CN111500590B - 一种调控鸡脂肪细胞形成的转录因子gata2的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控鸡脂肪细胞形成的转录因子GATA2的应用，属于动物分子遗传和发育生物学领域，本发明公开了转录因子GATA2中调控鸡脂肪细胞形成中的用途；本发明在细胞水平构建该转录因子的过表达载体，验证了GATA2转录因子调控鸡前脂肪细胞的分化，而对鸡前脂肪细胞的增殖没有明显调控作用；本发明进一步揭示了转录因子GATA2在鸡脂肪组织形成中的作用机制，该转录因子通过调控PPARγ、FASN、C/EBPα、LPL和FABP4、或其组合的表达，进而影响鸡前脂肪的分化。本发明提供了GATA2转录因子在调控鸡脂肪细胞形成中的新用途，在鸡遗传育种和动物营养领域具有实用价值。

Description

一种调控鸡脂肪细胞形成的转录因子GATA2的应用
技术领域
本发明涉及动物分子遗传和发育生物学领域，特别是涉及一种调控鸡脂肪细胞形成的转录因子GATA2的应用。
背景技术
经过育种工作者近百年的不懈努力，肉鸡育种已经取得了巨大进展。目前，商品代肉仔鸡的日增重和饲料转化率都达到了很高的水平。但是，由于长期育种过程中对生长性状的过度选择，腹部脂肪蓄积过多成为了当前肉鸡生产领域面临的一个重要问题。腹部脂肪过多蓄积不仅影响肉鸡生产效率，造成饲料浪费，而且造成肉鸡猝死和胴体品质下降。培育优质低脂肉鸡是控制肉鸡腹部脂肪过多蓄积的有效手段。
培育优质低脂肉鸡必须首先了解肉鸡腹部脂肪组织沉积的分子机制。腹部脂肪组织(abdominal adipose tissues)，又叫内脏脂肪组织，位于腹腔内，围绕在胃肠等脏器的周围；主要由白色脂肪细胞(white adipocyte)构成，是动物重要的能量储存库和内分泌器官。
腹部脂肪组织沉积主要发生在肉鸡生长发育阶段。脂肪细胞形成是导致脂肪组织沉积的直接原因。动物体内脂肪细胞前体主要存在于脂肪基质血管成分(adiposestromal-vascular fraction,SVF)中。目前研究者已经建立了研究鸡脂肪组织形成的有效手段。在动物水平，利用血浆极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)和腹部脂肪含量双向选择等技术手段建立的高、低腹部脂肪含量肉鸡群体、以及肉鸡生产中广泛使用的商品代“快大型”肉鸡，均是适合研究鸡腹部脂肪沉积的动物模型。全基因组关联分析、转录组学、蛋白质组学等组学技术的发展和应用，以及比较生物学的研究报道为研究鸡腹部脂肪组织沉积提供了众多有研究价值的候选基因。在细胞水平，从鸡腹部脂肪组织分离血管基质细胞(前脂肪细胞)和成熟脂肪细胞的技术；以及多种体外诱导鸡脂肪细胞形成(包括多种脂肪酸、Cocktail诱导液+油酸、Cocktail+PPARγ配体激活剂等)方法的应用，使得在体外研究鸡脂肪细胞形成具备了条件。
鸡脂肪细胞形成的研究目前已经取得了一些有价值的成果：神经多肽Y(neuropeptide Y,NPY)和BMP4等细胞外信号分子，PPARγ、C/EBPα、SREBP1、KLF2、KLF3、KLF5和KLF7等转录因子，以及gga-miR-21等miRNA在鸡脂肪细胞形成中具有重要调控作用。
GATA结合蛋白(GATAs)是一类具有2个保守的C-X2-C-X17-C-X2-C(C为半胱氨酸，X为任意氨基酸)锌指结构的转录因子，能够识别并结合靶基因(T/A)GATA(A/G)核苷酸序列发挥调控作用。哺乳动物GATAs共有6个成员，分为2个亚家族；亚家族1包括GATA1、GATA2和GATA3，主要调控中胚层和外胚层衍生组织的分化，在血细胞生成和神经系统发育中发挥重要作用；亚家族2包括GATA4、GATA5和GATA6，参与调控内皮和中胚层衍生组织的发育，对心血管系统、消化系统和泌尿生殖系统的形成具有重要调控作用。
GATA2对小鼠脂肪组织形成具有重要调控作用。遗传型肥胖症小鼠白色脂肪组织GATA2表达水平较正常小鼠明显下调。GATA2在小鼠白色脂肪组织高水平表达，过表达GATA2抑制小鼠白色脂肪细胞的分化。小鼠棕色脂肪组织也表达GATA2，过表达GATA2抑制棕色脂肪细胞分化。在哺乳动物脂肪细胞中GATA2至少可通过抑制PPARγ2表达、以及与C/EBPα和C/EBPβ发生蛋白互作2种途径抑制脂肪细胞分化。
尽管GATA2在小鼠脂肪细胞形成中的作用已经比较清楚了，但是，GATA2在鸡脂肪组织形成中的作用机制还不完全清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控鸡脂肪细胞形成的转录因子GATA2的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明前期研究结果显示GATA2在鸡脂肪组成生长发育过程中的每个检测时间点都有表达，并且过表达GATA2抑制鸡胚成纤维细胞DF1中的PPARγ活性，提示了GATA2可能在鸡脂肪细胞增殖和分化中发挥了重要作用。
本发明提供一种转录因子GATA2的用途，用于制备一种制剂或组合物，所述制剂或组合物用于调控鸡脂肪细胞形成。
进一步地，所述调控鸡脂肪细胞形成是指调控鸡脂肪细胞的分化。
进一步地，所述调控是指通过过表达转录因子GATA2抑制鸡脂肪细胞的分化。
进一步地，所述调控的基因选自下组：PPARγ、FASN、C/EBPα、LPL和FABP4、或其组合。
进一步地，所述转录因子GATA2通过调控所述基因的启动子活性和mRNA表达发挥调控作用。
