CN104830758A - 一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基，属于干细胞技术领域，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~50%体积百分比、谷氨酰胺0.5~5%体积百分比、抗生素0.5~5%体积百分比、抗坏血酸100~1000μM、磷酸甘油5~50mM、地塞米松5~50nM、白藜芦醇5~50μM和葛根素0.05~0.5μM。本发明提供的间充质干细胞成骨诱导分化培养基具有诱导效率高等优点。

Description

一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。MSC最初在骨髓中被发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而受到广泛地关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

为了验证体外培养的间充质干细胞的成骨分化潜能，必须将间充质干细胞用成骨诱导培养基进行诱导分化。现有的MSC成骨诱导分化培养基组成一般为：DMEM/F12培养基，10%FBS，1% 谷氨酰胺，1% 青霉素-链霉素溶液，150 μM 抗坏血酸，10 mM β-磷酸甘油，10 nM 地塞米松。

中国专利申请201010569210.4公开了一种成骨细胞诱导培养液，该培养液以a-MEM为基础培养基，添加了胎牛血清、地塞米松、维生素C和β-磷酸甘油。该培养液虽然能实现骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞，但诱导效率不够理想，且成骨诱导分化的专一性不强。

现有的间充质干细胞成骨诱导分化培养基存在诱导效率不够理想、成骨诱导分化的专一性不强的问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的诱导效率不够理想、成骨诱导分化的专一性不强的问题，发明人通过大量试验筛选，预料不到的发现：通过添加一定浓度的白藜芦醇和葛根素，获得一种新的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，该培养基的成骨诱导效率大大提高，提高了成骨诱导分化的专一性，通过该培养基的诱导可以获得大量成骨细胞。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

本发明提供一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~50%体积百分比、谷氨酰胺0.5~5%体积百分比、抗生素0.5~5%体积百分比、抗坏血酸100~1000 μM、磷酸甘油5~50 mM、地塞米松5~50 nM、白藜芦醇5~50 μM和葛根素0.05~0.5μM。

采用上述技术方案的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，可以实现各种间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化，提高了成骨诱导分化的专一性，诱导分化的细胞成骨钙结节更丰富，成骨相关基因OPN的表达水平更高，成骨诱导分化效率大大提高。

优选地，本发明提供的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~20%体积百分比、谷氨酰胺0.5~2%体积百分比、抗生素0.5~2%体积百分比、抗坏血酸100~200 μM、磷酸甘油5~20 mM、地塞米松5~20 nM、白藜芦醇5~20 μM和葛根素0.05~0.2μM。

更优选地，本发明提供的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、抗生素1%体积百分比、抗坏血酸150 μM、磷酸甘油10 mM、地塞米松10 nM、白藜芦醇10 μM和葛根素0.1μM。

优选地，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。

优选地，所述抗生素包括青霉素和链霉素，所述磷酸甘油为β-磷酸甘油。

本发明提供的间充质干细胞成骨诱导分化培养基还可根据实际需要添加其他成分，如1%体积百分比的非必须氨基酸，但添加后并未提高成骨诱导分化效率。

相应地，本发明还提供了间充质干细胞成骨诱导分化培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM/F12培养基中，按所述浓度加入FBS、谷氨酰胺、抗生素、抗坏血酸母液、磷酸甘油母液、地塞米松母液、白藜芦醇母液和葛根素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。

相应地，本发明还提供间充质干细胞成骨诱导分化培养基在间充质干细胞成骨诱导分化中的用途。

此外，本发明还提供一种间充质干细胞成骨诱导分化方法，包括如下步骤：a）培养间充质干细胞；b）待细胞汇合度符合要求时，弃去所述步骤a）中的培养基，加入权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基培养3~5周。细胞汇合度符合要求通常是指细胞长至70~90%汇合度。

优选地，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，可以实现包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和羊膜间充质干细胞在内的各种间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化，提高了诱导分化的专一性，避免了向成脂细胞等其他组织细胞的分化，诱导分化的细胞成骨钙结节丰富，成骨相关基因OPN的表达水平高，成骨诱导分化效率大大提高。此外，本发明提供的制备方法简单，制得的间充质干细胞成骨诱导分化培养基可以实现稳定、高效的成骨诱导分化。

附图说明

图1  不同配方的间充质干细胞成骨诱导分化培养基对成骨诱导分化相关基因OPN的表达影响。

图2  P3代骨髓间充质干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化染色结果图。

图3  P3代骨髓间充质干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化相关基因OPN的表达结果图。

图4  P3代脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化染色结果图。

图5  P3代脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化相关基因OPN的表达结果图。

图6  P3代羊膜间充质干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化染色结果图。

图7  P3代羊膜间充质干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化相关基因OPN的表达结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中的各组分均为常规市售产品。诱导培养基1：本发明实施例二提供的间充质干细胞成骨诱导分化培养基。诱导培养基2：Life Tecnology公司的成骨诱导分化培养基，货号A10072-01。诱导培养基3：与诱导培养基1相比，不包括葛根素。诱导培养基4：与诱导培养基1相比，不包括白藜芦醇。诱导培养基5：与诱导培养基1相比，不包括白藜芦醇，也不包括葛根素。

实施例一  间充质干细胞成骨诱导分化培养基的配方筛选

发明人对间充质干细胞成骨诱导分化培养基进行了大量试验筛选。取P3代骨髓间充质干细胞，以5000个/cm²的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1、诱导培养基3、诱导培养基4和诱导培养基5，每3天换液一次。诱导培养4周后，用qPCR鉴定成骨细胞相关基因OPN的表达水平，结果如图1所示。

