CN112831463B

CN112831463B - 一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用

Info

Publication number: CN112831463B
Application number: CN202110107581.9A
Authority: CN
Inventors: 李红; 李锦�; 吴宁; 周祥斌; 方婷; 宋贤奎
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN112831463A

Abstract

本发明涉及一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用。本发明提供了SAFit2在制备高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基中的应用。小分子化合物SAFit2的加入能够大大提高脂肪干细胞向骨细胞分化的效率。

Description

一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用。

背景技术

骨缺损是一种严重的骨科疾病，其治疗具有挑战性。目前骨缺损的治疗技术包括骨移植技术、带血管腓骨移植技术、IIizarov骨搬运技术、Masquelet诱导膜技术、钛网cage技术、髓内钉系统骨延长技术和组织工程技术等。移植骨可分为自体骨、同种异体骨、异种骨及人工骨4类。自体骨移植仍然是目前小缺损(<5cm)重建的治疗标准，但由于自体骨取材有限，并容易产生医源性损伤、术后疼痛等并发症，自体骨移植的临床应用还较为局限；相比之下，同种异体骨和异种骨移植在疾病传播和免疫原性反应等方面发生的风险概率都很高，目前也并没有被接受为骨缺损的标准治疗方式。同样，Masquelet诱导膜技术和IIizarov骨搬运技术是目前较大骨缺损(>5cm)重建的首选方法，但这些技术操作复杂，对术者技术要求高，其预后避免不了高并发症和再手术率的风险。因此，快速、安全的骨缺损修复方法成为近年来骨伤病领域的研究方向。

超临界大面积或大段骨缺损仍是临床面临的难题，研究者们致力于研发人工骨材料，但为了解决人工骨材料成骨效应不良的问题，人们越来越关注间充质干细胞在骨组织工程中的应用。间充质干细胞起源于中胚层细胞，具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞等多种间质细胞亚群的功能。间充质干细胞最早发现于骨髓，现研究者发现可从胎盘组织、脐带、脂肪等组织分离出间充质干细胞。间充质干细胞可作为种子细胞应用于骨组织修复，为骨质缺损、骨组织损伤修复带来新的治疗策略。

临床吸脂手术每次可产生100～3000毫升的脂肪组织，手术创伤小且微创且获得脂肪组织数量较大，该材料在术后通常被丢弃。脂肪组织中可分离培养出人脂肪干细胞(hASC)，即为脂肪组织来源的间充质干细胞，同样具有自我增殖和多向分化能力，使其成为修复组织损伤理想的种子细胞。但是，脂肪干细胞用于骨缺损仍然存在局限和挑战。比如：在缺血组织中，成骨分化效率低等。如何提高诱导效率、稳定、可控性骨分化以增加治疗成功率，是临床治疗亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用。小分子化合物SAFit2的加入能够大大提高人脂肪干细胞向骨细胞分化的效率。

本发明提供了SAFit2在制备高效诱导人脂肪干细胞骨分化的培养基中的应用。

本发明还提供了一种高效诱导人脂肪干细胞骨分化的培养基，所述培养基以成骨诱导培养基为基础培养基，还包括SAFit2。

优选的是，所述培养基中，SAFit2的质量浓度为10～200ng/mL。

优选的是，所述成骨诱导培养基以含质量百分含量为10％胎牛血清的DMEM-HG为基础培养基，还包括地塞米松0.1～1μM、抗坏血酸磷酸盐10～100μM和β-磷酸甘油1～100mM。

本发明还提供了上述技术方案所述培养基的制备方法，包括以下步骤：

将SAFit2添加到成骨诱导培养基中，得到高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述培养基或上述技术方案所述制备方法得到的培养基的高效诱导脂肪干细胞骨分化的方法，包括以下步骤：

