, 어느 누구도 이러하 세포를 포함하는 약학적 조성물을 생산하기 위하여 전구 세포 군을 확장하는 본 명세서에서 기술된 화합물의 사용을 기술하지않았다. 이러한 확장된 전구 세포 배양은 이식대숙주병의 치료와 면역 내성의 발달에서 유용할 것이다. 줄기 및 전구 세포 분화에 걸친 조절은 치료적으로 유용한 세포 군을 생산할 수 있기 때문에, 돌기 세포 및/또는 과립 백혈구의 제어된 생산을 위하여 골수모양 돌기 세포 계통의 세포 또는 인간 CD34+또는 CD133+전구 세포와 같은 초기 전구 세포의 분화를 제어 및 조절하는 능력이 필요하다.
본 출원은 2002년 4월 12일에 출원된 미국 예비출원 제60/372348호; 2002년 5월 30일에 출원된 미국 예비출원 제60/384251호, 2002년 12월 31일에 출원된 미국 예비출원 제60/437348호; 및 2002년 12월 31일에 출원된 미국 예비출원 제60/437350호의 이익을 주장하며, 이들은 각각 본 명세서에 그대로 포함된다.
본 발명은 포유류의 줄기 및/또는 전구 세포 분화를 조절하는 방법에 관련된다. 본 발명의 방법은 포유류, 특히 인간의 줄기 및 전구 세포가 특정세포 및 조직계통을 따라 분화하고 성숙하는 것을 조절하고 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 특정세포 및 조직계통을 따라서 줄기 또는 전구 세포군의 분화, 특히 산후 태반으로부터 생성되는 배아-유사 줄기 세포의 분화를 또는 초기 전구 세포가 과립구 계통으로 분화를 위하여 조절하는 특정 작은 유기분자의 용도에 관련된다. 또한 본 발명은 CD34+, CD45+ 및 CD133+ 전구 세포와 같은 전구 세포의 특정 계통의 분화를 조절하기 위한 이러한 유기분자들의 용도와 관련된다. 또한 본 발명은 전구 세포 발달의 시간적 측면 및 시험관 내에서 이러한 시간적 측면에 기초한 모델에 관련된다. 나아가, 본 발명은 그러한 세포 및/또는 작은 유기 화합물의 약학적 조성물을 포함하는 예방적 및 치료적 방법에서 이러한 조절된 세포의 용도에 관련된다. 최종적으로, 본 발명은 이식 및 다른 의학적 치료에 있어서 그러한 분화된 줄기 및 전구 세포의 용도와 관련된다.
3. 발명의 요약
본 발명은 포유류, 특히 인간의 줄기 세포 또는 전구 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 특정세포 및 조직 계통을 따라 인간 줄기 세포의 분화와 성숙을 조절하고 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 그러한 조절 또는 제어에 영향을 주는 PDE IV 억제제, 특히 SelCIDS(Celgene)로 알려진 일군의 화합물의 사용을 포함한다. 본 발명은 특정 방법으로 그들의 분화를 조절하기 위하여 특정 시간에서 전구 세포에 이러한 화합물의 투여가 더 예상된다.
본 발명의 방법은 중간엽, 조혈, 아디포제닉(adipogenic), 헤파토제닉(hepatogenic), 신경성, 글리제닉(gliogenic), 연골형성(chondrogenic), 바소제닉(vasogenic), 근육성(myogenic), 연골형성 또는 골원성 계통을 포함하되 이에 한정되지는 않는 특정 세포 계통으로 줄기 세포 또는 전구 세포의 분화의 조절을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 조혈 계통의 세포로 줄기 세포 분화의 조절을 포함한다.
또한, 본 발명은 특정 세포 유형, 예를 들면 중간엽 세포, 조혈세포, 지방세포(adipocyte), 간세포, 신경모세포, 아교모세포, 연골세포, 내피세포(EC) 전구체, 근육세포, 연골세포 또는 골모세포로 수임세포의 조절을 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명은 수임된(committed) 조혈 전구 세포에서 적혈구, 혈소판 또는 호중성 백혈구, 단핵세포, 마크로파지, 호산구, 호염기구, 마스트 세포, B-세포, T세포 또는 플라스마 세포와 같은 백혈구의 조절을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 조혈계통, 특히 CD34+, CD133+, 및 CD45+조혈 계통의 세포로의 줄기 세포의 분화를 조절하는 것과 그러한 세포들을 포함하는 예방적으로 또는 치료적으로 유익한 약학적 조성물을 생산하는 방법에 관계된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 돌기세포 계통 또는 과립백혈구 계통, 내피계통 또는 카르디오미오사이트(cardiomyocyte) 계통의 세포로의 초기 전구 세포의 분화를 조절하는데 관련된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 전구 세포의 조혈 계통, 특히 돌기세포 또는 과립백혈구 계통, 내피계통, 신경계통 또는 카디오미오사이트 계통으로의 분화를 조절하는데 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 상기 전구 세포는 CD34+ 또는 CD133+ 세포이다. 그러한 조절은 본 발명의 화합불로 배양하는 동안 전구 세포를 접촉함으로써 이루어진다. 하나의 실시예에서, 상기 화합물은 PDE IV 활성의 억제제이다. 보다 특정한 실시예에서, 상기 화합물은 PDE IV 억제제이다. 보다 바람직하게, 상기 PDE IV 억제제는 SelCID™이다(하기 4.3절 참조).
다른 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 전구 세포의 돌기세포로의 분화를 억제하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 그러한 전구 세포의 확장된배양을 산출하기 위한 배양의 처음 6일동안 전구 세포의 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 과립백혈구로의 초기 전구 세포 발달의 촉진을 포함하는데, 이것은 감염에 대항하는데 유용할 수 있다. 전구체(CD15+)에 수임된 과립백혈구(granulocyte) 계통의 증가는 암 화학치료법의 가장 일반적인 투여 제한 독성을 나타내는 호중성 백혈구 감소증 및 연속적인 감염성 합병증의 감소에서 잠재적인 사용이 가능하다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 돌기세포 분화를 억제하는데 사용될 수 있는데, 이것은 이식대숙주병의 영향을 완화시키는데 유용하다.
본 발명의 전구 세포는 본 발명의 화합물에 의해 조절되므로 이식(즉, 조혈 재건)에 유용하고, (이자, 심장, 간, 신장, 간, 뇌, 폐, 방광, 장 또는 근육세포와 같은) 세포 및 조직 대체의 재생가능한 근원으로서 정상적인 노화, 손상 또는 심장병, 중풍, 파킨슨 병 및 알츠하이머 병과 같은 질명을 치료하기 위한 재생적 의학에 사용될 수 있다. 세포들은 또한 본 발명의 화합물의 작용을 중재하는 세포내 생화학적 경로의 결정에 유용할 것이다. 이러한 세포들은 또한 새로운 약물 및 독소를 측정하는데, 예를 들면, 잠재적인 항암 약물을 결정하기 위해서, 발생 결점의 근원을 이해하기 위해서 등 유용할 것이다.
본 발명의 방법은 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 발생을 증가시키고, 총 콜로니 형성 유닛 생산을 촉지하는 반면, 특별하게 적혈세포 또는 적혈구 형성 콜로니(BFU-E 및CFU-E)의 발생을 억제하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 줄기 세포 및 CD34+ 전구 세포와 같은 전구 세포를 조절하는데 사용될 수 있을뿐만 아니라, 골수 주입 속도를 향상시킴으로써 조혈 줄기 세포 이식에 중요한 이익을 제공하는 콜로니 형성 속도를 촉진시키는데 사용될 수도 있다.
탯줄 혈액, 태반 및 다른 근원들로부터 분리된 줄기 세포를 포함하되 이에 한정되지는 않는 어떤 포유류 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다. 줄기 세포는 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아피그, 고양이, 돼지, 양, 소, 말, 원숭이 등, 더욱 바람직하게는 인간인 어떤 포유류 종들로부터 분리될 수 있다. 줄기 세포는 플루리포텐트 세포, 즉, 완전한 분화 다양성을 갖고, 자가-재생인 세포를 포함할 수 있고, 조직 내에 잠재적 또는 침묵적으로 남아있을 수 있다. 또한 줄기 세포는 멀티포턴트 세포 또는 수임 전구 세포를 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시예에서, 본 발명은 정상 임신기간이 다 찬 태반 내에 존재하거나 또는 그에 의해 후에 생성되는 생육가능하고, 침묵적이고, 플루리포텐트한 줄기 세포를 사용하는데, 즉, 그러한 세포들은 성공적인 분만과 태반 압박방출, 태반의 실혈과 관류가 뒤따르며, 10억개 정도의 응집된 세포들의 생산과 재생을 가져오는데, 5000만 내지 1억개의 멀티포턴트 및 플루리포턴트 줄기 세포를 산출한다. 그러한 세포들은 본 명세서에서 인간 태반 줄기 세포 또는 배아같은 줄기 세포를 의미한다.
본 발명의 하나의 특정 실시예에서. 세포, 예를 들면 골수에 또는 배아같은 줄기 세포, CD34+ 또는 CD133+세포와 같은 전구 세포, 플루리포텐트세포 및 멀티포텐트 세포를 포함하되 이에 한정되지는 않는 산후 관류 태반에 내부 세포는 본 발명의 화합물에 노출되고 분화가 유도된다. 내부세포는 시험관 내에서 증식될 수 있다. 다른 실시예에서, 원하는 세포 유형 또는 계통으로 분화가 일어나도록 내부 세포는 태반 및 배양 배지로부터 모아질 수 있고, 적절한 조건 하에서 충분한 시간동안 시험관 내에서 배양될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 줄기 또는 전구 세포는 탯줄혈액, 말초혈액 또는 성인혈액과 같은 다른 근원으로부터 유래되고, 본 발명의 화합물에 노출되고 분화가 유도된다. 바람직한 실시예에서, 분화는 적절한 조건 하에서 충분한 시간동안 원하는 계통 또는 세포유형으로 분화가 일어날 수 있도록 분화가 수행된다. 본 발명의 화합물은 추가에 의해, 본래의 장소에 생성 또는 줄기 또는 전구 세포가 본 발명의 화합물과 접축할 수 있는 어떤 다른 방식으로 분화/배양 배지에 사용된다.
본 발명의 화합물의 투여 시기가 CD34+전구 세포의 분화에 심오한 영향을 미친다는 것이 발견되었다. 따라서 본 발명의 하나의 실시예에서, CD34+전구 세포의 돌기세포로의 분화는 본 발명의 화합물과 배양의 첫날 전구 세포의 접촉을 포함하는 방법에 의해 연기되거나 억제된다. 다른 실시예에서, CD34+ 전구 세포로부터 CD1a+의 발달은 배양 첫날 본 발명의 화합물과 상기 전구 세포의 접촉을 포함하는 방법에 의해 감소되거나 예방될 수 있다. 다른 실시예에서, CD34+ 전구 세포로부터 기인한 CD1a+세포군의 유지는 상기 화합물의 부존재 하에서 6일간 상기 전구 세포를 배양한 후에 본 발명의 화합물과 상기 전구 세포를 접촉함으로써 증가된다.
또한 본 발명은 CD34+ 및 CD133+과 같은 초기 전구 세포의 분화를 조절하는 방법을 포함하는데, 증식 및 분화 시기 동안 다양한 시간에 전구 세포와 하나 이상의 본 발명의 화합물을 접촉하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 단지 배양 첫날에 상기 세포와 하나 이상의 화합물의 접촉을 포함하는 전구 세포의 분화를 조절하는 방법을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 배양의 첫날과 12일 사이의 어느 날에 한번 투여로 상기 화합물과 접촉된다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 0-12일 사이에 (0과 12를 포함하여) 다른 날에 상기 화합물과 적어도 두 번 접촉된다. 또 다른 실시예에서, 상기 세포는 증식 및/또는 분화 시기 중 하루에 두 번, 하루에 한번 또는 2일에 한번 하나 이상의 화합물과 접촉된다. 다른 실시예에서, 상기 접촉은 시험관 내에서 이루어진다. 또 다른 실시에에서, 상기 접촉은 대상물에 생체 내에서 이루어진다. 더욱 바람직한 실시예에서, 상기 대상물은 인간, 비인간 포유류, 조류 또는 파충류이다.
요컨데, 본 발명의 화합물에 산후 관류된 태반에서 배양될 수 있는 내부 또는 외부 줄기 또는 전구 세포의 노출은 태반내에서 세포가 배양되는 동안 일어날 수 있고, 또는 바람직하게는 세포가 재생되고 태반으로부터 제거된 후 시험관내에서 일어날 수 있다.
본 발명은 줄기 및/또는 전구 세포 발달의 조절자로서 PDE IV 억제 활성을 갖는 화합물의 사용을 포함한다. 특정 실시예에서, 화합물은 SelCIDs™(Celgene Corp., Warren, NJ)으로 알려진 일군의 화합물과 같은 PDE IV 억제제이다.
또한 본 발명은 질병을 치료하거나 예방하기 위하여 전처리된 줄기 또는 전구 세포의 이식을 포함한다. 하나의 실시예에서, 이식에 필요한 환자는 또한 이식 전, 그동안 및/또는 그 후에 본 발명의 화합물이 투여된다.
본 발명은 본 발명의 방법으로부터 생산된 전구 세포 또는 특정 세포 유형의사용을 더 포함한다. 즉, 본 발명은 조혈 전구체의 분화로부터 만들어진 백혈구, 과립 백혈구 또는 돌기세포의 사용을 포함하는데, 상기 전구체의 분화는 본 발명의 화합물을 사용하여 조절되고 제어된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 줄기 세포 및 본 발명의 작은 분자 화합물 모두를 이들이 필요한 환자들에게 투여함으로써 생체 내에서 줄기 세포의 제어 또는 조절을 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 특히 상기 전구 세포의 증식과 분화를 촉진하는 조건 하에서 배양의 처음 6일동안 PDE IV의 활성을 억제하는 것과 접촉된 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포와 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 배양 6일 후 수집되고 냉동 보존된 세포를 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 약학적 조성물의 세포는 CD34+CD38-CD34- 또는 CD34+CD38-CD34+ 세포이다. 다른 특정 실시예에서, 세포와 접촉된 화합물은 본 발명의 PDE IV 억제제이다. 다른 특정 실시예에서, 세포와 접촉된 화합물은 SelCID™이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 또한 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포가 PDE IV 활성을 억제하는 화합물과 접촉하는데, 여기서 상기 전구 세포는 상기 전구 세포의 증식과 분화를 허용하는 배양 조건하에서 배양 배지에서 6일간 배양되고; 배양 6일 후 상기 세포를 수집하고; 상기 세포가 약학적으로 수용가능한 운반체와 결합하는 것을 포함하는 약학적 조성물을 만드는 방법에 대해 제공한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 접촉은 배양 첫날에 실시된다. 본 발명의 다른 특정 실시예에서,상기 접촉은 상기 배양 6일동안 적어도 두 번 실시된다. 다른 특정 실시예에서, 세포와 접촉되는 화합물은 본 발명의 PDE IV 억제제이다. 다른 특정 실시예에서, 세포와 접촉되는 화합물은 SelCID™ 이다. 또 다른 특정 실시예에서, 상기 전구 세포는 상기 배양 전에 다른 혈액 세포로부터 분리된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 배양 배지는 추가적으로 GM-CSF 및 TNF-알파를 더 포함한다. 본 발명의 더욱 특정한 실시예에서, 상기 SelCID™는 0.1 내지 10.0μM 사이의 농도로 존재한다. 다른 더욱 특정한 실시예에서, 상기 SelCID™는 1.0μM 농도에서 존재한다. 다른 특정 실시예에서, 상기 세포는 상기 수집 후에 냉동보존된다.
본 발명은 포유류 대상물에서 전구 세포 군을 확장하는 방법을 더 제공하는데, 치료적으로 효과적인 양의 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포 및 하나 이상의 SelCID™를 상기 수용 포유류 대상물에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 전구 세포는 수용 포유류 대상물에서 분화된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구 세포는 적혈구가 실질적으로 없는 세포 제제에서 상기 대상물에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구 세포는 골수 세포, 태반세포, 탯줄혈액세포 또는 PBMCs를 포함하는 세포제제에서 수용 포유류 대상물에게 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구 세포는 운반체와 결합하여 수용 포유류 대상체에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구 세포는 CD34+CD133+ 전구 세포이다. 다른 특정 실시예에서, 전구 세포는 관심 있는 결합된 유전 물질을 발현한다.
본 발명은 또한 약학적 조성물로서 유용한 상기 방법에 의해 생산된 세포를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 냉동 보존과 줄기 세포 상에 냉동보존제 노출의 악영향을 중화하기 위하여 본 발명은 냉동보존하고 녹인 후 줄기 세포 또는 전구 세포, 예를 들면 CD34+ 전구 세포를 조절하는 방법을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명은 증식 및 이동 능력이 있는 줄기 세포 상에 냉동보존제(예를 들면 DMSO)의 노출의 악영향을 중화하기 위하여 본 발명은 냉동보존하고 녹인 후 줄기 세포를 조절하는 방법을 포함한다.
3.1.정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 생반응기(bioreactor)"라는 용어는 세포 증식, 생물학적 물질의 생산 또는 발현, 및 세포 조직, 오가노이드, 바이러스, 단백질, 폴리뉴클레오티드 및 미생물의 성장 또는 배양을 위한 생체 밖 시스템을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “DC 세포”는 돌기세포를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, “초기 전구 세포”는 CD34+전구 세포, CD133+ 전구 세포 또는 포유류, 조류 또는 파충류 각각의 등가물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “배아 줄기 세포”라는 용어는 주머니배(예를 들면, 4 내지 5일 성숙된 인간 배아)의 내부 세포 군으로부터 유래되고, 플루리포턴트한 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “배아-유사 줄기 세포(embryonic-like stem cell)”라는 용어는 주머니배의 내부 세포 군으로부터 유래되지 않은 세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “배아-유사 줄기 세포”는 또한 “태반 줄기 세포”를 의미할 수 있다. 배아같은 줄기 세포는 바람직하게 플루리포텐트하다. 그러나, 태반으로부터 얻어질 수 있는 줄기 세포는 배아같은 줄기 세포, 멀티포턴트 세포 및 수임 전구 세포를 포함한다. 본 발명의 방법에 따라서, 일단 잔류 세포들은 제거하기에 충분한 시간동안 실혈되고 관류되어지면 태반으로부터 기인된 배아-유사 줄기 세포는 분리된 태반으로부터 수집될 수 있다. 바람직하게, 배아-유사 줄기 세포는 비록 다른 포유류로부터 기인할 수 있을지라도 인간으로부터 기인한 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 태반과 관련되어 사용되는 경우 “실혈된(exsanguinated)” 또는 “실혈(exsanguination)”은 태반으로부터 실질적인 모든 탯줄혈액을 제거 및/또는 배출하는 것을 의미한다. 본 발명에 따라서, 태반의 실혈은 예를 들면 배출, 중력 유발 유출, 마사지, 짜내기, 펌핑 등에 의해 이루어질 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 태반의 실혈은 태반을 태반의 실혈에 도움이 되는 항응고제와 같은 약품을 포함하거나 포함하지 않는 플루이드를 이용하여 관류, 린싱 또는 플러싱함으로써 더 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “관류한다(perfuse)” 또는 “관류(perfusion)”는 플루이드를 기관이나 조직 위로 또는 통과하여 붓거나 또는 통과시키는 조작을 의미하는데, 바람직하게는 어떠한 잔류불, 예를 들면 부착되지 않은 세포를 기관이나 조직으로부터 제저하기 위하여 충분한 힘이나 압력으로 기관 또는 조직을 통하여 플루이드를 통과시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “관류액(perfusate)”은 기관이나 조직을 통하여 통과한 후 수집되는 플루이드를 의미한다. 바람직한 실시예에서, 관류액은 하나 이상의 항응집제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “내재적(내생적) 세포(endogeneous cell)"이라는 용어는 ”외래가 아닌“ 세포, 즉, 태반으로부터 유래된 자가 또는 자가조직의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “외인성 세포(exogenous cell)”는 태반 이외의 기관 또는 조직으로부터 기인된 “외인성” 세포, 즉 이종유래의 세포(즉, 태반 공여자 이외의 다른 근원으로부터 유래된 “비-자가 세포”) 또는 자가조직의 세포(즉, 태반 공여자로부터 유래된 자가세포)를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “면역조절 화합물(immunomodulatory compound)”은 하기 5.3.절에 개시된 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “오가노이드(organoid)”라는 용어는 표면 외관 또는 포유류 신체, 바람직하게는 인간 신체의 어떤 기관이나 샘처럼 실질적인 구조에서 비슷한 하나 이상의 세포 유형의 모임을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “멀티포텐트(multipotent) 세포"라는 용어는 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 어떤 작은 집합으로 성장하는 능력을 가진 세포를 의미한다. 플루리포텐트 세포와는 달리, 멀티포텐트 세포는 모두 세포 유형에서 벗어나서 형성되는 능력을 갖지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “플루리포텐트(pluripotent) 세포”라는 용어는 완전한 분화 다양성, 즉 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 어떤 것으로 성장할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 플루리포텐트 세포는 자가재생할 수 있고, 조직 내에 잠재 또는 침묵으로 남을 수 있다. 토티포텐트 세포 (예를 들면 살균된 디플로이드 난세포)와는 달리, 배아줄기 세포는 일반적으로새로운 주머니배를 형성할 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “전구 세포(progenitor cell)”라는 용어는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하기 위하여 수임된 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “줄기 세포”라는 용어는 조직과 기관의 특정화된 세포를 형성하기 위하여 무기한으로 재생산할 수 있는 마스터 세포를 의미한다. 줄기 세포는 발달적으로 플루리포텐트 또는 멀티포텐트 세포이다. 줄기 세포는 두개의 딸 줄기 세포 또는 하나의 딸 줄기 세포와 하나의 전구(“통과”) 세포를 생산하기 위해 나누질 수 있는데, 그런 다음 조직의 성숙한, 완전히 형성된 세포로 증식한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “토티포텐트 세포”라는 용어는 완전한 배아(예를 들면 주머니배)을 형성 할 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명은 본 발명의 화합물에 줄기 세포 또는 전구 세포들을 노출시키면 줄기 또는 전구 세포들이 특정한 군들의 전구 세포들로 또는 전구 세포들이 수지상 세포, 과립구 세포, 내피세포 또는 신경 세포와 같은 특정한 세포 타입으로 분화되는 것을 조절하는 조절가능한 수단을 야기한다는 예측하지 못한 발견에 부분적으로 기초한다. 상세하게는 본 발명의 화합물에 대한 줄기 또는 전구 세포의 노출은CD34+, CD38+ 및 CD133+세포를 포함하는 조혈성 세포의 특정 군의 조절가능한 분화 및 팽창을 야기한다. 그러한 분화 조절은 세포 사멸에 의한 수율의 현저한 감소나 바람직하지 않은 세포 타입 또는 세포계없이 달성된다; 다른 말로 본 발명의 화합물은 하나 이상의 세포군의 아팝토시스를 야기하지 않는다. 더욱이 본 발명의 화합물에 조혈 전구 세포들을 노출은 특정 세포 타입들의 조절가능한 분화 및 팽창을 야기한다.
따라서 본 발명은 인간 줄기 세포 분화, 특히 CD34+조혈성 전구 세포 및 CD133+ 전구 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 전구 세포 군을 특정의 세포 및 조직 계통로 분화를 조절하는 PDE IV활성을 억제하는 작은 유기 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 조혈성 전구 세포를 PDE IV 저해제 또는 길항제에 노출시키는 것을 포함하는 포유류, 조류 또는 파충류에 이식을 위한 인간 CD133+ 또는 CD34+ (특히 CD34+CD38- 세포)와 같은 초기 전구 세포를 팽창하는 방법을 포함하고, 여기서 저해제 또는 길항제는 작은 분자이다. 본 발명은 또한 뇌, 신장, 장 및 근육을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 이들 초기 전구 세포들로부터 다른 세포 타입을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 또한 CD34+ 전구 세포로부터 수지상 세포의 분화를 억제하고 과립구 세포 분화를 촉진하는 작용을 한다.
본 발명과 혼합하여 사용될 수 있는 작은 분자 화합물의 예는 PDE IV활성을 억제하는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 방법에 사용된 화합물은 4.3.에서 상술한다. 특히 바람직한 실시예에서 본 화합물은SelCIDsTM(Celgene)이다.
본 발명의 방법은 원하는 세포계의 세포로 분화를 야기하기에 충분한 기간동안 본 발명의 화합물로 바람직하게는 인 비트로에서 줄기 또는 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기 또는 전구 세포들을 간엽, 조혈, 지방원성, 간원성, 신경성, 신경원성(gliogenic), 연골 원성, 혈관원성, 근원성, 골원성 계를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 특정한 세포 계로 분화를 조절하는 것을 포함한다. 특정한 실시예에서 줄기 또는 전구 세포의 조혈계 세포로의 분화가 조절된다. 특히 본 발명의 방법은 CD34+, CD133+, 및 CD45+ 조혈 전구세포에서 용량 의존적인 형태로 혈구 세포 콜로니 형성의 형성을 조절하는 곳에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 원하는 세포계의 세포로 분화를 야기하기에 충분한 기간동안 본 발명의 화합물로 바람직하게는 인 비트로에서 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는 CD34+ 전구 세포가 수지상 세포로 분화를 조절하는 것을 포함한다. 특정한 실시예에서 그러한 전구 세포가 수지상 세포로의 분화는 PDE IV 저해제 특히 SelCIDsTM또는 그러한 저해제 또는 SelCIDsTM의 아나로그 또는 프로드러그로 세포를 접촉하여 조절된다. 또 다른 특정 실시예에서 CD34+ 전구 세포의 분화는 골수 계를 통한 분화 억제 및 과립구 계를 통한 분화 촉진을 조절한다. 더욱 특정한 실시예에서 CD34+ 전구 세포의 과립구 세포 계의 세포로의 분화는 상기 전구 세포들의 배양 첫날 본 발명의 화합물로 CD34+ 전구 세포를 접촉하는 것을 포함하는 방법을 통하여 조절된다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 포유류 줄기 또는 전구 세포는 제대혈 세포들("CB"세포들), 태반 및 다른 소스에서 분리된 줄기 세포들을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 줄기 세포들은 만능 세포 즉 조직 내에서 스스로 재생되고 휴지 또는 비활성을 유지할 수 있는 완전한 분화 다양성을 갖는 세포를 포함할 수 있다. 상기 줄기 세포들은 다기능 세포 또는 단분화성 혈구 발생(committed) 전구 세포들을 포함할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서 본 발명은 다기능 또는 만능 줄기 세포들의 회수를 야기하는 성공적인 출산 및 태반 밀어내기, 방혈, 관류 후에 회수될 수 있는 전기간 태반 내에 존재하는 생존하고 비활성을 유지하는 다기능 줄기 세포들을 이용한다.
