CN101878297A - 用于间质干细胞优化扩增和移植的方法与组合物 - Google Patents

用于间质干细胞优化扩增和移植的方法与组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于优化扩增间质干细胞以及将其植入有此需要的患者的组合物和方法。对于需要MSC的患者是自体的间质干细胞(MSC)被收获、扩增，其在新型生长参数内，并且在位于患者血小板上的自体生长因子的影响下。

Description

用于间质干细胞优化扩增和移植的方法与组合物
技术背景
本发明整体上涉及用于干细胞分离、扩增及植入有需要的宿主的组合物和方法。更特别的，本发明涉及采用在优化的生长条件下扩增的自体间质干细胞对靶组织进行置换和修复。
发明背景
间质干细胞属于多能母细胞或胚胎样细胞，其位于血液、骨髓、皮肤和骨膜中。通常，这些细胞经过一段时间以及在各种环境条件下能够自我更新，并且分化为软骨、骨及其他结缔组织。最近，不同的研究者研究了使用这些细胞修复或再生靶组织例如，骨、软骨等的可能性。据报告，MSC以这种方式在多个动物模型中有再生的能力。参见：Acosta等，(2005)Neurosurg Focus 19(3)：E4；Barry(2003)Novartis Found Symp.249：86-102，170-4，239-41；Brisby等，(2004)Orthop Clin.North Am.35(1)：85-89；Buckwalter和Mankin(1998)Instr Course Lect.47：487-504；Caplan(1991)J Orthop Res.9(5)：641-650。而且，这些研究结果正在拓展到对人的临床试验中，然而，大部分这些临床试验需要运用高浓度重组细胞因子和生长因子进行分离的非自体MSC的体外扩增。例如，大多数用于人的研究利用从骨髓(或外周血)分离的MSC，然后用掺加(spkie)有不同重组生长因子的胎牛血清(FBS)培养基在实验室装置中对细胞进行离体(ex vivo)扩增。这些补充FBS的培养基显示出支持MSC扩增的能力，但也存在感染载体的交叉污染风险；使用未经食品与药品管理局(FDA)批准的药物/因子，例如重组TGF-β、FGF，表现出种间反应，并有可能导致癌症性祖细胞形成的潜力提高。
此外，大多数MSC用于人的研究均需要受训的实验室人员和实验室设备，以进行分离的MSC的扩增。这些技术并非医师和/或医院人员应该具备的技能，尤其是考虑到医师在法律上受FDA协议及有关非FDA批准药品的程序的约束。因此，基于MSC的治疗很难以实际应用方式加以实施，实际应用方式，即利用医院的设备由医院工作人员。由于存在这样各种各样的顾虑，大多数基于MSC的研究针对非自体细胞，这些细胞已经被分离并培养成永久细胞系。
Doucet(Doucet，Ernou等。2005 J.Cell Physiol 205(2)：288-36)最近描述了一项技术，即用5％富含培养基的血小板裂解物扩增年轻健康供体的MSC。然而，Doucet的研究并未确定这些程序对年长患者、退行性关节病(例如骨关节炎)患者或其他患者特异性病症的治疗效果。除了用富含5％血小板裂解物的培养基之外，该研究未以其他任何扩增条件进行过。由此可见，已经表明，在患者中MSC生长会由于患有或没有骨关节炎、年龄、性别以及基于某些遗传表型而有宽范围的变化。因此，Doucet的研究的实用性非常受限于实际生命状况，其中大多数需要基于MSC的治疗的患者通常是年长的，或者患有退行性关节、器官或脊椎疾病。Doucet数据也不适用与其它骨代谢疾病如非血管性坏死或骨坏死。此外，Doucet的结论结果不是性别或年龄特异性的，其对于如何治疗不同的性别或如何从高龄的患者扩增MSC几乎没有指导。
在培养中，MSC能够容易分化，其取决于细胞因子暴露、环境条件(压力、附着机会、传代处理等)或其他化学物质暴露。例如，暴露于不同水平的TGF-β、FGF和/或PDGF，均能影响培养物中产生的细胞的最终细胞表型。此外，将细胞长时间保留在培养物中也会影响其分化潜能。可以将细胞培养达到一定程度的细胞形态、汇合或密度，所有这些都影响所产生的细胞终产品及其用于特定类型组织修复的可能性。因此，本发明集中于控制因子/参数，以期获得均一化且具有一定促恢复性质的的细胞产品。
在用MSC进行置换或修复组织的过程中，其中一个考虑就是非自体细胞的使用。尽管MSC传统上被认为是免疫豁免(immuneprivileged)细胞，最近研究证明，MSC在外源性宿主体内活化自然杀伤细胞系统(Spaggiari，Capobianco等。2006 Blood 107(4)：1484-90)。这就使得使用非自体细胞变得困难，因为预料宿主免疫系统会攻击这些外源细胞，并有可能大量杀死(decimate)移植的MSC群，这就严重限制了其修复能力。此外，Ueda发表的最近一项研究对非自体细胞的使用具有深远的意义(Ueda，Inaba等。2007 Stem Cells 25(6)：1356-63)。这项研究证明，患有骨质疏松的年老小鼠通过骨髓载体将疾病传给了正常的小鼠。这暗示，年老的骨质疏松小鼠的MSC一旦转移到正常健康小鼠体内就会将患病状态也传给正常健康小鼠。传播疾病的遗传载体值得关注，这是因为理论上任何供体MSC都需要对所有已知的遗传易感性与由供体转移的疾病进行筛选。
在本领域中存在对这样的MSC扩增技术的需求，其不使用未经FDA批准的药物或生长因子，且能够有效用于置换有需要的患者的组织。这种置换术应当利用自体细胞，其中所述自体细胞已经基于患者的医疗状况、年龄、性别和其他相关置换条件而进行优化扩增。此外，存在对自体技术的需求，以产生具有已知的再生能力并进行严格质量控制的同源细胞系。
本发明旨在克服解决以上讨论的一个或更多个问题。
发明内容
本发明的实施方式提供用于自体人间质干细胞(MSC)离体扩增以及后续植入有需要的患者靶组织的组合物和方法。这些MSC就它们的移植以及置换/再生靶组织的能力而被优化，例如，再生膝关节软骨组织的能力。如上所述，它们还通过严格的质量控制被优化以产生均一的细胞系，表达一种或更多种下列细胞表面抗原：CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD166和CD105，在某些实施方式中表达两种、三种、四种、五种、六种或七种上述细胞表面抗原。另外，本文所述的某些优化的细胞不表达一种或更多种下列细胞表面抗原：CD14、CD31、CD45和/或CD106。
