ES2957410T3 - Células madre derivadas de tejido adiposo marrón humano y sus utilizaciones - Google Patents

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Abstract

Una construcción implantable que comprende un andamio. En una realización, la construcción implantable comprende una célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano derivada de una célula madre de tejido adiposo marrón neonatal humano aislada; en el que la célula madre de tejido adiposo pardo neonatal humano aislada se cultiva en un medio de cultivo que comprende la proteína 5 que contiene el dominio de fibronectina tipo III (FNDC5) y se diferencia en la célula diferenciada de adiposo pardo neonatal humano; y en el que la expresión de los genes UCP-1, ELOVL3 y PGC1A está regulada positivamente en la célula diferenciada del tejido adiposo marrón neonatal humano. En otra realización, la construcción implantable comprende una célula madre de tejido adiposo marrón neonatal humano aislada cultivada en el armazón; en el que la célula madre de tejido adiposo pardo neonatal humano aislada se cultiva en un medio de cultivo y se diferencia en una célula diferenciada de tejido adiposo pardo neonatal humano.

Description

DESCRIPCIÓN
Células madre derivadas de tejido adiposo marrón humano y sus utilizaciones
SOLICITUDES AFINES
Esta solicitud reclama prioridad de las solicitudes provisionales de EE.UU. 61/906,087 y 61/813,771, presentadas el 19 de noviembre de 2013 y el 19 de abril de 2013, respectivamente.
CAMPO DE LA INVENCION
La invención se relaciona en general con el campo del cultivo celular y más específicamente con el campo de la determinación del tipo celular, y en particular con constructos implantables que comprenden una estructura y una célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano derivada de una célula madre aislada de tejido adiposo marrón neonatal humano o una célula madre aislada de tejido adiposo marrón neonatal humano cultivada en la estructura.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El tejido adiposo marrón (TAM) desempeña un papel clave en los mecanismos evolutivamente conservados que subyacen en la homeostasis energética de los mamíferos. Se caracteriza por vacuolas de grasa de 5-10 micras de diámetro y la expresión de la proteína desacoplante 1 (UCP1), fundamental para la regulación de la termogénesis. En los recién nacidos humanos, los depósitos de TAM típicamente se agrupan alrededor de la vasculatura y los órganos sólidos. Estos depósitos mantienen la temperatura corporal durante la exposición al frío al calentar la sangre antes de distribuirla hacia la periferia. También garantizan una temperatura óptima para las reacciones bioquímicas dentro de los órganos sólidos. Se pensaba que el TAM involucionaba a lo largo de la infancia y la adolescencia. Sin embargo, estudios recientes han confirmado la presencia de tejido adiposo marrón activo en humanos adultos, con depósitos que residen en regiones cervicales, supraclaviculares, mediastínicas, paravertebrales y/o suprarrenales, por ejemplo. Además, también se ha informado que el TAM, también llamado grasa beige, puede encontrarse dentro del tejido adiposo blanco (TAB).
PATEL AMIT N Y COLS, “población supuesta de células madres derivadas de tejido adiposo asiladas del tejido mediastínico durante la cirugía cardíaca”, TRANSPLANTE CELULAR, vol 22, nr. 3, 2 Abril 2012 (2012-04-02), páginas 507-511, describe una población de líneas de células madre derivadas del tejido adiposo aisladas de tejido adiposo marrón mediastínico y demuestra que estas células expresan CD44, CD105, CD166 y CD90 y son negativas para CD34, CD45 y HLA-DR. Las líneas celulares se obtienen por el revestimiento celular único en placas de 96 pocillos. Se demuestra que las células son capaces de sufrir adipogénesis, osteogénesis y condrogénesis. ARTURO HERNANDEZ Y COLS, “la dexametasona inhibe la actividad de la deiodinasa del tipo 3 inducida por el factor de crecimiento y la expresión mRNA en una línea celular cultivada derivada de la célula del estroma-vascular grasa marrón neonatal de rata”,
ENDOCRINOLOGY, vol. 143, nr.7, 1 julio 2002 (2002-07-01), páginas 2652-2658, ISSN 0013-7227, DOI 10.1210/endo.143.7.8923”, revela una línea celular derivada de células precursoras del estroma, vasculares.
