JP7154210B2 - 筋幹細胞のインビトロ産生 - Google Patents
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Description
本発明は、筋幹細胞、特に、分化運命が決定されておらず、その長期生着能が維持されている、骨格筋幹細胞を産生するためのインビトロ方法に関する。本発明はまた、かかる方法により産生される筋幹細胞、並びに、治療における、及び自己複製、増殖若しくは分化を促進できる薬剤のスクリーニング方法における、筋幹細胞の使用に関する。
筋萎縮症、すなわち筋肉の部分的又は完全な萎縮は、一時的に身体が不自由な状況下に置かれる対象が経験することがある。しかしながら、筋萎縮症はまた、ミオパチー、筋ジストロフィー及びサルコペニアなど、多くの筋消耗性障害の結果でもある。
筋ジストロフィーは、骨格筋の衰弱及び破壊をもたらす疾患群である。この群には、９つの主要カテゴリーと、少なくとも３０の具体的なタイプが含まれ、そのうちデュシェンヌ型筋ジストロフィーは最も一般的なものである。更なるタイプとしては、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー及び筋緊張性ジストロフィーが含まれる。筋ジストロフィーは、典型的には筋肉タンパク質の合成に関与する遺伝子における変異に起因して生じ、遺伝性又は特発性のものであり得る。現在、筋ジストロフィーの治療法は存在せず、個々のアウトカムは障害の具体的なタイプに依存する。
サルコペニアは、加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少が生じ、衰弱をきたして生活の質に影響を及ぼすようになった時点で生じるものと定義される（Ｓａｙｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｇｅ Ａｇｅｉｎｇ ４２：１４５～１５０）。サルコペニアは、例えば神経－筋伝達障害、興奮／収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連する再生能への障害、筋繊維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全、並びに、骨格筋への脂肪の入り込み、及び線維症などの病態生理学的変化と関連する多因子性症候群である（Ａｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ６０：２９４～３０５）。したがって、これらの症候群の病因は複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動の低下、タンパク同化ホルモン（例えばアンドロゲン及びＩＧＦ－１）のホルモン減少、及び栄養不良／栄養失調が重要な役割を果たしている（Ｍｉｔｈａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．２４：１５５５～１５６６）。サルコペニアは、加齢による身体活動の減少と、長寿命化とが特に顕著となっている先進国において主要な健康問題になりつつある。重症の症例では、サルコペニアは、自立して生活する能力を低下させる場合もある。更に、サルコペニアは、集団に基づく研究において広範な身体障害の予測因子であり、平衡障害、歩行速度、転倒及び骨折患者数の増大と関連がある。
身体活動の減少はサルコペニアの可能性を高めると考えられており、したがって運動量の増加は病状との闘いにおいて有益であろう。実際に、レジスタンス運動は、骨格筋におけるタンパク質合成の増加と関係がある。しかしながら、治療としての運動は、多くの場合、患者のコンプライアンスがよくない。
筋萎縮症は、遺伝学的及び病態生理学的にあまり理解が進んでおらず、それを緩和するための有効な治療に対する切実なニーズが存在する。いくつかの研究は、筋ジストロフィーの治療に対する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の可能性を実証している（Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｆ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１４０ｒａ８９；Ｃｈａｌ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３：９６２～９６９）。例えばｉＰＳＣは、筋系統の発達をインビトロでモデル化するため、筋原線維が組織化した多核筋線維を産生するのに首尾よく使用されてきた（Ｃｈａｌ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３：９６２～９６９）。これらのｉＰＳＣから誘導された細胞は、ジストロフィーのｍｄｘマウスの筋肉に移植されたときに筋線維を再構成することができる。
しかしながら、ｉＰＳＣを、筋系統へと分化誘導し、かつその分化運命が融合して繊維になるように決定されてはいない初期の幹細胞段階で分化を停止させることが可能であるかは未だ検討されていない。かかる分化運命が決定されていない細胞型の利用が可能になれば、幹細胞コンパートメントへの持続的な生着及び寿命の遺伝的矯正が可能になるため、例えば筋ジストロフィーなどへの細胞療法の選択肢として非常に魅力的なものとなる。
数十年にもわたる研究にもかかわらず、例えば変性筋疾患の治療用の、分化運命が決定されていない筋幹細胞（ＭｕＳＣ）を十分な数で得るための実施可能な方法は存在しない。筋肉の幹細胞療法に関連する最も基本的な問題の１つは、従来の培養によるＭｕＳＣの増殖が、かかる細胞の最終的な分化運命の決定を筋分化に誘導することである。このインビトロでの幹細胞性の喪失は、ＭｕＳＣの長期生着能を損なわせる。移植時には、分化運命が決定された細胞は幹細胞コンパートメントへの生着が非効率的であり、かつ大部分の細胞は注入部位の近くで筋線維に分化及び融合する。これにより、宿主組織におけるドナー核を有する筋線維の分布が少なくなり、また効果は筋線維の代謝に伴い消失する一時的なものになる。
したがって、筋幹細胞、特に分化運命が決定されておらず、長期生着能を維持する筋幹細胞を産生する方法に対するニーズが依然として存在する。このような筋幹細胞を用いることにより、筋肉の疾患、特にミオパチー、筋ジストロフィー及びサルコペニアなどの障害の治療が促進され、並びに筋損傷からの回復の補助にもつながる。
本発明者らは、天然のＭｕＳＣニッチに見られる条件を模倣して、多能性幹細胞から分化運命が決定されていないＭｕＳＣを誘導するためのプロトコルの開発に成功した。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から筋原細胞を生成するための既存のプロトコルとは対照的に、本発明者らは、幹細胞マーカー（例えばＰａｘ７）の発現が維持されているが、分化運命決定マーカー（例えばＭｙｆ５）については陰性が維持されている、分化運命が決定されていない細胞の生成を可能にする環境条件を利用することに着目した。
このような利用を支援するため、本発明者らは、中胚葉形成の誘導後に筋原系統への分化を誘導する凝集条件について様々な細胞型を用いてスクリーニングした。これらの研究中、本発明者らは、ＭｕＳＣニッチの三次元組織を再現するために、所定の種類のアクセサリ細胞株を用いて凝集条件の範囲をスクリーニングした。
分化運命が決定されていないＭｕＳＣの産生へのアクセスを提供するだけでなく、本発明者らのアプローチは、化学物質又は外因性転写因子を大量に使用する必要がないという点で更に有利である。
要約すると、本発明者らは、３Ｄ細胞培養法で、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを共培養することにより、分化運命が決定されておらずかつ長期生着能が維持された筋幹細胞集団の産生が可能となることを見出した。
したがって、一態様では、本発明は、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを３Ｄ細胞培養液中で共培養することを含む、筋幹細胞集団を産生するインビトロ方法を提供する。
好ましい実施形態では、筋幹細胞は、骨格筋幹細胞である。
一実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７を発現し、すなわち、筋幹細胞はＰａｘ７＋である。一実施形態では、筋幹細胞はＮＣＡＭを発現し、すなわち、筋幹細胞はＮＣＡＭ＋である。一実施形態では、筋幹細胞はＣＤ８２を発現し、すなわち、筋幹細胞はＣＤ８２＋である。
一実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７及びＮＣＡＭを発現し、すなわち、筋幹細胞はＰａｘ７＋／ＮＣＡＭ＋である。一実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７及びＣＤ８２を発現し、すなわち、筋幹細胞はＰａｘ７＋／ＣＤ８２＋である。一実施形態では、筋幹細胞はＮＣＡＭ及びＣＤ８２を発現し、すなわち、筋幹細胞はＮＣＡＭ＋／ＣＤ８２＋である。
一実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７、ＮＣＡＭ及びＣＤ８２を発現し、すなわち、筋幹細胞は、Ｐａｘ７＋／ＮＣＡＭ＋／ＣＤ８２＋である。
別の態様では、本発明は、Ｐａｘ７／ＮＣＡＭ、Ｐａｘ７／ＣＤ８２、ＮＣＡＭ／ＣＤ８２、又はＰａｘ７／ＮＣＡＭ／ＣＤ８２を発現する細胞集団を産生するインビトロ方法を提供し、当該方法は、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを３Ｄ細胞培養法で共培養することを含む。
一実施形態では、筋幹細胞は、低レベルでＭｙｆ５を発現するか、又は実質的にＭｙｆ５を発現しない。好ましい実施形態では、筋幹細胞はＭｙｆ５－である。
好ましい実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５－である。
一実施形態では、筋幹細胞は、低レベルのミオゲニンを発現するか、又は実質的にミオゲニンを発現しない。好ましい実施形態では、筋幹細胞はミオゲニン－である。
好ましい実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７＋／ミオゲニン－である。
一実施形態では、筋幹細胞は、低レベルのＭｙｏＤを発現するか、又は実質的にＭｙｏＤを発現しない。好ましい実施形態では、筋幹細胞はＭｙｏＤ－である。
好ましい実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７＋／ＭｙｏＤ－である。一実施形態では、筋幹細胞は、低レベルのＭＹＨ２を発現するか、又は実質的にＭＹＨ２を発現しない。好ましい実施形態では、筋幹細胞はＭＹＨ２－である。
一実施形態では、筋幹細胞は、中胚葉マーカーＴを発現し、すなわち、筋幹細胞はＴ＋である。一実施形態では、筋幹細胞は、中胚葉マーカーＧＡＴＡ４を発現し、すなわち、筋幹細胞は、ＧＡＴＡ４＋である。一実施形態では、筋幹細胞はＦＧＦ５を発現し、すなわち、筋幹細胞はＦＧＦ５＋である。
別の態様では、本発明は、３Ｄ細胞培養において、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを共培養することを含む、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５－の細胞集団を産生するインビトロ方法を提供する。
一実施形態では、当該方法は、
（ａ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを混合するステップと、
（ｂ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを含む、少なくとも１つの３Ｄスフェロイドを作成するステップと、を含む。
（ａ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを混合するステップと、
（ｂ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを含む、少なくとも１つの３Ｄスフェロイドを作成するステップと、を含む。
一実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。好ましくは、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
一実施形態では、多能性幹細胞は、哺乳動物多能性幹細胞である。好ましくは、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。
一実施形態では、胚性線維芽細胞は、哺乳動物胚性線維芽細胞である。一実施形態では、胚性線維芽細胞は、ヒト胚性線維芽細胞である。一実施形態では、胚性線維芽細胞は、マウス胚性線維芽細胞である。
一実施形態では、胚性線維芽細胞は、非哺乳動物胚性線維芽細胞である。一実施形態では、胚性線維芽細胞は、ハエ、魚又は線虫（ｗｏｒｍ）の胚性線維芽細胞である。
一実施形態では、内皮細胞は、哺乳動物内皮細胞である。一実施形態では、内皮細胞はヒト内皮細胞である。一実施形態では、内皮細胞は、マウス内皮細胞である。
一実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約０．３～４：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約０．５～４：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約０．５～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約１～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約１．５～２．５：１の比である。好ましい実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約２：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約０．３～４：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約０．５～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約１～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約１．５～２．５：１の比である。好ましい実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約２：１の比である。
一実施形態では、胚性線維芽細胞と内皮細胞とは、約１～２：１の比である。好ましい実施形態では、胚性線維芽細胞と内皮細胞とは、約１：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．３～８：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～８：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～６：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１～６：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１．５～５：１～２：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．３～４：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～３：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１～３：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１．５～２．５：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約２：１～２：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．３～４：１：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～３：１：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１～３：１：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１．５～２．５：１：１の比である。好ましい実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約２：１：１の比である。
別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１：２：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約３～３０、３～２５、３～２０、３～１５又は３～１０日間培養される。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約４～３０、４～２５、４～２０、４～１５又は４～１０日間培養される。一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約５～３０、５～２５、５～２０、５～１５又は５～１０日間培養される。
別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約３～３０日間、好ましくは約５～２０日間培養される。
一実施形態では、培養物は、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞、平滑筋細胞及び／又は筋芽細胞を更に含む。
一実施形態では、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞は、骨格筋線維芽細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）である。一実施形態では、骨格筋線維芽細胞は、マウス又はヒト骨格筋線維芽細胞、好ましくはマウス骨格筋線維芽細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）である。マウス骨格筋線維芽細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）は、例えば、ＮＯＲ－１０細胞（例えば、寄託番号ＣＣＬ－１９７でＡＴＣＣから入手可能な細胞）であってもよい。
一実施形態では、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞は、胚性線維芽細胞以外のマウス又はヒト線維芽細胞である。一実施形態では、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞は、３Ｔ３マウス線維芽細胞である。３Ｔ３マウス線維芽細胞は、例えば、寄託番号ＣＲＬ－１６５８でＡＴＣＣから入手可能な細胞であってもよい。
一実施形態では、平滑筋細胞は、マウス又はヒト平滑筋細胞、好ましくはマウス平滑筋細胞である。マウス平滑筋細胞は、例えば、ＭＯＶＡＳ細胞（例えば、寄託番号ＣＲＬ－２７９７でＡＴＣＣから入手可能な細胞）であってもよい。
一実施形態では、筋芽細胞は、マウス又はヒト筋芽細胞、好ましくはマウス筋芽細胞である。筋芽細胞は、例えば、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（例えば、寄託番号ＣＲＬ－１７７２でＡＴＣＣから入手可能な細胞）であってもよい。
一実施形態では、多能性幹細胞と共培養される細胞（すなわち胚性線維芽細胞、内皮細胞、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞、平滑筋細胞及び／又は筋芽細胞）は、不死化細胞株由来である。
別の態様では、本発明は、本発明の方法を使用して得られる単離された筋幹細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、単離されたＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５－筋幹細胞を提供する。
一実施形態では、筋幹細胞はまたＮＣＡＭ＋である。別の実施形態では、筋幹細胞はまたＣＤ８２＋である。
別の態様では、本発明は、治療に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、筋疾患の治療又は予防に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。別の態様では、本発明は、筋萎縮症の治療又は予防に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。別の態様では、本発明は、ミオパチーの治療又は予防に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。別の態様では、本発明は、筋ジストロフィーの治療又は予防に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。別の態様では、本発明は、サルコペニアの治療又は予防に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。更なる態様では、本発明は、悪液質の処置又は予防に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、筋損傷、具体的には、外科的介入及び／又は外傷を介して生じる筋損傷の治療に使用するための、本発明の筋幹細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、筋幹細胞の自己複製、増殖又は分化を増強できる薬剤をスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、
（ａ）本発明の方法を使用して得られる筋幹細胞集団を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の筋幹細胞集団を、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）当該候補薬剤が、筋幹細胞の自己複製、増殖、又は分化を増強するか否かを判定するステップと、を含む。
（ａ）本発明の方法を使用して得られる筋幹細胞集団を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の筋幹細胞集団を、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）当該候補薬剤が、筋幹細胞の自己複製、増殖、又は分化を増強するか否かを判定するステップと、を含む。
別の態様では、本発明は、筋幹細胞の自己複製、増殖又は分化を増強できる薬剤をスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、
（ａ）本発明の方法を使用して筋幹細胞集団を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の筋幹細胞集団を、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）該候補薬剤が、筋幹細胞の自己複製、増殖、又は分化を増強するか否かを判定するステップと、を含む。
（ａ）本発明の方法を使用して筋幹細胞集団を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の筋幹細胞集団を、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）該候補薬剤が、筋幹細胞の自己複製、増殖、又は分化を増強するか否かを判定するステップと、を含む。
別の態様では、本発明は、本発明の筋幹細胞を、当該細胞を必要とする対象に投与することを含む、筋疾患の治療又は予防方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の筋幹細胞を、当該細胞を必要とする対象に投与することを含む、筋萎縮症の治療又は予防方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の筋幹細胞を、当該細胞を必要とする対象に投与することを含む、ミオパチーの治療又は予防方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の筋幹細胞を、当該細胞を必要とする対象に投与することを含む、筋ジストロフィーの治療又は予防方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の筋幹細胞を、当該細胞を必要とする対象に投与することを含む、サルコペニアの治療又は予防方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の筋幹細胞を、当該細胞を必要とする対象に投与することを含む、悪液質の処置又は予防方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の筋幹細胞を、当該細胞を必要とする対象に投与することを含む、筋損傷、特に外科的介入及び／又は外傷によって引き起こされる筋損傷の治療方法を提供する。
別の態様では、本発明は、薬剤の製造のための本発明の筋幹細胞の使用を提供する。別の態様では、本発明は、筋疾患の治療又は予防のための薬剤の製造のための、本発明の筋幹細胞の使用を提供する。別の態様では、本発明は、筋萎縮症の治療又は予防のための薬剤の製造のための、本発明の筋幹細胞の使用を提供する。別の態様では、本発明は、ミオパチーの治療又は予防のための薬剤の製造のための、本発明の筋幹細胞の使用を提供する。別の態様では、本発明は、筋ジストロフィーの治療又は予防のための薬剤の製造のための、本発明の筋幹細胞の使用を提供する。別の態様では、本発明は、サルコペニアの治療又は予防のための薬剤の製造のための、本発明の筋幹細胞の使用を提供する。別の態様では、本発明は、悪液質の治療又は予防のための薬剤の製造のための、本発明の筋幹細胞の使用を提供する。別の態様では、本発明は、筋損傷、特に外科的介入及び／又は外傷を介して発生する筋損傷の治療のための薬剤の製造のための、本発明の筋幹細胞の使用を提供する。
本明細書で用いる用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」と同義であるか、又は「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義で、包括的又はオープンエンドのものであり、追加の、明記されていないメンバー、要素又はステップを除外するものではない。用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」はまた、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」をも包含する。
幹細胞
本発明の筋幹細胞は、多能性幹細胞からインビトロで産生され得る。
本発明の筋幹細胞は、多能性幹細胞からインビトロで産生され得る。
幹細胞は、より特殊化された細胞に分化する能力を有する細胞であり、分裂してより多くの幹細胞を産生することもできる。
多能性幹細胞は、際限なく増殖し、人体の全ての細胞型に分化できる幹細胞である。これらの幹細胞は、損傷又は疾患によって影響を受けた細胞と置き換えることができる単一の細胞源を提供することが期待できる。
多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞の生成などのいくつかの技術を介して作製することができる。
好ましくは、本発明の幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
ｉＰＳＣは、成体細胞から直接作製することができる多能性幹細胞の一種である。当業者は、例えば、特定の転写因子を成体細胞に導入することによって、又は成体細胞を特定のタンパク質の組み合わせと接触させることによって、ｉＰＳＣを容易に調製することができる。
ｉＰＳＣは、胚性材料を使用する必要性を克服しているという点において、またｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣから産生された細胞）は、後に再導入される対象から調製され得るという点において、胚性幹細胞よりも有益である。かかる自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞移植は、移植される材料の免疫拒絶の危険性を克服することができる。
本発明の幹細胞は、胚性幹細胞であってもよく、特に、胚を破壊することなく産生された胚性幹細胞であってもよい。
胚を破壊することなく、哺乳動物胚性幹細胞などの多能性幹細胞を産生するための方法は当該技術分野で知られている。特に、マウス及びヒトの胚性幹細胞は、胚をそのまま残存させたまま、単一の割球から産生され得ることが示されている。例えば、Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９：２１６～２１９では、単一の割球からマウス胚性幹細胞を作製するための方法を記載している。この手順のその後の進歩により、割球細胞株を他のＥＳＣと共培養する必要がない方法が提供された（Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１１３～１１７）。
好ましくは、本発明の幹細胞は、哺乳動物幹細胞、好ましくはヒト幹細胞である。
筋幹細胞
本明細書で用いる用語「筋幹細胞」は、衛星細胞、好ましくは休止しており、かつ分化運命が決定されていない衛星細胞を指してもよい。
本明細書で用いる用語「筋幹細胞」は、衛星細胞、好ましくは休止しており、かつ分化運命が決定されていない衛星細胞を指してもよい。
衛星細胞は、骨格筋細胞の前駆体である。成人の筋肉では、衛星細胞は通常は休止しているが、疾患、又は損傷若しくは運動などの機械的ひずみに応答して活性化し、筋形成し得る。衛星細胞はまた、筋肉の正常な発達にも関与する。活性化により、衛星細胞は増殖することができる。加えて、これらの衛星細胞の一部は、筋芽細胞に分化することができ、筋芽細胞及び他の骨格筋要素を形成することができる。筋芽細胞はまた、すでに存在している筋管と融合することによって、すでに存在している筋線維を増強することもできる。
本発明の方法は、多能性幹細胞からの筋幹細胞のインビトロ産生を提供する。
本発明の方法により産生される筋幹細胞は、特定のマーカーの発現によって特徴付けられ得る。
好ましくは、本発明の筋幹細胞はＰａｘ７を発現し、すなわち好ましくは、筋幹細胞はＰａｘ７＋である。筋幹細胞はまた、ＮＣＡＭ及び／又はＣＤ８２を発現してもよく、すなわち筋幹細胞はＮＣＡＭ＋及び／又はＣＤ８２＋であってもよい。
Ｍｙｆ５は、休止した衛星細胞と分化運命が決定された衛星細胞とを区別するために使用され得る分化運命決定マーカーである（図１）。
好ましくは、本発明の筋幹細胞は、低レベルのＭｙｆ５を発現するか、又は実質的にＭｙｆ５を発現しない。好ましい実施形態では、筋幹細胞はＭｙｆ５－である。
好ましい実施形態では、筋幹細胞はＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５－である。
ＭＹＨ２は、別の分化運命決定マーカーである。好ましくは、本発明の筋幹細胞は、低レベルのＭＹＨ２を発現するか、又は実質的にＭＹＨ２を発現しない。好ましい実施形態では、筋幹細胞はＭＹＨ２－である。
更なるマーカー、例えば中胚葉マーカーＴ及びＧＡＴＡ４、並びにＦＧＦ５もまた、本発明の筋幹細胞を特徴付けるために使用され得る。一実施形態では、筋幹細胞は、中胚葉マーカーＴを発現し、すなわち、筋幹細胞はＴ＋である。一実施形態では、筋幹細胞は、中胚葉マーカーＧＡＴＡ４を発現し、すなわち、筋幹細胞は、ＧＡＴＡ４＋である。一実施形態では、筋幹細胞はＦＧＦ５を発現し、すなわち、筋幹細胞はＦＧＦ５＋である。
マーカー発現の解析は、任意の好適な技術、例えばフローサイトメトリー又は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて容易に実施することができる。
筋幹細胞はまた、それらの形態によっても同定することができる。例えば、筋幹細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞又は上皮細胞と比較して、高い核細胞質体積比を有し得る。筋幹細胞はまた、筋芽細胞、線維芽細胞又は上皮細胞と比較して細胞小器官の数が少ない場合がある。筋幹細胞は、筋核に対して多量の核ヘテロクロマチンを有し得る。活性化された筋幹細胞は、休止した筋幹細胞と比較して、カベオラ及び細胞質細胞小器官の数が多く、ヘテロクロマチンレベルが低い場合がある。更に、筋幹細胞は、筋芽細胞と比較して、細長くはなく、また紡錘状でもない場合がある。
好ましくは、筋幹細胞は、筋芽細胞、特に融合して筋管を形成し得る筋芽細胞を形成することができる。この能力は、例えばインビトロ又はインビボで実施できる筋芽細胞又は筋管への分化を示すことによって、機能的に検出することができる。
筋疾患、筋障害、及び筋損傷
筋疾患及び筋障害は、発達的な意味及び分解的な意味の両面において、筋細胞の減少又は死に起因する筋機能の漸進的又は突発的な喪失、並びに発達上の疾患による筋肉発達の低下を生じさせ得る。先天性ミオパチーは、これらの特徴を呈する筋疾患の例である。筋損失はまた、老化から、疾患の治療から、又は他の多くの原因からも生じ得る。これらの種類の筋損失の例としては、サルコペニア及び悪液質が挙げられる。
筋疾患及び筋障害は、発達的な意味及び分解的な意味の両面において、筋細胞の減少又は死に起因する筋機能の漸進的又は突発的な喪失、並びに発達上の疾患による筋肉発達の低下を生じさせ得る。先天性ミオパチーは、これらの特徴を呈する筋疾患の例である。筋損失はまた、老化から、疾患の治療から、又は他の多くの原因からも生じ得る。これらの種類の筋損失の例としては、サルコペニア及び悪液質が挙げられる。
筋機能、筋肉量、及び筋萎縮
本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、筋機能及び／又は筋肉量の維持又は増加を提供するために用いられ得る。
本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、筋機能及び／又は筋肉量の維持又は増加を提供するために用いられ得る。
本明細書で用いる用語「筋機能」は、対象の生活に悪影響を及ぼさない態様で機能する筋肉の能力を指してもよく、筋力、筋収縮、筋持久力、及び／又は筋弾性のパラメータを包含する。
筋機能を評価する好適な試験としては、握力計を用いた握力測定、レッグプレス、チェストプレス、又は脚部伸展における１回最大反復測定（ｏｎｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｘｉｍｕｍ）、歩行速度、６分間歩行検査、ＴＵＧテスト（ｔｉｍｅ ｕｐ ａｎｄ ｇｏ）、簡易身体能力バッテリー、Ｆｒｉｅｄによるフレイル基準、並びに段差を上る時間の測定（ｓｔａｉｒ ｃｌｉｍｂｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）が挙げられる。
筋肉量（筋量、筋厚又は筋線維サイズと同義である場合もある）は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）又はバイオインピーダンス試験により測定することができる。同様にして、筋肉の体積の評価にはＭＲＩを使用でき、筋肉の厚み及び羽状角の評価には超音波を使用できる。
本明細書で用いる用語「筋萎縮症」及び「筋消耗」は、例えば筋損失が衰弱をもたらす段階にまで、筋肉量が減少することを指す場合もある。一実施形態では、本発明の筋幹細胞が投与される対象は、それらの筋肉量の１０％、５％、４％、３％、２％又は１％を超えて損失しない。
好ましくは、本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、筋肉量を維持又は増加する。
本明細書で用いる用語「維持する」は、筋機能及び／又は筋肉量などの特定のパラメータが、一定期間（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０年以上）にわたり実質的に変化しないことを指す。
一実施形態では、筋肉量は、（本発明の筋幹細胞が投与される対象において）少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％又は２０％増加する。
別の実施形態では、筋肉量は、（本発明の筋幹細胞が投与される対象において）１～２．５％、１～５％、１～１０％又は１～２０％増加する。
好ましくは、筋肉は骨格筋である。
ミオパチー
本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、ミオパチーを治療又は予防するために用いられ得る。
本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、ミオパチーを治療又は予防するために用いられ得る。
ミオパチーは神経筋障害であり、その主な症状は、筋線維の機能不全に起因する筋力低下である。更なる症状としては、例えば、筋けいれん、硬直及び攣縮が挙げられる。
ミオパチーは、遺伝性（例えば筋ジストロフィー）又は獲得性（例えば筋けいれん）のいずれの場合もあり得、多くのグループに分類され、例えば運動技能の発達遅延によって特徴付けられる先天性ミオパチー、出生時に明らかとなる骨格及び顔面異常、随意筋の進行性衰弱を特徴とする筋ジストロフィー、ミトコンドリアにおける遺伝的異常により生じるミトコンドリアミオパチー、ポンペ病、アンデルセン症候群及びコーリ（Ｃｏｒｉ）病を含む筋糖原病、ミオグロビンの代謝障害によるミオグロビン尿症、皮膚筋炎、骨化性筋炎（筋肉内での骨成長を特徴とする）、家族性周期性四肢麻痺、多発筋炎及び封入体筋炎、神経性筋強直、全身強直性症候群、通常の筋けいれん及び硬直、並びにテタニー、などが挙げられる。
筋ジストロフィー
本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、筋ジストロフィーを治療又は予防するために用いられ得る。
本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、筋ジストロフィーを治療又は予防するために用いられ得る。
筋ジストロフィーは、骨格筋の衰弱及び破壊をもたらす疾患群である。この群には、９つの主要カテゴリーと、少なくとも３０の具体的なタイプが含まれ、そのうちデュシェンヌ型筋ジストロフィーは最も一般的なものである。更なるタイプとしては、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー及び筋緊張性ジストロフィーが含まれる。
筋ジストロフィーは、典型的には筋タンパク質の合成に関与する遺伝子の変異に起因して生じ、遺伝性であり得る。
悪液質
本発明は、悪液質又は消耗症候群に対処する方法を提供する。悪液質は、基礎疾患に関連する複雑な代謝症候群であり、筋肉の減少によって特徴付けられ、脂肪量の減少を伴う場合も伴わない場合もある。悪液質の顕著な臨床的特徴は、成人における（保持される体液分を補正した）体重減少又は小児の成長障害（内分泌障害を除く）である。悪液質は、癌、ＡＩＤＳ、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、慢性腎疾患、慢性膵炎、及び／又は代謝性アシドーシスなどの疾患を有する患者において多く見られる。
本発明は、悪液質又は消耗症候群に対処する方法を提供する。悪液質は、基礎疾患に関連する複雑な代謝症候群であり、筋肉の減少によって特徴付けられ、脂肪量の減少を伴う場合も伴わない場合もある。悪液質の顕著な臨床的特徴は、成人における（保持される体液分を補正した）体重減少又は小児の成長障害（内分泌障害を除く）である。悪液質は、癌、ＡＩＤＳ、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、慢性腎疾患、慢性膵炎、及び／又は代謝性アシドーシスなどの疾患を有する患者において多く見られる。
サルコペニア
本発明は、筋萎縮症に対処する手段を提供する。加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少は、全ての個体において必ず生じるものの、その進行は、広範な遺伝的要因並びに例えば身体活動及び栄養摂取等の環境的要因によって異なる。
本発明は、筋萎縮症に対処する手段を提供する。加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少は、全ての個体において必ず生じるものの、その進行は、広範な遺伝的要因並びに例えば身体活動及び栄養摂取等の環境的要因によって異なる。
サルコペニアに特異的な状態は、加齢による筋肉量及び筋機能の低下により衰弱をきたし、生活の質に影響を及ぼしている時点で発生している状態と定義される（Ｓａｙｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｇｅ Ａｇｅｉｎｇ ４２：１４５～１５０）。
サルコペニアは、例えば障害性の神経－筋伝達障害、興奮／収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連する再生能への障害、筋繊維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全、並びに、骨格筋への脂肪の入り込み、及び線維症などの病態生理学的変化と関連する多因子性症候群である（Ａｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ６０：２９４～３０５）。したがって、これらの症候群の病因は、複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動の低下、タンパク同化ホルモン（例えばアンドロゲン及びＩＧＦ－１）のホルモン減少、及び栄養不良／栄養失調が重要な役割を果たしている（Ｍｉｔｈａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．２４：１５５５～１５６６）。
筋損傷
急性の筋変性は、筋線維の強力な破壊、及び免疫細胞の筋肉への浸潤を特徴とする。筋再生中の免疫応答の役割は、重要であり、適切に調整されなければならない。好中球及び前炎症性マクロファージは、最初に筋肉に侵入し、損傷後の筋肉片のクリアランスに関与する。次いで、免疫細胞集団は、筋再生を維持する抗炎症性マクロファージに切り替わる。免疫細胞によるサイトカインの連続分泌は、筋損傷後最初の数日の間に細かく統制され、筋肉前駆細胞の活性を調節する。実際に、多数の筋肉常在前駆細胞は、筋肉片が一旦除去されると活性化し増殖し始め、直ちに筋肉を再生する特異的な系列へと分化運命が決定される。特に、筋幹細胞（衛星細胞、ＳＡＴ）は増殖し、最終的には筋線維に分化する。間葉系非筋原性前駆細胞、又は線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰ）も、筋形成を維持するために同時に活性化される。筋損傷の７日後、ほとんどの前駆細胞集団の分化運命が決定され、免疫応答は消散されている。損傷の１４日後、筋肉は新たに形成された筋線維から構成され、ほとんどのシグナルは基底レベルに戻っている。
急性の筋変性は、筋線維の強力な破壊、及び免疫細胞の筋肉への浸潤を特徴とする。筋再生中の免疫応答の役割は、重要であり、適切に調整されなければならない。好中球及び前炎症性マクロファージは、最初に筋肉に侵入し、損傷後の筋肉片のクリアランスに関与する。次いで、免疫細胞集団は、筋再生を維持する抗炎症性マクロファージに切り替わる。免疫細胞によるサイトカインの連続分泌は、筋損傷後最初の数日の間に細かく統制され、筋肉前駆細胞の活性を調節する。実際に、多数の筋肉常在前駆細胞は、筋肉片が一旦除去されると活性化し増殖し始め、直ちに筋肉を再生する特異的な系列へと分化運命が決定される。特に、筋幹細胞（衛星細胞、ＳＡＴ）は増殖し、最終的には筋線維に分化する。間葉系非筋原性前駆細胞、又は線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰ）も、筋形成を維持するために同時に活性化される。筋損傷の７日後、ほとんどの前駆細胞集団の分化運命が決定され、免疫応答は消散されている。損傷の１４日後、筋肉は新たに形成された筋線維から構成され、ほとんどのシグナルは基底レベルに戻っている。
本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、筋損傷の有害な影響を治療、予防、又は軽減するために用いられ得る。
一実施形態では、対象は、外科的介入及び／又は外傷によって、筋損傷を受けている。
本明細書で用いる用語「外科的介入」は、筋肉への損傷をもたらす任意の外科的アプローチを指し得る。したがって、本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、外科手術後の回復を補助するために使用され得る。
本明細書で用いる用語「外傷」は、例えば事故又はスポーツによる損傷などの、筋肉の損傷をもたらす、不測の事象を指し得る。
別の実施形態では、対象は、計画された外科的介入を受けなければならない。例えば、本明細書に開示される筋幹細胞及びその使用は、１ヶ月未満、又は３週間、２週間又は１週間未満で、手術を受ける予定の対象に適用され得る。
処置方法
本明細書において参照される全ての処置には、治癒的、緩和的及び予防的な処置が含まれるが、本発明の文脈においては、予防への参照は、予防的処置とより近い関連性を有する。処置に、疾患の重症度の進行を停止することもまた更に含んでもよい。哺乳類、特にヒトの治療が好ましい。ヒトの治療及び獣医学的な治療の両方が本発明の範囲に包含される。
本明細書において参照される全ての処置には、治癒的、緩和的及び予防的な処置が含まれるが、本発明の文脈においては、予防への参照は、予防的処置とより近い関連性を有する。処置に、疾患の重症度の進行を停止することもまた更に含んでもよい。哺乳類、特にヒトの治療が好ましい。ヒトの治療及び獣医学的な治療の両方が本発明の範囲に包含される。
投与
本発明で用いる筋幹細胞は、単独で投与することもできるが、一般には、特にヒトの治療には、医薬用担体、賦形剤又は希釈剤との混合物として投与される。適切な担体及び希釈剤は、等張整理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含み、ヒト血清アルブミンを含有する可能性がある。
本発明で用いる筋幹細胞は、単独で投与することもできるが、一般には、特にヒトの治療には、医薬用担体、賦形剤又は希釈剤との混合物として投与される。適切な担体及び希釈剤は、等張整理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含み、ヒト血清アルブミンを含有する可能性がある。
移植
本発明の筋幹細胞は、例えば自家細胞移植手順の一部として、又は同種細胞移植手順の一部として、対象に投与され得る。
本発明の筋幹細胞は、例えば自家細胞移植手順の一部として、又は同種細胞移植手順の一部として、対象に投与され得る。
用語「自家細胞移植手順」とは、本発明の筋幹細胞が投与されるのと同じ対象から、（本発明の筋幹細胞が産生される）前駆細胞が得られる手順を指す。
自家移植手順は、免疫学的不適合と関連する問題を回避し、遺伝的に適合するドナーの利用可能性とは無関係に、対象に利用可能であることから、有益である。
自家細胞移植手順において移植される細胞は、正しく機能する遺伝子を導入するため、及び／又は機能障害性の遺伝子を除去するために（例えば遺伝子治療法を用いて）遺伝子改変されたものであってもよい。かかるアプローチは、筋ジストロフィーなどの遺伝性疾患の治療において特定の用途を見出すことができる。
用語「同種細胞移植手順」とは、本発明の筋幹細胞が投与されるのと異なる対象から、（本発明の筋幹細胞が産生される）前駆細胞が得られる手順を指す。好ましくは、そのドナーは、免疫学的不適合性のリスクを最小化するために、筋幹細胞が投与される対象と遺伝的に適合する。
薬用量
当業者は、過度の実験を行わずとも、本発明の薬剤を対象に投与するのに適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は、個々の患者に最も好適である実際の投与量を決定するが、その決定は、使用される特定の化合物の活性、該化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間及び形式、排泄速度、薬物の組み合わせ、具体的な症状の重症度、並びに別個に受けている治療、などを含む様々な因子による。当然ながら、より高い又はより低い用量範囲も想定され得、それらも本発明の範囲に包含される。
当業者は、過度の実験を行わずとも、本発明の薬剤を対象に投与するのに適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は、個々の患者に最も好適である実際の投与量を決定するが、その決定は、使用される特定の化合物の活性、該化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間及び形式、排泄速度、薬物の組み合わせ、具体的な症状の重症度、並びに別個に受けている治療、などを含む様々な因子による。当然ながら、より高い又はより低い用量範囲も想定され得、それらも本発明の範囲に包含される。
対象
本明細書で用いる用語「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを指し得る。
本明細書で用いる用語「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを指し得る。
非ヒト動物の例としては、脊椎動物、例えば非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えばマウス、ラット又はモルモット）、ブタ及びネコなどの哺乳類が挙げられる。非ヒト動物は、コンパニオンアニマルであってもよい。
好ましくは、対象はヒトである。
産生方法
一態様では、本発明は、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを三次元（３Ｄ）細胞培養で共培養することを含む、筋幹細胞集団を産生するインビトロ方法を提供する。
一態様では、本発明は、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを三次元（３Ｄ）細胞培養で共培養することを含む、筋幹細胞集団を産生するインビトロ方法を提供する。
一実施形態では、当該方法は、
（ａ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを混合するステップと、
（ｂ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを含む、少なくとも１つの３Ｄスフェロイドを作成するステップと、を含む。
（ａ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを混合するステップと、
（ｂ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを含む、少なくとも１つの３Ｄスフェロイドを作成するステップと、を含む。
３Ｄ細胞培養は、細胞が三次元的に成長し、又は周囲と相互作用することができる、人工的に作製された環境である。かかる培養では、細胞は典型的には、「スフェロイド」と呼称され得る３Ｄコロニーを形成する。３Ｄ培養アプローチは、細胞のインビボ成長及び挙動をより正確にモデルリングすることができる。
当業者は、例えば様々な市販の培養ツールのいずれかを活用することにより、３Ｄ細胞培養を容易に実施できる。例えば、３Ｄ培養は、スキャフォールド技術又はスキャフォールドフリー技術を使用して実施してもよい。
スキャフォールドベースの技術は、細胞による３Ｄ培養物の形成を可能にするため、固体スキャフォールド及びハイドロゲルなどの支持体を用いる。かかるスキャフォールドは、インビボで存在する天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣することを目的とするものであり得る。
スキャフォールドフリー技術では、細胞を成長させるスキャフォールドを使用した分配が行われる。代わりに、３Ｄスフェロイドは、例えば、低接着プレート、懸滴プレート、マイクロパターン化表面、回転バイオリアクター、磁気浮上、及び磁気３Ｄバイオプリンティングの使用により作成されてもよい。
多能性幹細胞、胚性線維芽細胞及び内皮細胞の共凝集体の３Ｄスフェロイドの作成は、例えば、超低接着プレートで培養することにより、及び／又はシェーカープラットフォームを使用して約８０～１２０ＲＰＭ又は９０～１１０ＲＰＭ、好ましくは約１００ＲＰＭで培養することにより実施できる。最初の共凝集体の作成は、例えば約６～１８時間又は９～１５時間、好ましくは約１２時間のインキュベート後になされ得る。
多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを含む少なくとも１つの３Ｄスフェロイドを作成した後、ステップ（ｂ）の共培養物を好適な時間インキュベートし、所望の細胞集団を産生することができる。したがって、一実施形態では、当該方法は、（ｃ）ステップ（ｂ）の共培養物を、筋幹細胞の産生に好適な条件下でインキュベートするステップを更に含み得る。
本発明の方法において、細胞培養は、任意の好適な細胞培養培地を使用して実施できる。一実施形態では、細胞培養培地はＡＰＥＬ培地である。
ＡＰＥＬ培地は、ヒト多能性幹細胞の分化を支援するために特別に開発された、無血清の、かつ動物由来成分を含まない培地である。ＡＰＥＬ培地の例示的な組成は、以下のとおりである：
組換え型ヒトアルブミン（５ｍｇ／ｍＬ）、脱イオン化ＢＳＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、リノール酸（１００ｎｇ／ｍＬ）、合成コレステロール（２．２μｇ／ｍＬ）、α－モノチオグリセロール（α－ＭＴＧ、３５０～４５０μＭ）、組換え型ヒトインスリン－トランスフェリン－セレン－エタノールアミン溶液（ｒｈＩＴＳ－Ｅｔｈ、Ｘ１）、無タンパク質ハイブリドーマ混合物ＩＩ（ＰＦＨＭＩＩ、５％）、アスコルビン酸２－リン酸塩（５０μｇ／ｍＬ）、Ｌ－アラニン－Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）及びペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液を添加した、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）／ハムＦ－１２栄養培地混合液（１：１）。
好ましくは、細胞培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、例えばＹ－２７６３２を含む。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えば、約５～１５、６～１４、７～１３、８～１２又は９～１１μＭ、好ましくは約１０μＭの濃度で含まれ得る。
多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞との共培養は、任意の好適な期間にわたり実施できる。培養期間は、関連する筋幹細胞マーカー（例えば、Ｐａｘ７、ＮＣＡＭ、ＣＤ８２、Ｍｙｆ５、ＭＹＨ２、Ｔ、ＧＡＴＡ４及び／又はＦＧＦ５、好ましくは少なくともＰａｘ７及び／又はＭｙｆ５）の発現をモニターすることにより管理することができ、また筋幹細胞マーカーの発現が基準レベルに到達し、及び／又は基準レベルから変化し始めたときに、培養を停止させることができる。
一実施形態では、多能性幹細胞、胚性線維芽細胞及び内皮細胞は、約３～３０、３～２５、３～２０、３～１５又は３～１０日間培養される。別の実施形態では、多能性幹細胞、胚性線維芽細胞及び内皮細胞は、約４～３０、４～２５、４～２０、４～１５又は４～１０日間培養される。一実施形態では、多能性幹細胞、胚性線維芽細胞及び内皮細胞は、約５～３０、５～２５、５～２０、５～１５又は５～１０日間培養される。
別の実施形態では、多能性幹細胞、胚性線維芽細胞及び内皮細胞は、約３～３０日間、好ましくは約５～２０日間培養される。
本発明の方法において用いる好適な培養条件としては、例えば、
（ａ）約３６～３８℃又は３６．５～３７．５℃、好ましくは約３７℃で培養するステップ、
（ｂ）約４～６％又は４．５～５．５％のＣＯ２、好ましくは約５％のＣＯ２で培養するステップ、及び／又は
（ｃ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の湿度、好ましくは約１００％の湿度で培養するステップ、が挙げられる。
（ａ）約３６～３８℃又は３６．５～３７．５℃、好ましくは約３７℃で培養するステップ、
（ｂ）約４～６％又は４．５～５．５％のＣＯ２、好ましくは約５％のＣＯ２で培養するステップ、及び／又は
（ｃ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の湿度、好ましくは約１００％の湿度で培養するステップ、が挙げられる。
多能性幹細胞は、本発明の方法の開始時に、任意の好適な数で添加することができる。例えば、約１００～１０００万、２００～９００万、３００～８００万、４００～７００万又は５００～６００万個の多能性幹細胞を、本発明の方法の開始時に添加することができる。
多能性幹細胞と共培養される更なる細胞（すなわち胚性線維芽細胞、内皮細胞、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞、平滑筋細胞及び／又は筋芽細胞）を、多能性幹細胞に添加して任意の好適な比としてもよい。
一実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約０．３～４：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約０．５～４：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約０．５～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約１～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約１．５～２．５：１の比である。好ましい実施形態では、多能性幹細胞と胚性線維芽細胞とは、約２：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約０．３～４：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約０．５～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約１～３：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約１．５～２．５：１の比である。好ましい実施形態では、多能性幹細胞と内皮細胞とは、約２：１の比である。
一実施形態では、胚性線維芽細胞と内皮細胞とは、約１～２：１の比である。好ましい実施形態では、胚性線維芽細胞と内皮細胞とは、約１：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．３～８：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～８：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～６：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１～６：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１．５～５：１～２：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．３～４：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～３：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１～３：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１．５～２．５：１～２：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約２：１～２：１の比である。
一実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．３～４：１：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約０．５～３：１：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１～３：１：１の比である。別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１．５～２．５：１：１の比である。好ましい実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約２：１：１の比である。
別の実施形態では、多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とは、約１：２：１の比である。
本明細書に開示される比は、好ましくは、細胞の最初の混合時の比率である。
培養が完了すると、３Ｄスフェロイドは、単一の細胞集団に分散させてもよく、次いで、フローサイトメーター（例えば分析用）を通過させてもよい。スフェロイドを単一の細胞に分散させるために、アキュターゼ又はトリプシンなどのタンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を有する酵素を利用することができる。また、アキュマックスなどの細胞凝集体分散溶媒を使用してもよい。
次いで、分散させた細胞を、Ｐａｘ７、ＮＣＡＭ／ＣＤ５６、Ｐａｘ３、ＣＤ８２、Ｍｙｆ５、ＭＹＨ２、Ｔ、ＧＡＴＡ４、及び／又はＦＧＦ５などの特定のマーカーに基づき解析及び／又は選別してもよい。
あるいは、又はそれに追加し、３Ｄスフェロイドを、例えば、本発明のスクリーニング方法においてスクリーニング目的で直接使用してもよい。かかる方法は、異なる化学物質及び薬物に対する筋幹細胞ニッチ機能及び筋組織の応答を含む様々なインビボでの生物学的プロセスの、正確な研究を容易にし得る。
胚性線維芽細胞
胚性線維芽（ＥＦ）細胞は、幹細胞の研究においてフィーダー細胞として利用されることが多い。それらは、動物の結合組織に存在する最も一般的な細胞であり、細胞外マトリックス及びコラーゲンを合成することができ、動物組織の構造フレームワークである。加えて、胚性線維芽細胞は、創傷治癒において一定の役割を果たすことが知られている。
骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞などの中胚葉型細胞の分化を研究するため、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）は、出生後の骨髄由来間質幹細胞の代用幹細胞モデルとして使用されてきた。
胚性線維芽細胞は、全ての結合組織の細胞と同様に、未分化間葉由来である。ビメンチンを発現する能力は、それらが中胚葉由来であることを示す。
好適な胚性線維芽細胞の例は、寄託番号ＳＣＲＣ－１０４０としてＡＴＣＣから入手可能なＭＥＦ（ＣＦ－１）である。
内皮細胞
内皮細胞は、体内の全ての血管の内側に配列され、内皮と呼ばれる厚い層を形成する。内皮は血管壁を形成し、より厚い筋細胞層、及び大型の血管（例えば静脈及び動脈）内の弾性繊維と連結される。
内皮細胞は、体内の全ての血管の内側に配列され、内皮と呼ばれる厚い層を形成する。内皮は血管壁を形成し、より厚い筋細胞層、及び大型の血管（例えば静脈及び動脈）内の弾性繊維と連結される。
内皮細胞の主な天然の機能は、血液と他の組織との間で障壁を形成することである。成体内皮細胞は、顕著な可塑性を維持し、ＩＬ－１、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦに応答してリプログラミングすることが知られている。
内皮細胞は、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１、ＣＤ３４、ＶＥ－カドヘリン、ＣＤ４５、ＣＤ１１７／ｃ－ｋｉｔ、ＣＤ１３３、ＣＸＣＲ４、ＥＴＶ２／ＥＲ７１、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、Ｔｉｅ－２及びＶＥＧＦ Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１を含む多数の表面マーカーを発現する。
好適な内皮細胞の例は、寄託番号ＣＲＬ－２５８１としてＡＴＣＣから入手可能なＣ１６６である。
更なるアクセサリ細胞
胚性線維芽細胞及び内皮細胞に加えて、本発明の筋幹細胞の産生中に、更なる種類の細胞を共培養に含めてもよい。
胚性線維芽細胞及び内皮細胞に加えて、本発明の筋幹細胞の産生中に、更なる種類の細胞を共培養に含めてもよい。
一実施形態では、培養物は、胚性線維芽細胞、平滑筋細胞、及び／又は筋芽細胞以外の線維芽細胞を更に含む。
一実施形態では、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞は、骨格筋線維芽細胞である。一実施形態では、骨格筋線維芽細胞は、マウス又はヒトの骨格筋線維芽細胞であり、好ましくはマウス骨格筋線維芽細胞である。マウス骨格筋線維芽細胞は、例えば、ＮＯＲ－１０細胞（例えば、寄託番号ＣＣＬ－１９７でＡＴＣＣから入手可能な細胞）であってもよい。
一実施形態では、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞は、胚性線維芽細胞以外の、マウス又はヒトの線維芽細胞である。一実施形態では、胚性線維芽細胞以外の線維芽細胞は、３Ｔ３マウス線維芽細胞である。３Ｔ３マウス線維芽細胞は、例えば、寄託番号ＣＲＬ－１６５８でＡＴＣＣから入手可能な細胞であってもよい。
一実施形態では、平滑筋細胞は、マウス又はヒトの平滑筋細胞、好ましくはマウスの平滑筋細胞である。マウス平滑筋細胞は、例えば、ＭＯＶＡＳ細胞（例えば、寄託番号ＣＲＬ－２７９７でＡＴＣＣから入手可能な細胞）であってもよい。
一実施形態では、筋芽細胞は、マウス又はヒトの筋芽細胞、好ましくはマウス筋芽細胞である。筋芽細胞は、例えば、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（例えば、寄託番号ＣＲＬ－１７７２でＡＴＣＣから入手可能な細胞）であってもよい。
スクリーニング方法
別の態様では、本発明は、筋幹細胞の自己複製、増殖又は分化を増強できる薬剤をスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、
（ａ）本発明の方法を使用して得られる筋幹細胞集団を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の筋幹細胞集団を、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）該候補薬剤が、筋幹細胞の自己複製、増殖、又は分化を増強するか否かを判定するステップと、を含む。
別の態様では、本発明は、筋幹細胞の自己複製、増殖又は分化を増強できる薬剤をスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、
（ａ）本発明の方法を使用して得られる筋幹細胞集団を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の筋幹細胞集団を、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）該候補薬剤が、筋幹細胞の自己複製、増殖、又は分化を増強するか否かを判定するステップと、を含む。
好ましくは、方法は、インビトロでの方法である。
幹細胞の自己複製は、幹細胞が、未分化状態を維持しながら複数サイクルの細胞分裂を経る能力である。増殖とは、単一細胞が２つの娘細胞に分割することによる細胞の増殖を指し得る。幹細胞は、幹細胞として維持されている１つの娘細胞と、より分化した第２の娘細胞とを形成するよう分割することによって増殖し得る。分化とは、細胞の型の変化、特に細胞がより専門的となる変化を指し得る。
幹細胞の自己複製、増殖及び分化は、マーカー（例えば筋幹細胞の場合では、Ｐａｘ７、ＮＣＡＭ、ＣＤ８２、Ｍｙｆ５、ＭＹＨ２、Ｔ、ＧＡＴＡ４、及び／又はＦＧＦ５などのマーカー）の発現を解析することにより、当業者により容易に解析することができる。マーカー発現を解析するための好適な方法としては、フローサイトメトリー及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が挙げられる。
一実施形態では、筋幹細胞集団は、３Ｄスフェロイドの形態である。別の実施形態では、筋幹細胞集団は、単細胞の集団の形態であり、好ましくは、３Ｄスフェロイドから分散されている。
候補薬剤は、例えば、医薬品又は栄養補助食品であり得る。好ましくは、候補薬剤は栄養補助食品である。本明細書で用いる用語「栄養補助食品」とは、対象の普段の食生活を補助することを意図する製品を指し得る。
一実施形態では、候補薬剤は、候補薬剤のライブラリ中に含まれる。
候補薬剤の効果は、特定の時間経過にわたり繰り返し測定を実施することにより、時間の関数として評価され得る。
候補薬剤が筋幹細胞の自己複製、増殖又は分化を増強するか否かの決定は、候補薬剤の存在下での、自己複製、増殖又は分化に対する何らかの効果を、それが不存在の場合（例えばコントロール実験又は所定の参照レベルを用いた場合）での、筋幹細胞の自己複製、増殖又は分化のレベルと比較することにより実施できる。
当業者は、開示される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を組み合わせることができることを理解するであろう。
本発明の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な実施例を用いて説明する。
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３ ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
実施例１
ＩＰＳＣからの分化運命が決定されていない筋幹細胞（ＭｕＳＣ）の誘導を可能にするニッチ模倣（ｎｉｃｈｅ-ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ）３Ｄモデルを設計するため、発達又は成熟期の間にＭｕＳＣを典型的に取り巻くであろう異なる種類の細胞との共凝集アッセイを開発した。これらの細胞型としては、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス骨格筋線維芽細胞（ＮＯＲ－１０）、３Ｔ３マウス線維芽細胞、内皮細胞、マウス平滑筋細胞（ＭＯＶＡＳ）及びＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞が挙げられる。
ＩＰＳＣからの分化運命が決定されていない筋幹細胞（ＭｕＳＣ）の誘導を可能にするニッチ模倣（ｎｉｃｈｅ-ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ）３Ｄモデルを設計するため、発達又は成熟期の間にＭｕＳＣを典型的に取り巻くであろう異なる種類の細胞との共凝集アッセイを開発した。これらの細胞型としては、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス骨格筋線維芽細胞（ＮＯＲ－１０）、３Ｔ３マウス線維芽細胞、内皮細胞、マウス平滑筋細胞（ＭＯＶＡＳ）及びＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞が挙げられる。
凝集体
凝集体は、平面シェーカープラットフォーム上で超低接着プレートを用いて調製した。本実施例では最初に、図２ Ａに概説されるように、本発明の３Ｄ凝集システムにおける２Ｄ培養で確立されている筋原細胞の誘導のための化学的プロトコルを試験することを決定した（Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：５１６～５２９）。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による解析により、化学的処理によるＰＡＸ７の有意な上方制御が示された（図２ Ｂ）。したがって、確立された薬剤ベースのプロトコルを用い、本発明者らの３Ｄシステムにおいて、筋原細胞を効率的に誘導することができた。
凝集体は、平面シェーカープラットフォーム上で超低接着プレートを用いて調製した。本実施例では最初に、図２ Ａに概説されるように、本発明の３Ｄ凝集システムにおける２Ｄ培養で確立されている筋原細胞の誘導のための化学的プロトコルを試験することを決定した（Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：５１６～５２９）。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による解析により、化学的処理によるＰＡＸ７の有意な上方制御が示された（図２ Ｂ）。したがって、確立された薬剤ベースのプロトコルを用い、本発明者らの３Ｄシステムにおいて、筋原細胞を効率的に誘導することができた。
次に、本発明者らは、ニッチ細胞とｉＰＳＣとの共凝集の効果を検討した。概略的なプロトコルを図３－１ Ａに示す。検討のために、ｉＰＳＣ及び他の細胞懸濁液を、異なる比で予混合した（図３－２ Ｂ～Ｈ）。ｑＰＣＲによるＰａｘ７発現の評価から、ＭＥＦと、内皮細胞と、筋芽細胞との共凝集条件（１：１）下、７日目及び１４日目において誘導が見られることが明らかとなった。また、ｉＰＳＣに対する支持細胞の種類及び比もＰａｘ７誘導において重要であった。ＭＥＦ、内皮細胞及びマウス筋芽細胞は、ｉＰＳＣからＰａｘ７＋細胞への分化を特に促進した支持細胞であった。
典型的な実験では、６ウェル超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ＮＹ）で５５０万個のｉＰＳ細胞及びニッチ細胞をピペッティングすることにより共凝集体を調製し、１００ＲＰＭに設定したシェーカープラットフォーム上で一晩スフェロイドを凝集させた。この３Ｄ共培養実験では、ｉＰＳＣ及び他の細胞懸濁液を、０日目に特定の比（例えば、１：１及び２：１の比）で予混合した。全ての培養物を加湿インキュベータ内、３７℃、５％ ＣＯ２、及び１００％湿度で維持した。１０μＭのＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を含有する凝集ＡＰＥＬ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）を１４日間使用した。次に、本発明者らは、中胚葉形成及びその後の筋原系統への分化を誘導するニッチ模倣凝集条件についてスクリーニングした。
上記の結果に基づき、ｉＰＳＣ、ＭＥＦ及び内皮細胞を三重クラスターに凝集させた（図５－１ Ａ）。ｉＰＳＣ－ＭＥＦ及びｉＰＳＣ－内皮細胞の二重クラスターと比較して、７日目において、「ｉＰＳＣ－ＭＥＦ－内皮」細胞（２：１：１）の三重クラスターにおいてＰａｘ７の発現が顕著に上昇した（図５－１ Ａ）。スフェロイドは、７日目までは芽出形態を示し、１４日目には内部に中空構造を有し、表面上に細胞のコンフルエント層を有する形態となった（図５－１ Ｃ）。更に、１４日目では、管状又は毛管様のネットワークが凝集体の内部で明らかとなった（図５－１ Ｃ）。
また、７日目に、ＭＥＦを添加したｉＰＳＣ－内皮細胞から構成される凝集体を調製した（図５－１ Ｂ）。Ｐａｘ７発現は、ｉＰＳＣ－内皮二重クラスター単独と比較して、ＭＥＦの関与により顕著に誘導された（図５－１ Ｂ）。しかしながら、最初から全ての３つの細胞型を共凝集させた方がより効果的であった。
次に、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、主要な筋原遺伝子及び分化運命決定マーカーの発現を解析した（図５－２ Ｄ～Ｆ）。Ｐａｘ３も、分化運命決定マーカー及び分化マーカーであるＭｙｆ５及びＭＹＨ２も、顕著に誘導されなかった（図５－２ Ｄ～Ｆ）。重要なことに、中胚葉マーカーＴ及びＧＡＴＡ４は強く誘導された（図５－３ Ｇ～Ｈ）。興味深いことに、本試験では外胚葉マーカーＦＧＦ５の発現の顕著な増加が観察された（図５－３ Ｉ）。結論として、ｉＰＳＣ－ＭＥＦ－内皮細胞を有する三重クラスターは、中胚葉への安定な分化を示し、Ｐａｘ７の発現を示し、かつ分化運命決定マーカーに関しては陰性のままであった。
１３日目に、成熟した凝集体の解剖学的構造を評価するため、Ｐａｘ７、ラミンＡ、ＣＤＸ２及びラミニンの免疫染色を行った（図６）。スフェロイドの断面の観察から、培養１３日後に、Ｐａｘ７陽性の細胞が中央部に存在していたことが明らかとなった（図６ Ａ～Ｂ）。それらの幹細胞の特徴を確認すると、Ｐａｘ７＋プロセッサー細胞（ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）の大部分は、分化マーカーラミンＡ（ヒト特異的）（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４ １７７～１８５）が陰性である。本試験ではまた、骨格筋組織の基底膜において強く発現される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子、ラミニンの免疫染色を行った（図６ Ｃ）。多くの凝集体は、クラスターにおいて腸内胚葉マーカーＣＤＸ２が陽性の上皮構造を有する、高レベルの自己組織化を示した（図６ Ｃ）。
本試験では、細胞の三重クラスターにおけるＰａｘ７発現を比較すると、特に７日目に明らかであるとおり、２Ｄ培養システムよりも３Ｄ培養システムを使用する利点があることを実証した（ｉＰＳＣ－ＭＥＦ－Ｅｎｄｏ）。２Ｄ培養システムと比較し、３Ｄ培養システムにおいてはＰａｘ７＋発現の有意な増加（ｐ≦０．０５）が見られる（図７）。
以上をまとめると、本発明者らは、分化運命の決定されていないヒトＭｕＳＣの薬剤フリーな誘導のための新規な３Ｄ凝集系を開発した。本発明者らのプロトコルは、重要なニッチシグナルを模倣することにより、分化運命の決定されていない状態で筋原性系統への決定を抑止することができる。以前に公表されたプロトコルは、多能性幹細胞由来のＭｕＳＣの分化運命の決定及び変性をもたらし、それらの治療的価値を顕著に損なうものである。
上記明細書で言及した全ての出版物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明に開示される方法、剤及び使用に対する様々な修飾及び変更を行うことは、当業者であれば、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく自明のことであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関して開示したが、特許請求される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、開示された本発明を実施するための形態を適宜改変することは、関連分野における当業者にとり自明であり、それは以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
Claims (3)
- 多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを３Ｄ細胞培養で共培養することを含む、筋幹細胞集団を産生するインビトロ方法であって、前記方法は、
（ａ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを混合するステップと、
（ｂ）多能性幹細胞と、胚性線維芽細胞と、内皮細胞とを含む、少なくとも１つの３Ｄスフェロイドを作成するステップと
を含み、
前記ステップ（ａ）において、
（ｉ）前記多能性幹細胞と前記胚性線維芽細胞とが１．５～２．５：１の比であり、
（ｉｉ）前記多能性幹細胞と前記内皮細胞とが１．５～２．５：１の比であり、及び、
（ｉｉｉ）前記胚性線維芽細胞と前記内皮細胞とが１～２：１の比である、
方法。 - 前記多能性幹細胞と、前記胚性線維芽細胞と、前記内皮細胞とが、１．５～２．５：１：１の比である、請求項１に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞、前記胚性線維芽細胞及び前記内皮細胞が、３～３０日間培養される、請求項１又は２に記載の方法。
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