本发明的一些方面包括新型扩增组合物，其不需要纯化的或重组生长因子、细胞因子或非天然存在的人体因子。特别是，扩增组合物被设计为包括引入不同数量(在不同时机)血小板裂解物，用于优化细胞生长、尤其是优化细胞在植入目标患者时的细胞生长。某些情况下的优化包括以一种可控制的方式扩增细胞，以促进细胞向有需求患者体内的成功移植；在某些情况下细胞生长与细胞生长条件受到监测和改变，以维持细胞在预先设定的“生长通道(growth channel)”内，即，在进入有限数量的细胞传代之前将细胞扩增至需要的数量。这些基于血小板裂解物的生长条件提供在这一生长通道内MSC离体增殖必需因子的持续自分泌释放。此外，为了保证均一性和严格的质量控制，该“生长通道”具有多项反映指标，如细胞密度、形态特征和培养模式。而且，这些被设计为产生符合已知细胞修复特性的细胞扩增，因为这种细胞生长配方的一些小变动都将导致产生具有不同分化及修复特性的完全迥异的细胞产物。
本发明的一些方面亦包括使患者做好接受经过优化培养的MSC的准备，其通过移植含特定数量血小板或血小板裂解物的细胞。细胞与血小板的移植可同时发生或者相继发生。在典型的实施方式中，MSC、血小板和血小板裂解物均来自即将向其移植MSC、血小板/血小板裂解物的患者。
本发明的一些方面还包括从需要基于MSC的恢复治疗的患者分离MSC的方法，运用通过不同数量血小板裂解物和基于细胞特性(例如汇合、形态特征、细胞培养模式等等)(为保证满足特定需要的适当均一性生长所必需，即在生长通道中生长)的培养决定因素获得的细胞特异性扩增数据对分离的MSC进行优化扩增，以及含有或不含相互依赖的MSC生长促进物质的扩增细胞的移植。
本发明的一些方面是在当收集细胞并将其重新植入骨关节炎或其他软骨病或骨代谢病(如非血管性坏死或骨质疏松)患者内时特别有用，条件是从这些患者常规收获的这些细胞显示了几乎没有在置换疗法中的使用前景。然而，这一观点并不意味着将本发明的范围或用途仅限于一个应用。
本发明的一些方面还提供一个生长通道，确保收集的MSC以一种天然的方式保持，这样有利于细胞被移植回到患者体内。这些细胞是自体的，并优化在靶中的生长潜能，其仅使用来自与收获细胞的相同宿主细胞的天然因子，即没有合成的或重组因子以促进细胞生长。在典型的生长通道实施方式中，细胞在进行第10次传代之前被扩增并准备好实施，在其他实施方式中细胞通过它们的第3次、第4次、第5次、第6次、第7次第8次或第9次传代(收集后)而被扩增并准备好实施。在大约第10次传代之后移植的细胞表现出临床应用方面无效性升高趋势。
本发明的一些方面还提供通过手工细胞计数确保扩增的MSC保持在生长通道内。在本发明的其他方面中，MSC通过可见的指示特征考察确定细胞是否处于生长通道内，适当的指示特征包括培养形态、培养模式和培养密度。在某些方面，细胞数目和可见的细胞考察指标用于指示细胞是否处于本发明的生长通道内。注意，可见的考察可在培养MSC的位点进行，例如，已经签约扩增这些细胞的医院血库，或者通过遥控位点实现，即经验丰富的组织培养技术人员通过数字显微摄像机(现场摄像、更新图片或其他类似技术)观察细胞培养状况，然后向远距离现场工作人员提供有关培养细胞状态的反馈信息。
最后，本发明的一些方面提供细胞群，其被使用本发明所述的方法就所鉴定的表型进行富集，所述表型包括以下一种或更多种细胞表面抗原：CD29、CD44、CD59、CD90、CD166、CD73和CD105。本文所鉴定的细胞进一步典型地是下列阴性的：CD14、CD31、CD45和CD 106细胞表面抗原。在某些实施方案中，经过优化和扩增的细胞群同时表达CD29和CD44与下列至少一种其它表面抗原：CD59、CD90、CD105和CD66。因此，在某些实施方案中，本发明优化的细胞群表达至少：CD29、CD44和CD59；表达CD29、CD44和CD90；表达CD29、CD44和CD105或者表达CD29、CD44和CD66。
具有上述表型的用本文所述方法制备的细胞显示出最佳的生长特征用于植入有需要的患者中。
通过下面的详细说明和所附权利要求，本发明的这些优点及其他各种特征和优势将变得清楚。
附图简要说明
图1A-E显示本文所述的“生长通道”的各种图解，其中包括细胞生长速率、细胞密度、细胞形态和细胞培养模式。A：细胞生长速率以优化用于修复的扩增。倍增时间定义为单层培养中细胞数目加倍的天数。这是一个关键指标，因为具有修复能力的细胞易于在培养中指数生长。使倍增时间处在可接受生长通道内所需要的血小板裂解物百分比浓度也决定需要进行体内细胞扩增与移植的血小板裂解物的量。细胞培养行为：
预期的生长通道以上(＞3天)：增加血小板裂解物浓度直至生长速率在预期的生长通道内；以更高密度接种直至生长速率在预期的生长通道内。
预期的生长通道以下(＜1天)：减小血小板裂解物浓度直至生长速率在预期的生长通道内；以更低密度接种直至生长速率在预期的生长通道内。
B：样本：两个10cc骨髓以＞100的PSIS得率将核化细胞转化为集落形成培养物，并从集落形成培养物中得到约700,000个MSC(裂解物的浓度20％，培养7-10天后)。在这个实施例中，生长通道显示出倍增时间有些滞后导致产生上述细胞培养行为。细胞培养行为：
如图示预期生长通道以上：增加血小板裂解物浓度直至生长速率在预期的生长通道内；以更高密度接种直至生长速率在预期的生长通道内；
如图示预期生长通道以下：减小血小板裂解物浓度直至生长速率在预期的生长通道内；以更低密度接种直至生长速率在预期的生长通道内。
C：细胞汇合的定义为，单层培养细胞之间自有空隙所占的百分比。如图所示，包装过于紧密的细胞将迅速进入分化状态，而包装过于疏松的细胞则不会达到目标生长速率。细胞的空间分布可用下列方程进行定量分析：表面积*(％汇合)/细胞数目。这个值范围应该在18-23之间。细胞培养行为：
预期生长通道以下(＜18)：减小血小板裂解物浓度直至汇合处于预期生长通道内；以更低接种密度接种直至汇合符合预期的生长通道；
预期生长通道以上(＞23)：以更高密度接种直至汇合符合预期通道(从12×103个细胞/cm2到15×103个细胞/cm2)；
显著高于预期生长通道(＞27)；增加血小板裂解物浓度。
D：细胞分布的定义为，细胞在二维空间(单层培养)中存在随机性。随机分布的细胞在该生长通道内，结块的或不均匀分布的细胞不属于该生长通道。细胞培养行为：
在预期的生长通道之外(不均匀分布)：以更高的密度接种直至细胞均匀分布；相对于预期较早地进行细胞传代。
E：与本发明相关的MSC形态学类型及非相关类型。可以利用各种环境刺激和条件，将MSC培养为相对于其他表型而倾向于一种表型。此处显示的为与本发明不相关的表型。与本发明相关的表型为纺锤形。或如图所示的I型。任何与这种形态特征的偏差都需要本文所述的细胞培养行为。
I型：根据本发明所述的生长通道要求生长的iMSC的I型MSC显微图像(10x)。
II型：II型MSC的显微图像(10x)，该图像取自：与环境接触的人间质干细胞：表面特征与整合素系统Denitsa Docheva*，Cvetan Popv，Wolf Mutschler，Matthias Schieker J.Cell Mol.Med.Vol 11，No 1，2007pp.21-38.