本发明还提供一种调控鸡脂肪细胞形成的转录因子GATA2，所述转录因子GATA2的编码基因序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供一种上述的用途的应用方法，构建重组质粒pCMV-myc-GATA2，并转染鸡脂肪细胞，所述重组质粒pCMV-myc-GATA2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开一种转录因子GATA2在调控鸡脂肪细胞形成中应用，在细胞水平构建该转录因子的过表达载体，验证了GATA2转录因子调控鸡前脂肪细胞的分化，而对鸡前脂肪细胞的增殖没有明显调控作用；本发明进一步揭示了转录因子GATA2在鸡脂肪组织形成中的作用机制，该转录因子通过调控PPARγ、FASN、C/EBPα、LPL和FABP4、或其组合的表达，进而影响鸡前脂肪的分化。本发明提供了GATA2转录因子在调控鸡脂肪细胞形成中的新用途，在鸡遗传育种和动物营养领域具有实用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为GATA2过表达载体的质粒图谱；
图2为GATA2过表达载体的质粒表达蛋白验证；
图3为过表达GATA2对鸡前脂肪细胞增殖影响图；
图4为过表达GATA2抑制鸡前脂肪细胞分化图；
图5为过表达GATA2调控PPARγ、C/EBPα、FASN、LPL和FABP4启动子活性图；
图6为过表达GATA2对鸡前脂肪细胞中内源性脂肪细胞分化标志基因FASN、LPL和FABP4表达的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
下列实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1鸡GATA2基因编码区(CDS)序列克隆和过表达质粒构建
1、鸡腹部脂肪组织RNA提取
1)取正常培养的7周龄AA肉鸡，乙醚麻醉后处死，取新鲜的腹部脂肪组织，液氮速冻后放-80℃冰箱备用。
2)取100mg保存的鸡腹部脂肪组织，在液氮中研磨后，加入1mL Trizol试剂(Invitrogen)。
3)将上述标本转移到1.5mL干净EP管中，室温静置5min，加入0.2mL的氯仿，剧烈震荡15s混匀，室温静置2min。
4)12000g，4℃，离心15min，将上层水相转移至一个新的干净的EP管中，加入0.5mL异丙醇，室温静置10min。
5)12000g，4℃，离心10min，弃掉上清。
6)在上述EP管中，加入1mL 75％的乙醇振荡重悬RNA，7500g,4℃离心5min。
7)弃去上清，在空气中静置5-10min干燥RNA。
8)用40μL RNase free水重悬RNA，-80℃保存备用。
2、GATA2基因全长CDS区序列克隆
1)反转录
以腹部脂肪组织RNA为模板，利用ImProm-II reverse transcriptase Kit(Promega)进行反转录，反应体系I：总RNA 1.0μg，oligo dT引物(2.5μM)0.5μl，加RNasefree ddH2O补足5μl。将上述反应体系I在70℃处理5min，然后在冰上放置5min，以破坏RNA的二级结构，之后配置反应体系II，如下：
Figure BDA0002485733920000071
反转录条件如下：
Figure BDA0002485733920000072
2)用引物GATA2CF:ATTAGATCTCCATGGAGGTGGCCACGGATC和GATA2CRACGGTACCTTATCCCATGGCTGTAACCAT进行PCR扩增。
反应体系如下：
Figure BDA0002485733920000073
Figure BDA0002485733920000081
PCR扩增条件为：94℃预变性7min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环72℃终延伸7min，4℃终止反应。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。将目的基因连接在pMD-18T载体(Takara)上，连接产物转换大肠杆菌DH5α，AMP抗性筛选培养，挑去单克隆，将单克隆接种于LB液体培养基，提取质粒，将质粒进行测序，测得插入pMD-18T中的序列如SEQ ID NO.1所示，将得到的阳性重组质粒标记为pMD-18T-GATA2。
3、GATA2过表达载体质粒的构建
分别以pMD-18T-GATA2载体和pCMV-myc载体为酶切底物，利用BglⅡⅠ和KpnⅡ两个内切酶进行双酶切，体系如下所示：
Figure BDA0002485733920000082
酶切条件为：37℃酶切1h。
酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并用AXYGEN凝胶回收纯化试剂盒纯化回收，利用T4DNA连接酶，将目的基因片段和骨架载体片段连接到一起，构建pCMV-myc-GATA2载体，连接产物转换大肠杆菌DH5α，AMP抗性筛选培养，挑去单克隆，将单克隆接种于LB液体培养基，提取质粒，利用KpnⅠ和BglⅡ进行双酶切和测序鉴定，得到的阳性重组质粒标记为pCMV-myc-GATA2，重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。GATA2过表达载体(pCMV-myc-GATA2)载体和空载体(pCMV-myc)的质粒图谱如图1所示。
实施例2过表达GATA2对鸡前脂肪细胞增殖分化的影响
1、鸡前脂肪细胞分离
1)从12日龄AA肉鸡中取腹部脂肪组织(3-5克)，用PBS清洗2遍后，用2mg/mL的I型胶原酶(Sigma)37℃消化1小时，每隔10分钟上下颠倒混匀一次。
2)让消化后的组织液通过100微米和600微米的滤网，除去未消化的组织块。
