CN105695399A - 一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法 - Google Patents
一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105695399A CN105695399A CN201610143944.3A CN201610143944A CN105695399A CN 105695399 A CN105695399 A CN 105695399A CN 201610143944 A CN201610143944 A CN 201610143944A CN 105695399 A CN105695399 A CN 105695399A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- mesenchymal stem
- osteogenic induction
- induction
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域,特别涉及一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法。本发明脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物包括钙粘附蛋白-11和富血小板血浆,该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化能力,采用PRP代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性,并且可应用于临床。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,特别涉及一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法。
背景技术
骨缺损指骨的结构完整性被破坏,是临床常见病。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。较小的骨缺损(通常指8mm以下),对于一个健康的非吸烟者来说,有可能自行愈合;但骨缺损过大,或者是在较小的骨头上的骨缺损,很难完全愈合。这就需要手术的干预,主要方法包括:骨移植、人工骨和组织工程骨。
骨组织工程是指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞,经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支架或称细胞外基质上,这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间,有利于细胞获得足够的营养物质,进行气体交换,排除废料,使细胞在预制形态的三维支架上生长,然后将这种细胞杂化材料植入骨缺损部位,在生物材料逐步降解的同时,种植的骨细胞不断增殖,从而达到修复骨组织缺损的目的。因此足够量的成骨细胞在骨组织工程中成为关键因素。如何通过诱导获得足够量的成骨种子细胞,并在诱导过程中维持种子细胞的表型特征成为骨组织工程研究中的热点。
脂肪组织是人体储存最大、容易获取和应用的组织,具有很大的临床应用前景。脂肪间充质干细胞(ADSCs)是一种成体干细胞,具有向血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞等多向分化的潜能。目前,间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化是骨组织工程研究中的热点,诱导的成骨细胞可应用于治疗骨头坏死、骨折后骨延迟愈合等骨科疾病。通常采用分离自体脂肪间充质干细胞在体外扩增并向成骨诱导培养后植入体内。从抽取的脂肪组织中提取的间充质干细胞作为介质在组织工程应用中取得明显成功。
研究发现,钙粘附蛋白-11(cadherin-11)能够诱导间充质细胞向成骨细胞的分化。钙粘附蛋白-11为钙粘附蛋白家族成员,参与多种生物学过程,如组织形成、胚胎发育、骨组织形成等。成骨细胞持续表达cadherin-11,在骨和软骨中优先表达,控制着间充质细胞向成骨细胞和软骨细胞的分化。但单纯采用钙粘附蛋白-11对间充质干细胞进行诱导时,诱导分化率较弱。因此,对于能够提高脂肪间充质干细胞向成骨细胞诱导分化能力的技术仍有需求。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法。该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化能力。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,包括钙粘附蛋白-11和富血小板血浆(PRP)。
本发明发现将钙粘附蛋白-11和富血小板血浆按一定比例联合使用后,可显著提高脂肪间充质干细胞向成骨细胞的转化效率,增强了成骨诱导分化能力。
作为优选,以μg/mL计,钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的比例为(0.1~1):(0.05~0.1)。
在本发明提供的一些实施例中,以μg/mL计,钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的比例为0.1:0.1。
在本发明提供的另一些实施例中,以μg/mL计,钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的比例为0.5:0.08。
在本发明提供的另一些实施例中,以μg/mL计,钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的比例为1:0.05。
作为优选,该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物还包括基础培养基。
作为优选,脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量为:
钙粘附蛋白-11:0.1~1μg/mL;
富血小板血浆:0.05~0.1mL/mL;
基础培养基:补足。
在本发明提供的一些实施例中,脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量为:
钙粘附蛋白-11:0.1μg/mL;