III型：III型MSC的显微图像(20x)，该图像取自：脂肪组织间质干细胞与骨髓间质干细胞肝脏生成分化的比较，RaquelTalens-Visconti，Ana Bonora，Ramiro Jover，Vincente Mirabet，FranciscoCarbonell，Jose Vincente Castell，Maria Jose Gomez-Dechon World J.Gastroenterol 2006年9月28日；12(36)：5834-5845。
IV型：IV型MSC的显微图像(10x)，该图像取自：自体骨髓衍生培养的间质干细胞通过纤维素喷射器给药后加速小鼠与人皮肤创面的愈合，V FALANGA，S IWAMOTO，M CHARTIER，T YUFIT，JBUTMARC，N KOUTTAB，D SHRAYER，P；CARSON TISSUEENGINEERING Volume 13，Number 6，2007。
细胞培养行为：
在预期通道之外(＞30％II型细胞)：增加血小板裂解物浓度直至细胞形态为I型，或者如果传代次数＞5则移植；
显著超出预期通道(＞30％III型细胞或IV型细胞)；较预期时间早一些对细胞进行传代或移植；细胞可能不发挥理想的效果。
图2为细胞扩增图，显示当细胞在体外生长于5-10％血小板裂解物时，8位骨关节炎患者细胞间生长速率与产率的差异。
图3A-E显示5位患者分离的MSC群经过使用5-20％血小板裂解物的1-16天培养后的条状图。
图4显示用5-20％血小板裂解物培养时6位不同患者MSC扩增的条形图，图中显示患者细胞生长缓慢或生长迅速。
图5为针对5位不同患者的干细胞生长通道叠加。
图6A和B为运用经过本发明实施方案优化的细胞进行MSC移植前后的“快速自旋质子密度图(fast spin proton density image)”。
图7为显示用10％或20％血小板裂解物的4位患者细胞首次传代、第2次传代或第3次传代的细胞生长的条形图。
图8显示在两种不同骨髓抽取条件下一位3-4期非血管性坏死患者的细胞扩增。条件1：两种10cc骨髓抽取物产生4800万核化细胞，这些细胞在10％血小板裂解物存在时不发生扩增。培养物在2周后死掉。条件2：6小份取自两侧PSIS区域的1-2cc骨髓产生1亿6400万核化细胞。显示的是MSC在20％血小板裂解物中生长的扩增图。
图9A和9B为运用经本发明实施方案优化的细胞进行MSC移植前后的“快速自旋质子密度MRI图像”。显示中前膝盖弯月面的部分再生。分离自非血管性患者臀部的MSC的扩增。细胞移植前(左图拍于2007年1月)和移植后3个月(右图拍于2007年6月)右膝盖的连续匹配图。
图10A与10B为运用经本发明实施方案优化的细胞进行MSC移植前后的透射图。显示的是肱骨错位骨折的部分恢复。
图11A和11B为用本发明实施方案扩增的MSC移植前后伴有膝关节中部弯月面重度退化、随后弯月面部分再生的骨关节炎患者的质子密度矢状面图。
详细说明
本发明的实施方案提供用于在最佳生长条件下收集、扩增和移植自体间质干细胞的方法和组合物。扩增条件基于患者特定MSC群的个性化生长特征，无需合成的或重组的生长因子。在典型的实施方案中，最佳生长条件至少部分由同一患者的血小板裂解物提供。这些血小板裂解物组合物提供患者自身生长因子组合的持续而有效地释放。注意：本发明的一些方面同样适用除MSC外的其他细胞类型，例如，干细胞、软骨细胞等等，只是出于方便，本文所述的实施方案仅局限于MSC。此外，优化生长的细胞可与自体分泌的因子一起进行移植，增强细胞发挥更强疗效的能力，例如，与血小板或血小板裂解物联用，即从将接受MSC的同一患者体内收集的血小板。最后，本文所述的本发明实施方案包括通过本文所述的优化生长条件获得的就均一表型被富集的MSC，经鉴定确定这样的细胞可作为最佳细胞用于基于再生性MSC的治疗。
定义：
提供下列定义将有助于理解本文常用的特定术语，但其并不为了限制本发明的范围。
“个性化生长特征”指所收集细胞的个体特异性离体生长。例如，典型地收集自许多骨关节炎患者个体的细胞表现出生长缓慢，需要变动生长特征确保细胞具有最佳生长，以便准备被移植入患者内。
“间质干细胞”或“MSC”指能够分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经元细胞、胰岛细胞等(见下文)的多能干细胞。
“天然扩增因子”指对于有需要的患者而言是天然的因子，如同暴露于从体外来源制备的合成或重组扩增因子。天然表达因子典型地与血小板裂解物有关并从其释放。
“血小板裂解物”指包含于血小板中的天然生长因子的组合，通过裂解血小板而释放。这可通过化学方法获得，即CaCl2、渗透作用(运用蒸馏水)、或通过冷冻/融化程序。本发明的血小板裂解物也可来自全血，例如根据在《美国专利号5,198,357》中所述进行制备，通过参照将其并入本文。
“蛋白质”、“肽”及“多肽”可交换使用，表示氨基酸的聚合物或一组互相作用或链接的两个或更多个氨基酸的聚合体。
“干细胞”指任何具有非特化并能长期通过细胞分裂进行更新、亦能被诱导变成特异性功能细胞的细胞。
“细胞培养行为”指血小板裂解物浓度的改变、以不同的密度在培养物中再接种细胞、或计划传代时间的改变(即，在更换培养基前保留在培养基中更长或更短的时间)。
“传代”指在单层细胞培养中更换用过的培养基或者以其他方式改变培养基以改善细胞培养微环境。
MSC与血小板裂解物的来源
间质干细胞为位于骨髓、外周血、脂肪组织及其他类似来源组织的多能干细胞。MSC具有分化为许多细胞类型的能力，其中包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞及β胰岛细胞。
本发明的MSC来源典型地收获自需要恢复/置换治疗的患者(或合适供体)的髂嵴，本文提及的这种患者指“有需要的患者”(注意其他来源如脂肪组织、滑液组织及结缔组织最近已通过鉴定，并被认为可作为本发明范畴内的MSC来源)。在一个实施方案中，收集了大约10-20cc骨髓，并运用Centeno的《美国专利申请号60/761,441》中所述方法或者通过Caplan等的《美国专利号5,486,359》中所述的塑料粘附法对其进行分离。这些参考文献的每一篇均以完整形式一并归入本文。
本发明还对标准骨髓抽取程序做了改动，以便使用本文所述的血小板裂解物技术获得适当的核化细胞产量。由于已经公开的大多数研究都是在健康人或动物中进行，这项技术针对患有不同疾病患者的应用尚未进行过研究。图8显示了一个实施方案，其中来自一位AVN(需要AVN部位的骨骼修复)的骨髓抽取物通过上述两侧10cc抽取技术导致在血小板裂解物中扩增失败。但是，运用每侧抽取3小份2-3cc骨髓(总共6份)的改良技术得到了所需要的核化细胞产量，这些细胞在20％血小板裂解物中进行了成功的扩增。