또 다른 실시예에서 전구 세포들은 특히 CD34+ 또는 CD133+와 같은 초기 전구 세포들이다. 바람직하게는 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포들은 인간 골수, 태반, 또는 제대혈로부터 유래한다. 다른 포유류로부터 온 이들 세포의 균등체도 사용될 수 있다. 예를 들어 쥐에서 Sca+ 전구세포들이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 조류 또는 파충류에서 온 초기 전구세포의 균등체도 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서 배아-유사 줄기 세포들, 전구 세포들, 만능 세포들 및 다기능 세포을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 태반 내생 또는 산후 관류된 태반에 의하여 생산된 세포들이 본 발명의 화합물에 노출되고 분리되고 관류된 태반에서 배양시에 분화가 유도된다. 산후 관류된 태반에서 증식된 내생적인 세포들이 수집될 수 있고/또는 생리활성 분자들이 관류액, 배양 배지 또는 태반 세포들 자체로부터 회수된다.
본 발명의 다른 실시예에서 산후 태반외의 다른 소스로부터 유래한 줄기 또는 전구 세포들이 본 발명의 화합물에 노출되고 인 비트로에서 배양시 분화가 유도된다. 따라서 본 발명은 본 발명의 화합물이 존재하고 원하는 분화에 적합한 조건 및/또는 배지하에서 줄기세포를 분화하는 것을 포함하는 포유류 줄기 세포들을 특정한 전구 세포들로 분화하는 방법을 포함한다.
더욱이 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 화합물이 존재하고 상기 분화에 적합한 조건 하에서 상기 전구 세포를 분화하는 것을 포함하는 특정한 전구 세포 군이 특정한 세포 타입으로 분화하는 것을 조정 또는 제어하는 방법을 포함한다. 대안적으로 줄기 또는 전구 세포는 본 발명의 화합물에 노출될 수 있고 후에 적당한 조건을 사용하여 분화될 수 있다. 적당한 조건의 예들은 인간 혈청으로 공급된 영양 배지 제제 및 성장 인자들로 공급된 MATRIGEL?과 같은 세포 배양 매트릭스를 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 증식 또는 분화 단계에서 배양 동안 여러 시간에서 본 발명의 화합물로 전구 세포를 접촉하여 생성될 수 있는 여러 세포 군들을 포함한다. 4.4. 특히 4.4.2 부분을 참조.
특정 실시예에서 본 발명은 조혈 전구들의 이식전 컨디셔닝에서 조혈을 조절 및 제어하기 위하여 작은 분자 특히 PDE IV 저해제 바람직하게는 SelCIDs 또는 그것의 프로드러그를 채택하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 전구들의 엑스 비보에서 조혈을 조절 및 제어하기 위하여 작은 분자를 채택하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 인 비트로에서 화합물로 줄기 또는 전구 세포들을 배양하고 대상에 분화된 세포들을 직접 이식하는 것을 포함하는 인 비트로에서 줄기 또는 전구 세포 분화의 조절을 포함한다.
본 발명은 또한 그것이 필요한 환자에게 본 발명의 화합물 및 줄기 또는 전구 세포들을 투여하여 인 비보에서 줄기 또는 전구 세포 분화의 제어 또는 조절을 포함한다.
본 발명은 더욱이 질병을 예방 또는 치료하기 위하여 전처리된 줄기 또는 전구 세포들을 이식하는 것을 포함한다. 일 실시예에서 이식이 필요한 환자는 또한 이식 전, 이식 동안 및/또는 이식 후에 본 발명의 화합물이 투여된다. 다른 실시예에서 이식이 필요한 환자는 또한 예를 들어 제대혈 세포들, 성인 혈 세포들, 말초 혈 세포들 또는 골수 세포들과 같은 비처리된 줄기 또는 전구 세포들이 투여된다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법은 이미 이식된 줄기 세포에 대한 조절 효과를 야기하기 위하여 비조건화된 줄기 세포들 또는 전구 세포들의 수용체인 대상에 상기 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명은 제대혈(또는 제대혈로부터 얻은 줄기 세포), 말초(즉 성인) 혈(또는 말초 혈로부터 얻은 줄기세포)을 이식하는 것을 포함하는 골수 이식을 포함하고, 여기서 제대혈 또는 줄기 세포들은 본 발명의 화합물로 전처리되었다. 더욱이 본 발명은 본 발명의 화합물의 존재하에서 분화된 조혈성 전구 세포들로부터 제조된 백혈구 세포들의 용도를 포함한다. 예를 들어 조혈성 전구의 분화에 의하여 생성된 백혈구 세포는 이식에 사용될 수 있거나 이식 전에 제대혈또는 제대혈 줄기 세포들과 혼합될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 얻어진 CD34+ 또는 CD133+와 같은 초기 전구 세포를 이식하는 것을 포함하는 골수 이식을 포함하고 여기서 상기 전구 세포들은 본 발명의 화합물로 전처리되었다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 주지상 전구체들은 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구체 세포들이다. 더욱이 본 발명은 본 발명의 화합물 존재하에서 분화된 CD34+ 전구세포에서 제조된 세포의 용도를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 화합물을 사용하여 CD34+ 전구세포의 분화에 의하여 생성된 CD34+CD38-CD33+ 전구 세포들, CD34+CD38-CD33- 전구체 세포들, 과립구 등이 이식에 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 사용하여 CD 133+ 세포들로부터 분화된 세포들 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 더욱이 줄기 세포에 대한 냉동 보존의 해로운 효과 및 냉동보존제에 대한 노출을 극복하기 위하여 줄기 세포를 컨디셔닝하고 냉동보존하고 해동하는 방법을 포함한다. 일부 실시예에서 본 발명은 줄기 세포들의 증식 또는 이동 활성에 대한 냉동보존제(예를 들어 DMSO)의 노출에 해로운 효과를 극복하기 위하여 줄기 세포를 컨디셔닝하고 냉동보존하고 해동하는 방법을 제공한다.
4.1. 줄기 세포들 및 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포들의 분화 조절
4.1.1. 줄기 세포들
본 발명은 인간 줄기 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 방법은 인 비트로에서 상기 화합물로 상기 줄기 세포들을 배양하고 대상에 분화된 세포를 직접 이식하는 것을 포함하는 인 비트로에서 줄기 또는 전구세포 분화를 조절하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명의 방법은 비조건화된 줄기 세포의 수용체인 대상에 상기 화합물을 운반하는 것을 포함하는 인 비보에서 줄기 또는 전구 세포 분화를 조절하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 간엽, 조혈, 지방원성, 간원성, 신경성, 신경원성(gliogenic), 연골 원성, 혈관원성, 근원성, 골원성 계를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 특정한 세포 계로 분화가 유도될 수 있다. 일부 실시예에서 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 이식 및 엑스 비보 처리 프로토콜에 서 사용하기 위하여 분화가 유도된다. 일부 실시예에서 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 특정한 세포 타입으로 분화하기 위하여 유도되고 치료적 유전자 산물을 생산하기 위하여 유전공학적으로 조작된다.
특정한 실시예에서 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 분화를 유도하는 작은 유기 분자와 같은 화합물로 배양되고 대상에 분화된 세포의 직접 이식이 수행된다. 바람직한 실시예에서 줄기 세포들의 분화를 제어 또는 조절하는데 사용되는 화합물들은 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이토카인, 올리고뉴크레오타이드 또는 핵산들이 아니다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 줄기 세포들은 제대혈 세포들, 태반 세포들, 배아 줄기 세포들, 배아-유사 줄기 세포들, 영양막 줄기 세포들, 전구 세포들, 골수 줄기 세포들 및 만능, 다기능 및 전능 세포를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
특히 본 발명의 방법은 간엽 줄기 세포외에 줄기 세포군을 특정한 조직계로 분화하는 것을 조절하는 것을 포함한다. 예를 들어 본 발명의 방법은 특정한 근골 재생 및 회복, 신혈관신생 및 심근, 골격근과 같은 특정한 근육 조직의 재군집(repopulation) 및 뇌, 철수, 간, 허파, 신장, 췌장을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 여러 기관의 혈관재생을 촉진하여 다기능 줄기 세포를 연골원성, 혈관원성, 근원성 및 골원성 계 세포로 분화하는 것을 조절하기 위하여 채택될 수 있다. 본 발명의 방법들은 다기능 줄기 세포를 지방원성, 연골원성, 골원성, 신경원성 또는 간원성 계로 분화하는 것을 조절하기 위하여 채택될 수 있다.
분화를 조절하기 위하여 사용된 약제는 태반 배양시에 세포들의 분화를 유도하기 위하여 산후 관류된 태반으로 공급될 수 있다. 대안적으로 상기 약제는 세포들이 수집되거나 태반으로부터 제거된 후에 인 비트로에서 분화를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법들은 또한 이들 세포들이 조혈 계로 분화를 야기하기에 충분한 기간동안 본 발명의 화합물로 인 비트로에서 전구 줄기 세포들을 배양하는 것을 포함하는 전구 줄기 세포가 조혈 계의 세포로 분화를 조절하는 것을 포함한다. 특히 본 발명의 방법들은 CD34+, CD133+, 및 CD45+ 조혈 전구 세포에서 용량 의존적인 형태로 혈 세포 콜로니 형성의 형성을 조절하기 위하여 사용될 수 있다(용량에 대해서는 4.7 참조).
바람직하게는 본 발명의 방법들은 적혈구 세포 또는 조혈 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특이적으로 억제하는 반면에 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성을 모두 증가시키고 전체 콜로니 형성 단위 생성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법들은 골수 접목의 속도 및 백혈구 및/또는 혈소판 생성의 회복을 촉진하여 조혈 줄기 세포 이식의 현저한 잇점을 제공하여 줄기 세포들의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있을 뿐 아니라 콜로니 형성의 속도를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 예를 들어 신경 전구 세포 또는 신경 모세포가 감각 뉴런(예를 들어 레티날 세포, 후각 세포, 기계감각 뉴런, 화학감각 뉴런 등), 운동 뉴런, 피질 뉴런 또는 인터뉴런과 같은 특정한 뉴런 세포로 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 콜린작동성, 도파민작동성, GABA작동성 뉴런, 교 세포(수초를 생성하는 핍지신경교를 포함하는) 및 상의 세포(뇌실에 있는)을 포함하는 이에 한정되지 아니하는 세포 타입의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시예들에서 본 발명의 방법들은 심장의 퍼킨제 세포, 간의 담관 상피, 췌장의 베타-섬 세포, 신장 피질 또는 수질 세포들 및 눈의 망막 광수용체 세포들을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 기관의 구성체인 세포의 분화를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법들에 따라 얻어진 줄기 세포들의 분화상태의 측정은 세포 표면 마커들의 존재에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 배아-유사 줄기 세포는 OCT-4+ 및 ABC-pt 세포 표면 마커에 의하여 구별될 수 있다. 더욱 본 발명은 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, SH3. SH4, OCT-4 및 ABC-p 마커를 갖거나상기에서 언급한 바와 같이 CD34, CD38, CD45, SSEA3 및 SSEA4와 같은 세포 마커가 없는 배아-유사 줄기 세포들을 포함한다. 그러한 세포 표면 마커들은 당업계에서 알려진 방법들 예를 들어 후로우 사이토메트리 후에 세척 및 항-세포 표면 마커 항체로 염색하는 방법에 따라 결정된다. 예를 들어 CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위하여 세포들을 PBS로 세척하고 항-CD34 피코에리쓰린 및 항-CD38 후로르신 이소싸이오씨아나이트(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 이중염색하였다.
4.1.2. CD34+ 및 CD133+ 초기 전구 세포들
본 발명은 또한 인간 CD34+ 또는 CD133+ 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서 본 발명의 방법들은 인 비트로에서 상기 화합물로 줄기 세포들을 배양하고 대상에 배양된 세포들을 직접 이식하는 것을 포함하는 인 비트로에서 줄기 또는 전구 세포 분화의 조절을 포함한다.
본 발명의 방법들에 의하여 얻어진 전구 세포들은 CD34+ 전구 세포들, 골수 또는 과립구 계 및 CD133+ 세포들, 내피 또는 신경 세포 곌르 포함하나 이에 한정되지 아니하는 특정한 세포 계로 분화를 유도할 수 있다. 일부 실시예에서 전구 세포들은 이식 및 엑스 비보 치료 프로토콜에 사용되기 위하여 분화를 유도할 수 있다. 일부 실시예에서 전구 세포들은 특정한 세포 타입으로 분화하기 위하여 유도되고 치료적 유전자 산물을 생산하기 위하여 유전공학적으로 조작된다. 특정한 실시예에서 전구 세포들은 분화를 유도하는 작은 유기 분자와 같은 화합물로 배양되고 대상에 분화된 세포의 직접 이식이 수행된다. 바람직한 실시예에서 전줄기 세포들의 분화를 제어 또는 조절하는데 사용되는 화합물들은 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이토카인, 올리고뉴크레오타이드 또는 핵산들이 아니다. 또 다른 바람직한 실시예에서 전구 세포들은 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포로 분화를 야기한다.
바람직하게는 본 발명의 방법들은 적혈구 세포 또는 조혈 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특이적으로 억제하는 반면에 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성을 모두 증가시키고 전체 콜로니 형성 단위 생성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법들은 골수 접목의 속도 및 백혈구 및/또는 혈소판 생성의 회복을 촉진하여 조혈 줄기 세포 이식의 현저한 잇점을 제공하여 줄기 세포들의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있을 뿐 아니라 콜로니 형성의 속도를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 CD34+ 전구 세포들을 CD1a+ 세포 특히 CD86+CD1a+ 세포들로 분화하는 것을 감소하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 CD34+ 전구 세포들을 CD14+CD1a- 세포들로 분화하는 것을 저해하거나 감소하는데 사용될 수 있다. CD14+CDla-세포들은 피부 수지상 세포 또는 단핵구/마크로파지 전구 세포들이다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 동시자극 분자인 CD80 및 CD86의 CD34+ 전구 세포들을 증식하는 것에 대한 발현을 감소하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 증식하는 CD34+ 전구 세포들을 CD54brigh세포들로 분화하고 CD54dim세포들로 분화하는 것을 촉진하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 증식하는CD133+ 세포들의 수를 증가시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 증식하는 CD34+ 전구 세포들을 CD11c-CD 15+ 세포로 분화를 감소시키고, CD11c+CD 15- 세포로 분화를 증가시켜서 골수 수지상 세포 계에서 과립구 계로 분화를 이동시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법들에 따라 얻어진 줄기 세포들의 분화상태의 측정은 세포 표면 마커들의 존재에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 전구 세포는 CD34+ 및 CD133+ 세포 표면 마커에 의하여 구별될 수 있다. 더욱 본 발명은 대조군에 비하여 하나 이상의 상기에서 언급한 바와 같은 CD15, CD34, CD33, CD133, 또는 CD54dim을 포함하거나, 증가된 발현을 보이는 증식하는 전구 세포들을 포함한다. 본 발명은 대조군에 비하여 하나 이상의 HLA-DR, CD1a, CD11c, CD38, CD80, CD86, CD54bright또는 CD14가 결핍되거나, 감소된 발현을 보이는 증식하는 전구 세포들을 포함한다. 바람직한 실시예에서 본 발명의 증식하는 전구 세포들은 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33-를 나타낸다. 그러한 세포 표면 마커들은 당업계에서 알려진 방법들 예를 들어 세척 및 항-세포 표면 마커 항체로 염색한 후에 후로우 사이토메트리하는 방법에 따라 결정된다. 예를 들어 CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위하여 세포들을 PBS로 세척하고 항-CD34 피코에리쓰린 및 항-CD38 후로르신 이소싸이오씨아나이트(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 이중염색하였다.
일부 실시예에서 분화된 세포들은 분화된 세포들의 패고사이틱 능력을 규명하여 규명될 수 있다. 패코사이토스로 분화되거나 분화되는 능력은 예를 들어 FITC로 덱스트란을 표지하고 공지된 방법들에 의하여 업테이크 양을 측정하여 측정할 수 있다. T 세포 자극하는 능력에 대하여 분화되고 분화하는 세포들의 능력은 항원-로딩된 세포와 T 세포를 혼합하고 T 세포 활성화의 레벨을 결정하는 혼합 백혈구 반응(MLR)에서 측정될 수 있다.
4.1.3. 세포들의 동정화 및 특성화
일부 실시예에서 분화된 세포들은 차별적으로 발현되는 유전자들(예를 들어 관심있는 비분화된 전구 세포에서 유전자 풀 대 전구세포로부터 유래한 분화된 세포에서 유전자 풀을 규명하는)에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어 PCR과 같은 핵산 증폭 방법 또는 전사-기초한 증폭 방법(예를 들어 인 비트로 전사(IVT))가 예를 들어 폴리뉴크레오타이드 마이크로어레이의 사용에 의하여 세포의 여러 군들의 유전자 발현을 프로화일하는데 사용될 수 있다. 그러한 차별적인 유전자 발현을 프로화일하는 방법은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어 Wieland 외, Proc. Natl. Acad: Sci. USA 87: 2720-2724 (1990; Lisitsyn 외, Science 259: 946-951 (1993); Lisitsyn 외, Meth. Enzymology 254: 291-304 (1995); 미국특허 5,436,142 ; 미국 특허 5,501,964; Lisitsyn 외, Nature Genetics 6: 57-63 (1994); Hubank 및 Schatz, 1994, Nucleic Acids Research 22: 5640-5648 ; Zeng 외, 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385 ; 미국특허 5,525,471 ; Linsley 외, "RNA 증폭 방법"이란 제목의 미국 특허 6,271,002, 2001년 8월 7일 등록 ; Van Gelder 외, "프로모터를 이용한 유전자 조작 방법"이란 제목의 미국 특허 5,716,785, 1998년 2월 10일 등록; Stoflet 외, 1988, Science 239: 491-494,1988; Sarkar 외 Sommer,1989, Science 244: 331-334; Mullis 외, 미국 특허 4,683,195; Malek 외, 미국 특허 5,130,238; Kacian 외 Fultz, 미국 특허 5,399,491; Burg 외, 미국특허 5,437, 990; R. N Van Gelder 외. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,1663 ; D. J. Lockhart 외, 1996, Nature Biotechnol. 14,1675 ; Shannon, 미국 특허 6,132,997; Lindemann 외, "감소 교잡화 및 차이 분석 방법"이란 표제의 미국 특허 6,235,503, 2001년 5월 22일 등록).
상업적으로 구입할 수 있는 키트들 예를 들어 유전자 발현을 프로화일하기 위한 젤-기초한 접근에 사용되는 키트들의 디스플레이 PROFILETM시리즈(Qbiogene, Carlsbad, CA)등이 사용가능하다. 상기 키트들은 진핵세포들에서 유전자 발현을 비교하기 위하여 Restriction Fragment Differential Display-PCR (RFDD-PCR)을 이용한다. 서브트랙티드 라이브러리에서 차별적으로 발현된 클론을 동정하기 위하여 PCR-Select Subtraction 키트(Clontech) 및 PCR-Select Differential Screening 키트(Clontech)도 사용될 수 있다. PCR-Select Subtraction 키트로 차별적으로 발현된 유전자들의 풀을 생성한 후에 PCR-Select Differential Screening 키트가 사용된다. 서브트랙티드 라이브러리는 테스터 및 드라이버 군으로부터 직접 합성된 프로브 서브트랙티드 cDNA에서 제조된 프로브 및 역-서브트랙티드 cDNA(역으로 수행된 2차 서브트랙션)에서 제조된 프로브로 교잡화하였다. 드라이버 프로브가 아니라 테스터와 교잡하는 클론들은 다르게 발현되지만 비-서브트랙티드한 프로브들은 적은 메세지를 검출하기에 충분한 만큼 민감하지 않다.
서브트랙티드 프로브들은 차별적으로 발현되는 cDNA들이 매우 풍부하나 가짜 양성 결과를 줄 수 있다. 제조업자(Clontech) 지시에 따라 양 서브트랙티드 및 비-서브랙티드 프로브들을 모두 사용하여 차별적으로 발현되는 유전자들을 동정한다.
또 다른 실시예에서 분화된 줄기 또는 전구 세포들은 당업계에게 통상적으로 알려진 예를 들어 Mesen Cult 배지(Stem Cell Technologies, INC., Vancouver British Columbia)와 같은 콜로니 형성 단위 분석에 의하여 동정되고 규명된다.
줄기 세포 또는 전구가 특정한 세포 형태로 분화되는 것을 결정하는 것은 당업계에게 통상적으로 알려진 방법 예를 들어 후로우 사이토메트리 또는 면역염색화학법(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-마커 항체들로 세포들을 염색), 광 또는 위상차 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사하거나 PCR 및 유전자 발현 프로화일과 같은 통상의 방법을 사용하여 유전자 발현의 변화를 측정하는 것과 같은 기술을 사용하여 형태나 세포 표면 마커들의 변화를 측정하는 방법에 의하여 달성될 수 있다.
4.2. 줄기 및 전구 세포 군들
본 발명은 인간 줄기 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 제대혈 세포들, 말초 혈, 성인 혈, 골수, 태반, 간엽 줄기 세포들 및 다른 소스를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 임의의 포유류 줄기 세포들이 본 발명의 방법들내에 사용될 수 있다.비 바람직한 실시예에서 상기 줄기 세포들은 배아 줄기 세포 또는 태반외 다른 소스로 분리된 세포들이다.
간엽 줄기 세포들의 소스는 골수, 배아 난황낭, 태반, 제대혈, 태아 및 청소년 피브 및 혈을 포함한다. 골수 세포들은 예를 들어 장골능, 훼모라(femora), 티비애(tibiae), 척추, 갈비 또는 다른 수질 공간들에서 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 줄기 세포들은 만능 세포 즉 조직 내에서 스스로 재생되고 휴지 또는 비활성을 유지할 수 있는 완전한 분화 다양성을 갖는 세포를 포함할 수 있다. 상기 줄기 세포들은 다기능 세포 또는 단분화성 혈구 발생(committed)전구 세포들, 소섬유아세포(fibroblastoid) 세포를 포함할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서 본 발명은 다기능 또는 만능 줄기 세포들의 회수를 야기하는 성공적인 출산 및 태반 밀어내기, 방혈, 관류 후에 회수될 수 있는 전기간 관류된 태반에서 분리된 생존하고 비활성을 유지하는 다기능 줄기 세포들인 줄기 세포를 이용한다.
줄기 세포군들은 상업적인 서비스를 통하여 얻어진 태반 줄기 세포들 예를 들어 LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ), ViaCord (Boston MA), Cord Blood Registry (San Bruno, CA) 및 Cryocell (Clearwater, FL)를 포함할 수 있다.
줄기 세포군들은 또한 미국특허출원번호 20020123141(2002년 9월 5일 공개, 제목은 '태반 줄기 세포 수집 방법") 및 미국특허출원번호 20030032179(2003년 2월 13일 공개, 제목은 "산후 포유류 태반 및 그것의 용도 및 그것으로부터 태반 줄기 세포들")에 기재된 방법에 따라 수집된 태반 줄기 세포를 포함할 수 있다.
일 실시예에서 제대혈로부터 얻은 줄기 세포가 사용될 수 있다. 태반으로부터 온 혈의 첫번 수집을 제대혈이라 하고 주로 CD34+ 및 CD38+ 전구 세포를 포함한다. 산후 관류의 첫 24시간내에 고농도의 CD34+CD38- 조혈 전구세포가 태반으로부터 분리될 수 있다. 약 관류 24시간 후에 고농도의 CD34-CD38- 세포들이 태반으로부터 상기 언급한 세포를 따라서 분리될 수 있다. 분리된 관류된 본 발명의 태반은 CD34+CD38-줄기 세포 및 CD34-CD38+ 줄기 세포들이 풍부한 많은 양의 줄기 세포들의 공급원을 제공한다: 24시난 또는 그 이상 관류된 분리된 태반은 CD34- 및 CD38- 줄기 세포가 풍부한 많은 양의 줄기 세포들의 공급원을 제공한다.
본 발명에서 사용되어지는 바람직한 세포는 방혈된 관류된 태반 또는 배아-유사 태반 줄기 세포들로부터 유래한 배아-유사 줄기 세포들이다. 본 발명의 배아-유사 줄기 세포는 후로우 사이토메트리 및 면역 조직화학염색과 같은 기술을 사용한 세포 표면 마커 및 형태의 변화 및 PCR과 같은 기술을 사용한 유전자 발현의 변화를 측정하여 규명할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 그러한 배아-유사 줄기 세포는 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, OCT-4 및 ABC-p와 같은 세포 표면 마커들의 존재 또는 CD34, CD38, CD45, SSEA3 및 SSEA4와 같은 세포 표면 마커들의 부재에 의하여 규명될 수 있다. 바람직한 실시예에서 그러한 배아-유사 줄기 세포는 OCT-4 및 ABC-p와 같은 세포 표면 마커들의 존재에 의하여 규명될 수 있다. 그러한 세포 표면 마커들은 당업계에서 알려진 방법들 예를 들어 후로우 사이토메트리 후에 세척 및 항-세포 표면 마커 항체로 염색하는 방법에 따라 결정된다. 예를 들어 CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위하여 세포들을 PBS로 세척하고 항-CD34 피코에리쓰린 및 항-CD38 후로르신 이소싸이오씨아나이트(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 이중염색하였다.
배아-유사 줄기 세포는 배아에서 유래한 것이 아니라 배아 줄기 세포의 특징을 갖는 태반에서 유래한다. 다른 말로 본 발명은 산후 관류된 태반으로부터 분리된 비분화된 줄기 세포들인 OCT-4+ 및 ABC-p+ 세포의 사용을 포함한다. 그러한 세포들은 인간 배아 줄기 세포들로 유용(즉 만능)하다. 상기에서 언급한 바와 같이 다수의 여러 만능 또는 다기능 줄기 세포들은 여러 시간에서 관류된 태반 예를 들어 CD34+ CD38+, CD34+ CD38- 및 CD34-CD38- 조혈세포로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 인간 태반이 배아-유사 줄기 세포의 공급원으로 산후에 사용된다.
예를들어 자궁에서 밀어낸 후에 태반은 아폽토시스를 예방하거나 감소하기 위하여 가능한한 빠르게 방혈한다. 그 후에 방혈 후 가능한 빠르게 태반은 기관에 존재하는 다른 물질 인자, 단백질, 잔류 세포들 및 피를 제거하기 위하여 관류한다. 물질 찌거기도 태반으로부터 제거될 수 있다. 관류는 통상적으로 적어도 2에서 24시간 이상 동안 적당한 관류액을 가지고 계속한다. 몇몇 부가적인 실시예에서 태반은 적어도 4,6,8,10,12,14, 16,18, 20 및 22 시간 동안 관류한다. 다른 말로 본 발명은 충분한 시간동안 방혈 및 관류(perfusion)에 의하여 산후 태반의 세포들이 활성화될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서 본 태반은 의약 개발, 질병의 치료 및 예방, 특히 이식 수술이나 치료 및 발생된(committed) 세포, 조직 및 소기관의 생성을 포함하는 연구에 사용될 수 있는 배아-유사 줄기 세포의 풍부한 공급원으로 사용될 수 있다. 출원번호10/004, 942(2001년 12월 5일 출원, "태반 줄기 세포의 수집 방법") 및 출원번호 10/076,180(2002년 2월 13일 출원, "산후 포유류 태반, 그것의 용도 및 그것으로부터 태반 줄기 세포")를 참조.