La WO 2009/1564413 A1 describe una población de células madre procedentes de tejido adiposo que son capaces de diferenciarse en diferentes linajes o ascendencias como adipocitos, osteoblastos y miocitos y que pueden ser inducidas a diferenciarse en adipocitos marrones.
M. CIGOLINI Y COL., "Células de tejido adiposo marrón humano en cultivo", EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, vol. 159, n.° 1, 1 de julio de 1985 (1985-07-01), páginas 261-266, ISSN 0014-4827, DOI 10.1016/S0014-4827(85)80056-2, describe el aislamiento de una población de células de tejido adiposo marrón a partir de neonatos humanos.
TIM J SCHULZ Y COLS, “ Identificación de progenitores de adipocito marrón inducible que residen en el músculo esquelético y en la grasa blanca”, vol. 108, nr.1, 4 enero 2022 (2011-01-04), páginas 143-148, DOI 10-1073/PNAS.
1010929108, describe el aislamiento de una población de células progenitoras de adipocitos marrones inducibles. KLEIN J Y COLS, “Líneas de adipocitos inéditas de grasa marrón: un sistema modelo, para el estudio de diferenciación, metabolismo energético y acción de la insulina”, BIOESSAYS, JOHN WILEY & SONS LTD, GB, vol.
24, 1 enero 2002 (2002-01-01), páginas 383-388, ISSN 0265-9247, DOI 10.1002/BIES. 10058, describe una línea celular de tejido adiposo marrón inmortalizado derivada del tejido adiposo marrón de ratones neonatos.
PONTUS BOSTROM Y COL., "Una miocina dependiente de PGC1-a que promueve el desarrollo similar al tejido adiposo marrón en el tejido adiposo blanco y la termogénesis", NATURE, vol. 481, n.° 7382, 1 de enero de 2012 (2012-01-01), páginas 463-468, XP055052526, ISSN 0028-0836, DOI 10.1038/nature.10777, enseña que FNDC5 induce un programa de genes de tejido adiposo marrón y resulta en una mayor expresión de genes específicos del tejido adiposo marrón, como UCP-1, y enseña células derivadas de tejido adiposo adulto.
RESUMEN
La invención se refiere a constructos implantables tal como se reivindica en las reivindicaciones 1 y 5. Además, se describen otros modos de realización en la siguiente descripción y en las reivindicaciones dependientes. En un modo de realización, se aísla una línea de células madre de tejido adiposo marrón humano a partir de un neonato varón de un día de edad. En otro modo de realización, la línea de células madre de tejido adiposo marrón humano aislada expresa marcadores como CREB1, DIO2, IRS1, MAPK14, NRF1, FOXC2, PPARD, PGC1-A, PGC1-B, PRDM16, SRC, UCP1 y WNT5A. En otro modo de realización, las células también expresan niveles más altos de genes de tejido adiposo no blanco como GATA2, KLF2 y KLF3. Incluso en otra configuración, la línea de células madre de tejido adiposo marrón humano aislada es capaz de diferenciarse en osteoblastos, condrocitos y adipocitos. E incluso en otra configuración, la línea se deriva de un neonato varón de un día de edad.
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS FIGURAS
La patente o solicitud de patente contiene al menos una figura realizada en color. Las copias de este patente o solicitud con figuras en color serán proporcionadas por la oficina a solicitud y con el pago correspondiente necesario. Las enseñanzas aquí descritas se comprenderán mejor a partir de la siguiente descripción de varias configuraciones ilustrativas, al ser leídas junto a las figuras. Se debería entender que las figuras descritas a continuación son para fines ilustrativos únicamente y no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas en modo alguno.