本文使用的血小板裂解物由利用Doucet法获得的骨髓收集物制备，这一方法通过参照整体并入本文。典型的裂解物包括从数千万到数千亿个血小板。正如Martineau等(Biomaterials，2004  25(18)p4489-503)(通过参照整体并入本文)的研究所显示的那样，血小板裂解物本身包括促进MSC同步生长所需的生长因子。在典型的实施方案中，血小板裂解物与MSC属于自体物质，且数量上亦属有效量，故能刺激MSC的同步扩增(见下文详述)。由其应当注意的是，尽管诸如TGF-β等生长因子的水平在血小板裂解物中远远低于常用于MSC扩增的水平，但认为，当包含于血小板裂解物的所有低水平生长因子一起使用时存在明显的协同效应。
生长通道要求
如本发明的发明人所揭示，本发明收集的MSC在离体不晚于第10次传代，优选离体不晚于第5次传代(一次传代相当于细胞的收集与接种平铺，使细胞数目增加，用于培养基和/或组织培养物定居/作为底物)后植入患者体内时可提供最佳恢复/再生性治疗。正因为如此，每位患者的MSC必须在有限的传代次数中扩增至治疗所必需数量，而无需加入FDA未批准的药物或生长因子。本发明的实施方式提供运用血小板裂解物确保收集的MSC扩增至所需数量的生长通道条件，因此扩增的MSC被优化用于移植并用于目标患者。
确定一位患者MSC生长潜能(确保所需数量的细胞)存在不同的要求，也就是说，需要个性化的生长特征(见上述定义)。这些要求包括MSC来源，即年龄、性别、遗传限制及退行性疾病如骨关节炎等的存在。
就从骨关节炎患者收集的MSC而言，发明人已经鉴定了两种不同的细胞生长类型：“缓慢生长”与“快速生长”。患者中存在缓慢生长细胞提出了一个实际的问题，即迅速扩增细胞并在这组细胞内保持最大分化潜能的能力。不具备最大分化潜能的细胞很可能在移植过程中停止分化。Crisostomo等，Shock，2006  26(6)：p 575-80。因此，需要更高水平的患者血小板裂解物去刺激所需要的MSC生长。所以，这些细胞的处理与分离自一个年轻而健康个体的MSC必须完全不同。注意，表现出有限离体扩增潜能的细胞，即经过整个传代过程(＜3天)细胞数目增加不到100％，被认为对于本发明的应用目的来说属于缓慢生长。
在本发明的一个实施方式中，最佳MSC离体培养扩增需要的血小板裂解物的量通过监测不同生长条件下生长的收集细胞来确定。当细胞涉及骨关节炎、骨质疏松、AVN或骨骼、软骨或结缔组织疾病患者时，这就显得尤为重要。MSC扩增依赖于许多变量：患者血小板裂解物中生长因子的量(因而改变裂解物的百分比浓度可满足最大生长速率需要)、生长因子的生物利用率(即这些因子对患者细胞的效应)、生长因子的相对浓度及患者初始源细胞的质量/数量。在本发明的一个实施方案中，为了在这些变量下优化MSC生长，本文提出了“生长通道”的概念，其含义即是，相对于一个预定的时间段和/或细胞传代次数(对于最佳生长条件来说不超过10次)患者细胞的目标扩增速率。这种生长通道考虑了所有产生一个特异的均一的细胞群落所需要的必需细胞培养条件。
在本发明的一个实施方式中，目标MSC离体培养扩增需要的血小板裂解物的量与可见参数相结合，从而确定最佳生长条件。特别是，这一实施方式要求上述血小板裂解物条件应当与收集的MSC集落形成及MSC单层培养扩增要求相结合。一方面，在集落形成过程中必须防止MSC过度生长，也就是说，必须防止出现封闭集落的集落边缘细胞。另一方面，在集落形成过程中必须防止MSC生长不足，也就是说，细胞不增殖。如果MSC在集落形成过程中过度生长，必须从集落形成培养物中将其去除并置于单层培养中，如果MSC在集落形成过程中生长不足，就应当去除部分培养基(大约一半)并加入新鲜培养基(加入之前使用的血小板裂解物浓度)。另一方面，对单层扩增中的细胞必须进行观察，看其是否出现过度生长，即高密度和高接种密度如10,000-12,000个细胞/cm2，或是否出现生长不足，即细胞形态为圆形、旗形或细胞膨胀等。当细胞出现这种形态时血小板裂解物浓度应当增加至至少10-15％。
更详细地说，本文所提及的细胞生长最大扩增速率与最大修复能力的“生长通道”包含以下四个不同的方面：
1.单层培养中的细胞生长速率；
2.单层培养中的细胞密度；
3.单层培养中的细胞培养模式；和
4.单层培养中的细胞形态。
这些概念在图1的图表中亦有解释。
“单层培养中的细胞生长速率”-由于血小板裂解物含有因患者不同而水平各异的生长因子，因而直到能确定生长因子对培养扩增速率的影响作用时才有方法确定其生物活性。因此，在“生长通道”内扩增的一个关键因素就是最小生长速率。将其定义为，调整血小板裂解物浓度参数和/或接种密度直至倍增时间为1-3天。这将使细胞在进行第5至第7次传代前数量增加大约50-100倍(见图1图表1)。也正如图1(图表2)所示，这是生长通道起始于两侧10cc骨髓抽取物(仅用于图解所述目的)的一个例子。从上述生长通道的偏离将需要实施图1图表1所描述及相关说明中的细胞培养行为。
“单层培养中的细胞密度”-细胞密度可影响细胞生长与分化能力。Doucet(上文引用)描述了一个大约每毫升几千个细胞的低接种密度(在其它健康的对照中)。但是，我们已经发现，患有诸如骨关节炎、AVN及错位骨折的患者需要更高的接种密度，而且在传代中保持高接种密度对产生具有修复能力的扩增细胞十分重要。因而，图1图表3就显示了本发明一个实施方案的可接受的细胞汇合通道(优化细胞的体内修复能力)。本发明所述的MSC空间分布可通过下列方程进行定量分析：表面积*(％汇合)/细胞数目。该图的范围应当为18-23。如果该值＜18，那么细胞可以低密度接种，因为细胞长势格外好。如果这一值落于23-27之间，就应该以更高密度接种(从12×103个细胞/cm2到15×103个细胞/cm2)。如果这个值＞27，那么就应当增加血小板裂解物浓度。
单层培养中的细胞培养模式-本发明中细胞生长模式十分重要，因为细胞之间均匀分布的距离就有利于促进连续扩增并使细胞保持未分化状态。为了保证这一点，均匀分布的MSC是本文所述生长通道的部分。在图1图表4中有进一步说明。任何从上述细胞培养模式的偏离将会要图1图表4及其他相关说明中所述的细胞培养行为进行矫正。
单层培养中的细胞形态：单层培养中的细胞形态对于本发明涉及的特异MSC表型十分重要。由于它只适用于间质干细胞，最佳形态为单层培养中呈纺锤形(成纤维细胞)。应当注意的是，其它间质干细胞系常常表现出多角或旗形形态，这一形态不属于所述生长通道的表型。注意：已经针对本发明的目的建立了一个分类系统，其中包括1-4型，与本发明有关的最佳细胞类型为I型。关于这点在图1图表5中有更详细的说明。需要注意的一点是，2-4级显示在图1的图表5中，选自以前的文献，引文的每位作者都认为这些是他们的MSC所能接受的形态。另外，处于所述生长通道内的优选形态为纺锤形，其细胞表面积小，不像2-4型中的MSC，其表面积比最佳1型的大50％。一旦培养物有＞30％的2-4型MSC，就应当将血小板裂解物浓度从10％增至15-20％。细胞群落应当在这个点上进行移植，以避免发生从理想形态的潜在偏离。