3)收集过滤后的组织消化液200×g离心10分钟。
4)静置10分钟，让细胞分层，下层细胞再次经过红细胞裂解液处理后，200×g离心10分钟，获得的鸡腹部脂肪组织来源的血管基质(SVF)细胞即为鸡前脂肪细胞使用。
5)分离的鸡前脂肪细胞用全培养基(DMEM/F12+10％FBS+1％K)悬浮，以接种密度1×105cells/cm2接种到细胞培养瓶中，保然后在37℃，5％CO2的条件下培养。
2、GATA2过表达载体在鸡前脂肪细胞中表达蛋白验证
将生长状态良好的鸡前脂肪细胞接种于6孔细胞培养板中，接种密度为1×105个/孔，传代24h后，大约细胞70-90％汇合，按照Fugene HD(promega)说明书分别将空表达载体质粒pCMV-Myc和GATA2过表达质粒pCMV-Myc-GATA2分别转染到6孔板培养的鸡前脂肪细胞中，每孔转染2.0ug质粒，转染后48h回收细胞，利用western blotting验证pCMV-Myc-GATA2载体能否表达融合蛋白，结果显示转染pCMV-Myc-GATA2的细胞中成功表达出大小约为50kD的蛋白，与预测的鸡GATA2融合蛋白大小相近，而转染pCMV-Myc的细胞没有表达出类似大小的myc融合蛋白如图2所示，表明在鸡前脂肪细胞中转染pCMV-Myc-GATA2可以过表达鸡GATA2蛋白质。
3、过表达转录因子GATA2对鸡前脂肪细胞增殖的影响
将生长状态良好的鸡前脂肪细胞接种于6孔细胞培养板中，接种密度为1×105个/孔，传代24h之后，大约细胞70-90％汇合，按照Fugene HD(promega)说明书分别将别将空表达载体质粒pCMV-Myc和GATA2过表达质粒pCMV-Myc-GATA2转染到不同孔的鸡前脂肪细胞细胞中，生长24h之后，利用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来，以每孔5000个细胞的浓度接种到96孔细胞培养板中，接种后24h、48h、72h、96h和120h时间点，利用
Figure BDA0002485733920000101
发光法细胞活力检测试剂盒(Promega)检测细胞增殖数目，结果如图3所示，在所有检测的时间点，均没有发现过表达GATA2的前脂肪细胞与对照组相比增殖能力发生显著变化(P>0.05，不配对双尾T检验)，过表达GATA2对鸡前脂肪细胞增殖没有明显影响。
4、过表达转录因子GATA2对鸡前脂肪细胞分化的影响
将生长状态良好的鸡前脂肪细胞接种于6孔细胞培养板中，接种密度为1×105个/孔，传代24h后，大约细胞70-90％汇合，采用Fugene HD转染试剂(Promega)按照说明书分别将别将空表达载体质粒pCMV-Myc和GATA2过表达质粒pCMV-Myc-GATA2转染到不同孔的鸡前脂肪细胞细胞中，转染后大约48h，当细胞培养板中的细胞完全长满(细胞100％汇合)后，利用160nM的油酸钠(Sigma)对前脂肪细胞进行诱导脂肪细胞分化。诱导分化24和48小时后，弃去培养基，用PBS洗3次，在10％甲醛固定10分。然后用蒸馏水冲洗固定液，用0.5％的油红O染色30分钟。弃去多余的染色液，用PBS冲洗两次。在肉眼和倒置显微镜下观察细胞形态。结果如图4所示，在检测的两个时间点，均发现转染pCMV-Myc-GATA2的鸡前脂肪细胞与对照组细胞相比，脂肪含量明显减少，表明过表达GATA2抑制鸡前脂肪细胞的分化。
5、在鸡脂肪细胞过表达GATA2对PPARγ、C/EBPα、FASN、LPL和FABP4启动子活性的影响
将生长状态良好的鸡前脂肪细胞接种于12孔细胞培养板中，接种密度为5×104个/孔，24h之后，按照Fugene HD(promega)说明书将各组质粒转染到鸡前脂肪细胞中，分组如下所示：
Figure BDA0002485733920000111
Figure BDA0002485733920000121
每组重复三次，48h之后收细胞，按照Promega公司的Dual-
Figure BDA0002485733920000122
LuciferaseAssay System说明书进行荧光活性测定，结果如图5所示，与转染空载体的对照组相比，过表达GATA2在鸡前脂肪细胞对C/EBPα无显著影响(P>0.05)，过表达GATA2在鸡前脂肪细胞对PPARγ、LPL和FABP4启动子具有显著调控作用(P<0.05,不配对双尾T检验)。
6、Real time PCR分析过表达GATA2对FASN、LPL和FABP4表达的影响
将生长状态良好的鸡前脂肪细胞以1×105 cells/cm2的密度接种到6孔板密度。接种12小时后，细胞大约长到60-80％汇合，按照Fugene HD(Promega)转染试剂按照说明书转染pCMV-myc-GATA2或空载体(pCMV-myc)转染到细胞中。转染后48 h后，收集细胞。
用TRIzol试剂收集贴壁的鸡前脂肪细胞并从中提取总RNA，用Nano drop 2000(Thermo scientific)测定提取的RNA浓度，取1μg RNA使用Promega-Improm II(Promega)反转录试剂套装进行反转录成cDNA，反转录条件为：25.0℃5min,42.0℃60min,70.0℃15min,5.0℃保温。然后取1微升cDNA产物采用10μ升体系,使用QIAGEN qRT-PCR仪器系统(QIAGEN,Hilden,Germany)进行real time PCR分析，程序设定为：95.0℃进行5min,然后40个循环：95.0℃进行10s，56.0℃进行30s,72.0℃进行40s加解离曲线，使用Rotor-Gene QSeries Software2.3.1软件进行数据分析，结果如图6所示，过表达GATA2抑制鸡前脂肪细胞中内源性脂肪细胞分化标志基因FASN、LPL和FABP4表达的表达水平(P<0.05,不配对双尾T检验)。
所用的引物如下所示：
Figure BDA0002485733920000131
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种调控鸡脂肪细胞形成的转录因子GATA2的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attagatctc catggaggtg gccacggatc agcctcgctg gatgacccac cacgccgtgc 60
tcaacgggca gcaccccgag agccaccacc cgggactggc tcacaactac atggaaccag 120
cgcagctcct acctccggac gaagtcgacg tcttcttcaa ccacctggat tcccagggca 180
acccttacta tgccaactct gcccatgccc gggcccgggt ctcctacagt caggcacacg 240
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ggctggacag cagcaaggcg gcactgtctg cccatcacca caacccctgg accgtcaacc 360
ccttcaccaa gacccccctg cacccctcgg cggccggagc acctggggcc atctcggtgt 420
accctggcag cagcacgtcc agcaccgcct ccgtctcgtc gctcaccccc gcctcgcact 480
cgggctccca cctcttcggt ttccccccga cccctcccaa ggaagtgtct ccagacccca 540
actccaccag cgctgcctcc ccttcgtcct ccgctggggc ccggcaggag gacaaagaca 600
gcatcaagta ccaagtgtcg ctgtcggaag ggatgaagat ggagagcgcc agcccgctcc 660
gcagcagcct caccagcatg ggggcccagc cctccaccca ccaccccatc cccacatacc 720
cctcttacgt gccggctgcc catgactaca gcagcagcct cttccacccg ggcagcttcc 780
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actgtcagac aaccaccacg accttatggg gacgcaacgc caacggggac ccggtttgta 1080
atgcctgcgg actctactat aaactgcata atgtgaacag gcctccgacc atgaaaaagg 1140
aaggaattca gaccaggaat aggaagatgt ccaacaaatc aaagaagagc aagaaaggct 1200
ctgagtgttt tgaggaactg tccaagtgca tgcaagagaa atcgtctcct ttcagcgccg 1260
ctgcccttgc tagtcacatg gcacctatgg ggcatttgcc accattcagc cactctggac 1320
acatcctacc aacacctacc cccatccacc catcttccag cgattcaatt ggacatccgc 1380
atccatccag catggttaca gccatgggat aaggtaccgt 1420
<210> 2
<211> 5186
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagttcgagc ttgcatgcct gcaggtcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 60
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 120
ccaataggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 180
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 240
ggcccgcctg gcatatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 300
ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 360
tggatagcgg tttgactcac gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 420
ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 480
acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 540
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 600
accgatccag cctccggact ctagaggatc cggtatagag gaactgaaaa accagaaagt 660
taactggtaa gtttagtctt tttgtctttt atttcaggtc ccggatccgg tggtggtgca 720
aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg cctttacttc tagcctgtac ggaagtgtta 780
cttctgctct aaaagctgcg gaattgtacc cgcgggccca ccatggcatc aatgcagaag 840
ctgatctcag aggaggacct gcttatggcc atggaggccc gaattcggtc gacgagatcc 900
catggaggtg gccacggatc agcctcgctg gatgacccac cacgccgtgc tcaacgggca 960
gcaccccgag agccaccacc cgggactggc tcacaactac atggaaccag cgcagctcct 1020
acctccggac gaagtcgacg tcttcttcaa ccacctggat tcccagggca acccttacta 1080
tgccaactct gcccatgccc gggcccgggt ctcctacagt caggcacacg cccgcctgac 1140
cgggagtcag atgtgccggc ctcatcttat ccacagcccc gggatccctt ggctggacag 1200
cagcaaggcg gcactgtctg cccatcacca caacccctgg accgtcaacc ccttcaccaa 1260
gacccccctg cacccctcgg cggccggagc acctggggcc atctcggtgt accctggcag 1320
cagcacgtcc agcaccgcct ccgtctcgtc gctcaccccc gcctcgcact cgggctccca 1380
cctcttcggt ttccccccga cccctcccaa ggaagtgtct ccagacccca actccaccag 1440
cgctgcctcc ccttcgtcct ccgctggggc ccggcaggag gacaaagaca gcatcaagta 1500
ccaagtgtcg ctgtcggaag ggatgaagat ggagagcgcc agcccgctcc gcagcagcct 1560
caccagcatg ggggcccagc cctccaccca ccaccccatc cccacatacc cctcttacgt 1620
gccggctgcc catgactaca gcagcagcct cttccacccg ggcagcttcc tggggggccc 1680
ggcgtccagc ttcaccccca agccacgaag caaggccaga tcctgttcag aaggcagaga 1740
gtgtgtgaac tgtggagcaa ccgctacccc tctctggaga agagacggca ccgggcatta 1800
cctgtgtaac gcctgcgggc tctaccacaa aatgaacggt caaaaccgac ctctcattaa 1860
acccaaacga aggctgtcag cggccaggag agcagggacg tgttgtgccg actgtcagac 1920
aaccaccacg accttatggg gacgcaacgc caacggggac ccggtttgta atgcctgcgg 1980
actctactat aaactgcata atgtgaacag gcctccgacc atgaaaaagg aaggaattca 2040
gaccaggaat aggaagatgt ccaacaaatc aaagaagagc aagaaaggct ctgagtgttt 2100
tgaggaactg tccaagtgca tgcaagagaa atcgtctcct ttcagcgccg ctgcccttgc 2160
tagtcacatg gcacctatgg ggcatttgcc accattcagc cactctggac acatcctacc 2220
aacacctacc cccatccacc catcttccag cgattcaatt ggacatccgc atccatccag 2280
catggttaca gccatgggat aatccagcat ggttacagcc atgggataag gtaccgcggc 2340
cgcggggatc cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg 2400
cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 2460
taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg 2520
gggaggtgtg ggaggttttt tcggatcctc tagagtgatc tgcaggcatg ctagcttggc 2580
gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 2640
catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taagagtgag ctaactcaca 2700
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 2760