从图1可知：向现有技术中的间充质干细胞成骨诱导分化培养基中同时添加一定浓度的白藜芦醇和葛根素，可以大幅提高成骨相关基因OPN的表达水平（与诱导培养基3、诱导培养基4和诱导培养基5相比，P<0.05或P<0.01），且未检出成脂相关基因FABP4的表达。

实施例二 间充质干细胞成骨诱导分化培养基

间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、青霉素-链霉素1%体积百分比、抗坏血酸150 μM、β-磷酸甘油10 mM、地塞米松10 nM、白藜芦醇10 μM和葛根素0.1μM。

制备方法：向DMEM/F12培养基中，按上述浓度加入FBS、谷氨酰胺、青霉素-链霉素、抗坏血酸母液、β-磷酸甘油母液、地塞米松母液、白藜芦醇母液和葛根素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。

抗坏血酸母液的配制：取10g抗坏血酸，用DMEM/F12 培养基溶解，配成15mM的母液，-20度保存。β-磷酸甘油母液的配制：取10gβ-磷酸甘油，用DMEM/F12 基础培养基溶解，配成1M的母液，-20度保存。地塞米松母液的配制：取1g地塞米松，用95%乙醇溶解，配成10μM的母液，-20度保存。白藜芦醇母液的配制：取100mg白藜芦醇，用DMSO溶解，配成10mM的母液，-20度保存。葛根素母液的配制：取100mg葛根素，用甲醇溶解，配成0.1 mM的母液，-20度保存。

实施例三 间充质干细胞成骨诱导分化培养基

间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 15%体积百分比、谷氨酰胺1.5%体积百分比、青霉素-链霉素1%体积百分比、抗坏血酸200 μM、β-磷酸甘油20 mM、地塞米松10 nM、白藜芦醇15 μM和葛根素0.05μM。

制备方法：与实施例二中的制备方法类似。

实施例四 间充质干细胞成骨诱导分化培养基

间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、青霉素-链霉素1%体积百分比、抗坏血酸150 μM、β-磷酸甘油10 mM、地塞米松15 nM、白藜芦醇5 μM和葛根素0.2μM。

制备方法：与实施例二中的制备方法类似。

实施例五  骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化

取P3代骨髓间充质干细胞，以5000个/cm²的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基2，每3天换液一次。诱导培养4周后，用茜素红进行成骨鉴定，结果如图2所示；同时，用qPCR鉴定成骨细胞相关基因OPN的表达水平，结果如图3所示。

从图2和图3可知：本发明提供的培养基所诱导分化的细胞，成骨钙结节更丰富，成骨相关基因OPN的表达水平更高（与诱导培养基2相比，P<0.01），说明其成骨诱导分化效果更好。

实施例五  脐带间充质干细胞的成骨诱导分化

取P3代脐带间充质干细胞，以5000个/cm²的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基2，每3天换液一次。诱导培养4周后，用茜素红进行成骨鉴定，结果如图4所示；同时，用qPCR鉴定成骨细胞相关基因OPN的表达水平，结果如图5所示。

从图4和图5可知：本发明的培养基所诱导分化的细胞，成骨钙结节更丰富，成骨相关基因OPN的表达水平更高（与诱导培养基2相比，P<0.01），说明其成骨诱导分化效果更好。

实施例六  羊膜间充质干细胞的成骨诱导分化

取P3代羊膜间充质干细胞，以5000个/cm²的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基2，每3天换液一次。诱导培养4周后，用茜素红进行成骨鉴定，结果如图6所示；同时，用qPCR鉴定成骨细胞相关基因OPN的表达水平，结果如图7所示。

从图6和图7可知：本发明的培养基所诱导分化的细胞，成骨钙结节更丰富，成骨相关基因OPN的表达水平更高（与诱导培养基2相比，P< 0.01），说明其成骨诱导分化效果更好。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于：包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~50%体积百分比、谷氨酰胺0.5~5%体积百分比、抗生素0.5~5%体积百分比、抗坏血酸100~1000 μM、磷酸甘油5~50 mM、地塞米松5~50 nM、白藜芦醇5~50 μM和葛根素0.05~0.5μM。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于：包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~20%体积百分比、谷氨酰胺0.5~2%体积百分比、抗生素0.5~2%体积百分比、抗坏血酸100~200 μM、磷酸甘油5~20 mM、地塞米松5~20 nM、白藜芦醇5~20 μM和葛根素0.05~0.2μM。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于：包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、抗生素1%体积百分比、抗坏血酸150 μM、磷酸甘油10 mM、地塞米松10 nM、白藜芦醇10 μM和葛根素0.1μM。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于：所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于：所述抗生素包括青霉素和链霉素，所述磷酸甘油为β-磷酸甘油。

6.根据权利要求1所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：向DMEM/F12培养基中，按所述浓度加入FBS、谷氨酰胺、抗生素、抗坏血酸母液、磷酸甘油母液、地塞米松母液、白藜芦醇母液和葛根素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基在间充质干细胞成骨诱导分化中的用途。

8.一种间充质干细胞成骨诱导分化方法，其特征在于：包括如下步骤：a）培养间充质干细胞；b）待细胞汇合度符合要求时，弃去所述步骤a）中的培养基，加入权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞成骨诱导分化培养基培养3~5周。

9.根据权利要求8所述的间充质干细胞成骨诱导分化方法，其特征在于：所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。