从上述细胞形态通道的任何偏离将需要图1图表5及相关说明中所述的细胞培养行为进行矫正。
在一个实施方案中，生长通道表示自体MSC在离体培养物中的生长特征，这一特征可保证获得1000万到1亿个细胞植入靶位点，例如膝关节。扩增细胞的数目一定程度上取决于需要再生的靶位点，例如椎间盘的再生需要大约每毫升100万到1000万个细胞，而膝关节表面需要的细胞数目则为每毫升数千万个到数亿个细胞。对收集的细胞进行监测，一般通过运用不同浓度的血小板裂解物来调整其生长。
本发明离体扩增的MSC生长可通过细胞计数和/或可见细胞参数进行监测。细胞计数技术建立的基础在于，当细胞数量超过那些细胞的容纳的空间/密度时，从组织培养容器或培养基中收集细胞并进行传代。细胞计数技术必须由一名熟练技工现场进行，这名技工可收集细胞并从计数小室装置如血球计数器或光谱图计数器中获取细胞数目。正如本发明其他地方所述，细胞计数亦可通过因特网向经验丰富技工远距离传递数字图像而进行。
如上文所述，本文公开的可见细胞培养参数包括观察本发明细胞形态，确定收集细胞和传代的难易度。可见参数包括细胞培养形态、细胞培养模式和细胞培养密度。特别是，下列特定的定量参数可被考察：集落形成过度生长、集落形成生长不足、单层扩增培养物过度生长、单层扩增培养生长不足、血球计数器中血小板图像和干细胞数目、抽取骨髓后首次接种的粘附细胞数、确定收集时间的集落形成到产生集落(包括生长过度与生长不足)、细胞接到培养瓶后分布的均匀度(即在单层扩增期间细胞应均匀分布于培养瓶中)、接种密度、确定何时该进行细胞传代的汇合时期和可见细胞分裂、细胞形成集落时培养瓶表现出的血液类似性、通过旋转离心获得血小板后血液组织的分离特性、离心后从红细胞分离有核细胞后骨髓分离物的形态(即膨胀的亮球状、分散排列)。
目标培养物的可见观察可由组织培养熟练技工现场进行，亦可通过数字显微摄像技术远距离进行(现场录像)，或者通过本文所述的生长通道运行期间用数字显微摄像机拍摄的更新图像进行。当需要更多地有限控制多细胞培养部位时可进行远距离细胞培养的监测。例如，从大量远距离培养物中由一位训练有素的专家提供可见数据。专家将获得某种可见参数是否有效的信息，例如，特定细胞密度、培养模式或细胞形态，这些信息对膝关节再生、稳定非血管性坏死、愈合错位骨折等等提供了良好的临床效果。然后专家会知道如何将培养形态与所有此类培养物联系起来(可是即使大量的现场工作人员花费数月乃至数年时间也做不了这种关联性分析)。在一个实施方案中，具有均一的、非过度生长等细胞培养形态的细胞将被认为是最佳状态细胞，处于生长通道内，因而易被收集与传代。
本发明的血小板裂解组合物包括大量已知细胞分裂必要的生长因子，其中包括：hFGF、PDGF-BB、TGF-β和VEGF。将血小板裂解组合物加入无血清生长培养基使得培养基中含有目标数量的裂解物，例如，10％血小板裂解物包含10％体积的血小板组合物。在优选实施方案中无血清基础培养基为DMEM、Hams F12、MEM或其他类似培养基。生长因子的有效量与患者血小板裂解物有关，并将随着患者不同而变化。
在典型的实施方案中，患者细胞最初培养在含10％血小板裂解物的培养基中孵育7-10天，形成集落，然后重新计数(集落形成)。如果患者有骨关节炎，将细胞转至单层培养中用初始弄度为10％的血小板裂解物培养。细胞生长2-4天，将其与特定患者治疗程序所需要的细胞总数作比较。在某些实施方案中，细胞可进行可见参数考察。上述不在生长通道内的细胞将改变其培养基，增加血小板裂解物浓度(例如15-20％)，而处于生长通道内的细胞将被继续培养至少2-4天，然后再重复以上步骤。依赖于生长通道条件的其他细胞培养行为包括以更低或更高密度再次接种、更频繁或更少更换培养基或者更迟或更早移植细胞。注意：可见参数亦可被用于确定细胞是否处于生长通道内(见上文)。
注意：MSC扩增速率的可变性取决于患者收集的MSC和患者血小板内生长因子的水平。因此，在某些情况下，需要更高水平的血小板裂解物来维持MSC处于生长通道内，这不仅因为细胞生长特征，而且因为需要更多的血小板裂解物提供所需水平的生长因子，也就是说，与其他血小板裂解物相比，患者的血小板裂解物可具有低浓度生长因子，亦可含有低浓度生长因子。令人惊奇的是，本发明发明人已经确定，与同样数量在非最佳条件(非生长通道)(例如需要15次传代的细胞培养物具有足够的数量实施需要的治疗效果)得到生长的细胞相比，在最佳生长条件下生长的细胞可获得更佳的疗效。例如，发明人发现，与运用本文所述生长通道方法在最佳条件下生长的细胞相比，运用10cc两侧PSIS骨髓抽取物(总共20cc骨髓)在非最佳扩增条件下生长的细胞产生的临床疗效更差(MRI未见或极少见明显的软骨再生，未见或极少见弯月面再生)。
自体MSC置换的方法
本文所述实施方案包括有需要的患者部位进行恢复性治疗的方法。例如，需要治疗的退化性椎间盘或关节软骨的治疗恢复其他实施方案包括MSC扩增的应用：心肌再生、皮肤创面愈合、骨折或骨错位愈合、神经修复、宿主移植治疗及其他免疫应用和其他应用，置换胰岛细胞、治疗骨质疏松、治疗听力丧失及其他用途。本文所述的方法利用自体MSC进行恢复性治疗，其中MSC用天然(非合成/非重组)生长因子(典型地通过在不同浓度血小板裂解物下培养而获得)处理。
最初，MSC来源从一位需要干细胞治疗恢复患者体内收集而获得。获得的MSC源保持在无菌环境中，并在无菌条件下进行整个操作过程。如上文所述，收集的细胞接种并在维持细胞在生长通道内的条件下离体培养这是本发明的实施方案(MSC分离自上述MSC来源)。这就要求血小板裂解物应由患者按上述实施例1方法制备而获得。对在最佳扩增条件下生长的自体MSC进行监测，准备在细胞进行第10次传代前实施移植术。细胞目标产量为1千万-1亿个细胞(靶位点的细胞总数可被鉴定，见上文)。在某些实施方案中，自体MSC在进行第5次传代前开始培养并检测其是否适合移植，其细胞目标产量为1-4千万个细胞。在其他实施方案中，自体MSC在进行第6、7、8或9次传代前开始培养并检测其是否适合移植，其细胞目标产量为1-4千万个细胞。随后将制备的MSC组合物植入靶位点，并监测在接下来的几个月中细胞的治疗效果。这一过程是否需要重复取决于想要的疗效。已经在导致在4-7次传代中产生1-4千万个细胞的条件下经过处理的细胞为最适于移植的细胞，可移植于需要移植患者的靶位点。
尤其是，在某些实施方案中，本发明还包括用在最初集落形成和附着培养中分离的骨髓有核细胞接种红细胞的方法。由于红细胞同样含有生长因子，这将进一步丰富细胞生长的环境，并对分离的MSC具有其他分化效应。
注意：此法的实施方案用自体细胞和生长因子进行，故避免了许多在其他非自体MSC置换治疗中出现的免疫感染问题。由于最近研究证明，非自体MSC活化宿主的自然杀伤细胞系统，故本发明在这点上具有显著的优势。Spaggiari等，Blood，2006107(4)：1484-90；Rasmusson等，Transpantation，2003  76(8)：1208-13。这些实施方案还对移植细胞在靶位点的扩增及分化为所需细胞(关节表面的软骨细胞、骨缺损中的成骨细胞等)的潜能进行了优化。如下一个实施方案所述，血小板组合物(或者血小板本身)可通过注射植入靶位点，同时或随后进入MSC移植程序。