Fig. 1 es una tomografía por emisión de positrones (PET) de la captación de 18F-FDG en un adulto;
Fig. 2 (a) es una fotografía de un tejido adiposo mediastínico de un neonato;
Fig. 2(b) es una fotografía del tejido adiposo mediastínico de un adulto de 56 años;
Fig. 2(c) es una fotografía del tejido adiposo mediastínico de un adulto de 80 años;
Fig. 2(d) es una fotomicrografía de una sección del tejido de la Fig.2 (a);
Fig. 2(e) es una fotomicrografía de una sección del tejido de la Fig. 2(b);
Fig. 2(f) es una fotomicrografía de una sección del tejido de la Fig. 2(c);
Fig. 3(a) es una serie de gráficos de citometría de flujo e inmunocitoquímica para marcadores de la superficie celular en células madre derivadas de tejido adiposo marrón neonatal;
Fig. 3(b) es una tabla de comparaciones de niveles de expresión para distintos marcadores de células madre de tejido adiposo marrón neonatal y células madre derivadas de tejido adiposo blanco;
Fig. 3(c) es un perfil de expresión genética para células madre de tejido adiposo marrón neonatal (CMTAM) y células madre derivadas de tejido adiposo blanco (CMDAB);
Fig. 4(a) es una microscopía electrónica de barrido (MEB) de células madre derivadas de tejido adiposo marrón cultivadas en matrices extracelulares porosas;
Fig. 4(b) es una MEB de tejidos adiposos marrones diferenciados direccionalmente;
Fig. 5(a) es un mapa de un primer constructo de transformación utilizado para inmortalizar células madre derivadas de tejido adiposo marrón neonatal;
Fig. 5(b) es un mapa de un segundo constructo de transformación usado para inmortalizar células madre derivadas de tejido adiposo marrón neonatal;
Fig. 5(c) es un mapa de un tercer constructo de transformación usado para inmortalizar células madre derivadas de tejido adiposo marrón neonatal;
Figura 5(d) es un mapa de un cuarto constructo de transformación usado para inmortalizar células madre derivadas de tejido adiposo marrón neonatal;
Figura 5(e) es un mapa de un quinto constructo de transformación usado para inmortalizar células madre derivadas de tejido adiposo marrón neonatal;
Figura 6 es un gráfico de la velocidad de crecimiento celular por pasaje
Fig. 7 es un gráfico de la actividad de la telomerasa para células de control y transfectadas;
Fig.8 es una fotomicrografía de células madre derivadas de tejido adiposo normal transfectadas que muestran morfología celular normal;
Fig.9 es una fotomicrografía de células madre derivadas de tejido adiposo normal que han sufrido adipogénesis; Fig.10 es una fotomicrografía de células madre derivadas de tejido adiposo normal que han sufrido osteogénesis; Fig. 11 es una fotomicrografía de células madre derivadas de tejido adiposo normal que han sufrido condrogénesis; Fig. 12(a) es un gráfico de los niveles de glucosa de ratones trasplantados con células madre derivadas de tejido adiposo normal y controles;
Fig. 12(b) es un gráfico de los pesos de ratones trasplantados con células madre derivadas de tejido adiposo normal y controles; y
Figura 13 es una representación de las etapas para el alto rendimiento de compuestos.
DESCRICIÓN DETALLADA
Se ha aislado una población de células madre de tejido adiposo marrón metabólicamente activas de un neonato masculino recién nacido de un día de vida. La población de células madre, denominada "células madre derivadas de tejido adiposo marrón neonatal" (CMTAM neonatal)), demostró el potencial para: (1) expandirse in vitro; (2) exhibir potencial multi-linaje; y (3) diferenciarse funcionalmente en adipocitos marrones metabólicamente activos. Tal población de células madre podría ofrecer nuevos medios basados en células para restaurar y mejorar la homeostasis energética in vivo para el tratamiento de la obesidad y trastornos metabólicos relacionados. Estas células madre también son una herramienta útil para estudiar la biología del tejido adiposo.
Para identificar una población de células madre en los depósitos de tejido adiposo marrón mediastínico de recién nacido, se generaban muestras de explante y se colocaban en placas de cultivo celular. Las células adherentes se diferenciaban con éxito de los explantes de tejido adiposo marrón, y estos cultivos celulares primarios se suministraban cada 3 días a medios que constaban de glucosa de bajo DMEM, 1xGlutamax, 1xNEAa y 10% de lisado de plaquetas. Para definir una población clonal de células, se diferenciaban líneas celulares mediante revestimiento celular único en placas de 96 pocillos. La confluencia se alcanzaba a los 6 días y las células exhibían una morfología tipo células madres mesenquimales (MSC), tal como se muestra en la figura 8. El tejido adiposo marrón mediastinal de una persona de 56 años de edad y de una persona de 80 años de edad se muestra en las figuras 2b y 2c, respectivamente, para su comparación con el tejido adiposo marrón mediastínico de recién nacido, mostrado en la fig. 2a. El descenso de tejido adiposo marrón es evidente. Las figuras 2d-2f son fotomicrografías de secciones H/E tomadas de los tejidos biopsiados de las figs. 2a-2c, respectivamente.
La cinética de crecimiento de la población celular clonal demostraba que la población se podía propagar durante más de 90 pasos. El cariotipo de la población celular clonal en el paso 7 mostraba células diploides normales sin aberraciones cromosómicas.
Con respecto a las figs. 3(a) y (3b) para caracterizar estas CMTAM neonatales, se ha utilizado citometría de flujo e inmunocitoquímica. Las células CMTAM neonatales demostraron ser capaces de exhibir características similares a otras células madre mesenquimales MSCs pero no idénticas. Por ejemplo, las células CMTAM neonatales dieron valores positivos de CD9, SSEA4, CD44, CD90, CD166, y CD73, pero dieron valores negativos para marcadores hematopoyéticos CD114, CD34 y CD45. Además, las células CMTAM neonatales no expresaron STRO-1, que se había expresado previamente en células madre mesenquimales derivadas de diversos tejidos.
Un análisis de los perfiles de expresión génica de las células CMTAM neonatales en el paso 2 demuestra que las células CMTAM neonatales tienen un perfil de expresión génica distinto, como se muestra en la Fig. 3(c), en comparación con las células madre derivadas de tejido adiposo blanco. Los genes cuya expresión está enriquecida en las células CMTAM neonatales incluyen genes selectivos para el tejido adiposo pro-marrón, como, por ejemplo, CREB1, DIO2, IRS1, MAPK14, NRF1, FOXC2, PPARD, PGC1-A, PGC1-B, PRDM16, SRC, UCP1 y WNT5A. Las células también expresan niveles más altos de genes de tejido adiposo no blanco, como GATA2, KLF2 y KLF3. Es importante destacar que la expresión de estos genes selectivos pro-marrón puede distinguir las células madre derivadas de tejido adiposo marrón de las células madre derivadas de depósitos de tejido adiposo blanco.
Las células CMTAM neonatales del paso 2 eran inducidas para diferenciar los linajes celulares adipogénicos osteo, condro, blanco y marrones, para determinar el potencial multi-linaje. Después de tres semanas de inducción las células mostraban la habilidad para diferenciar en osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Cuando se inducía para diferenciar en condiciones de promoción osteogénica, las células formaban una matriz mineralizada, lo que se confirmaba mediante la tinción roja de alizarina; la tinción o coloración de osteocalcina en la inmunocitoquímica y el análisis RT-PCR de osteopontina, osteonectina y fosfatasa alcalina, confirmaba además la diferenciación. La diferenciación condrogénica se confirmaba mediante la tinción con azul alcián para proteoglicanos sulfatados en pellets celulares inducidos. La RT-PCR confirmaba la expresión del colágeno 2A, biglicano, y A6, que son marcadores de la diferenciación condrogénica. La diferenciación adipogénica blanca era confirmada por la tinción de Oil Red O de gotitas de lípidos. La inmunocitoquímica confirmaba la expresión de FABP4. LPL, y PPAR que son marcadores de diferenciación adipogénica.
La qPCR en tiempo real de las células diferenciadas de tejido adiposo marrón neonatal demostró una regulación positiva de UCP1, la elongación de ácidos grasos de cadena muy larga como ELOVL3, y el receptor activado por el proliferador de peroxisomas y 1-a (PGC1A), un regulador importante de la biogénesis mitocondrial, en comparación con las células no diferenciadas con FNDC5. Por otro lado, la leptina, un gen asociado al desarrollo del tejido adiposo blanco, es regulada negativamente en las células diferenciadas del tejido adiposo marrón. Niveles más altos de expresión de estos genes marcadores de adipocitos marrones son coherentes con un destino de adipocitos marrones maduros. Estos hallazgos demuestran que los depósitos de tejido adiposo marrón de los recién nacidos son una fuente de células madre con propiedades únicas en comparación con las células madre encontradas en los depósitos de tejido adiposo marrón de adultos, depósitos de tejido adiposo subcutáneo y depósitos de tejido adiposo visceral, y tienen la capacidad de diferenciarse en múltiples tipos celulares.
Las CMTAM en general pueden ser cultivadas en constructos tal como se muestra en la fig. 4(a), y por tanto ser manipuladas más fácilmente para su implantación y demás experimentación.
Varias líneas de CMTAM eran inmortalizadas por transfección, aunque no se revele este hecho como parte de la invención. En una configuración se utilizaba una línea de CMTAM150.
Se crearon cinco construcciones de plásmidos diferentes, como se muestra en las Figuras 5(a)-5(e). Estas fueron una construcción de 7286 pares de bases denominada Blas-T, que codifica un promotor EEF1 que impulsa la expresión de TERT, una construcción de 4868 pares de bases denominada Blas-B, que codifica un promotor EEF1 que impulsa la expresión de BMI-1; una construcción de 8348 pares de bases denominada Blas-B-F-T, que codifica un promotor EEF1 que impulsa la expresión tanto de BMI1 como de TERT, una construcción de 8348 pares de bases denominada pBlas-BlT que codifica un promotor EEF1a1 que impulsa la expresión tanto de TERT como de BsrS2, y una construcción de 16,243 pares de bases denominada pUCPI-CPBfT que codifica un promotor EEF1A1 que impulsa la expresión de BMI1 y TERT, y un promotor UCP1 que impulsa la expresión de un gen reportero denominado "cherry picker".
En un modo de realización, la transfección se realizó utilizando Lipofectamine LTX y el reactivo PLUS. En un segundo modo de realización, la transfección se realizó utilizando Fugene HD, Xfect Adult Stem Cell Transfection Reagent y Lipofectamine LTX con el reactivo PLUS, siguiendo el protocolo recomendado por los fabricantes. Se probó cada reactivo en términos de eficiencia. Fugene HD resultó ser el menos tóxico para las células y produjo la mayor eficiencia de transfección para las células primarias BADSC150 con la construcción Blas-BFT que codifica el promotor EEF1 impulsando la expresión de BMI1 y TERT (BMI1-TERT FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento y TERT-BMI1 FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento). Debido a que las dos orientaciones de los polipéptidos de autoprocesamiento funcionarán con eficiencias diferentes dependiendo de la línea celular, ambas formas se probaron en cualquier experimento dado.
En otras configuraciones, que no son parte de la invención, la línea de CMTAM150 era transfectada con la siguiente combinación de constructos enumerada a continuación. Las células transfectadas con el gen de resistencia a la blastocidina se seleccionaban con una concentración de 6ug/ml de blastocidina. Se generaba una línea celular madre derivada de tejido adiposo marrón inmortalizada estable y se analizaba el potencial de diferenciación funcional.
Bajo el control EEF1A1 se disponía de cuatro opciones de resistencia:
pUNO-hpf Higromicina;
pUNO-pur Puromicina;
pUNO-zeo Zeocina; y
pUNO-bla Blasticidina;
Se utilizaban los siguientes sistemas reportero únicos:
*mCherry solo;
*NanoLuc(NL) solo; y
*Nanoluc segregado (sNL) solo.
La siguiente combinación de sistemas reportero también se utilizaba:
CP1-NL FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento;
CP1-sNL FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento;
NL-CP1 FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento; y
sNL-CP1 FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento.
En otras configuraciones, el promotor EEF1 era sustituido por genes específicos pro-marrón (es decir, PRDM16, PGC-1a, C/EBPp, Plac8 y UCP-1) y pro-blanco (es decir, P<p>AR<y>, C/EBPa, y AKT-1) usados con combinaciones diferentes de los sistemas reportero. Todas estas construcciones contienen la expresión conductora del promotor EEF1 de BMI1 y TERT.
Una vez la línea celular BDSC150 era transfectada y seleccionada, se utilizaba para determinar los efectos de los pasos ampliados. El CMTAM150 BML1-TERT FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento (fig. 5(d)) y el TERT-BMI1 FMDV2-polipéptido de autoprocesamiento eran conducidos a p20 (fig. 6) Las células expresaban la actividad de la telomerasa (fig. 7) que no estaba presente en el control (CMTAM150 no transfectada) y retenía la morfología celular normal (fig. 8).
También se reveló, pero no forma parte de la invención, que las células BADSC150 inmortalizadas también se sometieron a pruebas para determinar su capacidad de diferenciación funcional. Las células se indujeron a someterse a adipogénesis blanca, marrón (Figura 9), osteogénesis (Figura 10) y condrogénesis (Figura l l ) . Esta línea celular con las diferentes combinaciones de estas construcciones puede utilizarse para tamizar bibliotecas de moléculas pequeñas e inductores de tejido adiposo marrón (por ejemplo, FNDC5, BMP7, ácido retinoico).
En una combinación, donde el constructo es UCPI-CherryPicker BfT, (fig. 5(e), la EEF1A1 está conduciendo la expresión de Bmi1 y Tertl. Este constructo se utiliza para inmortalizar las células. La UCP1 está conduciendo la expresión de CherryPicker, la proteína fluorescente CherryPicker anclada a la membrana quimérica, que puede ser monitorizada por microscopía de fluorescencia y capturada en lechos magnéticos usando un anticuerpo específico. En esta configuración, las células CMTAM con este constructo son inmortales y la CherryPicker es activada únicamente cuando la UCP1 es inducida. La inducción de UCP1 se puede llevar a cabo exponiendo esta población celular a moléculas pequeñas de aparición natural o bien sintéticas que regulan positivamente los genes específicos de tejido adiposo marrón.
En otra configuración, CherryPicker es reemplazado por Nanoluc segregado (sNL). En este constructo, sNL es sintetizado únicamente cuando el promotor es activado “ON”. En una configuración, el promotor es UCP1. Puesto que el sNL es segregado por la célula hacia el medio de cultivo celular, se puede medir los niveles de sNL en el medio para obtener un análisis cuantitativo de la eficacia del compuesto para inducir que la UCP1 se active y produzca sNL. Este sistema permite un barrido elevado de miles de pequeñas moléculas de diferentes concentraciones al mismo tiempo.
También revelado, pero no como parte de la invención, todas las combinaciones de constructos han sido transfectadas en células madre de tejido adiposo blanco con el fin de identificar moléculas que conviertan grasa blanca en marrón o bien incrementen la actividad metabólica. Esta línea celular, en tándem a sus sistemas reportero permite el estudio eficaz de la cinética de la biología de la grasa marrón; específicamente, el mecanismo subyacente a la regulación positiva de las UCP1 y a la actividad metabólica elevada. Esta línea de células madre de tejido graso marrón humano es valiosa debido al hecho de que la composición de aminoácidos de UCP1 humano y de ratón es inferior al 80%, lo que hace que las líneas de células de tejido graso marrón de ratón sean inadecuadas para identificar compuestos que activan genes específicos de tejido graso marrón.
Además, una población de células CMTAM inmortales implantables proporcionaría un conjunto de tejido adiposo marrón que puede ayudar a regular el metabolismo en los seres humanos. Haciendo referencia a las Figuras 12(a) y 12(b), los dos gráficos muestran los efectos de las CMTAM en estructuras implantadas en ratones. La Figura 12(a) muestra que, en las semanas posteriores a la implantación, los niveles basales de glucosa en sangre para los ratones de control alimentados con una dieta alta en calorías son significativamente más altos (alrededor del 66%) que los ratones alimentados con la misma dieta, pero implantados con CMTAM. De manera similar, en la Figura 12(b), el peso corporal de los ratones de control es aproximadamente un 40% más alto que el peso corporal de los ratones con un implante. Esto indica que las CMTAM podrían ser útiles en el tratamiento de trastornos metabólicos como la diabetes y la obesidad.
Una placa de cultivo celular comprende células derivadas de tejido adiposo marrón neonatal humano. La placa puede ser, por ejemplo, una placa de múltiples pocillos. Uno o más pocillos de la placa de cultivo celular pueden ser sembrados con células derivadas de tejido adiposo marrón neonatal humano. Las células pueden ser células de tejido graso marrón diferenciado. Las células pueden ser inmortalizadas. Las placas de cultivo celular son útiles para el cribado de compuestos farmacéuticos poniendo en contacto las células con un compuesto farmacéutico candidato y observando el efecto del compuesto farmacéutico en la célula derivada de tejido adiposo marrón neonatal humano.
Con especto a la figura 13, dicho método de cribado para diversos fármacos potenciales empieza rellenado pocilios con células CMTAM transfectadas (como las CMTAM150FS.UCP1-Snl-bFt9 o células madre de tejido adiposo blanco (como WADSCFS.UCP1-sNL-Bft) (paso 1). Luego se añaden los compuestos de interés al pocillo (paso 2) y los pocillos son leídos en un lector de placas y se analiza el nanoluc segregado en cada medio (paso 3), por ejemplo. La presencia de nanoluc indica que el fármaco ha activado las células madre.
Se debe entender que las figuras y las descripciones de la invención se han simplificado para ilustrar elementos relevantes para una comprensión clara de la invención, eliminando, con fines de claridad, otros elementos. Sin embargo, aquellos con habilidades ordinarias en el campo reconocerán que estos y otros elementos pueden ser deseables. No obstante, debido a que tales elementos son conocidos en el campo y porque no facilitan una mejor comprensión de la invención, no se proporciona aquí una discusión de tales elementos. Se debe apreciar que las figuras se presentan con fines ilustrativos y no como dibujos de construcción. Detalles omitidos y modificaciones o formas alternativas de realización están dentro del ámbito de las personas con habilidades ordinarias en el campo
La invención puede encarnarse en otras formas específicas. Por lo tanto, las configuraciones anteriores deben considerarse en todos los aspectos como ilustrativas en lugar de limitantes en la invención descrita aquí. El alcance de la invención está indicado por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior, y todos los cambios que caen dentro del significado y el alcance de equivalencia de las reivindicaciones están destinados a ser abarcados en ellas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Constructo implantablecaracterizado por:
una estructura; y
una célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano derivada de una célula madre de tejido adiposo marrón neonatal humano aislada;
donde la célula madre de tejido adiposo marrón neonatal humano aislada es cultivada en un medio de cultivo que comprende proteína 5 (FNDC5) que contiene dominio tipo III de fibronectina y se diferencia en la célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano; y
donde la expresión genética de UCP-1, ELOVL3 y PGC1A es regulada positivamente en la célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano en comparación con las células diferenciadas sin FNDC5.
2. Constructo implantable conforme a la reivindicación 1, donde la estructura comprende una matriz extracelular porosa.
3. Constructo implantable conforme a la reivindicación 1, donde la célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano es un adipocito marrón humano.
4. Constructo implantable conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico, por ejemplo, obesidad y/o diabetes, en un paciente, donde el constructo implantable es implantado en el paciente.
5. Constructo implantablecaracterizado por:
una estructura; y
una célula madre de tejido adiposo marrón neonatal humano aislada cultivada en la estructura;
donde la célula madre de tejido adiposo marrón neonatal humano aislada es cultivada en un medio de cultivo que comprende proteína 5 (FNDC5) que contiene dominio tipo III de fibronectina y se diferencia en la célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano;
donde la expresión genética de UCP-1, ELOVL3 y PGC1A es regulada positivamente en la célula diferenciada de tejido adiposo marrón neonatal humano en comparación con las células diferenciadas sin FNDC5.
6. Constructo implantable conforme a la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico, por ejemplo, obesidad y/o diabetes, en un paciente, donde el constructo implantable es implantado en el paciente.
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