将脂肪干细胞在上述技术方案所述培养基或上述技术方案所述制备方法得到的培养基中进行诱导培养，得到骨分化细胞。

优选的是，所述脂肪干细胞在上述技术方案所述培养基或上述技术方案所述制备方法得到的培养基中进行诱导培养前，接种于MSC培养基进行培养6～48h。

优选的是，所述接种用脂肪干细胞为第3～5代脂肪干细胞，所述接种的密度为0.1×10⁴～5×10⁴/cm²。

优选的是，所述诱导培养中，每3天半量换液，所述诱导培养的时间为1～3周。

本发明还提供了上述技术方案所述培养基或上述技术方案所述培养方法得到的培养基或上述技术方案所述的方法在制备治疗骨缺损的药物中的应用。

本发明提供了一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基。小分子化合物SAFit2的加入能够大大提高脂肪干细胞向骨细胞分化的效率。试验结果表明，加入SAFit2组的细胞成骨细胞分化相关基因碱性磷酸酶，骨桥蛋白表达明显增高，骨分化相关蛋白Runx2明显增高；用茜素红染色检测骨细胞分泌的细胞外钙基质，结果显示：SAFit2的加入可明显促进脂肪干细胞向骨细胞分化。此外，本发明脂肪干细胞移植治疗大鼠颅骨缺损的实验中，SAFit2的加入能够明显提高骨缺损的治疗效果。因此，本发明为骨缺损治疗用药物或材料的制备，提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明提供的SAFit2促进脂肪间充质干细胞骨的细胞分化相关基因升高结果；

图2为本发明提供的SAFit2促进脂肪间充质干细胞的骨细胞分化相关蛋白升高结果；

图3为本发明提供的茜素红S染色显示SAFit2可促进脂肪干细胞骨分化结果。

具体实施方式

本发明提供了SAFit2在制备高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基中的应用。SAFit2可商业化购买，如MedChemExpress公司(产品编号:HY-102080)、TopScience公司(产品编号：T16836)，PlantChemMedicine公司(产品编号:PC-99022)。SAFit2常规是用作一个高效且高选择性的FK506结合蛋白51(FKBP5)抑制剂，但在本申请中的作用为诱导脂肪干细胞骨分化。

本发明加入小分子化合物SAFit2，能够大大提高脂肪干细胞向骨细胞分化的效率。本发明所述SAFit2可以加入常规诱导脂肪干细胞骨分化的培养基中。本发明对常规诱导脂肪干细胞骨分化的培养基没有特殊限定，采用常规的成骨诱导培养基即可。

本发明还提供了一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基，所述培养基以成骨诱导培养基为基础培养基，还包括SAFit2。

本发明所述培养基中，SAFit2的质量浓度优选为10～200ng/mL，更优选为10～100ng/mL，最优选为100ng/mL。

在本发明中，所述成骨诱导培养基优选以含质量百分含量为10％胎牛血清的DMEM-HG为基础培养基，还包括地塞米松0.1～1μM、抗坏血酸磷酸盐10～100μM和β-磷酸甘油1～100mM，更优选还包括地塞米松0.1μM、抗坏血酸磷酸盐50μM和β-磷酸甘油10mM。

在本发明中，所述脂肪干细胞在上述技术方案所述培养基或上述技术方案所述制备方法得到的培养基中进行诱导培养前，优选接种于MSC培养基进行培养6～48h，更优选为24h。在本发明中，所述接种用脂肪干细胞优选为第3～5代脂肪干细胞，所述接种的密度优选为0.1×10⁴～5×10⁴/cm²，更优选为1×10⁴/cm²。本发明对第3～5代脂肪干细胞的获得方法没有特殊限定，使用脂肪细胞进行常规的传代，既每3-5天传代一次即可。具体的，本发明优选将脂肪组织用透明质酸酶(0.05％，Hyclone，美国)和I型胶原酶(0.1％，Hyclone)37℃消化45min，在1500转/分离心10min后，将消化后的单个细胞收集在DMEM-LG中(Gibco)，添加青霉素100U/ml，链霉素100U/ml(Hyclone)和10％胎牛血清(FBS，Gibco)，放置在湿化的在37℃下，5％CO₂的培养箱中培养，每5～7天传代一次。

在本发明中，所述诱导培养中，优选每3天半量换液，所述诱导培养的时间优选为1～3周，更优选为2～3周。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

分别取第3～5代正常人脂肪细胞来源的脂肪干细胞，按1×10⁴/cm²接种于24孔板，脂肪干细胞培养基培养24h后换用常规成骨诱导培养基，常规成骨诱导培养基为含10％FBS的DMEM-HG并加入地塞米松0.1μM、抗坏血酸磷酸盐50μM和β-磷酸甘油10mM，另有一组细胞在此基础上加入SAFit2 100ng/ml，每3天半量换液，共诱导3周。

1.成骨诱导后不同时间点收集细胞，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对成骨分化后的相关基因，如骨桥蛋白(Osteopontin)，碱性磷酸酶(ALP)的表达水平进行检测，以肌动蛋白(β-actin)的表达作为内参，以明确SAFit2对脂肪干细胞骨分化的作用。

1)提取总RNA：

消化收获各组细胞(1×10⁶)，离心弃上清，置Eppendoff管中；加入1ml Trizol，混匀静置5min，加入200μl氯仿，室温放置5min后12000rpm×15min，4℃离心；吸取含RNA的上层水相，加入等量的异丙醇，室温放置10min后12000rpm×15min4℃离心；加入75％乙醇1ml7500rpm×10min4℃离心弃上清；干燥后，重悬于20μl去离子水中。

2)反转录

RNA的转录采用Qiagen公司的QuantiTect^TM Reverse Transcription Kit试剂盒(Cat.205313，QIAGEN公司，德国)，操作按试剂盒说明书进行。

3)定量PCR反应

实时定量PCR扩增采用Qiagen公司的QuantiTect^TM SYBR Green PCR Kit试剂盒(Cat.204145，QIAGEN公司，德国)，操作按试剂盒说明书进行，具体方法如下所示：

配置如下的PCR反应体系：

每个体系做3个复孔置于ABI PRISM 7500 Realtime-PCR仪中，反应条件如下：95℃，15min；94℃，10s；56℃，20s，40个循环；68℃，35s。

4)产物的定量分析。采用2-△△Ct计算方法对目的基因进行差异表达分析，其中△Ct＝Cttarget–Ctendo(endo为内参基因U6)；△△Ct＝△Ctsample–△Ctcontrol。

5)所用引物

表1扩增骨分化后的相关基因表达所用引物

Osteopontin-Up	5’-GTGCCATACCAGTTAAACA-3’(SEQ ID NO.1)
		Osteopontin-Dn	5’-CTTACTTGGAAGGGTCTCT-3’(SEQ ID NO.2)
ALP-Up	5’-GCTTGACCTCCTCGGAAGACACTC-3’(SEQ ID NO.3)
		ALP-Dn	5’-CGCCTGGTAGTTGTTGTGAGCATAG-3’(SEQ ID NO.4)
β-actin-Up	5’-TGACGTGGACATCCGCAAAGA-3’(SEQ ID NO.5)
		β-actin-Dn	5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO.6)

2.蛋白免疫印迹技术检测脂肪干细胞成骨分化后的相关蛋白Runx2的表达水平，以β-actin蛋白作为内参，以明确SAFit2在脂肪干细胞骨分化中的作用。

各组细胞成骨诱导第6天，12天，采用RIPA裂解提取细胞总蛋白，加入RUNX2抗体(1∶1000)，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)，室温孵育1h，采用化学发光法对蛋白条带进行可视化，采用Image J软件进行图像分析。

3.茜素红S(Alizarin Red S)染色

脂肪干细胞在特定的诱导培养基作用一段时间后，干细胞可分化为成骨细胞，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。茜素红S染色法是一种旨在通过鳌和技术，使钙离子和茜素红S产生复合物，来分析固定处理的细胞样本中橘红色钙沉积现象的经典的技术方法。使用茜素红S检测可检测脂肪干细胞骨分化后细胞外钙质/钙结节的量，明确SAFit2在脂肪干细胞分化中的作用。具体方法为：培养皿中分化诱导后的细胞用PBS冲2次，95％乙醇固定10min，蒸馏水冲洗3次；0.1％茜素红－Tris－HCL(pH 8.3)37℃，30min；蒸馏水冲洗；显微镜下拍照。

实验结果如图1～3所示，图1为SAFit2促进脂肪间充质干细胞骨的细胞分化相关基因升高结果；其中，A为各组脂肪干细胞成骨分化后3天后碱性磷酸酶基因表达情况图，B为各组脂肪干细胞成骨分化后5天后碱性磷酸酶基因表达情况图，C为各组脂肪干细胞成骨分化后1周后骨桥蛋白的基因表达情况图，D为各组脂肪干细胞成骨分化后3周后骨桥蛋白的基因表达情况图；PM:培养基组；PM+SAFit2:培养基加入SAFit2组；OM:成骨分化培养基诱导组；OM+SAFit2:成骨分化培养基加入SAFit2组；*，p<0.05。在分化培养基中加入SAFit2，培养后各时间点收集各组细胞，应用定量PCR技术检测成骨分化相关基因的表达。图1中，A和B显示了骨分化培养基中加入SAFit2后成骨细胞早期标志性基因碱性磷酸酶基因表达升高；C和D显示了骨分化培养基中加入SAFit2后成骨细胞晚期标志性基因骨桥蛋白基因表达增高。

图2为SAFit2促进脂肪间充质干细胞的骨细胞分化相关蛋白升高结果图，其中，A为各组脂肪干细胞成分化后3周后骨分化相关蛋白Runx2表达情况，为3次蛋白免疫印迹实验结果的统计后的柱状图，B为代表性的蛋白免疫印迹结果的图；PM:培养基组；PM+SAFit2:培养基加入SAFit2组；OM:成骨分化培养基诱导组；OM+SAFit2:成骨分化培养基加入SAFit2组；每组数值以平均值±SEM表示；*，p<0.05。在脂肪干细胞诱导培养2周后，收集各组细胞，应用蛋白免疫印迹技术检测成骨分化相关蛋白的表达。图2中的A显示，骨分化培养基中加入SAFit2后骨细胞标志性蛋白Runx2表达升高；图2中的B显示了三次实验的代表性结果。

图3为茜素红S染色显示SAFit2可促进脂肪干细胞骨分化结果，其中，A为3次实验的茜素红S染色结果利用Image J软件分析染色面积比例后的统计学结果；B为各组脂肪干细胞成分化后3周后茜素红S染色的代表性结果；PM:培养基组；PM+SAFit2:培养基加入SAFit2组；OM:成骨分化培养基诱导组；OM+SAFit2:成骨分化培养基加入SAFit2组；每组数值以平均值±SEM表示；*，p<0.05。图3显示，成骨诱导培养基中加入SAFit2，2周后茜素红染色面积增加，表明SAFit2可促进脂肪干细胞骨分化。

综上所述，成骨诱导后，发现加入SAFit2组的细胞成骨细胞分化相关基因碱性磷酸酶(图1中的A、B)，骨桥蛋白(图1中的C、D)表达明显增高，骨分化相关蛋白RUNX2明显增高(图2)；用茜素红染色检测骨细胞分泌的细胞外钙基质，染色面积明显增加(图3)，结果显示：SAFit2的加入可明显促进脂肪干细胞向骨细胞分化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基及制备和诱导分化方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgccatacc agttaaaca 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttacttgga agggtctct 19

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcttgacctc ctcggaagac actc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcctggtag ttgttgtgag catag 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgacgtggac atccgcaaag a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctggaaggtg gacagcgagg 20

Claims

1.SAFit2在制备高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基中的应用；所述诱导为将脂肪干细胞诱导为成骨细胞；所述培养基以成骨诱导培养基为基础培养基，还包括SAFit2；所述培养基中SAFit2的质量浓度为10~200ng/mL。

2.一种基于高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基的高效诱导脂肪干细胞骨分化的方法，包括以下步骤：

将脂肪干细胞在高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基中进行诱导培养，得到骨分化细胞；所述骨分化细胞为成骨细胞；

所述高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基以成骨诱导培养基为基础培养基，还包括SAFit2；所述培养基中SAFit2的质量浓度为10~200ng/mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述成骨诱导培养基以含质量百分含量为10%胎牛血清的DMEM-HG为基础培养基，还包括地塞米松0.1~1μM、抗坏血酸磷酸盐10~100 μM和β-磷酸甘油1~100mM。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂肪干细胞在高效诱导脂肪干细胞骨分化的培养基中进行诱导培养前，接种于MSC培养基进行培养6~48h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接种用脂肪干细胞为第3~5代脂肪干细胞，所述接种的密度为0.1×10⁴~5×10⁴/cm²。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养中，每3天半量换液，所述诱导培养的时间为1~3周。

7.权利要求2~6任一项所述的方法在制备治疗骨缺损的药物中的应用。