运用本文所述的细胞生长实施方案，制备可用于目标患者的最佳生长细胞。根据本文所述的方法生长的细胞用FACS进行分析，确定细胞表型，即，确定细胞表面抗原。本发明的一方面，筛选细胞群落并扩增，使其至少表达下列一种或更多种表面抗原：CD29、CD44、CD59、CD73，、CD90、CD105和CD166。注意：上述阳性结果为至少有90％待测细胞通过鉴定表达特定细胞表面抗原FACS分析表现为阳性。
在典型的实施方案中，相似细胞群落对至少两种下列细胞表面抗原为阳性：CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105和CD166。在更多的典型实施方案中，细胞群落对至少三种下列表面抗原为阳性：CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105和CD166。在甚至更多的实施方案中，细胞群落对至少四种下列表面抗原为阳性：CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105和CD166。在甚至更多的实施方案中，细胞群落对至少五种下列表面抗原为阳性：CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105和CD166。最后，在某些实施方案中本文所述的细胞群落对CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、和CD105中的六种或七种细胞表面抗原为阳性。本文的实施方案显示，具有潜在表达这些细胞表面抗原能力的细胞最适合用于治疗。此外，本文的实施方案显示，细胞群落含有上述细胞表面抗原，但却缺乏下列至少一种抗原：CD14、CD31、CD45和CD106。在其他实施方案中细胞群落具有上述表面抗原但缺乏下列至少两种或更多种抗原：CD14、CD31、CD45和CD106。在其他实施方案中细胞群落为阳性，表达CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105和CD166等表面抗原，但不表达CD14、CD31、CD45和CD106。
直接向靶位点注射血小板
在本发明的某些实施方案中，血小板组合物被直接注射进入患者靶位点。血小板注射可在MSC置换术、联用MSC置换术(同时)之前或有助于优化MSC生长环境的MSC置换后进行。在典型的实施方案中，用本发明的血小板裂解物培养基和生长通道条件扩增的MSC被收集(当时仍处于生长生长通道内)，并与自体血小板或血小板裂解物一起被注射入靶位点。
为了确定需要直接向靶位点注射的血小板的数目，可进行下列运算。首先需要确定维持最大离体MSC生长速率所需要的平均血小板数/cc。例如，如果患者细胞显示需要10％血小板裂解物培养3天，20％裂解物培养3天和30％裂解物培养3天，运用最高的血小板裂解物浓度确定靶位点需要补充血小板的数目。每天每cc血小板的最大利用率在该实施例中为30％(三天)。如果每cc血小板的起始体积为1.0×109，那么需要的条件为，在这个时间段3天内每cc体积消耗3×108个血小板，或每天每cc消耗1×108个血小板。
Marineau等，Biomaterials，200425(18)：p 4489-502(并入本文参考文献)提供通过血小板生长因子释放促进体内MSC生长所需要的凝血酶与钙水平检测方法。这是促进组织生长和血管生成的第一周自然发生的事件。从这些研究可以推测，血小板一经凝血酶和钙经7天培养活化就会释放大多数生长因子。因此，每天每cc 1×108个血小板被扩增7倍，每cc最终需要量为7×108个血小板。患者的最终注射体积被加入初始关节滑液容积(IFJV)，获得最终关节滑液容积(FFJV)。因此，运用上述运算，每cc 7×108个血小板被扩增12.5倍，产生8.75×109个血小板。这个数目表示最终血小板剂量(见公式1)：
(维持MSC生长的每cc消耗的平均血小板数/培养基更换之前维持这个水平的天数)×(培养基更换之前需要维持这个水平的天数(7)(最终关节滑液容积))＝PHC血小板剂量。(公式(I))。
或者，这种补充可用血小板裂解物等同物进行，直至促进扩增、调整关节容积和更频繁补充所需的最高离体血小板裂解物百分比浓度。
MSC移植的位点监测
本文所述的移植细胞可被监测，以保证这些细胞在体内存活，并最终使这些细胞分化为需要的细胞类型，获得所需的修复。在一个实施方案中，进行MRI标记实现患者靶位点的无创监测(但是，注意这一程序需要磁性粒子，且只提供细胞定位、细胞扩增或分化状态等信息)。
因此优选实施实时细胞检测。移植了优化扩增的细胞后，从植入位点进行经皮液体洗涤。获得自由漂浮细胞和最小粘附MSC后进行MSC(如果有)计数、细胞类型、分化状态及形态等分析，以及MSC增殖状态的分析。关节洗涤亦可进行监测或分析关键物质如粘多糖表达、主要蛋白、基因表达或其它表明关节微环境改善的重要化学物质或遗传标记。
可进行两种类型的实时监测：靶位点滑液随机取样和/或位点滑液的高压“敲除”。运用针或导管(典型相当于14-22注射器(gauge))进行高压敲除，其中高压液体从敲除最少的粘附MSC处流下。
或者，亦可用针形关节镜或者传统关节镜获得组织样品进行分析。
在MSC被移植之前(形成一个与后续样品作比较的样品)于基底处进行经皮取样。取样亦可在MSC植入靶位点后1周、可能2周及可能3周进行。
特别是，移植后一周时，进行关节洗涤或者组织取样，进行观察分析。尽管可以认为，细胞群落可离体很容易检查，并无需体内取样即可被调整为生长培养基，但是在体内却无法进行同样的必需调整保证体内生长和移植。然而，在实时监测的基础上，靶位点群落和/或血小板裂解物浓度补充的改变却能实施。这个程序是否需要重复因需要而定。此外，可向靶位点植入额外的自体培养MSC。
最后，一旦确定移植MSC存活且能增殖或者关节微环境适于细胞存活和移植，即可给靶位点加入分化促进剂。此外，经实时监测获得的细胞可在不同分化促进剂存在条件下培养，以确定哪一种最适合获得要求疗效。代表性的促进剂包括成骨蛋白2、地塞米松、透明质酸及类似物。此外，炎症细胞在实时监测中恢复时，可在处理中加入抗炎药物，在发生脱水部位加入透明质酸。
此外，运用试验方法可监测细胞移植后体内状况，看是否发生继发性组织再生效应如产生粘多糖(GAG)、已知退化性酶及其他因子水平降低。本发明这一部分的重点在于移植后对细胞的直接或间接监测。而且，这使我们能获得移植后的实时变化信息，确保细胞存活及移植成功和分化功能正常。作为一个代表性的例子，MSC一旦分化为早期软骨细胞即可进行GAG产生监测，保证其功能完全，使其分化为成熟的健康的软骨细胞生物等效物。此外，某些促进分化的或补充的物质可能监测的被导入关节，以便增强被监测的GAG产生。同样的例子亦能适用于组织再生的其他区域，例如体内由MSC分化为胰岛细胞过程中胰岛细胞的置换和胰岛素合成的监测。