富血小板血浆:0.1mL/mL;
基础培养基:补足。
在本发明提供的另一些实施例中,脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量为:
钙粘附蛋白-11:0.5μg/mL;
富血小板血浆:0.08mL/mL;
基础培养基:补足。
在本发明提供的另一些实施例中,脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量为:
钙粘附蛋白-11:1μg/mL;
富血小板血浆:0.05mL/mL;
基础培养基:补足。
在本发明提供的一些实施例中,富血小板血浆的制备方法为:将静脉血离心,取上层血浆和白膜层,离心,取下层1/4体积的血浆,得到富血小板血浆。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法,采用本发明提供的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物诱导培养脂肪间充质干细胞,获得成骨细胞。
作为优选,脂肪间充质干细胞为P3~P5代脂肪间充质干细胞。
在本发明提供的一些实施例中,脂肪间充质干细胞为P3代脂肪间充质干细胞。
作为优选,诱导培养的时间为14~20天。
在本发明提供的一些实施例中,诱导培养的时间为14天。
本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法。该组合物包括钙粘附蛋白-11和富血小板血浆。本发明至少具有如下优势之一:
1、本发明提供的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化能力;
2、本发明采用PRP代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性,并且可应用于临床。
附图说明
图1示P3代脂肪干细胞的细胞形态图片;其中图1-1为放大40倍的图片,图1-2为放大100倍的图片;
图2示P3代脂肪干细胞的流式鉴定图片;其中图2-1、2-2、2-3为对照组流式鉴定结果,2-1示空白对照,2-2示CD73、HLA-DR的表达情况,2-3示CD90、CD45的表达情况;图2-4、2-5、2-6为样品组流式鉴定结果,2-4示空白对照,2-5示CD73、HLA-DR的表达情况,2-6示CD90、CD45的表达情况;
图3示各组脂肪干细胞成骨分化诱导情况,其中,3-1示脂肪干细胞诱导前茜素红染色情况(40×),3-2示对照组1脂肪干细胞采用普通培养基诱导后的茜素红染色情况(40×),3-3示对照组2脂肪干细胞采用商品化培养基诱导后的茜素红染色情况(40×),3-4示实验组1脂肪干细胞采用cadherin-11诱导后的茜素红染色情况(40×),3-5示实验组2脂肪干细胞采用PRP诱导后的茜素红染色情况(40×),3-6示实验组3脂肪干细胞采用cadherin-11和PRP联合诱导后的茜素红染色情况(40×)。
具体实施方式
本发明公开了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法中所用生物材料均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
1、脂肪干细胞原代分离
待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体,加入等体积的生理盐水清洗脂肪组织2次,吸弃下方溶液;将脂肪组织分装至50mL离心管中,每管20mL,每管中加入等体积的0.5%Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25%),充分混匀,封口,转移至恒温空气摇床中,37℃、200R消化50min;消化完成后离心,1500rpm离心10min;弃去离心后的脂肪和脂肪油,每管加入40mL生理盐水重悬细胞,1500rpm离心5min,弃去上清,用普通培养基(DMEM/F12+10%FBS)重悬细胞,并接种至培养皿中,待细胞汇合度达到80-90%时,进行传代处理。
2、人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定
取对数生长期第3代的细胞,吸出培养基后,加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液进行消化,之后用适量血清终止消化1000rpm离心10min,弃上清,用4℃遇冷的PBS洗涤细胞2次后重悬均匀,调整细胞浓度约为105-106个/mL。取2个上样管,每管加入500μL的单细胞悬液,离心后1号管标为标准对照,2号各加入2μLFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。室温,避光,孵育20min;PBS洗两遍,以去除未结合的抗体,500μL1640培养基重悬后,上流式细胞仪鉴定表面标记。结果见图2。
由图2所示,扩增第3代的ADSCsCD73、CD90呈阳性表达,而HLA-DR、CD45呈阴性表达,符合干细胞的特性。
3、富血小板血浆的制备
加抗凝剂的静脉血低温高速离心,第一次离心3000转4min,吸取上层血浆、白膜层至另一抗凝剂采血管中。3000转离心15min,吸去上层3/4贫血小板血浆(PPP),余下1/4即为富血小板血浆(PRP)。分装后-80℃保存。
4、脂肪干细胞成骨分化诱导
1)实验分组:
对照组1:脂肪干细胞普通培养基组;
对照组2:商品化培养基诱导组;
实验组1:基础培养基+0.1μg/mLcadherin-11组;
实验组2:基础培养基+10%(体积百分比)PRP组;
实验组3:基础培养基+0.1μg/mLcadherin-11+10%PRP组。
2)取第3代的ADSCs,吸出培养基后,加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液进行消化,之后用适量血清终止消化。1200rpm离心5min,脂肪干细胞完全培养基重悬,调整密度为1x104/mL,接种于6孔板中,每孔2mL。
