CN112899225B - 一种牙周膜干细胞培养基及其培养方法 - Google Patents
一种牙周膜干细胞培养基及其培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种牙周膜干细胞培养基，由以下成分组成：基础培养基、二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂、谷胱甘肽、2‑巯基乙醇。本发明提供一种牙周膜干细胞培养基，在培养基中添加二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂协同作用，刺激牙周膜干细胞分裂，有效提高牙周膜干细胞的增殖能力，能在短时间内获得大量的牙周膜干细胞，提高细胞的增值速度，为牙周组织工程提供种子细胞来源，并且本发明的培养基不添加动物血清，提高了临床应用的安全性。本发明还提供了一种牙周膜干细胞的培养方法，采用本发明提供的培养基，以传代培养得到的P3‑P5代细胞为培养对象，实现牙周膜干细胞的快速扩增，方法简单易于操作，有效降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞培养基及其培养方法。
背景技术
目前，牙周组织再生是治疗牙周病的有效途径和最终目的。然而，传统治疗、刮治、根面平整等基础治疗，只能消除病因，无法完全修复已丧失的牙周组织，疗效甚微。随着组织工程的发展，研究者们将复合的种子细胞与支架的复合物移植到缺损部位，为被破坏的牙周组织的再生带来希望。
自2004年Seo等从牙周膜组织中分离出牙周膜干细胞（periodontal ligamentstem cells,PDLSCs）以来，该细胞就被认为是牙周组织工程的首选种子细胞，具有组我更新能力，能分化为牙周的三种组织：牙槽骨、牙周膜和牙骨质。一系列现有研究均证明PDLSCs是治疗牙周疾病的理想细胞。
传统的牙周膜干细胞培养需要添加胎牛血清，有引入异源血清携带的细菌、病毒的风险，再者血清培养的细胞产率、传代次数有限，极大限制了牙周膜干细胞的应用。牙周膜干细胞的研究和应用需要足够数量的细胞，因此就要求细胞在培养过程中具有较好的活性和增殖速度。对牙周膜干细胞的培养基提出了更高的要求。
现有技术中虽然公开了采用无血清培养基培养牙周膜干细胞，但是，目前的牙周膜干细胞无血清培养基存在培养的细胞活性差，增殖速率慢等问题，不能满足牙周膜干细胞的科研或临床需求，因此提高牙周膜干细胞的体外增殖能力显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙周膜干细胞培养基，成分明确，能有效实现牙周膜干细胞的体外快速扩增，为满足牙周膜干细胞的使用需求提供保障。
本发明的目的之二在于提供一种牙周膜干细胞的培养方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种牙周膜干细胞培养基，由以下成分组成：基础培养基、二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂、谷胱甘肽、2-巯基乙醇。
进一步地，以培养基终浓度计，各组分的质量浓度为：二羟丙茶碱2.0-8.5μg/mL、黄藤素9.8-12.0μg/mL、PDE 4抑制剂5.0-10.0ng/mL、谷胱甘肽1.0-2.0μg/mL、2-巯基乙醇10.0-14.5μg/mL。
进一步地，以培养基终浓度计，各组分的质量浓度为：二羟丙茶碱4.5μg/mL、黄藤素11.0μg/mL、PDE 4抑制剂8.5ng/mL、谷胱甘肽1.5μg/mL、2-巯基乙醇13.0μg/mL。
进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种牙周膜干细胞的培养方法，包括以下步骤：将待培养的牙周膜干细胞接种于上述的培养基中，在37℃，5%CO2的条件下进行培养。
进一步地，接种的牙周膜干细胞为传代培养至P3-P5代细胞。
进一步地，所述牙周膜干细胞的接种密度为1-2×104个/mL。
进一步地，在培养过程中每两天更换一次培养基。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种牙周膜干细胞培养基，在培养基中添加二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂协同作用，刺激牙周膜干细胞分裂，有效提高牙周膜干细胞的增殖能力，能在短时间内获得大量的牙周膜干细胞，提高细胞的增值速度，为牙周组织工程提供种子细胞来源，并且本发明的培养基不添加动物血清，提高了临床应用的安全性。
2、本发明还提供了一种牙周膜干细胞的培养方法，采用本发明提供的培养基，以传代培养得到的P3-P5代细胞为培养对象，实现牙周膜干细胞的快速扩增，方法简单易于操作，有效降低牙周膜干细胞的生产成本。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种牙周膜干细胞培养基，由以下成分组成：基础培养基DMEM/F12培养基、二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂、谷胱甘肽、2-巯基乙醇；
以培养基终浓度计，各组分的质量浓度为：二羟丙茶碱4.5μg/mL、黄藤素11.0μg/mL、PDE 4抑制剂8.5ng/mL、谷胱甘肽1.5μg/mL、2-巯基乙醇13.0μg/mL。
一种牙周膜干细胞的培养方法，包括以下步骤：取传代培养得到的P3代牙周膜干细胞复苏后以1×104个/mL接种于12孔培养板中，每孔加入培养基1mL，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每两天更换一次培养基，连续培养七天。
实施例2
一种牙周膜干细胞培养基，由以下成分组成：基础培养基DMEM/F12培养基、二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂、谷胱甘肽、2-巯基乙醇；
以培养基终浓度计，各组分的质量浓度为：二羟丙茶碱2.0μg/mL、黄藤素9.8μg/mL、PDE 4抑制剂5.0ng/mL、谷胱甘肽1.0μg/mL、2-巯基乙醇10.0μg/mL。
一种牙周膜干细胞的培养方法，包括以下步骤：取传代培养得到的P4代牙周膜干细胞复苏后以1.5×104个/mL接种于12孔培养板中，每孔加入培养基1mL，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每两天更换一次培养基，连续培养七天。
实施例3
一种牙周膜干细胞培养基，由以下成分组成：基础培养基DMEM/F12培养基、二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂、谷胱甘肽、2-巯基乙醇；
以培养基终浓度计，各组分的质量浓度为：二羟丙茶碱8.5μg/mL、黄藤素12.0μg/mL、PDE 4抑制剂10.0ng/mL、谷胱甘肽2.0μg/mL、2-巯基乙醇14.5μg/mL。