治疗应用
本发明的方法和组合物可用于治疗，也就是说，修复和维持需要MSC的患者的靶组织。可用本文所述的实施方案治疗的疾病包括骨关节炎、退行性椎间盘病，固定骨骼非血管性坏死部位、愈合骨折或骨错位、心肌再生、连接修复、皮肤创面愈合、神经修复、免疫抑制或调节的细胞治疗、β-胰岛细胞置换、听力细胞与结构的置换、治疗骨质疏松、和其他功能紊乱症，在这些情况下MSC可分化为可修复并置换受损、缺失或退化的细胞。
实施例
下列例子旨在解释而非专门限制本发明的范围。
实施例1：与生长通道相关的患者MSC生长通道
从患者后髋嵴处收集有核细胞，并用离心法从RBC中分离(血清呈浓度梯度)。
从靶患者处收集大约10ml骨髓，再转至细胞培养实验室的15ml离心管中。骨髓样品以100g离心2-3分钟。检查RBC沉淀，确保这批RBC中半数样品生长缓慢，且清晰区位于RBC沉淀与顶部级分区之间。注意，如果顶部级分不到总体积的40-50％，需要重复离心操作。又然后去掉顶部级分区置于15ml离心管中，以1000g离心10分钟。注意，有核细胞沉淀可能呈现红色，也许是包装松散所致，这取决于所存在RBC的数目。去掉血清上清，重新加入RBC沉淀中。用1ml盐溶液重悬有核细胞沉淀。重复上述步骤直至获得另外的有核细胞。
按1∶20用水稀释细胞悬液后(裂解RBC)进行有核细胞的计数。用1∶2000稀释液对RBC进行计数。
然后接种有核细胞进行单层培养。每cm2接种约0.66-1.25×106个有核细胞和0.16×109RBC(用来自RBC悬液的细胞将RBC补加到有核细胞悬液中)。将组合的细胞混合液以1000g离心10分钟，再用DMEM+Cipro+肝素+10％血小板裂解物(10％被选作初始剂量，这是基于Doucet所述的5％裂解物可使细胞扩增处于明显的次级优化状态这一事实)重悬。然后将细胞悬液于37℃保温30分钟。将保温的细胞悬液平铺于一个大小合适的组织培养瓶中，加入新鲜培养基。细胞培养物在5％二氧化碳、37℃孵育7-12天。
如图1所示，来自八位患者MSC的生长在上述条件下进行，并作细胞数目对天数的生长功能曲线图。一个可接受的生长通道已经与细胞数目扩增相重叠。在第7天，Gi细胞数量充足，最适于移植，第8天时，St细胞充足，适于移植，第10天时，Cl细胞充足，适于移植。所有其他细胞均未在可接受的生长速率内，需要增加培养基中血小板裂解物的浓度，保证最佳生长状态。
实施例2：患者MSC生长依赖于患者健康状况
从患有骨关节炎的个体收集MSC，按照实施例1所述使其生长。每位患者细胞的生长速率和整体产率均得到测定。
收集的MSC在不同含量血小板裂解物(5-10％)中生长，并对11天的过程作图(500％患者原血小板浓度，并通过冷冻法裂解)。图2中的图表数据显示，MSC产率和生长速率发生了显著变化。本实施例说明不同患者间细胞生长存在差异，需要优化MSC生长速率。
实施例3：在优化MSC生长条件下，5％血小板裂解物无效。
如实施例1所述，从骨关节炎患者收集的MSC(缓慢生长MSC)，用5％血小板裂解物、10％血小板裂解物或20％血小板裂解物进行MSC扩增。如图3A-E所示，与生长在10-20％裂解物中的细胞比较，许多用5％血小板裂解物生长的细胞系不能表现出最大扩增速率。注意，对于大多数在20％裂解物下生长的细胞系与10％裂解物相比只表现出最小的扩增优势。然而，必须强调的是，我们的实验数据显示，OA患者的扩增速率变化极大，有几位患者能在5％裂解物条件下达到生长通道要求，大多数为10％，还有一些患者需要20％裂解物。此外，患有其他疾病如非血管性股骨头坏死的患者细胞在甚至10％裂解物存在时都不扩增，需要作多重的变动，由实验规程决定(看下文实施例)。
图4进一步说明，从骨关节炎患者收集的MSC通常需要高浓度血小板裂解物(10％+)才能获得最佳扩增状态。但是，健康个体的MSC具有正常的生长，在5％或10％血小板裂解物下很少表现出变化。
本实施例中的数据表明，Doucet等所述的条件在骨关节炎患者收集的细胞条件下不产生最佳扩增状态。需要更高浓度裂解物表现出最佳扩增状态。
然而，在细胞收集为快速生长型细胞条件下，细胞可在5或10％血小板裂解物条件下生长。
实施例4：5位患者的图示生长通道
5位患者捐献MSC并按实施例1中收集方法收集。用不同的裂解物浓度使细胞生长，并计算细胞数目。细胞生长数据如图5所示，本发明的生长通道被重叠。在细胞生长通道参数内能够扩增的细胞被认为是最适于且已准备好用于临床目标者，可是5位患者的细胞生长产率很低，临床治疗成功率也最小。因此，基于调节细胞生长条件的血小板裂解物应当用于在所述的生长通道内获得细胞生长。此外，基于细胞密度的已经介绍的细胞培养决定因素细胞培养模式和形态也需要得到应用。
实施例5：细胞在生长通道参数内生长时MSC表达细胞表面抗原
收集MSC并用本文实施方案所述和实施例1和实施例2中所述的方法扩增细胞，为了确定培养细胞的表型，将其与荧光标记单克隆抗体(mAbs)一起孵育，该单抗为针对已知细胞表面抗原的单抗(表1和表2列出了所用的MAbs)。
用FACSCalifur流式细胞仪对来自2位受试者培养细胞的细胞表面抗原表达水平进行分析。结果见表1和表2。
表1：
表2：
Figure GPA00001045616700231
表1显示每个靶细胞表面抗原的平均荧光强度(MFI)。表2列出了每个细胞表面抗原的阳性百分率值。如表2所示，对于移植入目标患者而优化的细胞有大于99％的表达CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105和CD166。相反地，很少有细胞表达CD14、CD31、CD45和CD106，而一般认为这些表面抗原不出现在具有最佳移植能力的细胞表面。
实施例6：运用本文实施方案进行的MSC移植提供体内软骨细胞 置换
从一位57岁需要进行软骨置换纠正膝关节缺损的患者获得一份骨髓样品。收集骨髓，然后用实施例1所述的方法分离MSC。细胞生长在10-20％血小板裂解物上，经过6次传代获得了1000万个细胞。将细胞维持在本发明的生长通道内。然后用自体MSC将细胞植入靶位点。
图6(A与B)显示矢状面快速自旋质子密度3.0T MRI图像。图A显示一侧股骨骨节后方承重面的软骨缺损。39天后重新拍摄图像，发现软骨缺损已经被填充(如图6B所示)。本实施例的数据显示，运用本文所述的方法和组合物可有效纠正靶位点的软骨缺损。
实施例7：更高水平血小板裂解物的时机可通过增加细胞生长动力 使生长缓慢型MSC符合生长通道目标
下列实施例说明，在离体扩增期间改变血小板裂解物浓度会极大改善MSC产率。20％血小板裂解物浓度(“裂解物激发剂(boost)”)用于在细胞突出于集落形成结构表面时细胞的初始扩增。对4位患者的细胞群落进行了测试，分别用符号Re、Gi、Ve和Ca。对生长条件进行监测，结果如表3和图7所示。