当细胞达到40%-50%融合时,分别应用实验分组所示培养基,同样环境下诱导培养,每3天更换诱导培养基,培养14天后,部分细胞采用茜素红进行染色,观察形成钙结节的情况;部分细胞用于抽提RNA,逆转录成cDNA,以此cDNA为模板,以上游引物:TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物:TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP);上游引物:TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物:TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)为引物进行免疫荧光定量PCR,其中beta-actin作为内参,检测成骨细胞标志蛋白ALP、runx2的基因表达量。最后根据根据得到的C(t)值,以诱导前细胞中基因的表达量为参照,计算诱导后细胞中目的基因相对于诱导前的表达量。
3)茜素红染色结果如下:
由图3可知,对照组1和诱导前细胞形态并无差别,细胞未被茜素红染色,说明脂肪干细胞并未向成骨细胞诱导分化;对照组2、实验组1、实验组2和实验组3中各有一部分细胞被茜素红染成红色,说明细胞诱导分化过程中形成钙结节;而形成钙结节的多少顺序分别为:实验组3、实验组1、对照组2、实验组2,说明和商品诱导液相比较,加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化,但是PRP单独的诱导分化能力较弱,两者联合使用既可提高诱导分化能力,又代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性。
4)荧光定量PCR分析结果如下:
表1荧光定量PCR分析结果
其中:*表示和诱导前相比较,P<0.05;**表示和诱导前相比较,P<0.01。
由表1可知,对照组1和诱导前相比ALP和runx2基因表达无明显变化,而对照组2、实验组1、实验组2和实验组3中细胞的cadherin和runx2基因表达量均升高,说明脂肪干细胞成功向成骨细胞分化;而ALP和runx2基因表达量升高的顺序分别为:实验组3、实验组1、对照组2、实验组2,说明和商品诱导液相比较,加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化,但是PRP单独的诱导分化能力较弱,两者联合使用既可提高诱导分化能力,又代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性,和染色结果一致。
实施例2
1、脂肪干细胞原代分离
待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体,加入等体积的生理盐水清洗脂肪组织2次,吸弃下方溶液;将脂肪组织分装至50mL离心管中,每管20mL,每管中加入等体积的0.5%Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25%),充分混匀,封口,转移至恒温空气摇床中,37℃、200R消化50min;消化完成后离心,1500rpm离心10min;弃去离心后的脂肪和脂肪油,每管加入40mL生理盐水重悬细胞,1500rpm离心5min,弃去上清,用普通培养基(DMEM/F12+10%FBS)重悬细胞,并接种至培养皿中,待细胞汇合度达到80-90%时,进行传代处理。
2、人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定
取对数生长期第3代的细胞,吸出培养基后,加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液进行消化,之后用适量血清终止消化1000rpm离心10min,弃上清,用4℃遇冷的PBS洗涤细胞2次后重悬均匀,调整细胞浓度约为105-106个/mL。取2个上样管,每管加入500μL的单细胞悬液,离心后1号管标为标准对照,2号各加入2μLFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。室温,避光,孵育20min;PBS洗两遍,以去除未结合的抗体,500μL1640培养基重悬后,上流式细胞仪鉴定表面标记。结果与图2相近。可见,扩增第3代的ADSCsCD73、CD90呈阳性表达,而HLA-DR、CD45呈阴性表达,符合干细胞的特性。
3、富血小板血浆的制备
加抗凝剂的静脉血低温高速离心,第一次离心3000转4min,吸取上层血浆、白膜层至另一抗凝剂采血管中。3000转离心15min,吸去上层3/4贫血小板血浆(PPP),余下1/4即为富血小板血浆。分装后-80℃保存。
4、脂肪干细胞成骨分化诱导
1)实验分组:
对照组1:脂肪干细胞普通培养基组;
对照组2:商品化培养基诱导组;
实验组1:基础培养基+0.5μg/mLcadherin-11组;
实验组2:基础培养基+8%PRP组;
实验组3:基础培养基+0.5μg/mLcadherin-11+8%PRP组。
2)取第3代的ADSCs,吸出培养基后,加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液进行消化,之后用适量血清终止消化。1200rpm离心5min,脂肪干细胞完全培养基重悬,调整密度为1×104/mL,接种于6孔板中,每孔2mL。
当细胞达到40%-50%融合时,分别应用实验分组所示培养基,同样环境下诱导培养,每3天更换诱导培养基,培养14天后,部分细胞采用茜素红进行染色,观察形成钙结节的情况;部分细胞用于抽提RNA,逆转录成cDNA,以此cDNA为模板,以上游引物:TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物:TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP);上游引物:TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物:TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)为引物进行免疫荧光定量PCR,其中beta-actin作为内参,检测成骨细胞标志蛋白ALP、runx2的基因表达量。最后根据根据得到的C(t)值,以诱导前细胞中基因的表达量为参照,计算诱导后细胞中目的基因相对于诱导前的表达量。
3)茜素红染色结果与图3相似,对照组1和诱导前细胞形态并无差别,细胞未被茜素红染色,说明脂肪干细胞并未向成骨细胞诱导分化;对照组2、实验组1、实验组2和实验组3中各有一部分细胞被茜素红染成红色,说明细胞诱导分化过程中形成钙结节;而形成钙结节的多少顺序分别为:实验组3、实验组1、对照组2、实验组2,说明和商品诱导液相比较,加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化,但是PRP单独的诱导分化能力较弱,两者联合使用既可提高诱导分化能力,又代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性。