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc tccgcttcct 2820
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2880
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagaaa 2940
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 3000
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 3060
aggatataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 3120
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 3180
catagctcac gtgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3240
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3300
ccaacccggt aagacacgct tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3360
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 3420
tagaaggaca gtatttggta tctgcctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3480
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3540
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt tctacggggt 3600
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 3660
ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagttata 3720
tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 3780
ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 3840
ggaggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 3900
ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 3960
actttatccg ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 4020
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 4080
cgtttggtat ggcttcatca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 4140
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 4200
ggccgcagtg ttatcactca tggtatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 4260
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 4320
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg taatacggga taataccgcg ccacatagca 4380
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 4440
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtca cccaactgat cttcagcatc 4500
ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 4560
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttccttttca atattattga 4620
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 4680
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctagaaacca 4740
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 4800
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctg 4860
tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 4920
gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 4980
gcggtggaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca 5040
ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 5100
ctggcgaaag gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 5160
cacgacgttg taaaacgacg gccagt 5186

Claims (1)

1.一种转录因子GATA2的用途，其特征在于，用于制备一种制剂或组合物，所述制剂或组合物用于调控鸡前脂肪细胞中PPARγ、LPL和FABP4启动子活性，而不影响鸡前脂肪细胞中C/EBPα启动子活性，且所述制剂或组合物抑制鸡前脂肪细胞中FASN、LPL和FABP4表达，所述转录因子GATA2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481271B (zh) * 2020-12-11 2024-04-30 石河子大学 一种调控脂肪细胞形成的转录因子c/ebpz及其应用
CN112662673B (zh) * 2021-01-08 2022-06-28 石河子大学 一种人klf7基因启动子及其构建方法与应用
CN113584026B (zh) * 2021-07-23 2023-03-21 长江大学 一种长链RNA LncPRDM16及其检测试剂、方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014172561A1 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Biorestorative Therapies, Inc. Human brown adipose derived stem cells and uses
CN105969768A (zh) * 2016-05-10 2016-09-28 石河子大学 一种klf7基因启动子及其活性和应用
CN108048535A (zh) * 2017-11-27 2018-05-18 华子昂 一种用PPARγ基因评定牛肌内脂肪中甘油三酯含量的方法
CN112481271A (zh) * 2020-12-11 2021-03-12 石河子大学 一种调控脂肪细胞形成的转录因子c/ebpz及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120321671A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Method for reducing heat loss in neonatal mammalian subjects by transplanting brown adipocytes or precursors thereof
CN113943737A (zh) * 2021-09-22 2022-01-18 东北农业大学 一种鸡ctgf基因在抑制鸡前脂肪细胞分化的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014172561A1 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Biorestorative Therapies, Inc. Human brown adipose derived stem cells and uses
CN105969768A (zh) * 2016-05-10 2016-09-28 石河子大学 一种klf7基因启动子及其活性和应用
CN108048535A (zh) * 2017-11-27 2018-05-18 华子昂 一种用PPARγ基因评定牛肌内脂肪中甘油三酯含量的方法
CN112481271A (zh) * 2020-12-11 2021-03-12 石河子大学 一种调控脂肪细胞形成的转录因子c/ebpz及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DLK1 等7 个基因在鸡脂肪组织生长发育过程中的表达相关性;傅春旭等;《基因组学与应用生物学》;20191220;第38卷(第12期);5386-5392 *
Gallus gallus GATA binding protein 2 (GATA2), mRNA;Francius C等;《Genbank database》;20190924;NM_001003797.1 *
Molecular Regulation of Adipogenesis and Potential Anti-Adipogenic Bioactive Molecules;Dorothy Moseti等;《International journal of molecular science》;20160119;第17卷(第1期);1-24 *
PPARγ在脂肪生成中的遗传和表观遗传调控;崔婷婷等;《遗传》;20171231(第11期);115-126 *
调控脂肪代谢及脂肪细胞分化的转录因子研究进展;周金星等;《卫生研究》;20170330(第02期);173-177 *
过表达鸡Gata2或Gata3基因抑制Pparγ基因的转录;张志威等;《中国生物化学与分子生物学报》;20120920(第09期);第836页左栏最后1段，第836页第1.4小节，第837页表1，第837页第1.7小节，第841页讨论 *

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