在表3列出的4位患者中，注意对于Gi和Ve，其MSC在每一次传代的生长期数目成倍增加，生长状况得到了明显改善。对于受试者Gi，当运用20％的裂解物激发剂时，每次传代的细胞数增加倍数总和从9.74增至12.96。对于Re这个数值则从6.88几乎翻倍增至10.34。需要注意的是，两位患者均在用MSC进行靶位皮肤表观和再生性治疗(均被诊断患有骨关节炎(OA)，年龄分别为50多岁和60多岁)。对于年轻的受试者Ve(无已知的OA)，每一次传代的细胞增加倍数总数只是稍有改善(5.0到5.7)。在最年长的70多岁并有重度多关节OA的受试者中，其测定值也只有中等程度的改善(5.08到5.13)。
由于4位受试者中有两位有明显的产率改善，其他两位产率未见降低，只是稍有改善，提示本文所述方法和组合物可有效改善需要进行再生治疗的OA患者试验组的MSC产率。
实施例8：需要MSC移植的患者的细胞生长条件
从患有非血管性坏死的44岁白人女性患者提取10cc PSIS骨髓抽取物，将其细胞按本发明的方法进行处理。她的有核细胞产率很低，用10％裂解物生长于单层培养中，但是传代两次以上时就不再扩增了。重新召回该患者，对骨髓抽取技术做了改进，从其左右侧PSIS取3小份骨髓，然后当其还处在集落形成阶段时用20％裂解物激发细胞，再放在20％裂解物中生长。图8显示两次细胞扩增图，从中可看出，许多患有这种疾病的患者需要改进骨髓抽取技术来改善有核细胞计数，还需要集落形成期间的裂解物激发剂和单层培养扩增期加入更高浓度的血小板裂解物。
实施例9：本发明细胞的直接注射
伴有9个月之久的肱骨骨折的37岁白人女性患者曾用开放减压与外部固定术和骨刺激剂治疗。这种骨折表现出明显的错位，如图10a所示。从患者PSIS提取100cc骨髓抽取物，其MSC分离后在10％血小板裂解物中生藏。随后，将这些细胞在荧光显微镜导引下通过一根无菌套管针经皮植入骨折错位部位。图10b显示注射细胞后5周错位部位明显愈合。该实施例说明用本发明技术进行扩增的MSC在体内具有骨生成能力。
实施例10：膝关节软骨置换
患有重度膝盖中腔退行性疾病的43岁白人男性患者表现出中前弯月面明显有退行性病变。图11A显示3.0T质子密度矢状面MRI图像，其中明显退化的中部弯月面几乎从前方全部缺损。图11B为经皮植入MSC后3个月的图片，该MSC按照本文所述的生长通道方法获得并进行了扩增。图11B显示弯月面的再生以及后续的3-D图像容积分析结果，可看出弯月面容积增加了32.5％。注意，弯月面再生发生在弯月面内部，即众所周知的“白”或“非血管”区。因为进行了这一移植术，血管被引入了这一区域。这是该特异细胞系所具有的性质，或极有可能是由于血小板裂解物注射在细胞移植后赋予关节的特性。例如，众所周知，血小板裂解物具有显著的VEGF水平，可引起新血管生成。
表3：每次传代时细胞生长的增加倍数
尽管已参考许多实施方案对本发明进行了特别地描述，但本领域技术人员能够理解对于本文所公开的实施方案的形式和细节可以进行变化而不离开本发明的范围和主旨，并且本文所公开的各种实施方案并不为了作为对本发明权利要求的限制。
本文含有许多对专利、专利申请和出版物的引用，通过参照将它们均并入本文。

Claims (32)

1.用MSC移植治疗患者的方法，该方法包括：
从患者获得MSC；
从患者获得血小板；
从患者的血小板制备血小板裂解物，其中制备含有一定量患者的血小板裂解物的生长培养基；
用所述生长培养基扩增MSC；以及
在有此需要的部位，将扩增的自体MSC植入患者。
2.权利要求1的方法，其还包括在移植扩增的MSC后，对患者的靶部位进行体内监测。
3.权利要求1的方法，其还包括在移植扩增的自体MSC的过程中或之后，将血小板或血小板裂解物直接注射到患者的靶修复位点，以进一步促进MSC扩增。
4.权利要求1的方法，其中所述含有血小板裂解物的培养基包含5体积％到30体积％的血小板裂解物。
5.权利要求1的方法，其中所述MSC被扩增以在离体第十次传代之前具有最佳生长。
6.权利要求5的方法，其中所述MSC被扩增以在离体第七次传代之前具有最佳生长。
7.权利要求1的方法，其中所述有此需要的部位为退化的椎间盘。
8.权利要求1的方法，其中所述有此需要的部位为心肌。
9.权利要求1的方法，其中所述有此需要的部位为天然神经元。
10.权利要求1的方法，其中所述有此需要的部位为退化的关节。
11.权利要求3的方法，其中通过最大化离体MSC扩增所需的裂解物浓度测定所注射血小板或裂解物的浓度。
12.权利要求1的方法，其中所述患者是已经被诊断患有骨关节炎的患者。
13.用于离体扩增MSC的细胞培养基，其包含基础培养基和大约5％～大约30％的血小板裂解物。
14.权利要求13的细胞培养基，其中所述血小板裂解物为大约10％～大约20％。
15.权利要求13的细胞培养基，其中所述血小板裂解物对于MSC是自体的。
16.权利要求13的细胞培养基，其中在MSC扩增期间中的某些时候，使用更高浓度的裂解物以使产率最大化。
17.用于扩增细胞的生长通道，其中所述细胞可用于植入患者，所述生长通道包括某些参数，用于保证患者的细胞在从患者取出后的十次传代内可以被扩增并移植，其中一个参数是用于扩增细胞的血小板裂解物的水平。
18.权利要求1的方法，其中非自体供体提供MSC和血小板裂解物用于扩增。
19.生长通道，其用于MSC扩增以优化扩增产率。
20.权利要求2的方法，其中从体内监测获得的数据被用于调整体内补充，以优化位点的修复。
21.分离的人MSC群，其包含已经就下列细胞表面抗原进行富集的细胞：CD29、CD44和CD59。
22.权利要求21的分离的人MSC群，其中所述细胞还包括CD73。
23.权利要求21的分离的人MSC群，其中所述细胞还包括CD73和CD90。
24.权利要求21的分离的人MSC群，其中所述细胞还包括CD73、CD90和CD105。
25.权利要求21的分离的人MSC群，其中所述细胞还包括CD73、CD90、CD105和CD166。
26.权利要求17的方法，其中所述参数为细胞培养接种密度、更换培养基前的细胞培养时间、细胞形态和细胞生长模式。
27.权利要求1的方法，其中用于治疗退化区的MSC的剂量为100万到1亿个细胞。
28.权利要求1的方法，其中所述骨髓抽取技术包括提取多份1-10ml抽取物，以激发MSC产率。
29.权利要求1的方法，其中红细胞用于初始集落形成培养，以改善本文所述的特异性MSC表型的附着和集落形成。
30.权利要求2的方法，其中所述体内监测包括通过外科手术、关节镜和/或经皮途径直接观察正被处理的区域。
31.权利要求2的方法，其中所述体内监测包括取出粘附和非粘附细胞，用于离体观察。
32.权利要求2的方法，其中所述体内监测包括次生化学物质或细胞产物如粘多糖、酶、蛋白质、肽、多肽和脂类的检验。
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