4)荧光定量PCR分析结果如下:
表2荧光定量PCR分析结果
组别 | ALP相对表达量 | runx2相对表达量 |
诱导前 | 1 | 1 |
对照组1 | 1.0 | 1.0 |
对照组2 | 7.4** | 15.2** |
实验组1 | 8.4** | 15.3** |
实验组2 | 1.6** | 2.2** |
实验组3 | 9.6** | 18.3** |
其中:*表示和诱导前相比较,P<0.05;**表示和诱导前相比较,P<0.01。
由表2可知,对照组1和诱导前相比ALP和runx2基因表达无明显变化,而对照组2、实验组1、实验组2和实验组3中细胞的cadherin和runx2基因表达量均升高,说明脂肪干细胞成功向成骨细胞分化;而ALP和runx2基因表达量升高的顺序分别为:实验组3、实验组1、对照组2、实验组2,说明和商品诱导液相比较,加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化,但是PRP单独的诱导分化能力较弱,两者联合使用既可提高诱导分化能力,又代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性,和染色结果一致。
实施例3
1、脂肪干细胞原代分离
待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体,加入等体积的生理盐水清洗脂肪组织2次,吸弃下方溶液;将脂肪组织分装至50mL离心管中,每管20mL,每管中加入等体积的0.5%Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25%),充分混匀,封口,转移至恒温空气摇床中,37℃、200R消化50min;消化完成后离心,1500rpm离心10min;弃去离心后的脂肪和脂肪油,每管加入40mL生理盐水重悬细胞,1500rpm离心5min,弃去上清,用普通培养基(DMEM/F12+10%FBS)重悬细胞,并接种至培养皿中,待细胞汇合度达到80-90%时,进行传代处理。
2、人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定
取对数生长期第3代的细胞,吸出培养基后,加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液进行消化,之后用适量血清终止消化1000rpm离心10min,弃上清,用4℃遇冷的PBS洗涤细胞2次后重悬均匀,调整细胞浓度约为105-106个/ml。取2个上样管,每管加入500μL的单细胞悬液,离心后1号管标为标准对照,2号各加入2μLFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。室温,避光,孵育20min;PBS洗两遍,以去除未结合的抗体,500μL1640培养基重悬后,上流式细胞仪鉴定表面标记。结果与图2相近。可见,扩增第3代的ADSCsCD73、CD90呈阳性表达,而HLA-DR、CD45呈阴性表达,符合干细胞的特性。
3、富血小板血浆的制备
加抗凝剂的静脉血低温高速离心,第一次离心3000转4min,吸取上层血浆、白膜层至另一抗凝剂采血管中。3000转离心15min,吸去上层3/4贫血小板血浆(PPP),余下1/4即为富血小板血浆。分装后-80℃保存。
4、脂肪干细胞成骨分化诱导
1)实验分组:
对照组1:脂肪干细胞普通培养基组;
对照组2:商品化培养基诱导组;
实验组1:基础培养基+1μg/mLcadherin-11组;
实验组2:基础培养基+5%PRP组;
实验组3:基础培养基+1μg/mLcadherin-11+5%PRP组。
2)取第3代的ADSCs,吸出培养基后,加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液进行消化,之后用适量血清终止消化。1200rpm离心5min,脂肪干细胞完全培养基重悬,调整密度为1×104/mL,接种于6孔板中,每孔2mL。
当细胞达到40%-50%融合时,分别应用实验分组所示培养基,同样环境下诱导培养,每3天更换诱导培养基,培养14天后,部分细胞采用茜素红进行染色,观察形成钙结节的情况;部分细胞用于抽提RNA,逆转录成cDNA,以此cDNA为模板,以上游引物:TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物:TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP);上游引物:TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物:TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)为引物进行免疫荧光定量PCR,其中beta-actin作为内参,检测成骨细胞标志蛋白ALP、runx2的基因表达量。最后根据根据得到的C(t)值,以诱导前细胞中基因的表达量为参照,计算诱导后细胞中目的基因相对于诱导前的表达量。
3)茜素红染色结果与图3相似,对照组1和诱导前细胞形态并无差别,细胞未被茜素红染色,说明脂肪干细胞并未向成骨细胞诱导分化;对照组2、实验组1、实验组2和实验组3中各有一部分细胞被茜素红染成红色,说明细胞诱导分化过程中形成钙结节;而形成钙结节的多少顺序分别为:实验组3、实验组1、对照组2、实验组2,说明和商品诱导液相比较,加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化,但是PRP单独的诱导分化能力较弱,两者联合使用既可提高诱导分化能力,又代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性。
4)荧光定量PCR分析结果如下:
表3荧光定量PCR分析结果
组别 | ALP相对表达量 | runx2相对表达量 |
诱导前 | 1 | 1 |
对照组1 | 1.0 | 1.1 |
对照组2 | 7.0** | 14.9** |
实验组1 | 7.9** | 15.0** |
实验组2 | 1.4** | 1.9** |
实验组3 | 9.8** | 19.6** |
其中:*表示和诱导前相比较,P<0.05;**表示和诱导前相比较,P<0.01。