배아-유사 줄기 세포들은 태반 동맥 및/또는 정맥을 이용하는 관류 기술을 사용하여 얻어진 태반으로부터 추출된다. 태반은 바람직하게 방혈 및 잔류 혈(잔류 제대혈)의 수집에 의하여 얻어진다. 얻어진 태반은 그 후에 회수되는 유조직 및 혈관외 공간 내에서 잔류하는 엑스 비보 내추럴 바이오리엑터 환경을 형성하기 위한 방법으로 가공된다. 배아-유사 줄기 세포들은 빈 마이크로순환으로 이동하고 거기서 본 발명에 따라서 그들은 수집되고 바람직하게는 관류에 의하여 수집된 혈관속으로 세척에 의하여 수집된다.
특히 본 발명의 일부로 생각되는 것은 CD34+ 및 CD133+ 전구 세포가 골수 세포, 특히 수지상 또는 과립상 세포로 조절이다. 최근 보고는 그러한 세포들이 만능이어서 본 발명은 이들 전구가 뇌, 신장, 장, 간 또는 근육 세포로 발생하는 것을 조절하는 것을 생각할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있는 포유류, 조류 또는 파충류 CD34+ 또는 CD133+ 줄기 또는 전구 세포는 제대혈, 말초 혈 성인 혈, 골수, 관류된 태반을 포함하는 태반, 간엽 줄기 세포 및 다른 공급원을 포함하나 이에 한정되지 아니한다(출원번호 20030032179, 2003년 2월 13일 출원, "산후 포유류 태반, 그것의 용도 및 그것으로부터 태반 줄기 세포"를 참조). 바람직한 실시예에서 상기 줄기 세포는 조혈 줄기 세포들 또는 골수로부터 분리된 세포들이다. 그러한 세포들은 다른 조직 또는 기관으로부터 얻을 수 있으나 그러한 공급원은 덜 바람직하다.
일 실시예에서 제대혈 또는 산후 태반으로부터 온 전구 세포들이 사용될 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이 제대혈은 주로 CD34+ 및 CD38+ 조혈 전구세포를포함한다. 산후 관류의 첫 24시간내에 고농도의 CD34+ CD38- 조혈 전구 세포들이 분리된 관류된 태반으로부터 분리될 수 있다. 약 24시간 관류 후에 고농도의 CD34+ CD38- 세포들이 상기언급한 세포들을 따라 태반으로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서 전구 세포군은 LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ), ViaCord (Boston MA), Cord Blood Registry (San Bruno, CA) 및 Cryocell(Clearwater, FL)과 같은 상업적인 서비스를 통하여 얻을 수 있다.
4.3. 본 발명의 화합물
본 발명에 사용된 화합물은 라세미 화합물(racemic), 스테레오메릭하게 순수하거나 또는 스테레오메릭하게 풍부한 선택적인 사이토카인 억제제, 선택적인 사이토카인 억제 활성을 갖는 스테레오메릭하거나 이성질체적으로(enantiomerically) 순수한 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그를 포함한다. 본 발명에 사용되는 바람직한 화합물로서 셀젠사의 Selective Cytokine Inhibitory Drugs(SelCIDsTM)가 알려져 있다.
달리 언급하지 않았다면, 본 발명에서 사용된 "SelCIDsTM"이라는 용어는 저분자량의 약제, 예를 들어 펩타이드, 프로테인, 핵산, 올리고사카라이드 또는 다른 거대분자가 아닌 작은 유기 분자를 포함한다. 바람직한 화합물은 TNF-α 생산을 억제한다. 더욱이, 화합물은 IL1β 및 IL12를 유도하는 LPS에 대한 적절한 억제 효과를 또한 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 포텐트 PDE4 억제제이다.PDE4는 인간의 골수 및 림프계 선형세포(lineage cell)에서 발견되는 주된 포스포디에스테라아제 동종효소의 하나이다. 상기 효소는 편재하는 2차 메센저인 cAMP를 저하시키고 낮은 세포내 레벨에서 이를 유지하므로서 세포 활성을 조절하는 중대한 역할을 한다. 이론에 제한됨이 없이, PDE4의 억제 활성은 cAMP 레벨을 증가시켜 림프구 내에서 뿐만 아니라 단핵세포 내에서의 TNF-α 생산을 억제하는 것을 포함한, 사이토카인을 유도하는 LPS의 조정을 이끈다.
선택적인 사이토카인 억제 제제의 특정 예로서 미국 특허 제5,605,914호에 공개된 환상 이미드; 미국 특허 제5,728,844호 및 제5,728,845호의 사이클로알킬 니트릴; 미국 특허 제5,801,195 및 제5,736,570호의 아릴 아미드(예를 들어 N-벤조일-3-아미노-3-(3',4'-디메톡시페닐)-프로판아미드의 구현체); 미국 특허 제5,703,098호에 공개된 이미드/아미드 에테르 및 알코올(예를 들어, 3-프탈이미도-3-(3',4'-디메톡시페릴)프로판-1-올); 미국 특허 제5,658,940호에 공개된 숙신이미드 및 말레이미드(예를 들어 메틸 3-3',4',5',6'-페트라하이드로프탈이미도)-3-(3'',4''-디메톡시페닐)프로피오네이트); WO99/06041에 개시된 이미도 및 아미도 치환된 알카노하이드록사믹 에시드 및 미국 특허 제6,020,358호에 개시된 치환 페네틸술폰(phenethylsulfones); 및 미국 특허 제6,046,221호에 개시된 N-벤조일-3-아미노-3-(3',4',디메톡시페닐)프로판아미드와 같은 아릴 아미드를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 여기에 언급한 특허 및 특허출원 내용이 모두 레퍼런스로서 통합된다.
부가적인 선택적 사이토카인 억제 약제가 합성 화학 화합물의 패밀리에 포함된다. 대표적인 예로서, 3-(1,3-디옥소벤조-[f]이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)프로피온아미드 및 3-(1,3-디옥소-4-아자이소인돌-2-yl)-3-(3,4-디메톡시페닐)-프로피온아미드를 포함한다.
다른 특별한 선택적 사이토카인 억제 약제는 미국 특허 제5,698,579호 및 5,877,200호에 개시된 비펩타이드인 환상 아미드의 클래스에 속하며, 이들 특허는 모두 본 명세서에 통합된다. 대표적인 환상 아미드는 다음 화학식의 화합물을 포함한다;
여기서, n은 1, 2 또는 3이고;
R5는 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아크릴아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 1 내지 4의 치환체로 치환 또는 비치환된 o-페닐렌이고;
R7는 i) 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노,탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 하나 이상의 치환체로 치환된 페닐 또는 비치환 페닐이고, (ii) 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 1 내지 3의 치환체로 치환 또는 비치환된 벤질이고, (iii) 나프닐 또는 (iv) 벤질옥시이고;
R12는 -OH, 탄소수가 1 내지 12인 알콜시 또는이고,
R8은 수소 또는 탄소수가 1 내지 10인 알킬이고;
R9는 수소 또는 탄소수가 1 내지 10인 알킬, -COR10, 또는 -SO2R10으로서 R10은 수소, 탄소수가 1 내지 10인 알킬 또는 페닐이다.
이 클래스의 특정한 화합물은 다음 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
3-페닐-2-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온산;
3-페닐-2-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온아미드;
3-페닐-3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온산;
3-페닐-3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온아미드;
3-(4-메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-yl)프로피온산;
3-(4-메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-yl)프로피온아미드;
3-(3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-2-yl)프로피온산;
3-(3,4-디메톡시-페닐)-3-(1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-yl)-프로피온아미드;
3-(3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-2-yl)프로피온아미드;
3-(3,4-디에톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌린-yl)프로피온산;
메틸 3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)프로피오네이트;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)프로피온산;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-프로폭시-4-메톡시페닐)프로피온산;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-부톡시-4-메톡시페닐)프로피온산;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-프로폭시-4-메톡시페닐)프로피온아미드;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-부톡시-4-메톡시페닐)프로피온아미드;
메틸 3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-부톡시-4-메톡시페닐)프로피오네이트; 및
메틸 3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-프로폭시-4-메톡시페닐)프로피오네이트.
다른 특정한 선택적 사이토카인 억제 약제는 WO/ 99/06041에 개시된 이미도 및 아미도 치환 알카노하이드록스아믹산을 포함하며, 이는 본 명세서에 통합된다.이러한 화합물은 다음의 화합물을 포함하나 이에 한정하지 않는다;
여기서, R1및 R2는 각각 서로 독립적일 때 수소 또는 낮은 탄소수의 알킬이고, 또는 R1및 R2각각이 묘사된 탄소 원자에 서로 결합되어 있을 때 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 아크릴아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 1 내지 4의 치환체로 치환 또는 비치환된 o-페닐렌, o-나프틸렌 또는 사이클로헥센-1,2-diyl이고;
R3는 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시, 탄소수 1 내지 10인 알킬티오(alkylthio), 벤질옥시, 탄소수 3 내지 6인 사이클로알콕시, C4-C6-사이클로알킬리덴메틸, C3-C10-알킬리덴메틸, 인다닐옥시(indanyloxy) 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐이고;
R4는 수소, 탄소수가 1 내지 6인 알킬, 페닐 또는 벤질이고,
R4'는 수소, 탄소수가 1 내지 6인 알킬이고,
R5는 -CH2-, -CH2-CO-, -SO2-, -S- 또는 -NHCO-이고;
n은 0, 1 또는 2이고; 및
상기 화합물의 산 부가 염은 프로토네이트될 수 있는 질소 원자를 함유한다.
본 발명에 사용되는 부가적이고 특이적인 선택적 사이토카인 억제 약제는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-메톡시-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-프탈이미도프로피온아미드;
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(3-니트로프탈이미도)프로피온아미드;
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-프탈이미도프로피온아미드;
N-하이드록시-3-(3,4-디메톡시페닐)-3-프탈이미도프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(3-니트로프탈이미도)프로피온아미드;
N-하이드록시-3-(3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(4-메틸-프탈이미도)프로피온아미드;
3-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-프탈이미도프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(1,3-디옥소-2,3-디하이드로-1H-벤조[f]이소인돌-2-yl)프로피온아미드;
N-하이드록시-3-{3-(2-프로폭시)-4-메톡시페닐}-3-프탈이미도프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(3,6-디플루오로프탈이미도)-N-하이드록시프로피온아미드;
3-(4-아미노프탈이미도)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시프로피온아미드;
3-(3-아미노프탈이미도)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시프로피온아미드;
N-하이드록시-3-{3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드; 및
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(3-니트로프탈이미도)프로피온아미드.
본 발명에 사용되는 부가적인 선택적 사이토카인 억제 약제는 페닐 그룹 위에 옥소이소인딘 그룹으로 치환된 펜에틸술폰(phenethylsulfones)을 포함한다. 이러한 화합물은 미국 특허 제6,020,358호에 개시된 다음과 같은 화합물들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
여기서, *로 표시된 탄소원자는 키랄리티(chirality)의 중심을 구성한다;
Y는 C=O, CH2, SO2, 또는 -CH2C=O이고; R1, R2, R3및 R4는 각각 서로 독립적으로 수소, 할로겐 원소, 탄소수가 1 내지 4인 알킬, 탄소수가 1 내지 4인 알콕시, 니트로, 시아노, 하이드록시 또는 -NR8R9이고; 묘사된 페닐렌 고리의 인접한 탄소 원자 위의 R1, R2, R3및 R4중의 어떤 2개는 나프탈렌이고;
R5및 R6은 각각 서로 독립적으로 수소, 탄소수가 1 내지 4인 알킬, 탄소수가 1 내지 4인 알콕시, 니트로, 시아노 또는 탄소수가 18까지인 사이클로알콕시이고;
R7는 하이드록시, 탄소수가 1 내지 8인 알킬, 페닐, 벤질 또는 NR8'R9'이고;
R8및 R9은 각각 서로 독립적일때 수소, 탄소수가 1 내지 8인 알킬, 페닐 또는 벤질이고, R8및 R9중의 하나가 수소이고 다른 하나는 COR10또는 -SO2R10이거나, 또는 R8및 R9가 모두 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH2CH2X1CH2CH2-(X1은 -O-, -S- 또는 -NH-임)이고;
R8'및 R9'은 각각 서로 독립적일때 수소, 탄소수가 1 내지 8인 알킬, 페닐 또는 벤질이거나, R8'및 R9'중의 하나가 수소이고 다른 하나는 COR10'또는 -SO2R10'이거나, 또는 R8'및 R9'가 모두 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH2CH2X2CH2CH2-(X2는 -O-, -S- 또는 -NH-임)이다.
전술한 화합물들이 펜에틸술폰일 때를 가정한다면, 이들은 R7가 NR8'R9'일때 술폰아미드를 포함한다.
이러한 화합물들의 특정한 그룹들로서 Y가 C=O 또는 CH2인 화합물들이 있다.
이러한 화합물들의 더욱 특정한 그룹들로는 R1, R2, R3및 R4가 각각 서로 독립적으로 수소, 할로겐 원소, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 니트로, 시아노, 하이드록시 또는 -NR8R9인 화합물들이 있으며, 이 때, R8및 R9는 서로 독립적으로 수소 또는 메틸이거나, R8및 R9중의 하나는 수소이고 나머지 하나는 -COCH3이다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 -NH2이고 R1, R2, R3및 R4의나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 -NHCOCH3이고 R1, R2, R3및 R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 -N(CH3)2이고 R1, R2, R3및R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
이러한 화합물의 더욱 바람직한 그룹으로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 메틸이고 R1, R2, R3및 R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 플루오로이고 R1, R2, R3및 R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R5및 R6가 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 사이클로펜톡시 또는 사이클로헥소시인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R5가 메톡시이고, R6는 모노사이클로알콕시, 폴리사이클로알콕시 또는 벤조사이클로알콕시인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R5가 메톡시이고, R6는 에톡시인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 하이드록시, 메틸, 에틸, 페닐, 벤질 또는 NR8'R9'이고, R8'및 R9'은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 메틸인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 메틸, 에틸, 페닐, 벤질 또는 NR8'R9'이고, R8'및 R9'은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 메틸인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 메틸인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 NR8'R9'이고, R8'및 R9'은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 메틸인 화합물들이 있다.
다른 특정한 선택적 사이토카인 억제 약제들은 2002년 12월 30일 출원된 뮬러 등의 미국 가출원 제60/436,975호에 기재된, 플루오로알콕시-치환된 1,3-디하이드로-이소인돌릴 화합물을 포함하며, 이 문헌 전체가 본 발명의 레퍼런스로서 통합된다. 대표적인 플루오로알콕시-치환된 1,3-디하이드로-이소인돌릴 화합물들은 다음 화합물을 포함한다.
여기서,
Y는 -C(O)-, -CH2,-CH2C(O)-,-C(O)CH2- 또는 SO2;
Z는 -H, -C(O)R3, -(C0-1-알킬)-SO2-(C1-4-알킬), -C1-8-알킬, -CH2OH, CH2(0)(C1-8-알킬) 또는 -CN;
Rl및 R2는 각각 서로 독립적으로 -CHF2, -C1-8-알킬, -C3-18-사이클로알킬 또는 -(C1-10-알킬)(C3-18-사이클로알킬)로서 Rl및 R2중 적어도 하나는 CHF2이고;
R3는 -NR4R5,-알킬, -OH,-O-알킬, 페닐, 벤질, 치환된 페닐 또는 치환된 벤질이고;
R4및 R5는 각각 서로 독립적으로 -H, -C1-8-알킬, -OH 또는 -OC(O)R6이고,
R6는 -C1-8-알킬, -아미노(C1-8-알킬), -페닐, -벤질, 또는 -아릴이고,
Xl, X2, X3및 X4는 각각 서로 독립적으로 -H, -할로겐,-니트로, -NH2, -CF3, -C1-6-알킬, -(CO-4-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-4-알킬)-NR7R8, (C0-4-알킬)-N(H)C(O)-(R8), (CO-4-알킬)-N(H)C(O)N(R7R8), (CO-4-알킬)-N(H)C(O)O(R7R8), (CO-4-알킬)-OR8, (CO-4-알킬)-이미다조일, (C0-4-알킬)-피롤릴, (CO-4-알킬)-옥사디아졸릴 또는 (CO-4-알킬)-트리아졸릴 또는 Xl, X2, X3및 X4중의 2개가 함께 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 링을 형성하고(예를 들어, Xl과 X2, X2와 X3, X3와 X4, X1과 X3, X2와 X4또는 X1과 X4가 방향족인 3, 4, 5, 6 또는 7 멤버 링을 형성하여, 이소인돌릴 링을 갖는 바이사이클릭 시스템을 형성할 수 있다); 및
R7및 R8는 각각 서로 독립적으로 H, C1-9-알킬, C3-6-사이클로알킬, (C1-6-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C1-6-알킬)-N(R7R8), (C1-6-알킬)-OR8, 페닐, 벤질 또는 아릴;
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그.
바람직한 화합물은 다음 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-프로피온산;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-프로피온아미드;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-N-하이드록시-프로피온아미드;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(7-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-[7-(사이클로프로판카르보닐-아미노)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl]-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산;
3-[7-(사이클로프로판카르보닐-아미노)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl]-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산;
사이클로프로판카르복실산{2-[2-카르바모일-1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
사이클로프로판카르복실산{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-디메틸카르바모일-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
사이클로프로판카르복실산{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-하이드록시카르바모일-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온아미드;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N-하이드록시-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N-하이드록시-프로피온아미드;
사이클로프로판카르복실산{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
N-{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-1,3-디옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아세트아미드; 및
사이클로프로판카르복실산{2-[2-카바모일-1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-에틸]-7-chloro-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드.
다른 선택적인 사이토카인 억제 약제는, 뮬러 등에 의해 2003년 3월 12일 출원되고 본 명세서에 그 전체가 레퍼런스로서 통합되는 미국특허 가출원 제60/454,155호에 있는 7-아미도-치환된 이소인돌일 화합물을 포함한다. 대표적인 7-아미도-치환된 이소인돌일 화합물은 다음 구조식의 화합물을 포함한다:
여기서:
Y는 -C(O)-, -CH2, -CH2C(O)- 또는 SO2이고;
X는 H이고,
Z는 (C0-4-알킬)-C(O)R3 ,(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)-OH, (C1-4-알킬)-O(C1-4-알킬), (C1-4-알킬)-SO2(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)-SO(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)-NH2, (C0-4-알킬)-N(C1-8-알킬)2, (C0-4-알킬)-N(H)(OH), CH2NSO2(C1-4-알킬)이고;
R1및 R2는 각각 독립적으로 C1-8-알킬, 사이클로알킬, 또는 (C1-4-알킬)사이클로알킬이고;
R3는 NR4R5, OH, 또는 O-(C1-8-알킬)이고;
R4는 H이고;
R5는 -OH, 또는 -OC(O)R6이고;
R6는 C1-8-알킬, 아미노-(C1-8-알킬), (C1-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), C3-6사이클로알킬, 페닐, 벤질 또는 아릴이고;
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그; 또는 다음 화학식:
여기서:
Y는 -C(O)-, -CH2, -CH2C(O)-, 또는 SO2이고;
X는 할로겐, -CN, -NR7R8, -NO2, 또는 -CF3이고,
W는
Z는 (C0-4알킬)-SO2(C1-4-알킬), -(C0-4알킬)-CN, -(C0-4알킬)-C(O)R3, C1-4-알킬, (C0-4-알킬)OH, (C0-4-알킬)O(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)SO(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)NH2, (C0-4-알킬)N(C1-8-알킬)2, (C0-4-알킬)N(H)(OH), 또는 (C0-4-알킬)NSO2(C1-4-알킬)이고;
W는 -C3-6-사이클로알킬, -(C1-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), -(C0-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬)-NR7R8, (C0-8-알킬)-NR7R8, (C0-4-알킬)-CHR9-(C0-4-알킬)-NR7R8이고,
R1및 R2는, 각각 독립적으로 C1-8-알킬, 사이클로알킬, 또는(C1-4-알킬)사이클로알킬이고;
R3는 C1-8-알킬, NR4R5, OH, 또는 O-(C1-8-알킬)이고;
R4및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-8-알킬, (C0-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), OH, 또는 -OC(O)R6
R6는 C1-8-알킬, (C0-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), 아미노-(C1-8-알킬), 페닐, 벤질 또는 아릴이고;
R7및 R8는 각각 독립적으로 H, C1-8-알킬, (C0-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), 페닐, 벤질, 아릴, 또는, 그들을 연결하는 원자들과 함께 결합하여 3 내지 7 멤버의 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴 링을 형성할 수 있고;
R9는 C1-4-알킬, (C0-4-알킬)아릴, (C0-4-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-4-알킬)-헤테로사이클;
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그.
또 다른 선택적인 사이토카인 억제 약제는, 뮬러 등에 의해 2003년 3월 12일에 출원되고 본 명세서에 그 전체가 레퍼런스로서 통합되는 미국특허 가출원 제60/454,149호에 있는 N-알킬-하이드록스아민산-이소인돌일 화합물을 포함한다. 대표적인 N-알킬-하이드록스아민산-이소인돌일 화합물은 다음 식의 화합물을 포함한다:
여기서:
Y는 -C(O)-, -CH2, -CH2C(O)- 또는 SO2이고;
R1및 R2는 서로 독립적으로 C1-8-알킬, CF2H, CF3, CH2CHF2, 사이클로알킬, 또는(C1-8-알킬)사이클로알킬이고;
Z1는 H, (C1-6-알킬), -NH2-NR3R4또는 OR5이고;
Z2는 H 또는 C(O)R5이고;
X1, X2, X3및 X4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, NO2, OR3, CF3, C1-6-알킬, (C0-4-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-4-알킬)-N-(R8R9), (C0-4-알킬)-NHC(O)-(R8), (C0-4-알킬)－NHC(O)CH(R8)(R9), (C0-4-알킬)-NHC(O)N(R8R9), (C0-4-알킬)-NHC(O)O(R8), (C0-4-알킬)-O-R8, (C0-4-알킬)-이미다조일, (C0-4-알킬)-피롤릴, (C0-4-알킬)-옥사디아조일, (C0-4-알킬)-트리아조일, 또는, (C0-4-알킬)-헤테로사이클이고;
R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-6-알킬, O-C1-6-알킬, 페닐, 벤질 또는 아릴이고;
R6및 R7는 서로 독립적으로 H 또는 C1-6-알킬이고;
R8및 R9는 각각 독립적으로 H, C1-9-알킬, C3-6-사이클로알킬, (C1-6-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-6-알킬)-N(R4R5), (C1-6-알킬)-OR5, 페닐, 벤질, 아릴, 피페리디닐, 피페리지닐, 피롤리디닐, 모드포리노(morpholino), 또는 C3-7-헤테로사이클로알킬; 및
이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그.
특정의 선택적인 사이토카인 억제 약제는 이하를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다:
2-[1(-3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]이소인돌린-1-one;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-(N,N-디메틸-아미노술포닐)에틸]이소인돌린-1-one;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]-5-니트로-이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]-4-니트로이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-아미노이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-5-메틸이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-5-아세트아미도이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-디메틸아미노이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-5-디메틸아미노이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]벤조[e]이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-메톡시이소인돌린-1,3-dione;
1-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸-아민;
2-[1-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]이소인돌린-1,3-dione; 및
2-[1-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-디메틸아미노이소인돌린-1,3-dione.
추가적인 선택적 사이토카인 억제 약제는, 뮬러 등에 의해 2002년 3월 20일에 출원된 미국특허 가출원 제60/366,515호 및 제60/366,516와 뮬러 등에 의해 2003년 1월 7일에 출원된 미국특허 가출원 제60/438,450호 및 제60/438,448호에 개시되어 있는 에난티오메리컬하게(enantiomerically) 순수한 화합물을 포함한다. 상술한 모든 출원들은 본 명세서에 레퍼런스로서 통합된다. 바람직한 화합물들은 2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-아세틸아미노이소인돌린-1,3-dione의 에난티오머 및 3-(3,4-디메틸옥시-페닐)-3-(1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온아미드의 에난티오머를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바람직한 선택적 사이토카인 억제 약제는 3-(3,4-디메톡시-페닐)―3-(1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온아미드 및 사이클로프로판카르복실산 {2-[1-(3-에톡시-4-메톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1 H-이소인돌-4-yl}-아미드인데, 이들은 셀젠사 워렌, NJ에서 입수할 수 있다. 3-(3,4-디메톡시-페닐)―3-(1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온아미드는 이하의 화학 구조를 가진다:
사이클로프로판카르복실산 {2-[1-(3-에톡시-4-메톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1 H-이소인돌-4-yl}-아미드는 이하의 화학 구조를 가진다:
본 발명의 화합물은 또한, cilomast, 테오필린, zardaverine, rolipram, 펜톡시필린, 에녹시몬(enoximone), 이소인돌-이미드, 페네틸술폰, 알카노하이드록스아민산, 비-폴리펩타이드 사이클릭 아미드, 옥소이소인돌, 이소인돌린, 인다졸, 헤테로치환된 피리딘, 디페닐피리딘, 아릴 티오펜, 아릴 푸란, 인덴, 3 치환 페닐, 프탈아지논, 벤젠술폰아미드, 테트라사이클릭 화합물 및 그 염, 솔베이트, 아이소머, 포접 화합물, 프로드러그, 하이드레이트 또는 유도체와 같은 PDE IV 활성을 저해하는 화합물을 비한정적으로 포함한다.