一种牙周膜干细胞的培养方法，包括以下步骤：取传代培养得到的P5代牙周膜干细胞复苏后以2×104个/mL接种于12孔培养板中，每孔加入培养基1mL，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每两天更换一次培养基，连续培养七天。
对比例1
对比例1提供一种牙周膜干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去二羟丙茶碱，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种牙周膜干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去二羟丙茶碱，将黄藤素的用量调整为15.5μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种牙周膜干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去黄藤素，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种牙周膜干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去黄藤素，将二羟丙茶碱的用量调整为15.5μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种牙周膜干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去PDE 4抑制剂，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种牙周膜干细胞培养基，和实施例1的区别为：将 PDE 4抑制剂替换为PDE 5抑制剂，其余均和实施例1相同。
对比例7
对比例7提供一种牙周膜干细胞培养基，和实施例1的区别为：将 PDE 4抑制剂替换为PDE 3抑制剂，其余均和实施例1相同。
将实施例1至3，对比例1至7中培养的牙周膜干细胞分别于培养3d、5d和7d时各取3孔，去除培养液后用PBS清洗，加入0.25%胰酶消化后制备单细胞悬液，取10μL细胞悬液加入0.4%台盼兰染色进行细胞计数，结果如表1所示。
表1
由表1可以看出各实施例和对比例相比差异明显（P＜0.05），实施例1至3中牙周膜干细胞的增殖速度更快，培养七天后获得细胞数量更多。和实施例相比，对比例1至7中调整了培养基的组成，培养得到的牙周膜干细胞在增殖速度以及细胞数量上均不及实施例1。
对比例1至4中分别省去二羟丙茶碱或者黄藤素，或者在省去其中一种组分后调整另一种原料的用量，所得的培养基用于牙周膜干细胞的培养时，细胞的增殖效率明显不及实施例1。
对比例5至对比例7分别省去了PDE 4抑制剂，或者将PDE 4抑制剂替换为PDE 5抑制剂或PDE 3抑制剂，细胞的增殖数量及速率也受到一定程度的影响，说明采用PDE 4抑制剂和二羟丙茶碱、黄藤素协同作用可以更好的刺激牙周膜干细胞的增殖。
将上述实施例1至3，对比例1至7培养至第七天的细胞取3孔制成单细胞悬液，采用台盼蓝染色法统计细胞的存活率，如表2所示。
表2
由表2可以看出各实施例和对比例相比差异明显（P＜0.05），实施例1至实施例3的牙周膜干细胞存活率高于对比例1至7，说明本发明的培养基通过添加二羟丙茶碱、PDE 4抑制剂和黄藤素，组分间协同作用，在不添加血清的情况下仍能使牙周膜干细胞保持活性，细胞具有较高的存活率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (7)
1. 一种牙周膜干细胞培养基，其特征在于，由以下成分组成：基础培养基、二羟丙茶碱、黄藤素、PDE 4抑制剂、谷胱甘肽、2-巯基乙醇；
以培养基终浓度计，各组分的质量浓度为：二羟丙茶碱2.0-8.5μg/mL、黄藤素9.8-12.0μg/mL、PDE 4抑制剂5.0-10.0ng/mL、谷胱甘肽1.0-2.0μg/mL、2-巯基乙醇10.0-14.5μg/mL。
2. 根据权利要求1所述牙周膜干细胞培养基，其特征在于，以培养基终浓度计，各组分的质量浓度为：二羟丙茶碱4.5μg/mL、黄藤素11.0μg/mL、PDE 4抑制剂8.5ng/mL、谷胱甘肽1.5μg/mL、2-巯基乙醇13.0μg/mL。
3.根据权利要求1所述牙周膜干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
4.一种牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将待培养的牙周膜干细胞接种于权利要求1至3任一项所述的培养基中，在37℃，5%CO2的条件下进行培养。
5.根据权利要求4所述牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，接种的牙周膜干细胞为传代培养至P3-P5代细胞。
6.根据权利要求4所述牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述牙周膜干细胞的接种密度为1-2×104个/mL。
7.根据权利要求4所述牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，在培养过程中每两天更换一次培养基。
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Effective date of registration: 20231023 Address after: 2 / F, cell industry cluster innovation park, No. 101, Keyuan Road, high tech Zone, Kunming, Yunnan 650101 Applicant after: Yunnan Helsi Cell Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Building 804, Building 10, Biopharmaceutical Innovation Industrial Park, No. 14 Jinhui Road, Jinsha Community, Kengzi Street, Pingshan District, Shenzhen City, Guangdong Province, 518000 Applicant before: Shenzhen Wanjirui Biopharmaceutical Technology Co.,Ltd. |
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