由表3可知,对照组1和诱导前相比ALP和runx2基因表达无明显变化,而对照组2、实验组1、实验组2和实验组3中细胞的cadherin和runx2基因表达量均升高,说明脂肪干细胞成功向成骨细胞分化;而ALP和runx2基因表达量升高的顺序分别为:实验组3、实验组1、对照组2、实验组2,说明和商品诱导液相比较,加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化,但是PRP单独的诱导分化能力较弱,两者联合使用既可提高诱导分化能力,又代替动物血清,减少了其应用的风险和免疫原性,和染色结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,其特征在于,包括钙粘附蛋白-11和富血小板血浆。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,其特征在于,以μg/mL计,所述钙粘附蛋白-11与所述富血小板血浆的比例为(0.1~1):(0.05~0.1)。
3.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,其特征在于,以μg/mL计,所述钙粘附蛋白-11与所述富血小板血浆的比例为0.1:0.1。
4.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,其特征在于,以μg/mL计,所述钙粘附蛋白-11与所述富血小板血浆的比例为0.5:0.08。
5.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,其特征在于,以μg/mL计,所述钙粘附蛋白-11与所述富血小板血浆的比例为1:0.05。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,其特征在于,还包括基础培养基。
7.根据权利要求6所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,其特征在于,所述脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量为:
钙粘附蛋白-11:0.1~1μg/mL;
富血小板血浆:0.05~0.1mL/mL;
基础培养基:补足。
8.一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法,其特征在于,采用权利要求1至7中任一种所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物诱导培养脂肪间充质干细胞,获得成骨细胞。
9.根据权利要求8所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导方法,其特征在于,所述脂肪间充质干细胞为P3~P5代脂肪间充质干细胞。
10.根据权利要求8所述的脂肪间充质干细胞成骨诱导方法,其特征在于,所述诱导培养的时间为14~20天。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610143944.3A CN105695399B (zh) | 2016-03-14 | 2016-03-14 | 一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610143944.3A CN105695399B (zh) | 2016-03-14 | 2016-03-14 | 一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105695399A true CN105695399A (zh) | 2016-06-22 |
CN105695399B CN105695399B (zh) | 2019-05-07 |
Family
ID=56221369
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610143944.3A Active CN105695399B (zh) | 2016-03-14 | 2016-03-14 | 一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105695399B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106267354A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-01-04 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 |
CN109722413A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-05-07 | 杨姣姣 | 一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用 |
CN110218699A (zh) * | 2019-06-30 | 2019-09-10 | 山东如戴生物科技有限公司 | 脂肪干细胞快速培养及分化方法 |
CN112831463A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-05-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104830758A (zh) * | 2015-04-15 | 2015-08-12 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法 |
-
2016
- 2016-03-14 CN CN201610143944.3A patent/CN105695399B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104830758A (zh) * | 2015-04-15 | 2015-08-12 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
康夏等: "miRNA-144靶向调节钙粘蛋白11对间充质干细胞成骨分化的抑制效应", 《第三军医大学学报》 * |