실시예에서, 이 화합물은 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이토카인, 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산이 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명의 화합물은 아이소머, 프로드러그 및 약학적으로 허용되는 그 염, 하이드레이트, 솔베이트, 포접화합물을 포함하는 이하의 구조(I)를 가진다:
여기서:
Y는 N 또는 N-옥사이드을 나타내고;
R1및 R2는 H, C1-6알킬 및 할로 C1-6알킬로부터 독립적으로 선택되고:
R3및 R4는 H 및 C1-6알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 같은 탄소원자에 부착되는 R3및 R4는 전체로서 카르보닐 산소 원자를 나타내거나, 또는 임의의 개재되는 원자들과 함께 서로 다른 탄소원자에 부착되는 R3및 R4는 그 탄소원자들과의 조합으로서 포화된 5, 6 또는 7 멤버의 카르보사이클릭 링을 나타내며;
R5및 R6는 H, C1-6알킬, 할로 C1-6알킬 및 CN으로 이루어지는 군으로부터 선택된 멤버를 독립적으로 나타내고;
n는 0 내지 6의 정수를 나타내고;
Ar1은 티에닐, 티아조일, 피리딜, 페닐 및 나프틸로 이루이지는 군으로부터선택되고; 상기 Ar1은 할로겐 원소, C1-6알콕시,C1-7알킬티오, CN, C1-6알킬, 하이드록시 C1-6알킬, -C(O)C1-6알킬, -CO2H, -CO2C1-6알킬, NH(SO2Me), N(SO2Me)2, SO2Me, SO2NH2, SO2NHC1-6알킬, SO2N(C1-6알킬)2NO2, C2-6알케닐, C1-6알킬 및 NH2로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 내지 3의 멤버로 선택적으로 치환되며;
그리고, Ar1이 2 또는 3의 치환체가 있는 페닐 또는 나프틸기를 나타낼 때, 이러한 두 치환체는 조합으로서 간주되어 5 또는 6 멤버의 퓨즈드 락톤 링을 나타낼 수 있다.
이 구현예는 나아가, 그 전체가 본 명세서에 레퍼런스로서 통합되는 미국특허 제6,316,472호에 있는 것과 같은 화합물들을 포괄한다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(II)를 갖는다.
상기 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R1및 R2는 C1-C4의 알킬 또는 C3-C10의 사이클로알킬을 나타내며;
상기 R3및 R4는 독립적으로 C1-4알킬, 사이클로알킬, 하나의 이중결합을 포함하는 C2-C4알킬렌, 하나의 삼중결합을 포함하는 C2-C4알킬린, (CH2)nCO(CH2)mCH3, (CH2)pCN, (CH2)pCO2Me 또는 이들이 질소 원자에 함께 부착됨으로 인해 3-10 개의 인자로 구성된 링구조를 나타내며;
상기 n과 m은 0 내지 3을 나타내고;
상기 p는 1 내지 3을 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 제6,162, 830에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(III)를 갖는다.
상기 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R1은 수소, 할로겐, 저급 알콕시, 하이드록시, 저급 알킬, 저급 알킬 머캅도, 저급 알킬술포닐, 저급 알킬아미노, 디-저급 알킬 아미노, 아미노, 니트로, 니트릴, 저급 알킬 카복실레이트, -CO2H 및 술폰아미도로 구성된 그룹으로부터 각각 경우에 독립적으로 선택되어지며;
상기 R2는 수소 및 저급 알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되어지고;
상기 R3는 수소, 저급 알킬, 하이드록시 및 아미노로 구성되는 그룹으로부터 선택되어지며;
상기 R4는 -COM 및 CH2OH로 구성되는 그룹으로부터 선택되어진다. 이때, 상기 M은 하이드록시, 치환된 저급 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디아칼아미노, N-모폴리노, 하이드록시알킬아미노, 폴리하이드록시아미노, 디알킬아미노알킬아미노, 아미노알킬아미노 및 OMe 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 이때, Me는 양이온을 나타내며;
상기 R5는 알킬술포닐을 나타내고;
상기 n은 0 부터 4까지의 정수를 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,177, 471에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(IV)를 갖는다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R0는 수소, 할로겐 또는 C1-6알킬을 나타내며;
상기 R1은 수소; 피리딜, 모폴리닐, 피페라지닐, 피롤리디닐 및 피페리디닐로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 5 또는 6개의 인자로 구성된 헤테로사이클릭링, 페닐, C3-6-사이클로알킬, -NRaRb, -CO2Ra, 할로겐 및 페닐로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 C1-6알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되어지며, 하나 또는 둘 이상의 C1-6알킬에 의해 선택적으로 치환되며, C1-6알킬을 경유하여 R1에 부착되어진 질소 원자에 선택적으로 연결되어 있고;
상기 R2는 -ORa, -NR2, Rb, 할로겐, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노 및 니트로로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되는 페닐로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
상기 Ra및 Rb는 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 C1-6알킬 또는 수소를 독립적으로 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,218,400에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(V)를 갖는다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
상기 X는 S 또는 O이고;
상기 Ar1은 -OH, -CO2H, CO2C1-3알킬 또는 CN으로서 선택적으로 치환된 C1-6알킬; C1-6알콕시; -OH로서 선택적으로 치환된 C1-3알킬티오, C1-3알킬술포닐, C1-3플루오로알킬; 할로(halo), -OH, -CO2H 또는 -CO2C1-3알킬;로 이루어진 각 치환기가 독립적이면서 두 개의 치환기까지 선택적으로 치환된 페닐, 피리디닐 또는 퓨릴로부터 선택된 방향족 고리 화합물이며;
상기 R2는 수소 또는 C1-3알킬이고;
상기 R3는 C1-3알킬, C1-3알플루오로알킬, C1-6알콕시, C1-3플루오로알콕시, C1-3알킬티오, 할로(halo) 또는 -OH로 이루어진 각 치환기는 서로 독립적이면서 두 개의 치환기까지 선택적으로 치환된 페닐, 피리디닐, 퀴놀리닐 또는 퓨릴이다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,034, 089 및 미국 특허 No. 6,020,339에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(VI)를 가진다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 Y는 할로겐 또는 알킬 또는 -XR2그룹이며;
상기 Z는 -O-, S(O)p- 또는 -N(Rb)-이고, 여기에서 p는 0 또는 정수 1 또는 2이며;
상기 L은 -XR, -C(R11)C(R1)(R2) 또는 -(CHR11)nCH(R1)(R2)이고, 여기서 n은 0 또는 정수 1이고;
상기 Ra및 Rb각각은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 그룹이며;
상기 R은 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 시클로알킬 또는 시클로알케닐 그룹이며;
상기 R1및 R2각각은 수소, 플루오린, -CN, -NO2또는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알킬닐, 알콕시, 알킬티오, -CO2R8, -CONR9R10또는 -CSNR9R10그룹으로서 서로 같을 수도 있고 다를 수도 있거나, R1및 R2서로가 탄소 원자에 의해 부착되며, 선택적으로 치환된 시클로알킬 또는 시클로알케닐 그룹을 형성하기 위해 연결되어지며;
상기 R3는 수소, 플루오린, 하이드록시 또는 선택적으로 치환된 직선형 또는 가지형의 알킬그룹이며,
상기 R4는 수소, -(CH2)tAr 또는 -(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar1, 여기서 t는 0 또는 정수인 1, 2 또는 3이며;
상기 R5는 -(CH2)tAr 또는 -(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar'이며;
상기 R6는 수소, 플루오린 또는 선택적으로 치환된 알킬그룹이며;
상기 R7는 수소, 플루오린, 선택적으로 치환된 직선형 또는 가지형의 알킬그룹, Rc는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 알케닐 그룹인 -ORc또는 포밀, 알콕시알킬, 알카노일, 카복스아미도 또는 티오카복스아미도 그룹이며;
상기 R8, R9및 R10각각은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 어랄킬(aralkyl) 또는 아릴 그룹이며;
상기 R11은 수소, 플루오린 또는 메틸 그룹이다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 5,798,373에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
더 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따르는 화합물은 하기 화학식 구조(VII)를 갖거나 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물, 포접화합물, 거울상이성질체, 광학이성질체, 라세미체 또는 이들 입체이성질체의 혼합물로 이루어질 수 있다.
더 바람직한 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따르는 하기 화학식 구조(VIII)를 갖는 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 염, 포접화합물, 용매화합물, 수화물, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염을 포함한다.
상기 화합물의 일정 정도는 뉴저지주의 워런시에 소재하는 셀진 아이엔시(Celgene, Inc.) 사로부터 상업적으로 유용할 수 있다. 상기 다른 화합물은 본원 명세서에서 전체로서 인용되고 있는 특허들에서 개시되어 있는 종래에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 PDE IV 저해제의 추가적인 실시예는 영국특허 2 063 249 A, 유럽특허 0 607 439 A1, 미국특허 No. 6,333, 354, 미국특허 No. 6,300, 335, 미국특허 No. 6,166, 041, 미국특허 No. 6,069, 156, 미국특허 No. 6,011, 060, 미국특허 No. 5,891, 896, 미국특허 No. 5,849, 770, 미국특허 No. 5,710, 170, 미국특허 No. 4,101, 548, 미국특허 No. 4,001, 238, 미국특허 No. 4,001, 237, 미국특허 No. 3,920, 636, 미국특허 No. 4,060, 615, WO 97/03985, 유럽특허 0 607 439 A1, 미국특허 No. 4,101, 548, 미국특허 No. 4,001, 238, 미국특허 No. 4,001, 237, 미국특허 No. 3,920, 636, 미국특허 No. 4,060, 615, WO 97/03985, 유럽특허 0 395 328, 미국특허 No. 4,209, 623, 유럽특허 0 395 328, 미국특허 No. 4,209, 623, 미국특허 No. 5,354, 571, 유럽특허 0 428 268 A2, 미국특허 No. 5,354, 571, 유럽특허 0 428 268 A2,807, 826, 미국특허 No. 3,031, 450, 미국특허 No. 3,322, 755, 미국특허 No. 5,401, 774,807, 826, 미국특허 No. 3,031, 450, 미국특허 No. 3,322, 755, 미국특허 No. 5,401, 774, 미국특허 No. 5,147, 875, PCT WO 93/12095, 미국특허 No 5,147, 875, PCT WO 93/12095, 미국특허 No. 4,885, 301, WO 93/07149, 유럽특허 0 349 239 A2, 유럽특허 0 352 960 A2, 유럽특허 0 526 004 A1, 유럽특허 0 463 756 A1, 미국특허 No. 4,885, 301, WO93/07149, 유럽특허 0 349 239 A2, 유럽특허 0 352 960 A2, 유럽특허 0 526 004 A1, 유럽특허 0 463 756 A1, 유럽특허 0 607 439 A1, 유럽특허 0 607 439 A1, WO 94/05661, 유럽특허 0 351 058, 미국특허 No. 4,162, 316, 유럽특허 0 347 146, 미국특허 No. 4,047, 404, 미국특허 No. 5,614, 530, 미국특허 No. 5,488, 055, WO 97/03985, WO 97/03675, WO 95/19978, 미국특허 No. 4,880, 810, WO 98/08848, 미국특허 No. 5,439, 895, 미국특허 No. 5,614, 627, PCT US94/01728, WO 98/16521, 유럽특허 0 722 943 A1, 유럽특허 0 722 937 A1, 유럽특허 0 722 944 A1, WO 98/17668, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 98/06722, PCT/JP97/03592, WO 98/23597, WO 94/29277, WO 98/14448, WO 97/03070, WO 98/38168, WO 96/32379 및 PCT/GB98/03712에서 개시된 예들을 포함하며, 이들 모두는 본원 명세서에서 인용되어 융합되어진다.
본원 발명으로부터 예상할 수 있는 대부분의 화합물은 종래 기술로서 알려져 있는 표준 분석 또는 비대칭적 합성을 이용함으로서 전술한 특정한 화합물의 광학적 활성을 갖는 거울상이성질체 내에 풍부하게 존재할 수 있다. 참조의 예로서, 실리 등, Chem. Indus. 1030 (1965); 및 카시니 등, 파르마코 ED. Sci. 19: 563 (1964)를 들 수 있다.
또한, 본원 발명은 이들 화합물의 생리학적으로 수용가능한 비독성 산 첨가염에 관련되어 있다. 이러한 염들은 종래에 알려져 있는 유기 및 무기 산 또는 염기로부터 유도되는 것들을 포함한다. 이러한 산의 예로서, 염산, 브롬산(취화수소산), 인산, 황산, 메탄술폰산, 초산, 타르타르산(주석산), 락트산(유산), 숙신산(호박산), 시트릭산(구연산), 말산(사과산), 말레산, 소르빈산, 아코닛트산, 살리실산, 프탈산, 엠볼릭산, 에난트산 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 자연계에서는 산성이며, 다양한 약학적으로 수용가능한 염기와 염을 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 산성 화합물에 약학적으로 수용가능한 염기를 준비하기 위해 사용될 수 있는 염은 예를 들어, 이들에 한정하지 않는 약리학적으로 수용가능한 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염, 특히 칼슘, 마그네슘, 나트륨 또는 칼륨 염 등과 같은 비독성 염기 첨가 염을 형성하기 위한 것들이다. 적합한 유기 염기는 N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올라민, 에틸렌디아민, 메글루마인(N-메틸글루카민), 리신 및 프로카인에 한정하지 않는 것들을 포함하고 있다.
본 발명에 따른 화합물은 종래에 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어 미국특허 No. 6,316,472; 미국특허 No. ,204,275; 피더스톤 R.L. 등(2000) "래트 폐장의 체온 하강의 보존을 위해서 사용되는 성 토마스 병원 심장 마비성의 용액에 더해지는 차이가 나는 아이소자임 선택 작용의 포스포디에스테레이즈 저해제의 비교",Am J. Respir crit. Care Med.162：850-6; 및 브래킨 M. F. 등(1995) "사이클릭 AMP에 특이성을 갖는 포스포디에스터레이즈의 유력한 저해제로서의 4-(3-부톡시-4-메톡시벤질) 이미다졸리딘-2-온(Ro 20-1724)의 구조를 적합하게 하는 아날로그의 설계 및 합성",J. Med. CHEM. 38: 4848-54.를 들 수 있으며, 이들 전부는 본원 명세서 인용되어 융합되어진다.
본 발명에 따른 화합물은 상업적으로 구입하거나 본원 명세서 내에 개시된특허들이나 특허공보에 개시된 방법에 따라 준비되어질 수 있다. 광학적으로 더욱 순수한 성분은 비대칭적으로 합성되거나 유기화학기술의 표준합성과 마찬가지로 잘 알려져 있는 분해제 또는 키랄 컬럼을 이용하여 분해되어질 수 있다.
4.4. 줄기 세포 배양의 방법
본 발명의 특정 실시예에서, 배아 줄기 세포, 배아-유사 줄기 세포, 전구 세포, 플러리포텐트(pluripotent) 세포, 토티포텐트 세포, 멀티포텐트 세포, 산후 관류 태반에 내재적(endogenous)인 세포, 탯줄 혈액 세포, 말초혈액 또는 성인 혈액으로부터 유래한 줄기 또는 전구 세포, 또는 골수 세포를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 줄기 또는 전구 세포는 본 발명의 화합물에 노출되고 분화되도록 유도된다. 이러한 세포는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 in vitro로 증식될 수 있거나, 선택적으로 산후 관류 태반 내에서 증식된다.
일정 실시예에서, 산후 관류 태반에 내재적인 세포는 태반 및 배양 매질로부터 모아지고, 적절한 조건 하에서 in vitro로 배양되며, 바람직한 세포 타입 또는 계통으로 분화를 유도하도록 충분한 시간 동안 배양된다. 미국특허출원 공개번호 제20030032179호, 2003년 2월 13일 발행, "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom" 참조하기 바람. 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 줄기 또는 전구 세포는 산후 관류 태반으로부터 유래되지 않는 대신에, 본 발명과 같은 다른 소스로부터 분리되고 분화되도록 유도된다. 바람직한 실시예에서, 분화는 적절한 조건하에서 in vitro적으로 및 바람직한 계통(lineage) 또는 세포 타입으로 분화되도록 유도하기에 충분한 시간동안 행하여진다. 본 발명의 화합물은 추가적으로 in situ 생성, 또는 본 발명의 화합물과 줄기 또는 전구 세포와의 접촉을 가능하게 하는 어떠한 다른 방법으로 분화/배양 매질 내에서 사용된다.
다른 실시예에서, 예를 들어 in vitro에서 배양된 줄기 세포 또는 산후 관류 태반에서 배양된 줄기 세포와 같은 배양된 줄기 세포는 배양에서 증식되도록 예를 들어 에라이트로포이에틴, 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자(CSF), 인터페론, 케모카인, 인터루킨, 리간드를 포함하는 재조합 인간 조혈 성장 인자, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴(Tpo), 인터루킨, 및 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 다른 성장 인자의 투여에 의하여 배양 내에서 증식되도록 자극된다.
배양된 세포의 모집 및/또는 분리 후에, 그들은 식별되고 콜로니 형성 유닛 분석법에 의해 특징지어 지는데, 그것들은 Mesen CultTMmedium (stem cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia)와 같이 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다.
In vitro로 줄기 또는 전구 세포를 배양하는 방법은 예를 들어 Thomson et al., 1998, Science 282: 1145-47 (배아 줄기 세포); Hirashima et al., 1999, Blood 93(4): 1253-63, and. Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468 (표피 세포 전구체(endothelial cell progenitors)); Slager et al., 1993,Dev. Genet. 14 (3): 212-24 (신경 또는 근육 전구체(progenitors)); Genbachev et al., 1995, Reprod. Toxicol. 9 (3): 245-55 (cytotrophoblasts, 즉 태반 표피 세포 전구체); Nadkarni et al. 1984, Tumori 70: 503-505, Melchner et al., 1985, Blood 66 (6): 1469-1472, 국제 PCT 출원 제WO00/27999호, 2000년 5월 18일 발행, Himori et al., 1984, Intl. J. Cell Cloning 2: 254-262, and Douay et al., 1995, Bone Marrow Transplantation 15: 769-775 (조혈 전구 세포); Shamblott et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726-31 (원시 종자 세포); Yan et al., 2001, Devel. Biol. 235: 422-432 (영양막 줄기 세포)와 같은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다. 그러한 방법은 만약 전구 세포의 배양이 분화된 세포의 바람직한 군(들)을 생성하기 위하여 표시된 시간에 본 발명의 화합물로 세포를 배양하는 단계 또는 단계를 포함한다면 본 발명의 방법에서의 사용을 위하여 쉽게 적용될 수 있다.
4.4.1. 줄기 세포 in vitro 배양
본 발명의 방법은 대상(subject)에게 분화된 세포의 직접적 이식 후에 특정 바람직한 세포 계통의 세포로 세포들을 유도하도록 in vitro로 본 발명의 작은 유기 분자와 같은 화합물과 함께 세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기 세포 또는 전구 세포의 in vitro 조절을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 세포는 조혈 세포 계통으로 분화하도록 유도된다.
특정 실시예에서, 관심의 대상인 배양된 줄기 세포는 0.1ug/ml, 0.2ug/ml, 0.3ug/ml, 0.4ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml, 5ug/ml 또는 10ug/ml 농도의 본 발명의 화합물에 in vitro로 노출된다. 바람직하게는 관심의 대상인 세포는 약 0.005ug/ml 내지 약 5mg/ml의 PDE IV 억제제, 또는 약 0.005ug/ml 내지 약 5mg/ml의 SelCIDTM(Celgene Corp., Warren, NJ)(4.7.장 "약학적 조성물" 참조)에 노출된다.
특정 실시예에서, 배아-유사 줄기 세포는 관류 용액 내로 영양제, 호르몬, 비타민, 성장 인자, 또는 그들의 어떠한 혼합물의 도입에 의해 태반 생반응기 내에서 증식하도록 유도된다. 혈청 및 다른 성장 인자는 증식 관류 용액 또는 매질 내로 첨가될 수 있다. 성장 인자는 일반적으로 단백질이고 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자(CSF), 인터페론, 케모카인, 및 인터루킨을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수도 있는 다른 성장 인자는 리간드를 포함하는 재조합 인간 조혈 성장 인자, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴(Tpo), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 백혈병 억제 인자, 기초 섬유아세포 성장 인자, 태반 유래 성장 인자 및 표피 성장 인자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
관류 용액 내로 도입되는 성장 인자는 미분화된 배아-유사 줄기 세포, 수임된(committed) 전구 세포, 또는 분화된 세포(예를 들어 분화된 조혈 세포)의 증식을 자극할 수 있다. 성장 인자는 앞서 서술된 것처럼 면역글로블린, 호르몬, 효소 또는 성장 인자를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 생물학적 물질 및 생반응적(bioactive) 분자의 생성을 촉진할 수 있다. 배양된 태반은 사용된 매질을 제거하고, 방출된 세포를 분리시키고, 신선한 매질을 첨가하기 위하여 주기적으로 "공급되어야(fed)"한다. 배양된 태반은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 멸균 조건에서저장되어야 하고, 태반의 세포에 영양분의 충분한 공급을 유지하는 조건을 생성하도록 간헐적이고 주기적인 압력 하에서 유지되어야 한다. 태반의 관류 및 배양은 효율성과 증가된 수용량을 위하여 자동화 및 컴퓨터조절화 될 수 있음이 인식되어야 한다.
4.4.2. 전구 세포 in vitro 배양
본 발명의 방법은 또한 전구 세포, 특히 CD34+ 및 CD133+ 전구 세포의 발달의 조절 및 조정을 포함한다. 일정 세포 계통에서, 특정 실시예에서, 계통은 과립구 계통(lineage)이다. 대안적 실시예에서, CD133+ 세포는 내피 세포, 뇌 세포, 신장 세포, 간 세포 또는 내장관 세포로 분화되도록 유도된다.
전구 세포는 위에서 언급된 표준 방법에 의해 배양될 수 있다. 부가적으로, 전구 세포의 배양은 다양한 시기 또는 배양 동안의 시간 프레임에 세포를 접촉하여 전구 세포 분화를 다른 세포 계통으로 유도하는 것을 포함한다.
따라서, CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포를 배양하는 한 가지 방법으로, 세포는 0일에 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-알파를 포함하는 매질에 놓여지고, 6일 동안 배양된다. 6일째에, 세포는 GM-CSF와 TNF-알파를 포함하는 매질 내에 재-위치되고, 추가적으로 6일 동안 배양이 계속된다. 이러한 방법은 된다. 가지돌기 세포의 생성을 초래한다. 이러한 방법의 한 변형으로, 세포는 초기에 GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 매질 내에 놓여지고, 6일째에 단핵구-조절 매질로 옮겨진다 (Steinman et al., 국제 PCT공개 제WO97/29182호 참조). 일군의 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포를 생성하기 위하여, 전구 세포는 0일에 본 발명의화합물과 접촉하도록 놓여지고, CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포는 6일째에 모아진다.
발명자들은 본 발명의 화합물, 특히 SelCIDTM의 첨가의 시기가 CD34+ 세포의 특정 계통의 세포로의 분화의 경로, 및 CD133+ 세포의 분화에 실질적인 영향을 미친다는 것을 밝혀내었다. 표준 조건 하에서 배양된 CD34+ 전구 세포는 골수 발달 경로 또는 계통을 따른다. 즉 초기 플레이팅(즉 초기 배양 후) 12일 내에 가지 세포가 된다. 그러나 배양의 첫 6일 동안 몇몇 특정 시기 중 하나에서 본 발명의 화합물의 첨가는 이러한 경로를 실질적으로 변경한다. 예를 들어, CD34+ 세포, 특히 골수에서 유래한 CD34+가 본 발명의 화합물, 특히 SelCIDTM에 배양의 첫 일에 노출된다면, 골수 계통을 따른 분화는 억제되는데, 이것은 본 발명의 화합물에 노출되지 않은 (즉, DMSO에 노출된) 대조군과 비교하여 배양 6일째에 CD34+CD38- 세포의 수의 증가 및 CD1a+CD14- 세포의 수의 감소로 증명된다. 더욱이, 본 발명의 화합물에의 노출은 CD80 및 CD86과 같은 가지 세포 계통 내의 세포에 의해 발현되는 표면 마커를 발현하는 세포의 발달의 억제를 야기한다. 배양의 시작일, 또는 배양의 시작 일 후 3일까지 일정 포인트에서의 본 발명의 화합물과의 접촉은 CD34+ 전구 세포의 발달에 그러한 조절을 야기한다. 본 발명은 0일 내지 6일 사이에, 예를 들어, 0일과 2일에 투여, 0일과 4일에 투여, 3일과 6일에 투여, 또는 2일, 4일, 및 6일에 투여로 주어진다.
본 발명의 특정 유용한 측면으로, CD34+ 전구 세포 배양의 첫 일에 본 발명의 화합물의 첨가, 및 12일 동안 노출의 지속은 세포 표면 마커로 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33-의 특정 조합을 발현하는 특정 전구 세포의 발달을 야기한다. CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 세포 군은 분화에 있어 중간(intermediate) 단계를 나타낸다. 이러한 군은 예를 들어 과립구 세포와 같은 빠르게-발달하는 일군의 조혈 계통 세포가 필요한 환자에게 쉽게 이식될 수 있는 확장가능한 일군의 전구 세포로써 유용하다. 다른 실시예에서, CD+ 세포는 증식 상(phase) (약 6일) 동안 표준 매질 (즉, SelCIDTM와 같은 PDE IV 억제제, 또는 이와 유사한 것에 노출되지 않은) 내 놓여지고, 배양되며, 그 후 SelCIDTM또는 이것의 프로드럭, 또는 이와 유사한 것을 포함하는 동일 또는 유사한 매질로 교체되고, 12일까지 배양을 계속한다. 이러한 실시예에서, 분화하는 세포는 전형적으로 CD80, CD86 및 CD14의 감소된 발현을 나타내지만, 대조군과 비교하여 CD1a+ 세포 군의 증가된 저항성을 야기한다. 그러한 분화 세포는 가지 세포가 되는 것이 막아지지 않는다. 다른 실시예에서, CD34+ 세포는 증식 상 (플레이팅 후 1-6일) 동안 적어도 연속된 3일 동안 SelCIDTM또는 본 발명의 다른 화합물로 처리된다. 다른 실시예에서, CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포는 두 번 또는 그 이상 플레이팅 후 첫 6일 동안 SelCIDTM또는 본 발명의 다른 화합물로 처리된다. 그러한 다회 처리는 CD34+ 또는 CD133+ 군 양쪽의 증식의 증가를 야기한다. SelCIDTM또는 본 발명의 다른 화합물을 이용한 다회 처리는 또한 CD34+ 전구 세포의 분화에 있어 CD11c+CD15- 계통으로부터 CD11c-CD15+ 계통으로의 이동을 야기한다. 즉 골수 가지 세포 계통으로부터 과립구 계통으로의 이동을 야기한다(도 6B).
배양 0일로부터 전구 세포의 처리, 특히 0일과 6일 사이의 다회 투여는 또한 CD133+ 전구 세포, 특히 CD34+CD133+ 전구체 군의 증가를 야기한다. CD133+ 세포는 CD34+ 서브셋(subset)과 동일한 방식으로 확장할 수 있고, 그들의 다계통 능력을 보유하고 있기 때문에 CD34 분리에 대안적인 조혈 마커이다(Kobari et al., J. Hematother. Stem Cell Res. 10 (2): 273-81 (2001) 참조). CD133+는 인간 태아 뇌 조직으로부터의 CD34-세포 내에 존재하고, 유력한 주입(engraftment), 증식, 이동, 및 신경 분화를 보이는 것으로 보고 되어왔으며, 신생아 줄기 세포 내로 주사될 때 클론원성 능력 및 NOD-SCID 마우스 내의 높은 융합(engraftment)을 지닌 전구체 활성에 대한 풍부함을 보여주어 왔다.
전술한 사실들에도 불구하고, 본 발명의 화합물이 배양 3일 후에 증식하는 CD34+ 전구 세포와 접촉하도록 놓여진다면 (즉, 초기 배양 후 3-6일 사이의 일정 시기에), 증식 전구 세포, 이미 세포 표면 마커 CD1a의 발현을 시작한 증식 전구 세포는 DMSO-처리 대조군에 비하여 이러한 마커의 발현의 실질적으로 증가된 저항성을 보여준다. 세포독성이 이러한 증가된 저항성과 무관하다는 것을 인식하는 것은 중요하다. 즉, SelCIDTM와 같은 PDE IV 억제제를 이용한 처리는 다른 세포 군이 세포자멸사하도록 야기하지 않는다. 최종적인 효과는 존재하는 면역 능력의 유지 및 새로운 면역 능력의 발전이다.
따라서 본 발명의 방법의 일 실시예에서, CD34+ 세포의 가지 세포로의 분화는 CD34+ 전구 세포를 본 발명의 화합물과 배양 0일에 (즉, 배양의 첫째 날에) 접촉하는 것에 의하여 조절 (즉, 억제)된다. 다른 실시예에서, CD34+ 세포의 과립구 세포로의 분화는 CD34+ 전구 세포를 배양의 0일에 (즉, 배양의 첫째 날에) 본 발명의 화합물과 접촉하는 것에 의해 촉진된다. 다른 실시예에서, CD34+ 세포의 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포 군으로의 분화는 CD34+ 전구 세포를 배양의 첫 3일 동안 본 발명의 화합물과 CD34+ 전구 세포를 접촉하는 것에 의해 촉진된다. 다른 실시예에서, CD34+CD133+ 군은 전구 세포를 본 발명의 화합물과 배양 0일부터 6일까지 수회 접촉시켜 촉진 또는 증가된다. 다른 실시예에서, CD1a+ 세포 군의 저항성은 CD34+ 전구 세포를 본 발명의 화합물과 배양 6일째에 접촉시켜 촉진 또는 증가되는데, 여기에서 상기 CD34+ 세포는 CD1a 표면 마커를 나타내는 세포로 분화되고, 여기에서 상기 배양은 6일까지의 기간 동안 상기 화합물과 접촉하지 않는 것을 포함한다.
상기 실시예에서, SelCIDTM, 또는 관련된 화합물의 투여에 있어 적절한 변형이 in vivo적으로 전구 세포에 만들어 질 수 있음은 이해되어야 한다. 즉, 그러한 세포가 in vitro 전구 세포에게와 같이 환자 내로 이식 또는 인그래프트(engraft)될 수 있다.
본 발명의 방법은 줄기 세포 또는 전구 세포를 특정 바람직한 세포 계통의 세포로의 분화를 유도하기 위하여 in vitro로 본 발명의 작은 유기 분자와 같은 화합물과 세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기 세포 또는 전구 세포 in vitro 분화의 조절과, 그 후의 대상에게 분화된 세포의 직접적 이식을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 세포는 조혈 세포 계통으로 분화된다. 대안적 실시예에서, CD133+ 세포는 내피 세포, 뇌 세포, 신장 세포, 간 세포, 또는 내장관 세포로 분화되도록 유도된다.
여기에서 설명된 방법은 포유류에서 유래된, 바람직하게는 인간에게서 유래된 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포의 사용을 위하여 예시된 것이나, 조류 또는 파충류 전구 세포의 사용을 위해서도 또한 예시된 것임이 인식되어야 한다. 그러나 본 발명의 화합물은 잠재적으로 다양하게 전구 세포가 유래된 종에 따라 포텐트(potent)하다. 배양 방법에 있어 몇몇의 변형도, 특히 투여된 화합물(들)의 농도와 관련하여, 그러므로 또한 예시된다. 예를 들어, 쥣과 기원의 전구 세포는 본 발명의 화합물 예를 들어 SelCIDTM와 같은 화합물에 덜 민감하고, 인간 기원의 전구 세포에서 1uM의 농도롤 얻을 수 있는 효과를 얻기 위해서는 더 높은 농도가 필요하다. 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 그러한 최적화가 통상적인 것임을 이해할 것이다.
4.5. 줄기 및 전구 세포의 유전 조작
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 분화된 줄기 또는 전구 세포는 본 발명의 화합물에 노출되기 전에 또는 노출된 후에 예를 들어 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터를 사용하여, 또는 리포솜또는 화학적 매개 DNA 업테이크(uptake)와 같은 기계적 수단을 사용하여 유전적으로 조작된다. 특정 실시예에서, CD34+ 전구 세포는 유전적으로 조작되고, 그 후 본 발명의 화합물로 처리된다; 더 특정적 실시예에서, 상기 화합물은 SelCIDTM, 또는 이들의 유사체이다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 본 발명의 화합물로 처리되고, 그 후 유전적으로 조작된다.
트랜스유전자를 함유하는 벡터는 예를 들어 트랜스펙숀, 트랜스포메이숀(transformation), 트랜스덕션, 일렉트로포레이션(electroporation), 감염(infection), 미세주사, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포솜, LIPOFECTINTM, 리소솜 융합, 합성 양이온 리피드, 유전자 건(gun) 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용, 이러한 것은 트랜스유전자를 예를 들어 딸 배아-유사 줄기 세포 또는 배아-유사 줄기 세포의 분할에 의해 생성된 전구 세포와 같은 딸 세포에게 전달하는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 방법에 의하여 관심 있는 세포 내로 도입될 수 있다. 포유류 세포의 트랜스포메이숀 또는 트랜스펙숀에 대한 다양한 기술에 관해서는 Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.을 참조하기 바람.
바람직하게는, 트랜스유전자는 기술이 세포 핵 막 또는 다른 존재하는 세포성 또는 유전적 구조를 파괴하는 것이 아닌 한 어떠한 기술을 사용하여도 도입된다. 일정 실시예에서, 트랜스유전자는 본 발명이 속한 분야에서 실행되는 것에 의하여 핵 유전 물질(nucleic genetic material)내로 삽입된다.
태반 내의 세포 배양과 같이 배양된 포유동물 세포의 안정한 트랜스펙숀을 위하여, 세포의 단지 작은 부분(fraction)이 외래 DNA를 그들의 유전체내로 통합한다. 통합(integration)의 효율성은 벡터 및 사용된 트랜스펙숀 기술에 달려있다. 인티그런트(integrant)를 식별하고 선택하기 위하여, 선택적 마커(예를 들어 항생제에 대한 저항성과 같은)를 코딩하는 유전자가 일반적으로 호스트 배아-유사 줄기 세포내로 관심 있는 유전자 서열과 함께 도입된다. 바람직한 선택적 마커는 G418, 히그로마이신(hygromycin) 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 도입된 핵 산으로 안정하게 트랜스펙숀된 세포는 약물 선택(drug selection)에 의하여 식별된다 (예를 들어, 선택적 마커 유전자를 포함한 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 죽는다). 그러한 방법은 특히 대상 또는 환자 내로 재조합 세포의 도입 또는 이식 전에 포유동물 세포 (예를 들어 배아-유사 줄기 세포) 내 동종의(homologous) 재조합을 포함하는 방법에 있어 유용하다.
많은 선택 시스템이 배아-유사 세포와 같은 변형된 호스트 줄기 세포, 또는 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포와 같은 전구 세포를 선택하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 벡터는 검출가능한 또는 선택가능한 일정 마커를 함유할 수 있다. 선택의 다른 방법은 herpes simplex 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), 하이포싼틴-구아닌(hypoxanthine-guanine) 포스포리보실 트랜스페라제(phosphoribosyltransferase) (Szybalska and Szybalski, 1962, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 48: 2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라제 (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817)와 같은 다른 마커에 대한 선택을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 내로 적용될 수 있다. 또한, 다음의 유전자에 대한 선택의 기초와 같이 항대사체(antimetabolite) 저항성이 사용될 수 있다: dhfr, 이것은 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여함 (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, 이것은 마이코페놀릭 산(mycophenolic acid)에 대한 저항성을 부여함 (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, 이것은 아미노글리코사이드 G-418에 대한 저항성을 부여함 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); 및 hygro, 이것은 히그로마이신에 대한 저항성을 부여함 (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
트랜스유전자는 관심 있는 세포의 유전체 내로 통합되는데(integrate), 바람직하게는 랜덤(random) 통합에 의해서다. 다른 실시예에서, 트랜스유전자는 예를 들어 직접적 동종 재조합(directed homologous recombination) (즉, 관심 있는 세포의 유전체 내의 관심 있는 유전자의 "넉-인" 또는 "넉-아웃"), Chappel, 미국특허 제5,272,071호; 및 PCT 공개 제WO91/06667호, 1991년 5월 16일 발행; 미국특허 제5,464,764호; Capecchi et al., 특허 제5,487,992호, Capecchi et al., 1996년 1월 30일 발행)와 같은 직접적인 방법에 의해서도 통합될 수 있다.
동종(homologous) 재조합을 통한 목표 유전자 조정을 거친 세포의 생성을 위한 방법은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다. 구성체(construct)는 적어도바람직한 유전적 조절을 거친 흥미 있는 유전자의 일정 부분을 포함할 것이고, 목표 유전자자리(locus)와 동종인(homology)인 영역, 즉 호스트의 유전체 내에 목표 유전자의 내생의(endogenous) 복사와 같은 영역을 포함할 것이다. 동종 재조합을 위하여 사용된 방법과는 대조적으로, 무작위 통합을 위한 DNA 구성체는 재조합을 조절하기 위한 동종의 영역을 포함할 필요가 없다. 마커는 트랜스유전자의 삽입에 대한 양성 및 음성 선택을 수행하기 위하여 목표 구성체 또는 무작위(random) 구성체 내에 포함될 수 있다.
예를 들어 동종 재조합 배아 유사 줄기 세포, 내재적 태반 세포 또는 태반에서 배양된 외인성 세포와 같은 동종 재조합 세포를 생성하기 위하여, 목표 세포의 유전체에 내재적인 유전자 서열의 5' 및 3' 말단에 관심 있는 유전자가 플랭크(flank)된 동종 재조합 벡터가 제조되며, 이것은 벡터에 의해 운반되는 관심 있는 유전자와 목표 세포의 유전체 내의 내재적 유전자 사이에 동종 재조합이 발생하도록 한다. 추가적 플랭킹(flanking) 핵 산 서열은 목표 세포의 유전체의 내재적 유전자와 성공적인 동종 재조합을 위하여 충분한 길이이다. 일반적으로, 플랭킹 DNA(5' 및 3' 말단 양쪽)의 수 킬로베이스(kilobases)가 벡터에 포함된다. 동종 재조합 벡터 및 재조합 줄기 세포로부터 동종 재조합 동물을 구성하는 방법은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다 (예를 들어 Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51: 503; Bradley, 1991, Curr. Opin. Bio/Technol. 2: 823-29; 및 PCT 공개 번호 제WO90/11354호, 제WO91/01140호, 및 제WO93/04169호 참조).
특정 실시예에서, Bonadio et al.의 방법(미국특허 제5,942,496호, 제목:Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells, 1999년 8월 24일 발행; 및 PCT 제W095/22611호, 제목: Methods and compositions for stimulating bone cells, 1995년 8월 24일 발행)이 줄기 세포, 전구 세포 또는 예를 들어 골수 전구 세포와 같이 태반에서 배양된 외래의 세포와 같은 관심 있는 세포 내로 핵 산을 도입하기 위하여 사용된다.
4.6. 분화를 위하여 조정된 줄기 세포 및 전구 세포의 용도
4.6.1. 일반적인 용도
본 발명의 줄기 세포 및 CD34+ 및 CD133+ 전구 세포는 이식 및 ex vivo 치료 프로토콜에서의 사용을 위하여 분화되도록 유도된다. 일 실시예에서, 줄기 세포 군은 특정 세포 타입으로 분화되고 치료적 유전 프로덕트를 제공하도록 유전적으로 조작된다. 다른 실시예에서, 전구 세포 군은 초기 전구 세포로 팽창되고 치료적 유전 프로덕트를 제공하도록 유전적으로 조작된다. 다른 실시예에서, 전구 세포 군은 과립구와 같은 특정 세포 타입으로 분화되고, 치료적 유전 프로덕트를 제공하도록 유전적으로 조작된다.
본 발명의 화합물은 또한 이식의 목적이 질병 및/또는 임상적 마이에로아브레이션(myeloablation)으로부터 초래된 호중성백혈구감소증 및 백혈구감소증의 반전(reversal)과 같은 골수 백혈구 생성을 재복원하는 것인 임상적 세팅에서 유용성을 가진다. 본 발명의 화합물은 또한 초기 전구 세포 또는 과립구의 생성의 복원에 있어 유용성을 가지는데, 이는 질병, 다양한 알려진 치료적 부작용, 또는 마이에로아브레이션으로부터 초래된다. 본 발명의 화합물은 또한 때때로 골수 억제 없이 적혈구 생성의 억제가 바람직한 경우에 유용하다.
일정 실시예에서, 본 발명의 화합물로 처리된 줄기 세포는 그것이 필요한 환자에게 탯줄 혈액 또는 말초 혈액으로부터의 줄기 세포와 같은 비처리된 세포와 함께 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 화합물로 처리된 CD34+ 또는 CD133+ 세포는 그것이 필요한 환자에게 탯줄 혈액 또는 말초 혈액으로부터의 줄기 세포와 같은 비처리된 세포와 함께 투여된다. 일 실시예에서, 본 발명의 화합물로 배양의 첫 일부터 처리된 CD34+ 전구 세포는 그것이 필요한 환자에게 비처리된 세포와 함께 투여된다. 더 특정 실시예에서, 운반된 전구 세포는 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포이다.
예를 들어 배아-유사 또는 조혈 줄기 세포와 같은 줄기 세포, 또는 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되며, 주사제로 제제화될 수 있다 (PCT 제WO96/39101호 참조, 이것은 그 전체가 인용에 의하여 본 명세서에 포함됨). 대안적 실시예에서, 세포 및 조직, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되며, 미국특허 제5,709,854호; 제5,516,532호; 또는 제5,654,381호에 개시된 것과 같은 폴리머화 또는 크로스 링킹 하이드로겔을 사용하여 제제화된다. 상기 문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
배아-유사 줄기 세포는 전형적으로 전구 세포가 사용되는 치료적 또는 연구적 프로토콜에서 특정 클래스의 전구 세포(예를 들어 연골세포, 간세포, 조혈 세포, 췌장 실질 세포, 신경세포, 근육 전구 세포 등) 대신에 사용될 수 있다.
4.6.2. 조직 대체 또는 보강
본 발명의 줄기 세포, 특히 배아-유사 줄기 세포, 및 전구 세포, 그들의 분화는 줄기 세포 또는 전구 세포 군과 같은 바람직한 세포 군의 이식 또는 융합의 방법에 따라 조절된다. 줄기 또는 전구 세포는 존재하는 조직을 대체 또는 보강하기 위하여, 새로운 또는 개조된 조직을 도입하기 위하여, 또는 생물학적 조직 또는 구조를 결합하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 태반으로부터의 배아-유사 줄기 세포와 같은 줄기 세포, 또는 조혈 전구 세포와 같은 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 일치되는 및 일치되지 않는 HLA 타입을 포함하는, 자가의 및 동종이형의(allogenic)의 조혈 이식물로써 사용될 수 있다. 동종이형의 조혈 이식물로써 배아-유사 줄기 세포의 사용에 있어, 미국특허 제5,800,539호, 1998년 9월 1일 발행; 및 미국특허 제5,806,529호, 1998년 9월 15일 발행에 개시된 것과 같은 공여 세포의 면역학적 거부를 줄이기 위하여 호스트를 처리하는 것이 바람직하다. 상기 문헌은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
예를 들어, 배아-유사 줄기 세포, 그들의 분화는 예를 들어 간, 췌장, 신장, 폐, 신경 시스템, 근육 시스템, 뼈, 골수, 흉선, 비장, 점막 조직, 생식선, 또는 머리털의 줄기 또는 전구 세포를 보강 또는 대체하는 것과 같은 치료적 이식 프로토콜에서 사용될 수 있는 본 발명의 방법에 따라 조절된다. 마찬가지로, 조혈 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 골수 또는 내피 전구 세포 대신에 사용될 수 있다.
예를 들어 배아-유사 줄기 세포와 같이, 줄기 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 연골, 힘줄, 또는 인대의 보강, 치료 또는 대체를 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일정 실시예에서, 인공삽입물 (예를 들어 엉덩이 보철)은 본 발명의 배아-유사 줄기 세포로부터 성장한 대체 연골 조직 구조물로 코팅된다. 다른 실시예에서, 관절 (예를 들어 무릎)은 배아-유사 줄기 세포로부터 성장한 연골 조직 구조물로 재구성(reconstruct)된다. 연골 조직 구조물은 또한 다른 타입의 관절을 위한 다양한 재구성 수술에서 적용될 수 있다 (프로토콜에 관해서는 예를 들어 Resnick, D., and Niwayama, G., eels., 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d ed., W. B. Saunders Co. 참조).
본 발명의 방법에 따라 처리된 줄기 세포 및 전구 세포는 질병으로부터 유래한 조직 및 장기의 손상을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 실시예에서, 환자는 예를 들어 화학요법 또는 방사요법 후에 면역 시스템을 자극하기 위하여, 심근경색 후에 심장 조직을 치료하기 위하여와 같이, 질병의 결과로 손상된 조직 또는 장기를 재생성 또는 회복시키기 위하여 환자는 배아-유사 줄기 세포를 투여 받을 수 있다. 본 방법에 따라 처리된, 및 본 발명의 PDE IV 억제제로 처리된, 또는 본 발명의 PDE IV 억제제와 함께 투여된 줄기 및/또는 전구 세포는 간의, 췌장의 또는 심장의 조직을 치료 및/또는 대체하기 위하여 그것이 필요한 개체에게 이식될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 처리된 줄기 세포 및 전구 세포는 또한 골수 이식에 있어 골수 세포를 보강 또는 대체하기 위하여 사용될 수 있다. 인간 자가 및 동종이형의 골수 이식은 현재 백혈병, 림포마 및 다른 생명을 위협하는 장애와 같은 질병을 대한 치료로써 사용된다. 그러나 이러한 절차의 단점은 많은 양의 공여 골수가 그들이 이식을 위한 충분한 세포를 가지고 있는지 확인하기 위하여 제거되어야 한다는 것이다.
본 발명의 방법에 따라 모아진 배아-유사 줄기 세포는 많은 골수 기부에 대한 필요성을 감소시키는 줄기 세포 및 전구 세포를 제공할 수 있다. 작은 양의 골수 기부을 얻고, 그 후 수용자에게 주입 또는 이식하기 전에 태반에서 배양 및 확장을 통해 줄기 세포 및 전구 세포의 수를 확장하는 것 또한 본 발명의 방법에 따라서이다,
본 발명의 방법을 사용하여 얻어진 많은 수의 배아-유사 줄기 세포 및/또는 전구체는, 일정 실시예에서, 많은 골수 기부에 대한 필요성을 감소시킨다. 골수 이식에서 주입을 위하여 환자의 체중kg 당 약 1X108내지 2X108개의 골수 단핵 세포가 주입되어야 한다 (즉 70kg 공여자에 대하여 약 70ml의 골수). 70ml를 얻기 위해서는 기부(donation) 프로세스에 있어 집중적인 기부 및 심각한 혈액의 손실을 필요로 한다. 특정 실시예에서, 작은 골수 기부(예를 들어 7-10ml)로부터의 세포는 수용자(recipient) 내로 주입하기 전에 예를 들어 태반 생반응기 내에서와 같이 증식에 의해 확장될 수 있다. 줄기 세포, 및 전구 세포, 특히 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 따라서 대량의 골수 기부에 대한 필요성을 감소 또는 제거하는 줄기 및/또는 전구 세포를 제공할 수 있다.
태반으로부터 분리된 배아-유사 줄기 세포는, 특정 실시예에서, Tay-Sachs,Niemarm-Pick, Fabry's, Gaucher's, Hunter's, Hurler's 신드롬과 같은 리소솜 축적병 및 다른 강들리오시드증, 점액다당류증, 및 글리코겐증을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 특정 질병 또는 질환을 치료하는 자가 또는 이종유래 효소 대체 치료에서 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 세포는 아드레노류코다이스트로피(adrenoleukodystrophy), 낭 섬유증, 글리코겐 축적 질환, 갑상샘저하증, 낫 적혈구 빈혈, Pearson 신드롬, Pompe 병, 페닐케토뇨증(PKU), 및 Tay-Sachs 질환, 포르파린증, 단풍시럽뇨병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 병적 상태와 같은 선천적 대사 장애를 치료하기 위한 유전자 치료에서 자가 또는 이종유래 트랜스유전자 운반체로써 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 세포는 각막 표피 상해, 연골 수복(repair), 얼굴 박피술, 점막, 고막, 내장 내층, 신경학적 구조(예를 들어 망막, 기저막의 청각 신경, 코 표피의 후각 신경), 화상 및 피부, 두피 (머리털) 이식의 외상적 손상에 대한 상처 치료를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 대체 치료 또는 프로토콜의 자가 또는 이종유래 조직 재생성, 또는 질병이 있는 장기 또는 조직의 재구성을 위하여 사용될 수 있다.
더욱이, 작은 수의 줄기 세포 및 전구 세포는 일반적으로 혈류 내에서 순환한다. 다른 실시예에서, 그러한 외래의 줄기 세포 또는 외래의 전구 세포는 혈액이 회수되고, 하나 또는 그 이상의 성분이 선택적으로 제거되고, 혈액의 남은 부분이 공여자로 다시 재주입되는 절차인 성분채집술(apheresis)에 의해 모아진다. 성분채집술에 의해 모아진 외인성 세포는 본 발명의 방법에 따라 확장되고, 따라서 골수기부에 대한 필요성을 완전히 제거한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 따른 조혈 전구 세포의 확장은 화학요법에 더하여 보충적 치료로써 사용된다. 암 세포를 타켓으로 하여 암 세포를 파괴하기 위해 사용되는 대부분의 화학요법 성분은 모든 증식 세포, 즉 세포 분할을 수행하는 세포를 죽여서 그 효과를 나타낸다. 골수는 체내에서 가장 활발히 증식하는 조직 중의 하나이기 때문에, 조혈 줄기 세포는 종종 화학요법 성분에 의해 손상되거나 파괴되며, 결과적으로 혈액 세포 생성이 감소하거나 중단된다. 화학요법치료는 환자의 조혈 시스템이 화학요법치료를 재시작하기 전에 혈액 세포 공급을 보충하도록 하기 위하여 주기적으로 중단되어야 한다. 원래 무활동의(quiescent) 줄기 세포가 화학요법치료를 다시 재개할 정도의 수치까지 백혈구 수치를 증식하고 증가시키기 위해서는 한달 또는 그 이상의 시간이 걸린다(다시 때, 골수 줄기 세포는 파괴된다).
화학요법 치료 사이에 혈액 세포는 재생성 되는 반면, 그러나, 암은 자라고 자연적 선택에 의하여 화학요법 약물에 저항성이 될 수도 있는 시간을 가진다. 그러므로 화학요법치료가 길수록, 치료 사이의 기간이 짧을수록, 암을 성공적으로 사멸할 가능성은 커진다. 화학요법치료 사이의 시간을 줄이기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 분화된 배아-유사 줄기 세포 또는 전구 세포는 환자에게 도입될 수 있다. 그러한 치료는 환자가 낮은 혈액 세포 수를 보이는 시기를 줄이고, 그러므로 화학요법 치료의 빠른 재개를 가능하도록 한다.
다른 실시예에서, 인간 태반 줄기 세포는 만성 육아종 질환과 같은 유전적질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
4.6.3. 염증의 경감
줄기 및 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 일반적인 항-염증 성분으로 사용될 수 있다. 발명자들은 줄기 및 전구 세포, 예를 들어 탯줄 혈액으로부터의 줄기 및 전구 세포가 환자에게 이식될 때, 염증 반응을 줄이거나 또는 실질적으로 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 염증 반응을 가진 환자에게, 또는 염증 반응이 일어날 수 있는 환자에게 그것의 분화가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물에 의해 조정된 줄기 세포 또는 전구 세포를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 줄기 세포는 배아-유사 줄기 세포이고, 전구 세포는 조혈 줄기 세포, 특히 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포이다.
발명자들은 또한 본 발명의 화합물 즉, IMiDs를 이용한 개체의 치료는 면역 반응을 조정, 보강 또는 감소시키는 세포의 발달 및 분화를 자극한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 다른 실시예는 면역 반응을 가진, 또는 면역 반응을 일으킬 가능성이 있는 개체에게 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 상기 개체의 치료 방법을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 방법은 상기 개체에게 투여 전에 본 발명의 화합물을 줄기 또는 전구 세포와 접촉하고, 그 후 상기 개체에게 상기 세포의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 그렇게 처리된 세포는 치료학적으로 유효한 양만큼 상기 개체에게 본 발명의 화합물 하나 또는 그 이상이 함께 투여된다.
다른 실시예에서, 염증은 본 발명의 화합물 및/또는 세포와 함께 다른 화합물의 투여에 의해 감소된다. 예를 들어, 그러한 부가적 화합물은 프레드니손과 같은 스테로이드, 또는 cox-1/cox-2 억제제 아세틸살리실 산(아스피린), 이부프로펜, 아세트아미노펜, cox-1-특이 억제제와 같은 specific inhibitors, 비-스테로이드성 항-염증 성분, 또는 이러한 화합물의 유도체를 포함한다. 그러한 부가적인 항-염증 성분은 정맥내, 국소내, 피하내(intradermally), 또는 흡입과 같은 어떠한 표준 경로에 의해서도 투여될 수 있고, 본 발명의 화합물 및/또는 세포와 동시에, 또는 다른 시간에 투여될 수도 있다.
상기 방법은 염증과 관련된, 염증에 의해 야기된, 또는 염증을 일으키는 어떠한 질환 또는 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 사고 상처와 같은 외상에 의해 야기된 염증을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 외과 수술, 특히 자연적 조직의 이식, 합성 혈관 이식, 심 밸브 또는 혈관성형술과 같은 혈관-관련 외과 수술과 관련된 손상 또는 손상에 의한 염증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 협착 또는 재협착을 막기 위하여 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 심장 질환, 동맥경화증, 앨러지 또는 과민증, 면역 장애, 관절염과 같은 자가 면역 장애, 또는 감염에 의한 염증과 같은 질병 또는 질환을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 어떠한 질환 또는 상태로부터 야기된 염증을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 이미 존재하는 염증성 상태를 치료하는 것에 더하여, 본 발명의 화합물의 세포 및/또는 화합물은 예방학적으로 개체에게 투여될 수 있는데, 이를 통하여 염증의 발생 가능성을 줄일 수 있다. 이것은 특히수술 전 치료의 형태로써 유용하다. 이것에 의한 수술 후 염증 반응의 감소는 성공적 결과에 대한 가능성을 높이고, 입원 기간과 무력한 기간을 줄인다.
상기 치료의 항-염증 효과의 효율성 모니터링은 육안 관찰(visual inspection), MRI 또는 CAT 스캔, 전신 또는 국소 온도의 평가 등과 같이 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. C-반응성(reactive) 단백질로 알려진 단백질은 염증에 대한 마커이기 때문에, 상기 치료 방법의 효율성은 개체, 특히 전에 염증을 경험한 영역에서 C-반응성 단백질의 양의 감소를 평가하여 모티터링될 수 있다.
4.6.4. 가지 세포 및 과립구 세포 군의 제조
본 발명의 화합물은 줄기 및/또는 전구 세포의 분화를 과립구 발달 경로 대 가지 세포 발달 경로로 조절하기 위하여 특이적으로 투여될 수 있다. 유사한 방식으로, 본 발명의 세포는 확장된 일군의 가지 세포 또는 과립구를 제조하기 위하여 in vivo 또는 ex vivo로 조절될 수 있다.
가지 세포(dendritic cell)는 면역-기초 치료에 있어 반응물로써 사용될 수 있다. 예를 들어, 가지 세포는 T 임파구 및 단백질 항원과 in vitro로 같이 배양될 수 있고, 따라서 T 세포의 ex vivo 항원-특이적 활성을 유도한다. 활성화된 T 세포는 그 후 in vivo 항원-특이적 면역 반응을 초래하기 위하여 자가적으로(autologously) 투여된다 (WO97/24438). 다른 실시예에서, T 세포는 재조합 구조물로부터 항원 단백질을 직접적으로 발현하는 가지 세포로 T 임파구를 접촉시켜 in vitro 활성화될 수 있다. 활성화된 T 세포는 자가 주입을 위해 사용될 수 있다 (WO97/29183).
특이 펩타이드 또는 단백질 절편으로 활성화된 T 세포는 단백질, 그 펩타이드 또는 절편이 유래된 세포 또는 미생물에 대항하는 면역 성분이 된다. 예를 들어, 가지 세포는 종양-특이 펩타이드로 로딩될 수 있다. 전립선 암의 치료에 있어 DC-유도 ex vivo T 세포 활성화의 특이적 적용은 미국특허 제5,788,963호에 잘 개시되어 있다. Mayordomo 등은 합성 종양 펩타이드로 자극받은 골수-유도 가지 세포가 보호적이고 치료적인 항-종양 면역을 나타낸다는 것을 보여주었다 (Nature Medicine 1: 1297-1302 (1995); J. Exp. MED., 183: 1357-1365 (1996)). 미국특허 제5,698,679호는 가지 세포를 포함하는 목표 항원 표시 세포(antigen presenting cell, APC)에 항원성 펩타이드를 in vivo로 전달하는 면역글로블린 융합 단백질을 개시하고 있다. 동일한 접근이 바이러스성, 박테리아성, 또는 기생출성 백신을 생성할 수 있는 바이러스, 박테리아 또는 기생출으로부터 유래된 펩타이드 또는 항원을 사용하여 행하여 질 수 있다.
가지 세포는 또한 다양한 면역-관련 장애의 치료에 있어 치료적 중재로서의 목표이다. 예를 들어 가지 세포는 AIDS의 발병기전 및 병리생리기전에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(예를 들어 HIV 바이러스에 대한 레저보어로서 작용함). Zoeteweij et al., J. Biomed. Sci. 5 (4): 253-259 (1998); Grouard et al., Curr. Opin. Immunol. 9 (4): 563-567 (1997); Weissman et al., Clin. MICROBIOL. REV. 10 (2): 358-367 (1997) 참조. DC의 HIV 감염을 막기 위한 성분으로의 약학적 후보들을 스크리닝하는 in vitro 방법은 미국특허 제5,627,025호에 잘 개시되어 있다. 다른 실시예에서, 가지 세포는 수용자 내에서 공여자 조직 또는 장기에 T 세포가 반응하지 않도록 유도하기 위하여 조작될 수 있다 (미국 특허 제6,375,950호 참조).
과립구는 예를 들어 박테리아성 신생아 패혈증, 암 환자에 있어 호중성백혈구감소증-관련 감염, 및 골수 이식을 받은 환자에 있어서의 잠재적 감염과 같은 감염의 치료 또는 예방을 위한 과립구 수혈에서 사용될 수 있다. 과립구는 또한 앨러지의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, IgE-매개 감염에 관련된 과립구(즉, 몇몇이 앨러젠(allergen)에 대하여 특이성을 가지는 IgE 항체로 코팅된 과립구)는 앨러젠에 대항하여 이미 설립된 면역 반응의 증상을 경감하기 위하여 비활성화되고 사용될 수 있다(미국특허 제6,383,489호 참조).
따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 개체 내의 일군의 과립구는 본 발명의 치료학적으로 유효한 양의 화합물을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의하여 본 발명의 전구 세포로부터 확장된다. 여기에서 상기 양은 상기 개체에 내재적인 CD34+ 세포로부터 복수의 과립구의 생성을 야기할 정도로 충분한 양이다. 다른 실시예에서, 일군의 과립구는 일군의 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해서 개체 내에서 확장된다. 여기에서 상기 세포는 적어도 3일 동안 본 발명의 화합물과 접촉하고, 상기 개체에게 상기 군의 세포를 투여한다. 다른 실시예에서, 일군의 과립구는 상기 개체에게 일군의 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포와 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법에 의하여 개체 내에서 확장된다. 여기에서 본 발명의 상기 화합물의 투여량은 복수의 상기 군의 세포의 분화를 과립구로 유도하기에 충분한 양이다. 상기 실시예의특정 실시예에서, CD34+ 전구 세포는 CD34+CD38-CD33+ 세포이다.
4.6.5. 다른 질병 및 질환의 치료
본 발명의 분화된 줄기 및 전구 세포, 또는 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 병용하여 다양한 다른 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 일정 실시예에서, 예를 들어, 질병 또는 질환은 혈관 또는 심혈관 질환, 동맥경화증, 당뇨병, 재생불량빈혈, 척수형성이상증, 심근 경색, 졸도 장애, 다발성 경화증, 발작, 뇌졸중, 저혈압, 심장 정지, 허혈, 염증, 노화-관련 인식 기능의 손실, 방사선 상해, 뇌성 중풍, 신경퇴행성 질환, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 레이 병, AIDS 치매, 기억력 손실, 근육위축가쪽경화증(ALS), 허혈성 신장 질환, 뇌 또는 척수 상해, 심장-폐 바이패스, 녹내장, 망막 허혈, Tay-Sachs, Niemarm-Pick, Fabry's, Gaucher's, Hunter's, Hurler's 신드롬과 같은 리소솜 축적병 및 다른 강들리오시드증, 점액다당류증, 및 글리코겐증, 선천적 대사 장애, 아드레노류코이상증(adrenoleukodystrophy), 낭 섬유증, 글리코겐 축적 질환, 감상샘 저하증, 낫적혈구빈혈, Pearson 신드롬, Pompe 병, 페닐케토뇨증(PKU), 포르파린증, 단풍시럽뇨병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 만성 육아종 질환 및 티로신혈증, Tay-Sachs 병, 암, 종양 또는 다른 병리적 또는 종양적 병태를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명의 세포(예를 들어 본 발명의 화합물에 노출된 세포)는 외상, 특히 염증을 포함하는 외상으로 인한 어떠한 종류의 상해를 치료하는데 사용될 수 있다. 그러한 외상-관련 병태의 예는 뇌, 척수 상해를 포함하는 중추신경 시스템(CNS) 상해, 또는 말초 신경 시스템(PNS)에 있어 CNS 상해 주위의 조직; 또는 신체의 어떠한 다른 부분의 상해를 포함한다. 그러한 외상은 사고에 의해 야기될 수 있고, 또는 수술 또는 혈관성혈술과 같은 치료적 절차의 정상적 또는 비정상적 결과에 의한 것일 수도 있다. 외상은 예를 들어 발작 또는 정맥염과 같이 혈관의 파열 또는 폐쇄와 관련될 수 있다. 특정 실시예에서, 세포는 세포는 각막 표피 상해, 연골 수복(repair), 얼굴 박피술, 점막, 고막, 내장 내층, 신경학적 구조(예를 들어 망막, 기저막의 청각 신경, 코 표피의 후각 신경), 화상 및 피부, 두피 (머리털) 이식의 외상적 손상에 대한 상처 치료를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 대체 치료 또는 프로토콜의 자가 또는 이종유래 조직 재생성, 또는 질병이 있는 장기 또는 조직의 재구성을 위하여 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 질병 또는 장애는 재생불량성 빈혈, 척수형성이상증, 백혈병, 조혈 질환 또는 장애의 골수 장애이다. 다른 특정 실시예에서, 대상은 인간이다.
4.7. 약학적 조성물들
본 발명은 1회 투여량 및/또는 하나 또는 그 이상의 복수의 투여량를 구비하는 약학적 조성물들을 포함하며, 특정 세포 타입 예컨대, 조혈 리니지 세포 특히, 마이에로이드(myeloid) 리니지 세포 내에서 이들 줄기 및/또는 전구 세포의 분화를 억제, 조정 및/또는 조절하기에 충분한 효과를 발휘하는 개체에 대한 조건부 또는 비조건부 인체의 CD34+또는 CD 133 전구 또는 줄기 세포의 이식 전 또는 후에 상기투여량 또는 복수의 투여량은 1회 또는 복수회 투여시 효과적이다. 상기 문맥에서, 그리고 본 발명의 다른 문맥과 마찬가지로, "개체"는 예컨대, 포유류, 조류, 또는 파충류에 투여되는 혼합물 또는 세포들의 각 개체를 의미한다.
따라서, 일 실시예에 있어서, 개체에 투여되는 본 발명에 따른 혼합물의 1회 투여량 또는 복수 투여량은 가지 세포 내로 내생적인 CD34+전구 세포의 분화를 조절한다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기의 1회 투여량 또는 복수의 투여량은 투여되었던 상기 개체 내의 과립 세포들의 수를 증가시킨다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 1회의 투여량 또는 복수의 투여량은 투여된 포유류의 CD34+CD38-CD33+또는 CD34+CD38-CD33-전구 세포의 수를 증가시킨다.
다른 실시예에 있어서, 관심 대상인 CD34+또는 CD133+전구 또는 줄기 세포는 필요로 하는 환자 또는 인간 대상체에 이식된다. 이식에 수반하여, 본 발명의 화합물은 생체 내에서 관심 대상인 이식 세포의 분화를 조절하기 위해 인간 대상체 또는 환자에게 투여된다. 일 실시예에 있어서, 이러한 세포들은 과립구 내로 생체내에서 분화된다. 다른 실시예에 있어서, 인간 대상체 또는 환자의 관심 대상인 전구 또는 줄기 세포의 분화는 본 발명에 따른 화합물의 투여에 의해 원상태로 조절된다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 상기 방법에 따라 PDE IV 활성을 억제하는 화합물 노출에 의해 분화된 조혈 전구 세포를 증가시킨 전구 세포 개체수 또는 분리된 탯줄 혈관 줄기를 구비하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 발명은 본 발명에 따른 화합물 즉, 일 실시예에 있어서, 상기 화합물에 의해 분화된 상기 줄기 또는 전구 세포들과 접촉된 전구 또는 줄기 세포들을 보충하는 탯줄 혈관을 구비하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 상기 줄기 및/또는 전구 세포들과 하나 또는 그 이상의 PDE IV 반응억제제 모두를 구비하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물들은 서로 다른 계발적/분화 경로를 따르는 상기 줄기 및/또는 전구 세포들의 분화를 조절하기 위해 미리 투여량을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 전에 준비될 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 약학적 조성물들은 여기에 개시된 방법에 따라 분화된 상기 세포들 자체의 줄기 또는 전구 세포들을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 복수의 줄기 세포들 및/또는 전구 세포들을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데, 상기 복수의 줄기 및/도는 전구 세포들은 상기 세포들의 분화를 조절하는 상기 화합물들에 충분한 기간을 위해 그리고 농축에 상기 하나 또는 그 이상의 PDE IV 억제제가 접촉된다.
따라서, 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물들은 개체에 투여되는 상기 화합물과, 개별적으로 투여된 본 발명의 화합물과 공동으로 개체에 투여되는 본 발명에 따른 상기 세포들, 및 상기 개체에 투여된 본 발명에 따른 화합물과 접촉된 본 발명에 따른 상기 세포들을 포함한다.
본 발명은 대상물 안에 존재하거나, 이식할 CD34+또는 CD133+전구 세포들 또는 줄기 세포들의 분화 및/또는 증식을 효과적으로 조절하기 위해, 포유류 바람직하게는 인체 대상물에 본 발명의 화합물 또는 조성물들을 약학적으로 효과적인 양을 투여함으로써 질병 또는 장애의 방지 및 처치 방법을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 포유류 내의 과립구 세포들의 수를 증가시키기 위해 CD34+및 CD133+전구 또는 줄기 세포들의 분화를 조절하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 실시예에 있어서, CD34+및 CD133+전구 또는 줄기 세포로부터 추출될 수 있는 세포 리니지는 포유류, 바람직하게는 인체에 본 발명에 따른 화합물의 투여에 의해 조절될 수 있다. 상기에서 사용된 용어 "포유류"는 어떠한 포유류도 포함한다. 바람직하게 포유류는 이러한 처지 또는 방지를 필요로 한다. 포유류의 예로서는 특히 한정되는 것은 아니지만 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 돼지, 원숭이 등과 더욱 바람직하게는 인간을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물들은 전신 또는 일부에 투여될 수 있다. 대부분의 포유류에 대한 투여는 본 발명에 따른 화합물의 전신 방출 결과(예, 혈관 내)이다. 투여 방법은 장(腸) 경로 예컨대, 경구투여, 버컬, 설하, 및 좌약과, 국부 투여 예컨대, 경피 및 진피와, 비경구적 투여를 포함한다. 적합한 비경구적 루트는 피하주사바늘 또는 카테터를 통한 주사 예컨대, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 복막내, 동맥내, 심실내, 경막내, 안내 및 앞방내 주사 및 비주사 루트 즉 질내 창, 또는코 투여를 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물들은 경구로 투여된다. 일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 화합물을 처치에 필요한 영역에 국부적으로 투여하는 것도 바람직하다. 이것은 예를 들어 수술중 국소 주입에 의해, 국소 기구 즉, 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터를 이용하여, 좌약을 이용하여, 또는 다공, 비다공이 존재하는 임플란트를 이용하여, 또는 실라스틱 멤브레인과 같은 멤브레인을 포함하는 젤라틴 재료, 또는 섬유들로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화합물은 전형적인 것은 물론 예를 들어, 리포솜, 미소입자, 마이크로캡슐 등의 캡슐화와 같은 비표준 전달 시스템을 통해서도 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 상기 화합물 및 조성물들은 소포 내, 특히 리포솜에 전달될 수 있다(see Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et AL., in Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds. ), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); LOPEZ-BERESTEIN, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.). 다른 일례에 있어서, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 컨트롤된 방출 시스템 내로 전달될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 펌프가 사용될 수 있다(see Langer, supra ; Sefton, 1987, CRC Crit. REFBIOMED. ENG. 14: 201; Buchwald et AL., 1980, Surgery 88: 507 Saudek et AL., 1989, N. Engl. JMED. 3: 574). 다른 예에 있어서, 중합 재료가 사용될 수 있다(see Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Press. , Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug ProductDesign and Performance, Smolen and Ball (eds. ), Wiley, New York (1984); Ranger ANDPEPPAS, 1983, J. MACROMOL. Sci. Rev. Macromol. CLAIM. 23: 61 ; see also Levy et AL., 1985, Science 228: 190; During et AL., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et AL., 1989, J. Neurosurg 71: 105). 또 다른 예에 있어서, 컨트롤된 방출 시스템은 예들 들어 전신 투여의 일부에만 필요로 하는 간장(see, e. G., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) ) 등과 같이 처치될 목표 영역 근처에 위치될 수 있다. 또한, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533)에서 언급된 또 다른 컨트롤된 방출 시스템이 사용될 수도 있다. 조성물로서 투여되었을 때, 본 발명에 따른 화합물은 포유류에 적합한 투여 형태로 제공되기 위하여 약학적으로 허용되는 캐리어 또는 비히클의 적정량으로 제재될 것이다. 상기 용어 "약학적으로 허용" 된다는 것은 포유류 특히 인간에게 사용할 수 있는 조제로 일반적으로 인정되거나 또는 U.S 조제서에 리스트되어 있거나 또는 주 정부 또는 연방 정부의 통제 사무소에 의해 승인된 것을 의미한다. 상기 용어 "비히클" 은 희석액, 애주번트, 부형제 또는 포유류에 투여하기 위해 제재된 본 발명에 따른 화합물의 캐리어를 말한다. 이러한 약학적 비희클은 석유, 애니멀, 베지터블 또는 합성 오리진(예를 들면 땅콩 기름, 콩기름, 미네랄 기름, 참기름 등)을 포함하는 물 및 기름과 같은 액체일 수 있다. 상기 약학적 비히클은 염류 용액, 아라비아 고무, 젤라틴, 전분 올라, 활석, 각질, 콜로이드 실리카, 요소 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정제, 농후제, 광택제 및 착색제 등의 약품이 사용될 수 있다. 바람직하게, 포유류에 투여되었을 때, 본 발명에 따른 화합물과 조성물 및 약학적으로 허용되는 비히클, 첨가제 또는 희석재는 멸균(sterile)이다.
본 발명에 따른 화합물이 정맥 내에 투여되었을 때, 수성 매개체는 예를 들어 물, 식염수, 및 액상 포도당 및 글리세린 용액과 같은 비히클이 바람직하다.
상기 화합물과 조성물은 캡슐, 타블릿, 필, 펠릿, 능형(lozenges), 분말, 과립, 시럽, 엘릭스(elixirs), 용액, 현탁, 에멀젼, 좌약 또는 이들의 지속성 방출 제재, 또는 포유류에 투여하기 적합한 다른 형태를 가질 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 화합물과 조성물은 인체에 경구 또는 정맥 투여에 적합한 약학적 조성으로 루틴 단계에 따라 투여를 위해 제재화된다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 비히클은 경캅셀이다. 적합한 약학적 비히클의 예와 이것의 제재를 위한 방법은 레민톤(Remington)에 기재되어 있다(The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19TH ed. , 1995, Chapters 86,87, 88,91, and 92 참조).
경구 전달을 위해 제재화된 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 바람직하게, 캡슐, 태블릿, 필, 또는 압축된 약학적 형태를 형성한다. 또한, 태블릿 또는 필 형태에 있어서, 상기 화합물 및 조성물은 위장 영역 내의 흡수 및 소화를 지연시키기 위해 코팅되기 때문에 그 연장시간 동안 유지력을 제공할 수 있다. 또한, 삼투압적 활성 구동 화합물을 둘러싼 선택 투과성 멤브레인은 경구를 통해 투여되는 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물에 적합하다. 이러한 후자의 플랫폼에 있어서, 캡슐을 둘러싼 환경으로부터의 유체는 구멍을 통해 약제 조성물 또는 상기 약제를 치환하기 위해 부풀어오르는 구동 화합물에 의해 흡수된다. 이러한 전달 플랫폼은 즉각 방출 제재화의 프로파일과 반대되는 제로 오더(order) 전달 프로파일을 필수적으로 제공할 수 있다. 글리세롤 모노스테리에이트 또는 글리세롤 스테리에이트와 같은 시간 지연 재료 또한 사용될 수 있다. 경구 조성물은 표준 비히클, 부형재 및 제재 예컨대 마그네슘 스테리에이트, 소디움 사카린, 셀률로스, 마그네슘 카보네이트, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니토르, 전분, 아라비아 고무, 규산 칼슘, 미결정성의 섬유소, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 시럽 및 메틸 섬유소을 포함할 수 있으며, 상기 제제화는 부가적으로 광택 성분, 즉 활석, 마그네슘 스테리에이트, 미네랄 오일, 웨팅 성분, 유화 및 지연 성분, 메틸- 및 프로필히드록시벤조네이트와 같은 보존 성분을 포함할 수 있다. 이러한 비히클은 약학적 등급이 바람직하다. 경구로 투입되는 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 프럭크토스, 아스파탐 또는 사카린과 같은 감미 성분을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 페파민트, 노루발풀 오일, 또는 체리와 같은 향미 성분, 하나 또는 그 이상의 약학적 풍미를 제공하기 위한 착색 성분을 포함한다.
특정 장애 또는 질환의 치료를 위한 치료학적으로 유효한 투여 요법은 그 성질 및 어려움(severity)에 의존하며, 의사의 판단에 의한 표준 임상 기술에 의해 결정될 수가 있다. 또한, 생체 밖 또는 생체 내 분석은 최적 투여량을 식별하는데 도움이 될 수 있다. 물론, 치료학적으로 효과적인 투여량으로 구성되는 본 발명에 따른 화합물 또한 상기 투여 루트에 의존한다. 일반적으로, 경구 투여를 위한 적합한 투여 범위는 1일당 킬로그램 체중에 대해 본 발명에 따른 화합물의 약 0.001 ~２０mg 이며, 바람직하게는 약 0.7 ~ 6mg이며, 더욱 바람직하게는 약 1.5 ~ 4.5mg이다. 바람직한 실시예에 있어서, 포유류 바람직하게 인체에는 1일당 본 발명에 따른 화합물의 약 0.01 ~ 1000mg이 경구로 투여되며, 더욱 바람직하게는 일회 또는 분리 투여량에 있어서 약 0.1 ~ 300mg 또는 약 1 ~ 250mg이다. 여기서, 상기 투여량은 총 투여된 양으로 서술된다. 즉 이것은 만약 하나 이상의 상기 화합물이 투여된다면, 바람직한 투여량은 투여된 상기 화합물의 총량과 일치하기 때문이다. 경구 조성물은 바람직하게 10 ~ 95w% 의 상기 화합물을 포함한다. 바람직한 유닛 경구-투여 형태는 필, 태블릿 및 캡슐을 포함하며, 더욱 바람직하게는 캡슐이다. 일반적으로 이러한 유닛-투여 형태는 약 0.01, 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500mg의 본 발명에 따른 화합물을 포함하며, 바람직하게는 투여 유닛 당 약 5 ~ 200mg의 화합물을 포함한다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있으며(예, 근육내, 경막내, 정맥내, 및 동맥내 루트), 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 일반적으로, 정맥내 투여를 위한 상기 화합물 및 조성물은 물, 살린, 링거액, 또는 덱스트로스 용액 등과 같은 무균 등장 액상 비히클 용액이다. 필요에 따라, 상기 조성물은 또한 솔루빌라이징 제재를 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위한 조성물은 주사 자리의 고통을 완하하기 위한 리그노카세인과 같은 국부 마취제를 선택적으로 포함할 수 있다. 정맥 투여를 위해, 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 무균형태, 동결건조 분말 또는 엠플 또는 사키테(sachette)와 같은 밀봉 실링된 컨테이너 내의 워터-프리 농축물, 활성 제재의 양을 나타내는 컨테이너 형태로 제공될 수 있다. 이러한 분말 또는 농축물은 정맥 투여에 앞서 적정한 액상 매개체로 희석된다. 무균 물, 살린 용액 또는 다른 적합한 액상 매개체의 앰플은 투여에 앞서 희석을 위한 분말 또는 농축물로 제공될 수 있다. 또는 상기 조성물은 투여를 위한 프리믹스된 형태로 제공될 수도 있다. 정맥 내에 주입됨으로 인해 투여되는 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물은 예를 들어 무균 약학적-등급 물, 살린, 또는 다른 적합한 매개체를 담는 주입병으로 조제될 수 있다.
직장(直腸) 투여는 코코아 버터, 수정된 식물성 오일 및 다른 지방 베이스(fatty bases)와 같은 종래의 캐리어로 제재된 좌약의 사용을 통해 효과적일 수 있다. 좌약은 예컨대, (Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ED., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed. , 1995, pp. 1591-1597, 참조)에 잘 알려진 포물레이션을 사용하는 잘 알려진 방법에 의해 조제될 수 있다.
국부적인 투여 형태로 투여 및 제재화하기 위해서는, 잘 알려진 로우션, 크림 및 연고와 같은 경피성 및 내피성 전달 매개체, 및 패치와 같은 경피성 전달 장치가 사용된다(Ghosh, T. K.; Pfister, W. R.; Yum, S. I. TRARASDERMAL AND TOPICAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, INTERPHARM Press, Inc. p. 249-297, 참조). 예를 들어, 저장소 타입의 패치 디자인은 접착제로 코팅된 백킹(backing) 필름 및 본 발명에 따른 화합물 및 조성물을 포함하는 저장소 구획을 구비하는데, 이것은 반투성 멤브레인(예, 미국특허 4,615, 699참조)에 의해 피부로부터 분리된 것이다. 백킹 레이어를 코팅한 상기 접착제는 피부에 집중 실을 제공하며 피부에 인접한 저장소를 홀딩하기 위해 저장소의 경계영역까지 확장된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 화합물로 채워진 하나 또는 그 이상의 컨테이너로 이루어진 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 컨테이너와의 선택적 결합은 제약 또는 바이오 제품의 제조, 사용 또는 판매를 통제하는 정부 부처에 의해 처방되는 형태로 고지될 수 있으며, 상기 고지는 인체 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 부처에 의해 승인된 것을 반영한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 화합물과 다른 생화학적 활성제를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 인체에 사용하기에 앞서 소망하는 치료적 또는 예방적 활동을 위해 바람직하게 생체내 또는 생체 밖에서 분석된다. 예를 들면, 생체내 분석은 본 발명에 따른 특정 화합물의 투여 또는 본 발명에 따른 화합물의 결합이 적합한가 아닌가를 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물과 화합물은 동물 모델 시스템을 사용하여 안전성과 효과성이 증명될 수 있다. 다른 방법들은 숙력된 당업자들에게 알려진 것들로 본 발명의 범위에 포함된다.
4.8. 본 발명의 방법을 사용하는 분석
상술한 방법론 예컨대, CD34+세포와 같은 초기 전구 세포의 분화에 대한 SelCID 효과의 검사는 알려지길 원하는 상기 분화에 대한 효과가 어떠한 대상체 화합물에도 적용될 수 있다. 이것은 몇 가지 방법으로 달성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 본 발명에 따른 다른 화합물 또는 SelCID로 간단히 대체될 수 있다. 여기서, CD34+전구 세포 및/또는 CD133+전구 세포들은 허용되는 전구 세포들의 급증 및/또는 분화 및/또는 완전 분화된 세포들을 허락하는 조건에서 다양한 농축도로 대상체 화합물에 접촉될 수 있다. 여기에 개시된 배양 방법은, 특히 섹션 4.4에 개시된 배양 방법이다. 대상체 화합물의 효과가 만일 있다면, 전구 세포들로부터 분화되는 셀 개체수에 있어 변화를 측정함으로써 결정되고, 상기 변화는 표현형 변화에 의해 모니터될 수 있지만, 바람직하게는 존재하거나 또는 존재하지 않는 세포 표면 마커를 결정함으로써 평가된다. 본 발명에 따른 방법과 같이, 대상체의 상기 화합물은 최종 분화된 세포의 획득을 위한 최초 배양으로부터 언제든지 1회 투여량 내에서 투여될 수 있다. 선택적으로, 대상체의 상기 화합물은 급증 스테이지, 분화 스테이지 또는 양쪽 스테이지 동안 다수의 투여량이 투여될 수 있다. 상기 급증/분화 전구 세포의 표현형 특징 내의 변화는 바람직하게, DMSO 처치된 세포와 같은 세포의 컨트롤 배양과 비교된다. 특별한 관심은 제한되는 것은 아니지만 예컨대, 급증 비율의 조정;분화 비율의 조정; 특정하게 허용된 전구(precursor) 세포 내의 전구(progenitor) 세포들의 분화 조정; 특정 세포 타입으로의 분화 블로킹; 및 특정 세포 타입으로의 분화 강화;와 같은 분화 또는 급증 효과이다.
또 다른 실시예에 있어서, 배양, 급증 및 분화는 상기와 같이 발생하지만, 관심 있는 화합물은 SelCIDTM과 같은 PDE IV 반응억제제를 따라 전구 세포와 접촉된다. 이러한 방법에 있어서, 다수 화합물의 효과는 결정될 수 있다. 특별한 관심은 어떠한 화합물이 혼자서 급증 또는 분화에 대한 미약한 또는 전혀 효과를 가지지 않는다는 것이지만, SelCIDTM또는 그 프로드러그와 결합하여 상당한 효과를 가진다. 또 다른 실시예에 있어서, 관심 있는 어떤 두 개의 화합물은 일반적으로 전구 세포들의 급증과 분화를 허용하는 상기와 같은 배양 조건에서 전구 세포들과 접촉될 수 있다. 여기서, 관심 있는 두 개의 화합물과 접촉하는 전구 세포들의 실험은 바람직하게 상기 화합물들의 각 어느 하나에만 접촉되는 전구 세포로 컨트롤 하거나, SelCIDTM과 같은 PDE IV 반응억제제와 접촉하는 세포로 컨트롤하거나, 화합물과 접촉하지 않거나 또는 DMSO와 접촉되는 세포로 컨트롤하는 것을 포함한다. 또한, 투여량에 있어서 상기 변화들과 투여 시기는 상기 및 4.4장에 기재된다.
5.1. 실시예 1: CD34+ 전구 세포의 분화에 대한 PDE IV 억제제의 영향
다음의 분석법이 CD34+ (조혈 전구체) 세포의 분화 및 콜로니 형성 유닛(CFU)의 생성에 대한 PDE IV 억제제의 영향을 평가하기 위하여 사용되었다. 중요하게도, 분석은 적혈구 콜로니의 생성 (BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특이적으로 억제하는 PDE IV 억제제의 능력을 보여준 반면, 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성은 증강시켰고, 총 콜로니 형성 유닛(CFU-Total) 형성은 촉진하였다. 본 발명의 방법은 그러므로 줄기 세포의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있고, 또한 콜로니 형성의 속도를 자극하기 위하여 사용될 수 있으며, 골수 이식 및 백혈구및/또는 혈소판 생성의 회복 속도를 향상시킴으로써 조혈 줄기 세포의 이식에 중요한 이점을 제공한다.
탯줄 혈액 CD34+ 조혈 전구체 세포는 96 웰 배양 디쉬에 웰당 1000 세포의 밀도로 20% 소태아 혈청 및 사이토카인(IL-3, G-CSF 및 kit-ligand (R&D Systems, Inc.) 으로 보충된 IMDM 내에 플레이팅된다. 세포는 하나 또는 그 이상의 PDE IV 억제제에 노출되거나, 또는 DMSO (대조군 화합물)에 노출되고, 6일 동안 배양된다. 탯줄 혈액 CD34+ 세포는 96 웰 배양 디쉬에 웰당 1000 세포의 밀도로 20% 소태아 혈청 및 사이토카인(IL-3, G-CSF 및 kit-ligand(KL) (R&D Systems, Inc.)으로 보충된 IMDM 내에 플레이팅된다. 배양 후에, 세포는 염색되고, 형광 활성 세포 소터(sorter)(FACS)를 사용하여 분류된다. 염색된 세포 400ul는 배양되고, 1% 소태아 혈청을 가진 인 완충 생리식염수(PBS)로 1.0ml가 되도록 희석되었다. 세포는 줄기 세포 분화의 조절에 대한 영향을 결정하기 위해 카운팅된다. 결과는 적혈구 또는 적혈구 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성의 억제, 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성의 증강, 및 총 콜로니 형성 유닛 형성의 증가를 나타낸다. 본 발명의 방법은 그러므로 줄기 세포의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있고, 또한 특정 콜로니 형성 속도를 촉진하기 위하여 사용될 수 있으며, 골수 이식 및 백혈구 및/또는 혈소판 생성의 회복 속도를 향상시킴으로써 줄기 세포의 수임(commitment)을 바람직한 이식 가능한 계통으로 향하도록 함으로써 조혈 줄기 세포의 이식에 중요한 이점을 제공한다.
5.2. 실시예 2: 인간 탯줄 혈액 CD34 + 전구 세포의 분화에 관한 PDE Ⅳ 억제제의 효과
다음 실시예에서, CD34+(조혈 전구:hemaotopoietic progenitor) 세포에 대한 탯줄 혈액(Cord Blood : CB) 단핵세포의 분화와 증식에 관한 PDE Ⅳ 억제제의 효과가 연구된다. 탯줄 혈액 단핵 세포는 조혈 전구(CD34+)세포의 작은 군을 포함하는 혼합된 세포의 군이다. 이러한 작은 CD34+세포 군의 작은 부분은 CD34+CD38+세포의 군(대략적으로 모든 탯줄 혈액 단핵 세포의 1%)과 CD34+CD38-세포의 더 작은 군(모든 탯줄 혈액 단핵 세포의 1%보다 적은)을 포함한다. 특히, PDC Ⅳ 억제제는 CD34+세포의 업-조절(up-regulaion)(증가된 분화)을 일으키며, 양의 또는 음의 조절과 비교하여 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 분화를 억제 또는 지연시킨다.
5.2.1. 재료 및 방법
탯줄 혈액(CB) CD34+세포는, 싸이토킨(cytokines)(IL3,G-CSF와 Kit-lignad)(R&D System, Inc.)이 첨가된 20%의 FCS IMDM(태아 장딴지 혈청 : Iscove's Modified Dulbecco's Medium)의 24-웰 플레이트(24-well plate)의 4×104cell/ml에서 발생된다. PDE Ⅳ 억제제는 다양한 농도에서 컬쳐(culture)에 포함된다. DMSO의 똑같은 볼륨은 조절로써 사용된다. 어떠한 화합물도 없이 음의 조절이 또한 사용된다. 세포는 37℃와 7일 동안의 축축한 배양기의 5% CO2에서 배양된다. 세포는 각각의 웰(well)에서 배양된다.
각각의 웰(well)으로부터의 모든 세포의 숫자는 CELL-DYN 1700(Abbott Diagnostics)을 계속함으로써 판단되고, CXCR4, CD45, CD38, CD11b의 발현과 Gly-A 발현은 FACS(형광 표지 세포 분리)염색법에 의해 분석된다.
5.3. 실시예 3: PDE Ⅳ 억제제의 인간 탯줄 혈액 MNC 세포에 대한 효과
표준 방법을 사용한 냉동보존 및 해동되었던 탯줄 혈액 MNC는 표준 피콜 분리법(Ficoll seperation method)에 의해 격리되고, 트리플리케이트(triplicate)의 싸이토킨(IL6,각각 KL 및 G-CSF 10 ng/ml)이 첨가된 20%의 FCS-IMDM의 24-웰 플레이트(24-well plate)의 0.5×106cell/ml에서 배양된다. 실험 그룹은 무(none)(단지 싸이토킨), DMSO(1.7ul), DMSO에서의 다양한 농도의 PDE Ⅳ 억제제이다. 배양된 세포는 증식되고, 1주일간의 배양후에 FACS 염색법에 의해 분석된다.
5.4. 실시예 4: PDE Ⅳ 억제제의 단핵세포 생산에 관한 효과
정제된 인간 탯줄 혈액 CD34+세포는, 축축한 5% CO2인큐베이터에서 37℃에서 14일동안 4×104cell/ml에서, 싸이토킨(IL3,IL6,G-CSF,KL 및 Epo)이 첨가된 20%의 FCS-IMDM 배지(medium)에서 배양된다. 실험 그룹은 다음 그룹으로 구성된다. (ⅰ) DMSO나 어떠한 화학적 화합물이 첨가되지 않은 그룹("None"), (ⅱ)오직 DMSO 만 첨가된 그룹, (ⅲ) PED Ⅳ 억제제가 DMSO에 용해된 그룹으로 구성된다. 세포의앨리컷(aliquots)는 배양되고, 단세포군 항체와 접합된 CD34-PE와 단세포군 항체와 접합된 CD14-FITC로 염색된다.
5.5. 실시예 5: PDE Ⅳ 억제제의 탯줄 혈액과 태반으로부터의 이식 핵 세포에 대한 효과
이 실험은 PDE Ⅳ 억제제의 사전-조치(pre-treatment)가 이식된 태반 단핵 세포(PLNC), 탯줄 혈액 단핵 세포(UCBNC), 및 뼈 골수 세포(BMNC)의 생존을 증가시키는 것을 보여준다.
태반 단핵 세포 (PLNC), 탯줄 혈액 단핵 세포(UCBNC), 및 뼈 골수 세포(BMNC)는 인간 기증자로부터 얻어진다. PLNC 및 UCBNC는 태반 및 탯줄로부터 얻어진다.
세포들은 24시간 동안 PDE Ⅳ 억제제의 10㎍/ml과함께 2% 인간 CB 줄기가 첨가된 DMEM에서 배양함으로써 사전처리된다. 세포들은 그리고 나서 세척되고, 자가 플라즈마 (autologous plasma)에서 재부유되고( resuspended), 표준방법에 의해 치사 방사선 조사(900cGy)에 의해 생산된 뼈 골수 절제(ablation)된 기증받는 어른 SJL/L 쥐들(Jackson Laboratories)에게 정맥으로 투약된다. 그러한 방사선 조사는 50일간의 지난 방산선 조사에 의해 90%이상이 치사되는 것보다 낫다. (엔덴 그외, 2001, 라이프 싸이언스 69(13):1531-1539, 첸 및 엔덴,2000, J.메드. 31:21-30;엔덴 그외, 2000, 라이프 싸이언스 67(1):53-9;엔덴 및 첸, 2000, 암.J.클린.패톨. 114:89)
5.6. 실시예 6 : SelCIDs TM 의 CD34+ 전구 세포에 대한 효과
다음 예는 SelCIDsTM의 CD34+(조혈 전구)세포의 분화에 대한 효과 및 콜로니 형성 유니트(colony forming units)(CFU)의 생성에 관한 효과를 분석한다. 특히, 그 결과는 SelCIDsTM가 적혈구 콜로니(erythropoietic colonies)(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특히 억누르는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 반면에, 백혈구와 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 증대와 모든 콜로니 형성 유니트(CFU-Total) 생산을 증대한다는 것을 보여준다.
발명의 방법은 그러므로, 줄기 세포의 분화를 조절하는데 사용될 수 있으며, 콜로니 형성의 속도를 자극하는데 사용될 수 있으며, 뼈 골수 융합(engrafrment)의 속도를 향상시킴으로써 조혈 줄기 세포 이식에 대해 중요한 이익을 제공하며, 백혈구 또는/및 혈소판 생산의 회복에 사용될 수 있다.
탯줄 혈액 CD34+ 조혈 전구 세포는, 싸이토킨(IL-3, G-CSF 및 kit-ligand (R&D Systems, Inc) 및 20% 태아의 장딴지 혈청이 첨가된 IMDM에서 웰(well)당 1000 세포의 밀도에서, 96 웰 배양 접시에 놓여진다. 세포는 SelCIDsTM또는 DMSO (조절 화합물)에 노출되며, 6일 동안 배양된다. 탯줄 혈액 CD34+ 세포는 싸이토킨(IL-3, G-CSF 및 kit-ligand(KL)(R&D Systems, Inc)) 및 20% 태아의 장딴지 혈청이 첨가된 IMDM에서 웰(well)당 1000 세포의 밀도에서, 96 웰 배양 접시에 놓여진다. 배양후, 세포는 염색되고, 형광 표지 세포 분리(FACS)되어 저장된다. 염색된 세포 400㎕는 배양되고, 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)(PBS)에서 1% 태아 장딴지 혈청과 함께 0.1ml 로 희석된다. 세포는 줄기 세포 분화의 조정의 효과를 판단하기 위해 카운트 된다.
발명의 화합물은 조혈 전구 줄기 세포의 리니지 커미트먼트(lineage commitment)에 효과적이다. 그래서, SelCIDsTM는 붉은 피 세포 또는 적혈구 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특히 억제하며, 반면에 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성을 증가시키며, 또한 모든 형성 유니 생산(forming unit production)을 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로 발명의 방법은 줄기 세포의 분화를 조정하는데 사용될 수 있으며, 또한 특별한 콜로니 형성의 비율을 자극하는데 사용될 수 있으며, 뼈 골수 융합(engrafrment)의 속도를 향상시킴으로써 조혈 줄기 세포 이식에 대해 중요한 이익을 제공하며, 바람직한 융합이 가능한 계통의 원형 줄기 세포 커미트먼트(commitment)에 의해 백혈구 또는/및 혈소판 생산의 회복에 사용될 수 있다.
5.7. 실시예 7: SelCIDs TM 의 인간 탯줄 혈액 CD34 + 세포의 증식 및 분화에 관한 효과
다음 예에서, SelCIDsTM의 탯줄 혈액(CD) 단핵 세포의 CD34+(조혈 전구)세포에 대한 증식 및 분화에 관한 효과가 연구된다. 탯줄 혈액 단핵 세포는 조혈 전구(CD34+)세포의 작은 군을 포함하는 세포의 혼합 군이다. 이러한 작은 CD34+세포군의 작은 부분은 CD34+CD38+세포의 군(대략적으로 모든 탯줄 혈액 단핵 세포의 1%)과 CD34+CD38-세포의 더 작은 군(모든 탯줄 혈액 단핵 세포의 1%보다 적은)을 포함한다. SelCIDsTM는 CD34+세포의 업-조절(up-regulaion)(증가된 분화)을 일으키며, 양의 또는 음의 조절과 비교하여 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 분화를 억제 또는 지연시키는 것으로 보인다.
5.7.1. 재료 및 방법
탯줄 혈액(CB) CD34+세포는, 싸이토킨(cytokines)(IL3,GCSF와 Kit-lignad)(R&D System, Inc.)이 첨가된 20%의 FCS IMDM(태아 장딴지 혈청 : Iscove's Modified Dulbecco's Medium)의 24-웰 플레이트(24-well plate)의 4×104cell/ml에서 발생된다. SelCIDsTM는 세가지 농도에서 컬쳐(culture)에 포함된다:5㎕/ml, 1㎕/ml 및 0.3 ㎕/ml. DMSO의 똑같은 볼륨은 조절로써 사용된다. 어떠한 화합물도 없이 음의 조절이 또한 사용된다. 세포는 37℃와 7일 동안의 축축한 배양기의 5% CO2에서 배양된다. 세포는 각각의 웰(well)에서 배양된다.
각각의 웰(well)으로부터의 모든 세포의 숫자는 CELL-DYN 1700(Abbott Diagnostics)을 계속함으로써 판단되고, CXCR4, CD45, CD38, CD1lb의 발현과 Gly-A 발현은 FACS(형광 표지 세포 분리)염색법에 의해 분석된다.
두 다른 기증자(CB2276 및 CB2417)로부터의 탯줄 혈액 세포는 배양되고, 측정되고, 개별적으로 분석된다.
5.7.2. 결과 및 토의
SelCIDTM의 CD34+ 세포의 싸이토킨-자극 팽창에 대한 효과가 테스트된다. SelCIDTM는, 음의 조절과 비교하여 IL-3, Kit-ligand(KL) 및 G-CSF의 존재하에서 배양된 CD34+ 세포의 증식에 대해 중요한 효과를 갖지 않는다. 그러나, SelCIDTM는 DMSO 컨트롤과 비교하여 많은 세포들의 일드(yield)를 유도한다고 예상된다.
SelCIDTM의 세포 분화의 발현에 대한 효과는 표면 단백질 CXCR4 및 CD34의 FACS 분석에 의해 분석된다. SelCIDTM는 CXCR4의 발현에 대해 억제 효과를 나타낸다고 예상된다.
표면 단백질 CD34+과 비교하여, SelCIDTM는 CD34+세포의 업-조절(up-regulaion)(증가된 분화)을 일으킬것으로 예상된다. SelCIDTM처리 세포에서, CD34+와 CD34-세포의 대부분은 CD38-가 되며, 반면에 컨트롤에서의 세포와 DMSO-처리된 콜로니은 주로 CD38+가 된다. 이것은 SelCIDsTM이 붉은 피 세포 또는 적혈구 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특히 억제하며, 반면에 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성을 증가시키며, 또한 모든 형성 유니 생산(forming unit production)을 증가시키는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 그러므로 발명의 방법은 줄기 세포의 분화를 조정하는데 사용될 수 있으며, 또한 콜로니 형성의 비율을 자극하는데 사용될 수 있으며, 뼈 골수 융합(engrafrment)의 속도를 향상시킴으로써 조혈 줄기 세포 이식에 대해 중요한 이익을 제공하며, 백혈구 또는/및 혈소판 생산의 회복에 사용될 수 있다.
SelCIDsTM의 세포 분화의 발현에 대한 효과는 표면 단백질 세포 CD34+CD38-대 CD34+CD38+ 또는 CD11b+의 FACS 분석에 의해 분석된다. CD1lb 발현의 레벨은 SelCIDsTM처리된 세포에서 감소되며, 중간의 면역형광(immunofluorescence)로써 판단되며, CD11b 발현이 억제되는 것을 의미한다. CD11b+세포는 그러므로 SelCIDsTM의 존재하에서 배양될때, 더 적게 분화된다.
5.8. 실시예 8: SelCIDs TM 의 인간 탯줄 혈액 MNC 세포에 대한 효과
먼저 실시예에서, SelCIDsTM은 탯줄 혈액 CD34+세포에서 CXCR4의 발현을 특히 하향-조정한다고 예상되며, CD34+CD38- 세포 콜로니을 증가시키는 것으로 예상된다. 이러한 예에서, SelCIDsTM은 탯줄 혈액 단핵 세포(MNC)에서 유사하게 활동성을 갖는 것으로 보여진다.
표준 방법을 사용한 냉동보존 및 해동되었던 탯줄 혈액 MNCs는 표준 피콜 분리법(Ficoll seperation method)에 의해 격리되고, 트리플리케이트(triplicate)의 싸이토킨(IL6,각각 KL 및 G-CSF 10 ng/ml)이 첨가된 20%의 FCS-IMDM의 24-웰 플레이트(24-well plate)의 0.5×106cell/ml에서 배양된다. 실험 그룹은 무(none)(단지싸이토킨), DMSO(1.7㎕), SelCIDsTM(1.7㎕ DMSO에서 5.0㎍)이다. 배양된 세포는 증식되고, 1주일간의 배양후에 FACS 염색법에 의해 분석된다.
DMSO, SelCIDsTM와 함께 배양된 MNCs의 모든 세포 숫자는, 컨트롤 그룹(무"None", 단지 싸이토킨)에 비해 적을 것으로 예상된다. MID 1과 함께 배양된 세포 배양은 모든 다른 그룹에 비해 CD34+ 세포의 더 높은 퍼센티지를 나타내야하며, 반면에 모든 CD34+세포의 숫자는 모든 그룹에서 유사해야한다. CD34+CD38- 세포의 숫자는 SelCIDsTM처리된 세포에서 특히 높을 것이며, 이것은 화합물과 함께한 정제된 CD34+세포의 처리 결과와 일관된다. CD34+CD38- 세포는 더 적게 분화된, CD34+CD38+ 세포보다 더 높은 효율로 이식된 후에 융합되고 증식된 조혈 전구 세포이다. (다오 그외. 1998,블러드91(4):1243-55;후앙 그외, 1994, 블러드 83(6):1515-26)
SelCIDsTM처리된 세포의 배양에서 CXCR4+세포의 대다수는 CD45 네커티브이다. 이러한 세포 군은 특히 SelCIDsTM처리 세포에서 높다.
이러한 결과는 SelCIDsTM가 냉동보존, 해동 또는/및 줄기 세포에 대한 냉동보존의 해로운 효과에 반대작용하기 위한 컨디셔닝(conditioning) 줄기 세포에서 유용하다. 이 결과는 나아가 CD34+의 DMSO에 의한 억제 및 CD14+세포의 생산이 SelCIDsTM에 의해 처리됨으로써 반대작용될 수 있다는 것을 나타내며, 이것은 CD34+및 CD14+의 증식양을 증가시킨다.
5.9. 실시예 9: SelCIDs TM 의 단핵구 생산에 대한 효과
정제된 인간 탯줄 혈액 CD34+ 세포(90 % CD34+ 보다 큰)는 37℃와 축축한 5 % CO2배양기에서 14일 동안, 싸이토킨(cytokines)(IL3,IL6, G-CSF,KL 및Epo)이 첨가된 20%의 FCS IMDM 배지에서 4×104cell/ml에서 배양된다. 실험 그룹은 다음 그룹으로 구성된다. (ⅰ) DMSO나 어떠한 화학적 화합물이 첨가되지 않은 그룹("None"), (ⅱ)오직 DMSO 만 첨가된 그룹, (ⅲ) SelCIDsTM가 DMSO에 용해된 그룹으로 구성된다. 세포의 앨리컷(aliquots)는 배양되고, 단세포군 항체와 접합된 CD34-PE와 단세포군 항체와 접합된 CD14-FITC로 염색된다. SelCIDsTM처리 그룹은 조절 그룹보다 특히 Cd34+ 세포가 더 높은 퍼센티지를 나타낼 것으로 예상된다. 게다가, CD14+세포의 숫자의 감소에서 알수 있듯이 단핵구의 생산은 감소한다. SelCIDsTM-처리 그룹은 DMSO에도 노출되었기 때문에, DMSO에 의해 억제된 단핵구 생산은 SelCIDsTM에 의해 처리됨으로써 극복된다는 것을 유츄할 수 있다.
5.10. 실시예 10: SelCIDs TM 사전 처리의 탯줄 혈액 및 태반으로부터의 이식 핵 세포에 대한 효과
이 실험은 SelCIDsTM의 사전-조치(pre-treatment)가 이식된 태반 단핵세포(PLNC), 탯줄 혈액 단핵 세포(UCBNC), 및 뼈 골수 세포(BMNC)의 생존을 증가시키는 것을 보여준다.
태반 단핵 세포 (PLNC), 탯줄 혈액 단핵 세포(UCBNC), 및 뼈 골수 세포(BMNC)는 인간 기증자로부터 얻어진다. PLNC 및 UCBNC는 태반 및 탯줄로부터 얻어진다.
세포들은 24시간 동안 SelCIDsTM의 10g/ml과함께 2% 인간 CB 줄기가 첨가된 DMEM에서 배양함으로써 사전처리된다. 세포들은 그리고 나서 세척되고, 자가 플라즈마 (autologous plasma)에서 재부유되고(resuspended), 표준방법에 의해 치사 방사선 조사(900cGy)에 의해 생산된, 뼈 골수 절제(ablation)된 기증받는 어른 SJL/L 쥐들(Jackson Laboratories)에게 정맥으로 투약된다. 그러한 방사선 조사는 50일간의 지난 방산선 조사에 의해 90%이상이 치사되는 것보다 낫다. (엔덴 그외, 2001, 라이프 싸이언스 69(13):1531-1539, 첸 및 엔덴,2000, J.메드. 31:21-30;엔덴 그외, 2000, 라이프 싸이언스 67(1):53-9;엔덴 및 첸, 2000, 암.J.클린.패톨. 114:89)
SelCIDsTM사전 처리는 이식 태반 단핵 세포(PLNC), 탯줄 혈액 단핵 세포(UCBNC) 및 뼈 골구 세포(BMNC)의 생존을 증가시킨다.
5.11. 실시예 11: CD34 + 전구 세포의 분화의 조정
뼈 골수 및 탯줄 혈액 CD34+ 전구 세포는 클로네틱(Clonetic)에서 얻어지고, SCF, Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에서 6일동안, BIT 95000(StemCellTechnologies)이 첨가된 Iscove's MDM에서 배양되고, 그리고 나서, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에서 추가 6일동안 배양된다.
세포 표면 표현형의 분석 : 세포는 6일째와 12일째에 FITC 및 PE 접합된 mAbs를 사용하여 이중 염색(4℃에서 30분) 처리된다. 사용된 항체는 BD 파민젠(Pharmingen) : CD34(PE), CD38(FITC), CD33(FITC), CD1a(FITC), CD86(PE), CD14(PE), CD83(PE), CD54(PE), CD11b(PE), CD11c(PE), HLA-DR(PE),CD15(FITC), 및 CD133(PE) 밀테니(Miltenyi):에서 나온다. 형광 분석은 10,000 이벤트(events)(Coulter)의 획득후에 FACScan 플로우 세포측정기에서 이루어진다.
아포프토시스(apoptosis)의 검출 : 인지질 세린 (Phosphatidyl serine)은, 제조자 설명에 따른 프로피디움(propidium) 요오드화물(iodide)(BD 파민젠 아포프토시스 (Pharmingen apoptosis) 검출 키드)이 첨가되어 혼합된 아넥신(Annexin) V-FITC 염색을 사용하여 판단된다.석
포식작용(Phagocytosis): 세포의 엔도싸이틱(endocytic) 활동은 FITC-덱스트란(dextran) 섭취를 측정함으로써 분석된다. 세포는 음의 조절로써 1시간동안 4℃및 1시간동안 37℃에서 완전한 배지에서 1mg/ml 덱스트란-FITC (시그마)에서 배양된다.
T 세포 증식 분석 : 13일동안의 배양후에, CD34+-유도 DC 세포는 채집되고, 그리고나서, 미토미신(mitomycin) C (50㎍/ml, 시그마)에서 처리되고, 건강한 자원자로부터 원주 피 단핵 세포(PBMCs)의 정제된 어른 CD3+T 세포동종이형(allogenic)의 자극세포로서 사용된다. CD3+T 반응 세포는 5×104cells/well의 농도에서 사용된다. 자극 세포는 화학발광 검색용 블랙 96-웰 평면 바닥, 깨끗한 바닥 티슈 배양 플레이트에서 T 세포에 그레이디드(graded) 투여량에 첨가된다. 배양은 10 % 열-불활성 FBS, 글루타민(glutamine),및 페니실린-스트렙토미신(Penicillin-streptomycin)이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 이루어진다. 배양 6일 후에, 세포 증식은 BrdU 화학발광 분석(Roche, Nutley NJ)에 의해 제조자의 설명에 따라 측정된다. 결과는 삼중 배양에서 얻어진 평균 ±SD 로써 나타난다.
SelCIDsTM은 특히 CD34+전구로부터 DC의 개선으로 변화될 수 있다. SelCIDsTM의 DC 생산에 대한 효과를 연구하기 위해, CD34+전구 세포는 팽창과 성숙(1일에서 12일)의 12일동안, 또는 성숙(6일에서 12일)의 6일 동안 SelCIDsTM(1μM)과 함께 또는 없이 배양된다. 1일에서 12일까지 SelCIDsTM의 첨가는 DC 표현형의 획득을 억제할 것으로 예상되며, 보다 중요하게 CD34+CD38-군을 증가시키며, CD34+CD38-세포의 노말한 분화를 CD34+CD38+세포로 변화시킨다. 그러나, SelCIDsTM처리된 CD34+세포는 골수 마커(myeloid marker)를 얻는것으로 예상되며, 이러한 세포들은 CD34+CD38-CD33+표현형을 6일째에 제공할 것이다. SelCIDsTM는 6일째에 CD1a+세포의 생산, 특히 더블 포지티브(double positive) CD86+CD1a+세포의 생산을 거의 완벽하게 억제한다. 이러한 더블 포지티브 군은 표피 랭거한스(Langerhans) DC의 전구물질로써 생각되어졌다. SelCIDsTM은 또한 피부 DC 및 단핵세포/대식세포 양쪽을 다 일으키는 CD14+CD1a-세포의 생산을 감소시킬 수 있다. 초기 전구군(CD34+CD38-) 및 골수 DC 전구(CD1a+CD14-및 CD1a-CD14+세포)의 블럭에서 증가는, 아마도 투여량에 의존할 것이며, SelCIDsTM의 1μM에서 최대에 도달한다. 이러한 효과는 가역적이며, CD34 분화 경로는 단지 CD34+전구가 SelCIDsTM과 함께 적어도 3일동안 배양됨으로써 방해된다.
0일째와 6일째의 SelCIDsTM의 다중 투여는 CD34+군에서 증가를 심화시킬 것이다.
CD34+전구 세포는 SelCIDsTM의 존재하에서 배양되며, 또한 합동-자극 분자(co-stimulatory molecule)(CD86,CD80)의 줄어든 발현을 나타낸다.CD54 부착 분자는 CD54bright의 감소된 발현에 의해 변화되며, CD54dim군의 발현을 증가시킨다. HLA-DR 분자의 발현은 SelCIDsTM처리된 CD34+전구에서 감소된다.
하나 또는 그이상의 SelCIDsTM이 6일째에 첨가되면, 처리 없이 0일에서 6일까지의 배양후에, CD1a+군이 이미 생성됐을 경우, SelCIDsTM은 Cd1a+군의 유지를 증가시킨다. SelCIDsTM-처리 배양은 DMSO 조절보다 12일째에 상대적으로 보다 많은 CD1a+전구물질을 포함한다. 6일째에 CD34+분화 세포에 대한 SelCIDsTM의 첨가는 또한 CD14+전구물질의 생산 및 합동-자극 분자(CD86,CD80)의 발현을 상당히 감소시킨다.
SelCIDsTM는 과립성 백혈구의 분화를 촉진한다 : DC 생성에서 불럭이 다른 골수(myeloid) 분화 경로의 변화와 관련이 있는지를 판단하기 위해, CD15 과립성백혈구 마커의 발현이 모니터될 수 있다. CD15 표면 분자의 발현은 SelCIDsTM의 존재하에서 배양된 CD34+전구 세포에서 증가된다. DC 분화를 유도하는 싸이토킨(cytokine) 혼합물의 존재하에서, SelCIDsTM의 첨가는 전구 세포를 보다 과립성-유사 표현형으로 팽창/성숙하도록 전환한다. 골수(myeloid) 분화에서 편위는 2 표지:랑거한스 세포 및 침입형 DC용 골수 DC 전구에 의해 발현된 CD11c, 과립성 전구에 의해 발현된 CD15 :의 발현을 모니터 함으로써 연구될 수 있다.CD11c+CD15-군에서 감소는 CD11c-CD15+과립성 군에서 수반된 증가와 관련된다. 흥미롭게, SelCIDsTM의 다중 투여가 과립성 계통을 향한 이동을 증가시킨다.
DC 생성의 블록(block)은 DC 전구물질의 특이 죽음(specific killing)에 의해 조정되지 않는다 : DC 전구물질의 감소가 특이 죽음에 의해 조정되는지 판단하기위해, CD34+전구 세포는 6일동안 SCF, Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에서 배양된다. 6일째에, CD1a+CD14-및 CD1a-CD14+세포(DC 전구)는 자성 세포 분리(Miltenyi)에 의해 격리된다. 정제된 군은 추가적으로 2일동안 GM-CSF 및 TNT-α의 존재하에서 SelCIDsTM(1μM)와 함께 또는 없이 배양된다. 아넥신(annexin) V+-PI-(초기 아포프토시스)군의 레벨과 SelCIDsTM처리된 아넥신(annexin) V+-PI+(후기 아포프토시스)군의 레벨에 잇어서 큰 증가는 없다.
CD34+전구로부터 생성된 DC 의 기능적 활동은 변화된다 : SelCIDsTM과 함께 또는 없이 싸이토킨과 함께 배양된 CD34+전구 세포로부터 유도된 세포의 포식 능력은, 12일째에 덱스트란(destran)-FITC의 마노세(mannose) 수용체-조정 엔도싸이토시스(endocytosis)에 의해 분석된다. 1일부터 12일까지 하나 또는 그이상의 SelCIDsTM이 첨가되면, DMSO 조절에 비해 포식 능력에서 커다란 감소가 있다. SelCIDsTM이 6일부터 12일까지동안 첨가되면, 포식 능력은 DMSO-조절 세포에 필적한다.
SelCIDsTM과 함께 또는 없이 싸이토킨과 함께 배양된 CD34+세포의 항원 제시 용량(antigen presentation capacity)(APC)은, 12일째에 혼합된 LeucocyteReaction (MLR) 분석에서 CD3+동종이형 T 세포의 증식을 유도하는 용량을 측정함으로써 평가된다. 1일부터 12일까지 동안 SelCIDsTM이 첨가되면, CD34+세포는 DMSO 조절에 비해 T-세포의 증식을 자극하는 용량이 줄어든 것을 보여준다. 반대로, 6일에서 12일까지 동안, 하나 또는 그 이상의 SelCIDsTM이 첨가되면, T-세포의 증식을 자극하는 용량은 DMSO-조절 세포에 필적한다.
SelCIDsTM은 CD34+전구 세포의 가지(dendritic)세포로의 분화를 극적으로 약화시킨다. 결과적으로, SelCIDsTM-처리 세포는 낮은 포식 용량과 줄어든 APC 용량을 제공할 것이다. SelCIDsTM는 또한 초기 조혈 전구 세포, CD34+CD38-세포를 증가시킬 것이다. 이러한 초기 조혈 전구 세포는, NOD-SCID 쥐 모델에서 보다 향상된 재증식과 융합(engraftment)을 제공하는 것으로 알려졌다(타마키 그외, J.뉴로시.Res. 69(6) : 976-86(2002)). 더 나아가, 과립성 계통(graulocytic lineage)으로의 골수 분화를 바꿈으로써 SelCIDsTM편위 CD34+세포는, 심지어 싸이토킨 압력에서도 가지(dendritic) 세포 분화에 호의적이다. 게다가, SelCIDsTM은 CD34+세포에 대해 해로운 효과가 없는 것으로 발견됐으며, 세포의 증식 능력을 손상시키지 않는 것으로 발견됐다. 이러한 DC 기능의 조절과 과립성(granulocytic) 분화의 촉진은 다양한 암의 처치 에 대한 중요한 치료 능력, 면역학적 무질서, 및 감염 질병, 장기 이식, 재활 치료을 갖는다.
5.12. 실시예 12: SelCIDs TM 의 CD133 + 전구 세포의 분화에 대한 조절
SelCIDsTM의 다중 투여는 CD34+군의 증가를 심화시킬뿐만 아니라,CD133의 발현을 증가시키는데, 이것은 일반적으로 CD34bright조혈 전구 세포와 일단의 원시(primitive) 하부군(subpopulaion)에 의해 발현된다. CD34+CD133+원시 조혈 세포를 강화함으로써, SelCIDsTM는 줄기 세포 이식후에 조혈 세포 회복용 임상 임플리케이션(implication)을 가져야 한다. 덧붙여, CD133+줄기 세포는 또한 내피 계통(endothelial lineage)을 발생시킬 수 있으며, 부상 치료에 관해 기여한다. SelCIDsTM의 다중 투여는 랑거한스 DC 전구물질의 생성에 블록(block)을 악화시키지 않는다.
5.13. 실시예 13: 뼈 골수 (BM) Sca + 조혈 전구 세포의 생쥐 가지 세포
근교배 C57BL/6 쥐의 뼈 골수는 클로네틱(Clonetics)으로부터 얻어진다. 조혈 Sca+Lin- 전구물질은 스핀셉(SpinSep) 쥐의 선조 강화 혼합물(StemCell Technologies)를 사용함으로써 강화되고, 쥐 성장 요인인 SCF, Flt3L, GM-CSF, 및 M-CSF의 존재하에서 9일동안, BIT 95000(StemCell Technologies)이 첨가된 Iscove's MDM에서 배양되고, Sca+세포 및 DC 전구물질 표현형의 팽창을 촉진시키고, 그리고 나서, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에서 추가 3일동안 세포들이 미성숙한DC 표현형으로 되도록 이끈다. 강화된 Sca+Lin- 세포는 0일째부터 DMSO(0.1%), 10μM의 SelCIDsTM또는 10μM의 모든-트랜스(trans) 레티노 산 (ATRA)(ICN Biomedicals)의 존재하에서 배양된다. 화합물은 0일째에서 9일째에 세포에 첨가된다.
쥐 세포 표면 표현형의 분석 : 쥐 세포는 9일째와 12일째에 FITC 및 PE 접합된 mAbs를 사용하여 이중 염색(RT에서 14분) 처리된다. 사용된 항체는 BD 파민젠(Pharmingen) : Sca(PE), CD11b(FITC), Gr-1(FITC), CD86(PE), CD14(PE), CD80(PE), I-Ab(PE), CD40(PE), 및 CD32.1/16.1(FITC), 밀테니(Miltenyi):에서 나온다. 형광 분석은 10,000 이벤트(events)(Coulter)의 획득후에 FACScan 플로우 세포측정기에서 이루어진다
SelCIDsTM은 Sca+전구물질로부터 쥐 DC의 발달(development)로 변화된다. 9일째에, 세포는 높은 표면 가지/골수 표지 CD32/16(Fc 수용체), CD11b, CD80의 발현, I-Ab, 및 CD86의 낮은 발현과 CD14 및 Gr-1의 계통 표지의 낮은 발현과 함께 DC 전구물질 표현형을 제공할 것이다. SelCIDsTM은 9일까지 세포 표지 발현에 어떠한 중요한 효과를 나타내지 않을 것이지만, 반면에 ATRA는 CD80, I-Ab, 및 Sca+ 발현(데이타 없음)의 현저한 하향조절을 나타낼 것이다. 그러나, 12일째에는, SelCIDsTM는 아마도 CD86 및 브라이트(bright) I-Ab발현의 하향 조절과 CD11b 발현의 상향조절을 나타낸다. ATRA는 비슷하게 나타나지만, SelCIDsTM보다 현저한 효과를 보여준다. 덧붙여, SelCIDsTM은 CD40 및 CD80의 발현에 대해 어떠한 효과도 없지만, ATRA는 이러한 분자들에 대해 현저한 하향조절을 나타낸다.
SelCIDsTM은 CD86 및 MHC Ⅱ 발현의 하향조절에 의해 DC 전구물질의 미성숙한 DC 로의 분화를 억제한다. 화합물의 효과는 인간 조혈 전구 세포에서 관찰된 것처럼 극적이지 않을 것으로 예상된다. SelCIDsTM의 효과는 ATRA의 효과보다 덜 현저하며, 이것은 쥐에서 기형유발물질(teratogen)이다.
5.14. 실시예 14: SelCIDs 외의 다른 화합물에 대한 분화 분석에 대한 응용
위에서 설명된 방법론은, CD34+와 같은 초기 전구 세포의 분화에 대한SelCIDs 효과의 시험이, 흥미있는 어떠한 화합물에도 적용될 수 있으며, 분화에 대한 효과는 알려질 것으로 기대된다. 다른 화합물에 대한 이러한 분석 방법의 확대의 예로써, 우리는 레티노산과 아스피린의 효과(ATRA)를, 조절(DMSO-처리)세포에 한 DC 계통을 향한 CD34+세포의 분화에 대한 SelCIDsTM의 효과와 비교하였다. 레티노산은 세포의 증식과 분화에 대한 알려진 효과, 그것의 암에대한 치료와 기형유발(teratogenic) 효과때문에 연구되었다. 거꾸로, 아스피린의 효과는 일반적으로 알려진 어떠한 이뮤노모듈레토리(immunomodulatory) 성질도 없는 항-염증 약이기 때문에 연구되었다. SCF, Flt-3L, GM-CSF, 및 ,TNF-α의 존재하에서, 6일동안 화합물과 함께 또는 없이 배양된 CD34+전구 세포의 6일째의 결과는 얻어질 수 있다.
예를 들어, 문헌에서 다른 약들은 세포의 분화를 조절하는 것으로 나타났지만, 최근의 논문은 CD34+전구 세포로부터의 DC 생성의 겉질스테로이드(corticosteroid)에 의한 조절을 알려준다. 프로필(profile)은 CD1a+군에서 증가와 CD14+군에서의 감소에 의해 SelCIDsTM와 틀리다.
본 발명은 여기서 설명된 구체적인 실시예에 의해 한정되지 않는다. 또한, 여기서 설명된 실시예에 대한 본 발명의 다양한 변형은 후술하는 상세한 설명으로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가에게 자명하다. 그러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위에 속하는 것으로 본다.
6. 참고문헌
여기서 인용된 모든 참고문헌은, 각각 개별적인 출판물, 특허 또는 특허 출원이 특별히 및 개별적으로 모든 목적을 위해 온전히 참고문헌으로써 통합되는 것을 가리킨다면, 모든 목적을 위해 똑같은 정도로 온전히 참고문헌으로써 여기서 통합된다.
어떠한 출판물의 인용은 출원일에 앞선 공개이며, 선행 발명에 의해 그러한 출판물에 선행하도록 본 발명이 권리가 있는 것이 아니라는 자백으로써 해석되어져서는 안된다.

Claims (101)

  1. 화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 PDE IV활성을 억제하는 화합물이 존재하고 적합한 조건하에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화하는 것을 포함하는 포유류 줄기 세포 또는 전구 세포의 분화를 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 조혈 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 배 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 말초 혈 줄기 세포 및 골수 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PDE IV활성 저해제는 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분화는 세포 배양에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분화는 개체 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화합물의 농도는 약 0.005㎍/㎖에서 약 5mg/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 PDE IV활성을 억제하는 화합물이 존재하고 증식 또는 분화에 적합한 조건하에서 상기 세포를 증식 또는 분화하는 것을 포함하는 포유류 CD34+또는 CD133+전구 세포의 증식 또는 분화를 조절하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 전구 세포는 CD34+전구 세포 및 CD133+전구 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 전구 세포는 CD34+CD38-CD33+또는 CD34+CD38-CD33-세포들로 분화되는 것을 특징으로 하는 방법.
    제9항에 있어서, 상기 화합물은 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 분화는 세포 배양에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 분화는 개체 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 전구 세포들은 상기 개체로 이식된 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 화합물은 대조군과 비교하여 분화 또는 증식에서 검출될 차이를 유발하는데 충분한 양 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 CD34+또는 CD133+전구 세포로 냉동보존되고 상기 분화 전에 해동되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 포유류 대상의 PDE IV활성을 억제하는 치료적으로 유효한 양의 화합물 및 CD34+전구 세포를 투여하는 것을 포함하는 포유류 대상에서 전구 세포 군을 팽창하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CD34+전구 세포들은 상기 포유류 대상에서 분화된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 CD34+전구 세포들은 적혈구 세포들이 실질적으로 없는 세포 조제물에서 상기 포유류 대상에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 CD34+전구 세포들은 골수 세포들, 태반 세포 또는 제대혈 세포들을 포함하는 세포 조제물에서 상기 포유류 대상에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 CD34+전구 세포들은 담체와 결합하여 상기 포유류 대상에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 CD34+전구 세포는 CD34+CD38-CD33+또는 CD34+CD38-CD33-전구 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 CD34+세포는 CD34+CD133+전구 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 상기 전구 세포들은 통합된 관심있는 유전 물질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 줄기 세포의 분화 또는 증식의 조절을 야기하는데 충분한 시간에 PDE IV활성을 억제하는 화합물과 접촉된 포유류 줄기 세포 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 줄기 세포는 배 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 말초 혈 줄기 세포 및 골수 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 화합물은 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 상기 접촉 단계는 세포 배양에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제25항에 있어서, 상기 화합물의 농도는 약 0.005㎍/㎖에서 약 5mg/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제25항에 있어서, 상기 줄기 세포는 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제25항에 있어서, 상기 분화는 조혈 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제25항에 있어서, 상기 조혈 세포는 CD34+또는 CD38+조혈 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제25항에 있어서, 상기 조혈 세포는 CD11b+세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 조건에서 PDE IV활성을 억제하는 화합물의 존재 및 적합한 조건하에서 줄기 세포를 분화하는 것을 포함하는 방법에 의하여 생산된 분리된 백혈구 세포군들 및 분리된 제대혈 세포들을 포함하는 약학 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 화합물은 이미드 또는 아마이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 분화 단계는 세포 배양에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 상기 화합물의 농도는 약 0.005㎍/㎖에서 약 5mg/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 상기 줄기 세포는 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제34항에 있어서, 상기 줄기 세포는 전구 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제34항에 있어서, 상기 전구 세포는 특정 세포계로 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 전구 세포는 조혈 전구 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 전구 세포들의 분화 및 증식을 촉진하는 조건하에서 PDE IV활성을 저해하는 화합물로 배양의 처음 6일내에 접촉된 배양된 CD34+또는 CD133+전구 세포들 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 전구 세포들은 배양 6일 후에 수집되고 냉동보존되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 상기 전구 세포들은 CD34+CD38-CD34-또는 CD34+CD38-CD34+세포들인 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제42항에 있어서, 상기 화합물은 SelCIDTM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. (a) 줄기 세포의 분화를 조절하는데 충분하게 처리된 줄기 세포를 생산하는 PDE IV활성저해 화합물로 줄기 세포를 접촉하고;
    (b) 개체에게 상기 처리된 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는 포유류 줄기 세포 이식 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 (b)단계는 처리되지 않은 세포들과 혼합하여 처리된 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 처리되지 않은 세포들은 배 줄기 세포, 태반 세포, 제대혈 세포, 말초 혈 세포 및 골수 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 줄기 세포는 냉동보존되고 상기 투여 전에 해동되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. (a) 전구 세포의 분화를 조절하는데 충분하게 처리된 전구 세포를 생산하는 PDE IV활성저해 화합물로 전구 세포를 접촉하고;
    (b) 개체에게 상기 처리된 전구 세포를 투여하는 것을 포함하는 포유류 전구 세포 이식 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 (b)단계는 처리되지 않은 세포들과 혼합하여 처리된 전구 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 처리되지 않은 세포들은 배 줄기 세포, 태반 세포, 제대혈 세포, 말초 혈 세포 및 골수 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 전구 세포는 냉동보존되고 상기 투여 전에 해동되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 개체에게 (a)화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 PDE IV활성을 억제하는 화합물;
    (b) 상기 화합물의 존재하에서 분화된 줄기 세포; 및
    (c) 상기 화합물의 존재하에서 분화되는 전구 세포로 구성된 군으로부터 선택된 질병을 현저하게 감소하거나 개선하는 약제를 투여하는 것을 포함하는 질병을 갖는 개체를 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 질병은 염증, 심장병, 혈관 질환, 근위축성 측삭 경화증, 리조좀 저장 질환 및 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 약제는 화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 PDE IV활성을 억제하는 화합물 및 줄기 세포 모두를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 화합물이 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이트 카인, 올리고 뉴클레오티드 또는 핵산이 아닌 조건에서 PDE IV활성을 억제하는 화합물의 존재 및 적합한 조건하에서 줄기 세포를 분화하는 것을 포함하는 방법에 의하여 생산된 치료적으로 유효한 양의 백혈구 세포들을 포유류 대상에 투여하는 것을 포함하는 개체를 치료하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 줄기 세포들은 인 비트로에서 분화된 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 줄기 세포들은 산후 관류(perfused)된 태반에서 분화된 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제57항에 있어서, 상기 백혈구들은 실질적으로 적혈구가 없는 세포 조제물에서 상기 개체에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제57항에 있어서, 상기 백혈구들은 제대 혈 세포들을 포함하는 세포 조제물에서 상기 개체에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제57항에 있어서, 상기 백혈구들은 담체와 결합하여 개체에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제57항에 있어서, 상기 백혈구들은 수용하는 포유류 대상에서 결함을 치료 또는 회복하기 위하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 결함은 조혈 또는 혈 세포 증식 결함인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 조혈 또는 혈 세포 증식 결함은 호중구감소증 또는 백혈구 감소증인 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 백혈구들은 전신적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제63항에 있어서, 상기 백혈구들은 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제63항에 있어서, 상기 백혈구들은 통합된 관심있는 유전 물질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제57항에 있어서, 상기 백혈구들은 동종이계인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제57항에 있어서, 상기 수용 포유류 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. (a) 전구 세포들의 증식 및 분화가 가능한 조건하에서 6일간 배양된 CD34+또는 CD133+전구 세포들에 PDE IV활성을 억제하는 화합물을 접촉하는 단계;
    (b) 6일간 배양한 후에 상기 세포를 수집하는 단계; 및
    (c) 약학적으로 수용가능한 담체에 상기 세포를 위치시키는 것을 포함하는 약학 조성물 제조 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 접촉은 배양 첫날 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 접촉은 배양의 6일 동안 적어도 2회 수행하는 것을특징으로 하는 방법.
  74. 제71항에 있어서, 상기 화합물은 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제71항에 있어서, 상기 전구 세포들은 배양 전에 다른 혈구들로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제71항에 있어서, 상기 배양 배지는 부가적으로 GM-CSF 및 TNF-알파를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그는 0.1μM에서 10.0μM 농도 사이 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제74항에 있어서, 상기 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그는 1.0μM 농도 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제74항에 있어서, 상기 세포들은 상기 수집 후에 냉동보존되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제74항의 방법에 의하여 제조된 약학 조성물.
  81. (a) 분화가 일어날 수 있는 조건하에서 전구 세포들 군을 제공하는 단계;
    (b) PDE IV 저해제인 화합물로 상기 전구 세포들을 접촉하는 단계; 및
    (c) 상기 전구 세포들이 분화하는 시간의 적어도 일부분 동안 상기 전구 세포들과 상기 화합물을 접촉하는 분화에 적합한 조건하에서 상기 전구 세포를 분화하는 단계를 포함하는 CD34+또는 CD133+전구 세포의 분화를 조절하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 (b)단계에서 접촉은 배양 0에서 6일 사이의 임의의 시간에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 (b)단계에서 접촉은 상기 전구 세포들의 배양 시작 때 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제81항에 있어서, 상기 (b)단계에서 접촉은 상기 전구 세포들을 적어도 2일간 증식한 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제81항에 있어서, 상기 (b)단계에서 접촉은 상기 전구 세포들을 적어도 6일간 증식한 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제81항에 있어서, 상기 전구 세포들은 CD34+전구 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제81항에 있어서, 상기 전구 세포들은 컨트롤과 비교하여 CD11c 발현의 감소;
    컨트롤과 비교하여 CD38 발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD80 발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD86 발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD1a 발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD14 발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD54bright발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 HLA-DR 발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD15 발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD33 발현의 감소;컨트롤과 비교하여 CD54dim발현의 감소; 컨트롤과 비교하여 CD133 발현의 감소 및 상기 마커 인자 중 임의의 하나의 혼합으로 이루어진 군으로 부터 선택된 세포 표면 마커 인자를 나타내는 세포들로 분화되고, 상기 대조군은 상기 화합물이 없이 전구 세포와 같은 조건하에서 배양된 CD34+ 전구 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제81항에 있어서, 상기 전구 세포들은 CD34+CD38-CD33+또는 CD34+CD38-CD33-전구 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제81항에 있어서, 상기 PDE IV 저해제는 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. SelCIDTM또는 그것의 프로드러그로 상기 전구 세포들을 접촉하고 증식 및 분화가 가능한 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 CD34+전구 세포들로부터 분화된 세포들을 생산하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 접촉은 배양 첫날 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제90항에 있어서, 상기 접촉은 배양의 첫 6일 동안 적어도 2회 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제90항에 있어서, 상기 접촉은 상기 배양 첫날보더 더 일찍은 일어나지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제90항에 있어서, 상기 분화 세포는 수지상 세포, 과립구, CD34+CD38-CD33+또는 CD34+CD38-CD33-세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제90항에 있어서, 상기 CD34+전구 세포는 CD34+CD133+전구 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제90항에 있어서, 상기 분화된 세포는 배양 6일에 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제90항에 있어서, 상기 분화된 세포는 배양 12일에 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제90항에 있어서, 상기 CD34+전구 세포들은 배양 전에 다른 혈구들로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제90항에 있어서, 상기 배양 배지는 부가적으로 GM-CSF 또는 TNF-알파를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제90항에 있어서, 상기 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그는 0.1μM에서 10.0μM 농도 사이 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제86항에 있어서, 상기 SelCIDTM또는 그것의 프로드러그는 1.0μM 농도 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
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