杨民等: "富血小板血浆促进脂肪间充质干细胞的体内外成骨", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106267354A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-01-04 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 |
CN109722413A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-05-07 | 杨姣姣 | 一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用 |
CN109722413B (zh) * | 2019-03-19 | 2022-08-16 | 上海揽微赛尔生物科技有限公司 | 一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用 |
CN110218699A (zh) * | 2019-06-30 | 2019-09-10 | 山东如戴生物科技有限公司 | 脂肪干细胞快速培养及分化方法 |
CN112831463A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-05-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用 |
CN112831463B (zh) * | 2021-01-27 | 2022-08-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105695399B (zh) | 2019-05-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Choi et al. | Adipogenic differentiation of adipose tissue derived adult stem cells in nude mouse | |
Mojallal et al. | Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal–vascular fraction | |
CN105695399A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法 | |
CN107338218A (zh) | 一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导剂和方法 | |
Park et al. | Acquisition of human alveolar bone‐derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: in vitro and in vivo evaluations | |
Wu et al. | Osteogenic performance of donor-matched human adipose and bone marrow mesenchymal cells under dynamic culture | |
König et al. | Direct transplantation of native pericytes from adipose tissue: a new perspective to stimulate healing in critical size bone defects | |
Gao et al. | Vitalisation of tubular coral scaffolds with cell sheets for regeneration of long bones: a preliminary study in nude mice | |
CN105219707A (zh) | 一种复苏脂肪间充质干细胞的方法 | |
CN104704111A (zh) | 通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法 | |
CN102899287A (zh) | 一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用 | |
CN102367435A (zh) | 人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用 | |
CN110938590B (zh) | 一种间充质干细胞无血清培养基及其用途 | |
CN105238749A (zh) | 一种复苏骨髓间充质干细胞的方法 | |
CN105779388B (zh) | 一种脐血间充质干细胞的培养基及其培养方法 | |
CN107267453A (zh) | 一种用于培养脂肪间充质干细胞的培养基及其应用 | |
CN1912109A (zh) | 一种组织工程化脂肪组织的构建方法与应用 | |
CN105456293A (zh) | 一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法 | |
CN104707176A (zh) | 一种复合支架材料 | |
Hattori et al. | Establishment of a novel method for enriching osteoblast progenitors from adipose tissues using a difference in cell adhesive properties | |
CN104805051A (zh) | 诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法 | |
CN105441388A (zh) | 促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法 | |
Hung et al. | Engineering bone grafts with enhanced bone marrow and native scaffolds | |
Merceron et al. | Cartilage tissue engineering: From hydrogel to mesenchymal stem cells | |
CN102002479A (zh) | 一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |