ES2962325T3

ES2962325T3 - Método para inducir la diferenciación osteogénica tridimensional de células madre con hidrogel

Info

Publication number: ES2962325T3
Application number: ES15842391T
Authority: ES
Inventors: Hyun Sook Park; Sun Ray Lee; Ji Won Yang; Seol Chu; Hyun Jung Mo
Original assignee: Cefo Co Ltd
Current assignee: Cefo Co Ltd
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2024-03-18
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: EP3196298B1; EP3196298A4; CN107075476A; KR20160034541A; US20170283768A1; JP2017527297A; KR101860301B1; US10494601B2; EP3196298A1; EP3196298C0; CN107075476B; JP6475323B2; WO2016043488A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para inducir la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales y, más particularmente, a un método de diferenciación osteogénica de corto tiempo para cultivar células usando una membrana porosa y un biogel sintético biodegradable, mediante el cual las células no entran en contacto con un cultivo celular. envase. La presente invención puede acortar significativamente el período de inducción de la diferenciación osteogénica, en comparación con el método de diferenciación osteogénica convencional, y tiene el efecto de que las células también sean fácilmente separables después de la diferenciación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para inducir la diferenciación osteogénica tridimensional de células madre con hidrogel

Campo técnico

La presente descripción se refiere a un método para la diferenciación osteogénica sobre un gel biosintético en poco tiempo en la inducción de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas.

Técnica anterior

Debido al progreso reciente de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, se están desarrollando métodos capaces de tratar tejidos y órganos dañados de manera diferente a los métodos convencionales, y el tratamiento celular mediante células madre mesenquimatosas está recibiendo la mayor atención. Las células madre se refieren a células que pueden proliferar indefinidamente en un estado indiferenciado, así como diferenciarse para tener una función y forma especializadas en entornos y condiciones específicos. Los ejemplos de células madre son: células madre embrionarias y células madre adultas, tales como las células de la médula ósea que generan constantemente células sanguíneas. Las células madre embrionarias pueden diferenciarse para dar lugar a todas las células y tejidos que constituyen el cuerpo humano, pero su uso está limitado por razones éticas. Por otra parte, las células madre adultas se extraen de la sangre del cordón umbilical o de la médula ósea y la sangre de adultos totalmente desarrollados, son capaces de diferenciarse a tejidos y órganos específicos después de su trasplante in vivo y tienen flexibilidad de diferenciación para transdiferenciarse a células de otros tejidos con características diferentes de las de las células originales. Las células adultas se usan ampliamente en la ingeniería de tejidos sin limitaciones éticas. En los últimos años, se han estado llevando a cabo diversos intentos y primeros ensayos clínicos en el campo médico para la regeneración y la sustitución de tejidos u órganos de pacientes mediante el crecimiento de células madre y la diferenciación posterior de dichas células madre a células específicas. Las células madre mesenquimatosas son un tipo de células madre adultas presentes en diversos órganos o en la sangre del cuerpo después del desarrollo y son una fuente de células fácil de mantener y sin problemas éticos. Las células madre mesenquimatosas son actualmente las células madre más destacadas en el campo de la medicina regenerativa, pero presentan el inconveniente de estar limitadas en cuanto al subcultivo in vitro y la potencia de diferenciación en comparación con las células madre embrionarias.

Los estudios en seres humanos y en animales han confirmado ya que las células madre derivadas de la médula ósea de adultos se diferencian a células osteogénicas (Friedenstein A. J. et al., Transplantation, 6: 230-247, 1968) y estudios recientes han avanzado métodos para cultivar células madre aisladas de la médula ósea para la diferenciación de dichas células madre a osteoblastos, y las posibilidades de aplicación clínica aumentan con estos métodos (Ohgushi H. et al., J. Biomed. Mater. Res., 48: 913-927, 1999). En los últimos tiempos, se han estudiado predominantemente métodos para la diferenciación de células madre mesenquimatosas a osteocitos.

Por otra parte, los métodos para el cultivo y la diferenciación de células en placas de pocillos bidimensionales son los más extendidos actualmente en la diferenciación de células madre. Sin embargo, hay artículos recientes que señalan que el cultivo celular bidimensional (monocapa) reduce las funciones celulares y altera significativamente la morfología en comparación con el cultivo celular tridimensional (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 1943-1948, 2003; Cell, 111: 923 925, 2002; Cancer Cell 2: 205-216, 2002). El cultivo y la diferenciación celular en una manera que afecta negativamente al estado de las células, como se describe anteriormente, causa dificultades en la diferenciación y requiere mucho tiempo. Con el fin de superar los inconvenientes de tal cultivo celular, la patente coreana n.° 10 0733914 describe un sistema de cultivo microcelular tridimensional caracterizado por que las células están presentes en un gel tridimensional, pero el gel tiene que disolverse para separar las células presentes en el mismo después del cultivo o la diferenciación de las células madre, lo que causa daños celulares graves.

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

La inducción de la diferenciación osteogénica en el recipiente de cultivo celular bidimensional convencional tiene el inconveniente de que solo una porción de la célula madre está en contacto con el medio y, por tanto, la entrada de los nutrientes, los ingredientes inductores y el aire necesarios para la diferenciación no es fácil, lo que dificulta la diferenciación y hace que dure más tiempo, por ejemplo, de tres a cinco semanas. Un método de cultivo tridimensional convencional en el que las células se cultivan dentro de un gel tiene el inconveniente de que las células no pueden separarse. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar un sistema de cultivo celular tridimensional que facilite la separación y el uso de las células diferenciadas después de la diferenciación osteogénica de las células madre.

Solución técnica

Por tanto, con el fin de aumentar el área superficial de contacto de las células con el medio para estimular la diferenciación osteogénica, a la vez que facilitar la separación de las células, un aspecto de la presente descripción es proporcionar un método en el que las células existan dentro de un recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto y estén en contacto con el medio en todas direcciones para estimular la diferenciación osteogénica, y así acortar la duración de dicha diferenciación osteogénica.

Efectos ventajosos

En los casos en que la diferenciación osteogénica de células madre se realiza mediante el método para inducir la diferenciación osteogénica de células madre de la presente descripción, las células madre pueden estar en contacto con el medio con un área superficial más extensa, lo que estimula la inducción de la diferenciación osteogénica de las células madre y, de este modo, se acorta notablemente la duración de dicha inducción de la diferenciación osteogénica en comparación con el método de diferenciación osteogénica convencional; y aunque las células se adhieren a las superficies internas y externas del hidrogel, un hidrogel en fase de gel pasa a la fase de sol a una temperatura por debajo de la temperatura de cultivo celular, 37 °C, y por tanto, las células pueden separarse fácilmente incluso después de la diferenciación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un método para la diferenciación de células madre en un estado tridimensional según la presente descripción.

La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra un método para la diferenciación de células madre en un estado bidimensional con una placa de cultivo según la técnica convencional.

La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra un método para la diferenciación tridimensional de células madre solo con una membrana de polímero sin hidrogel.

La figura 4 confirma la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea inducida por el método del ejemplo comparativo 1 (14 días: control I, 5 días: control II), el método del ejemplo comparativo 2 (carril 3, concentración de hidrogel del 0 %) y el método del ejemplo.

La figura 5 confirma la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea inducida por el método del ejemplo comparativo 1, el método del ejemplo comparativo 2 (carril 2) y el método del ejemplo.

La figura 6 confirma los grados de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas del cordón umbilical inducida por el método del ejemplo comparativo 2 (control), el método del ejemplo comparativo 2 100 ng/ml de BMP2 o 20 ng/ml de Wnt3a y el método del ejemplo.

La figura 7 confirma los grados de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas del cordón umbilical inducida por el método del ejemplo durante 1 día, 3 días, 5 días o 7 días.

La figura 8 muestra los resultados de la inducción de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas de la médula ósea (BMMSC), células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo (ADMSC), células madre mesenquimatosas del cordón umbilical (UCMSC), células madre mesenquimatosas derivadas de células madre embrionarias (ESMSC) y células del ligamento periodontal (PDL) por el método del ejemplo comparativo 1, el método del ejemplo comparativo 2 (sin hidrogel) y el método del ejemplo.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

En lo sucesivo, la presente descripción se describirá en detalle con referencia a los ejemplos siguientes. Sin embargo, la presente descripción puede realizarse de diversas formas diferentes y, por tanto, no se limita a las realizaciones que se describen en este documento.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para inducir la diferenciación osteogénica de células madre en un recipiente de cultivo celular, dentro del cual se coloca, de manera que no haya contacto, una membrana porosa con una superficie recubierta con un hidrogel.

La presente solicitud describe un método para inducir la diferenciación osteogénica de células madre durante 3-7 días que comprende:

colocar una membrana porosa sobre el fondo de un recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto; aplicar una solución de hidrogel sobre una superficie de la membrana porosa para recubrirla con una concentración de hidrogel del 1-10 % a través de una transición de fase sol-gel;

sembrar las células madre sobre el recubrimiento de hidrogel; y

cultivar las células madre en un medio de inducción de la diferenciación osteogénica,

en donde el hidrogel está en la fase de gel a la temperatura de cultivo celular, 37 °C, y la viscosidad del hidrogel a 37 °C es de 100 a 106 mPas,

en donde el hidrogel está en fase de sol a una temperatura inferior a la temperatura de cultivo celular,

en donde el hidrogel producido por la transición de fase sol-gel tiene un espesor de 1 mm a 4 mm.

En una realización, el método puede incluir además, antes del cultivo de las células madre en un medio de inducción de la diferenciación osteogénica tras la siembra de las células madre, una etapa de cultivo de las células madre en un medio de tratamiento previo a la diferenciación osteogénica durante 10-24 horas. El medio de tratamiento previo puede tener una concentración de glucosa de 1,5 g/l o inferior.

En una realización, la membrana porosa puede colocarse paralela al fondo del recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto. El orden del recubrimiento de hidrogel sobre la membrana porosa y la colocación de la membrana porosa dentro del recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto no está particularmente limitado. La membrana porosa puede disponerse sobre el fondo del recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto y después recubrirse con hidrogel, o la membrana porosa puede recubrirse con hidrogel previamente y después disponerse dicha membrana porosa recubierta dentro del recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto.

También se describe, pero no se reivindica, una placa o una placa de pocillos usada para el cultivo celular, y el recipiente de cultivo celular no está particularmente limitado, siempre y cuando se utilice para el cultivo celular y pueda introducirse una membrana porosa en el fondo del recipiente de manera que no haya contacto.

Cuando las células se cultivan no horizontalmente dentro del recipiente de cultivo celular para inducir la diferenciación osteogénica de las células madre, puede aplicarse una solución de hidrogel sobre una superficie de la membrana porosa, puede permitirse que las células se adhieran al hidrogel y después la membrana resultante puede colocarse dentro del recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto para inducir la diferenciación osteogénica.

Según la presente invención, las células madre se cultivan en el medio de inducción de la diferenciación osteogénica durante 3-7 días.

En una realización, el medio fluye entre la membrana porosa y el recipiente de cultivo celular para aumentar el área superficial de contacto entre las células madre y el medio, con lo que se acorta la duración de la inducción de la diferenciación osteogénica. La membrana porosa y el hidrogel de la presente descripción permiten el paso del aire y el medio, y el medio fluye para llenar el espacio entre la membrana porosa y el recipiente de cultivo celular que se genera al disponer la membrana porosa y el recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto, de modo que el medio y el aire fluyen incluso en la porción adherida de las células y, así, las células madre están en contacto con el medio y el aire con un área superficial más extensa, lo que acorta la duración de la inducción de la diferenciación osteogénica. Por ejemplo, el método de diferenciación osteogénica existente requiere de tres a cinco semanas, pero la diferenciación osteogénica por el método de la presente descripción tiene lugar dentro de 3-7 días.

El recipiente de cultivo celular de la presente descripción se refiere generalmente a una placa o una placa de pocillos usada para el cultivo celular, y el recipiente de cultivo celular no está particularmente limitado, siempre y cuando se utilice para el cultivo celular y pueda introducirse una membrana porosa en el fondo del recipiente de manera que no haya contacto.

En una realización, la transición de fase sol-gel de la solución de hidrogel (hidrosol) a hidrogel puede realizarse a 37 °C durante 1 a 2 horas.

En una realización, el hidrogel puede incluir hidrogeles al 1-40 % y más preferiblemente hidrogeles al 1-15 %. La diferenciación de las células madre no se produce con hidrogel al 0 % y la eficiencia de la diferenciación osteogénica no aumenta y por tanto no es significativa para hidrogeles al 40 % o más. Sin embargo, la concentración del hidrogel no se limita a la anterior.

En una realización, los hidrogeles al 1-40 % pueden recubrir la membrana porosa con 200-300 |jl/cm2 y el espesor de los hidrogeles formados a través de la transición de fase sol-gel puede ser de 1-4 mm.

Según la presente invención, la viscosidad a 37 °C del hidrogel es de 100 a 106 mPas, dependiendo de la concentración (%) del hidrogel. En un hidrogel con un tamaño de poro fuera del intervalo, la adhesión o diferenciación de las células madre puede ser difícil. El hidrogel de la presente descripción está en la fase de gel a la temperatura de cultivo celular, 37 °C, y de este modo las células se cultivan dentro y fuera del gel. El hidrogel de la presente descripción pasa a la fase de sol a una temperatura inferior a la temperatura de cultivo celular, con lo que se facilita la separación de las células después de la diferenciación celular.

En una realización, la membrana porosa puede tener un tamaño de poro de 0,1-8 jm , pero el tamaño de poro no está limitado siempre y cuando dicho tamaño de poro sea tal que el medio y el aire puedan pasar a través de la membrana porosa, pero el hidrogel no pueda pasar a través de la membrana porosa.

En una realización, las células madre pueden se células madre mesenquimatosas del cordón umbilical, células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo, células madre mesenquimatosas derivadas de células madre embrionarias, células del ligamento periodontal o células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea. El origen de las células madre no está particularmente limitado y ejemplos de las mismas pueden ser células de origen humano, de mono, cerdo, caballo, vaca, oveja, perro, gato, ratón y conejo. Las células madre son preferiblemente células de origen humano, pero no se limitan a las mismas.

Como se usa en este documento, el término “membrana porosa” o “membrana de polímero” se refiere a una membrana porosa, una membrana permeable o un material de tipo pelicular, a través del cual pasa el medio o el aire, pero no puede pasar el hidrogel. Cualquier estructura porosa a través de la cual pueda pasar el medio de cultivo celular y el aire no está particularmente limitada.

Como se usa en este documento, el término “hidrogel” se refiere a un material en donde un líquido, que contiene agua como medio de dispersión, solidifica a través de una transición de fase sol-gel para perder fluidez y formar una estructura porosa. Cualquier hidrogel adecuado para la adhesión y el cultivo celular no está particularmente limitado y en una realización de la presente descripción se usó un biogel sintético biodegradable.

Como se usa en este documento, el término “células madre” se refiere a células indiferenciadas con potencial de autorrenovación y diferenciación. Las células madre incluyen los subgrupos de las células madre pluripotentes, células madre multipotentes y células madre unipotentes, según su capacidad de diferenciación. Las células madre pluripotentes son células madre que tienen potencial para diferenciarse a todos los tejidos, y las células madre multipotentes son células que no tienen el potencial de diferenciarse a todos los tipos de tejidos o células, pero sí a varios. Las células madre unipotentes son células que tienen el potencial de diferenciarse a un tipo de tejido o célula particular. Las células madre pluripotentes pueden incluir células madre embrionarias (células ES) o células madre pluripotentes inducidas (células iPS). Las células madre multipotentes pueden incluir células madre adultas, tales como las células madre mesenquimatosas (derivadas de grasa, médula ósea, sangre del cordón umbilical o del cordón umbilical, etc.), células madre hematopoyéticas (derivadas de la médula ósea o la sangre periférica), células madre neurales o células madre germinales. Las células madre unipotentes pueden incluir células madre comprometidas para hepatocitos, que normalmente están inactivas, con baja capacidad de autorrenovación, pero se diferencian vigorosamente a hepatocitos en ciertas condiciones.

También se describe, pero no se reivindica un aparato para la diferenciación de células madre, en donde el sistema incluye:

un recipiente de cultivo celular; y

una membrana porosa configurada para tener una superficie a la que se une un hidrogel, en donde las células han de adherirse al hidrogel,

en donde la membrana porosa con el hidrogel unido está dispuesta dentro del recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto.

En una realización, la membrana porosa y el hidrogel pueden permitir el paso del aire y el medio.

Modo de llevar a cabo la invención

La presente descripción se describirá en más detalle a través de los ejemplos siguientes. Sin embargo, los ejemplos siguientes se proporcionan solamente para ilustrar la presente descripción y no para restringir el alcance de la presente descripción.

[EJEMPLO]

Ejemplo 1:Método de diferenciación de células madre en estado tridimensional

Con el fin de estimular la diferenciación de células madre, se llevó a cabo un ensayo de diferenciación tridimensional de células madre. Para ello, se proporcionó una membrana de polímero con un espesor de 0,4-1 |jm (Corning, EE. UU.) en posición horizontal con respecto al fondo de una placa o pocillo de cultivo celular, de manera que no hubiera contacto. Se disolvió un biogel sintético biodegradable (BASF, Alemania) en agua destilada terciaria estéril para preparar geles de diversas concentraciones (%). Después, las membranas de polímero se recubrieron con 250 jl/cm2 de los biogeles sintéticos biodegradables preparados, que se solidificaron a 37 °C durante 1 hora y 30 minutos, con lo que se fabricaron los recipientes de cultivo celular. El espesor del biogel sintético biodegradable después de la transición de fase sol-gel fue de al menos 1 mm y como media de 2,5 mm. Las células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo en medio CEFOgro para ADMSC (CB-ADMSC-GM, CEFO, Corea), las células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea en medio CEFOgro para BMMSC (CB-BMMSC-GM, CEFO, Corea), las células madre mesenquimatosas derivadas de células madre embrionarias en medio CEFOgro para ESMSC (CB-ESMSC-GM, CEFO, Corea), las células madre mesenquimatosas del cordón umbilical en medio CEFOgro para UCMSC (CB-UCMSC-GM, Ce FO, Corea) y las células del ligamento periodontal (PDL) en medio CEFOgro para PDL (CB-PDL-GM, CEFO, Corea) se cultivaron en la incubadora de CO2 a 37 °C durante 3-4 días. A continuación, cada tipo de células madre se sembró en el biogel y se les añadió el medio de tratamiento previo a la diferenciación osteogénica (CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Corea), a lo que siguió su cultivo en la incubadora de CO2 a 37 °C durante 18 horas. Seguidamente, el medio se sustituyó por el medio para la inducción de la diferenciación osteogénica (CB-DM-Osteo, CEFO, Corea) y la diferenciación osteogénica se indujo en el incubador de CO2 a 37 °C durante 5 días (figura 1).

Ejemplo comparativo 1:Método de diferenciación de células madre en estado bidimensional

Se diferenciaron células madre por un método de diferenciación bidimensional, que es el método convencional de diferenciación de células madre. Específicamente, las células se sembraron en el recipiente (placa) de cultivo celular de 12 pocillos y se cultivaron en el medio de tratamiento previo (CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Corea) a la inducción de la diferenciación osteogénica hasta que la densidad celular alcanzó el 85-90 %. A continuación, el medio se sustituyó por el medio de inducción de la diferenciación osteogénica (CB-DM-Osteo, CEFO, Corea), a lo que siguió la inducción de la diferenciación osteogénica durante 14-21 días (figura 2).

Ejemplo comparativo 2: Método de diferenciación de células madre en estado tridimensional sin hidrogel

Con el fin de investigar la diferenciación de células madre cuando la concentración de biogel sintético biodegradable en la membrana de polímero en el ejemplo 1 es el 0 % (solo está presente la membrana de polímero), las células madre se sembraron sobre la membrana de polímero y luego se cultivaron durante 5 días al igual que en el ejemplo 1 (figura 3).

Ejemplo de prueba 1:Verificación de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea

Las células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea sometidas a diferenciación osteogénica inducida por el método del ejemplo comparativo 1 durante 14 días o 5 días, las células madre derivadas de la médula ósea sometidas a diferenciación osteogénica inducida por el método del ejemplo comparativo 2 (biogel sintético biodegradable al 0 %) durante 5 días y las células madre derivadas de la médula ósea sometidas a diferenciación osteogénica por el método del ejemplo anterior (biogel sintético biodegradable al 5 %, 10 % o 15 %) se observaron visualmente para determinar la diferenciación osteogénica con un microscopio de contraste de fase. Además, con el fin de investigar las células diferenciadas osteogénicamente mediante tinción con rojo de alizarina, las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con alcohol etílico al 70 % a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se lavaron dos veces con agua destilada terciaria. A continuación, las células se trataron con la solución I del kit de tinción con rojo de alizarina (CB-SK-Osteo) y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, las células se lavaron tres veces para limpiarlas con la solución II y se sometieron a análisis de imágenes con un microscopio invertido (LEICA, Alemania). Asimismo, para la digitalización de los resultados, después de la generación de las imágenes, las células se trataron con la solución III y se dejaron reaccionar durante 30 minutos para disolver por completo el reactivo de tinción. Después se tomaron 100 |jl de la solución disuelta, se pusieron en una placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 550 nm. Como resultado, no se alcanzó la diferenciación osteogénica cuando dicha diferenciación osteogénica se indujo por el método del ejemplo comparativo 1 durante 5 días ni cuando la diferenciación osteogénica se indujo por el método del ejemplo comparativo 2 durante 5 días, pero se logró una diferenciación osteogénica suficiente cuando dicha diferenciación osteogénica se indujo por el método del ejemplo durante 5 días. Especialmente, pudo observarse que, con respecto a la diferenciación osteogénica por el método del ejemplo anterior, la diferenciación osteogénica se produjo favorablemente en todos los hidrogeles del 1 al 30 %, y la máxima diferenciación osteogénica se alcanzó para una concentración del 10 % (figura 4).

Ejemplo de prueba 2: Verificación de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo

Las células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo sometidas a diferenciación osteogénica inducida por el método del ejemplo comparativo 1 durante 14 días, las células madre derivadas de la médula ósea sometidas a diferenciación osteogénica inducida por el método del ejemplo comparativo 2 (biogel sintético biodegradable al 0 %) durante 5 días, y las células madre derivadas de la médula ósea sometidas a diferenciación osteogénica inducida por el método del ejemplo anterior (biogel sintético biodegradable al 5 %, 10 % o 15 %) se observaron visualmente para determinar la diferenciación osteogénica con un microscopio de contraste de fase. Además, con el fin de investigar las células diferenciadas osteogénicamente mediante tinción con rojo de alizarina, las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con alcohol etílico al 70 % a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se lavaron dos veces con agua destilada terciaria. A continuación, las células se trataron con la solución I del kit de tinción con rojo de alizarina (CB-SK-Osteo) y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, las células se lavaron tres veces para limpiarlas con la solución II y se sometieron a análisis de imágenes con un microscopio invertido (LEICA, Alemania). Como resultado, pudo observarse que nunca se produjo diferenciación osteogénica cuando dicha diferenciación osteogénica se indujo por el método del ejemplo comparativo 2 durante 5 días, pero cuando la diferenciación osteogénica se indujo por el método del ejemplo durante 5 días, dicha diferenciación osteogénica se produjo favorablemente en todos los hidrogeles biosintéticos del 1 al 30 % y la máxima diferenciación osteogénica se alcanzó para una concentración del 5-10 % (figura 5).

Ejemplo de prueba 3:Verificación de la diferenciación osteogénica en células madre mesenquimatosas del cordón umbilical

Las células madre mesenquimatosas del cordón umbilical sometidas a diferenciación osteogénica inducida por el método del ejemplo comparativo 2 durante 5 días, las células madre mesenquimatosas del cordón umbilical sembradas por el método del ejemplo comparativo 2, tratadas con 100 ng/ml de proteína morfogénica ósea 2 (BMP 2, Preprotech, Israel) o 20 ng/ml de Wnt3a (Preprotech, Israel) y sometidas después a la inducción de la diferenciación osteogénica durante 5 días, y las células madre mesenquimatosas del cordón umbilical sometidas a diferenciación osteogénica por el método del ejemplo anterior (biogel sintético biodegradable al 10 %) se observaron visualmente para determinar la diferenciación osteogénica con un microscopio de contraste de fase. Además, con el fin de investigar las células diferenciadas osteogénicamente mediante tinción con rojo de alizarina, las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con alcohol etílico al 70 % a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se lavaron dos veces con agua destilada terciaria. A continuación, las células se trataron con la solución I del kit de tinción con rojo de alizarina (CB-SK-Osteo) y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, las células se lavaron tres veces para limpiarlas con la solución II y se sometieron a análisis de imágenes con un microscopio invertido (LEICA, Alemania). Asimismo, para la digitalización de los resultados, después de la generación de las imágenes, las células se trataron con la solución III y se dejaron reaccionar durante 30 minutos para disolver por completo el reactivo de tinción. Después se tomaron 100 |jl de la solución disuelta, se pusieron en una placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 550 nm. Como resultado, la eficiencia osteogénica fue significativamente excelente en las células madre mesenquimatosas del cordón umbilical al usar el método del ejemplo de la presente descripción, en comparación con la diferenciación osteogénica inducida por el método del ejemplo comparativo 2 durante 5 días, más el tratamiento con BMP y Wnt3a que se sabe que estimula la diferenciación osteogénica (figura 6).

Ejemplo de prueba 4: Verificación del cambio en función de la duración de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas del cordón umbilical

Las células madre mesenquimatosas del cordón umbilical sometidas a diferenciación osteogénica durante 1, 3, 5 o 7 días por el método del ejemplo anterior (biogel sintético biodegradable al 10 %) se sometieron a un análisis de imágenes mediante tinción con rojo de alizarina. Además, para la digitalización de los resultados, se midió la absorbancia a 550 nm. Como resultado, la inducción de la diferenciación osteogénica comenzó el 1er día de dicha inducción de la diferenciación osteogénica y la diferenciación osteogénica fue más intensa a medida que aumentó la duración de dicha diferenciación osteogénica. Especialmente, las células madre mesenquimatosas del cordón umbilical, de las que se sabe que experimentan menor diferenciación osteogénica en el método bidimensional convencional en comparación con los otros tipos de células madre mesenquimatosas, mostraron una diferenciación osteogénica favorable en el método de diferenciación osteogénica tridimensional del ejemplo de la presente descripción, similar a la de los otros tipos de células madre mesenquimatosas (figura 7).

Ejemplo de prueba 5: Verificación de la diferenciación osteogénica en diversos tipos de células madre mesenquimatosas

Se sometieron células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo, células madre mesenquimatosas del cordón umbilical, células madre mesenquimatosas derivadas de células madre embrionarias y células del ligamento periodontal a la inducción de la diferenciación osteogénica por el método del ejemplo comparativo 1 durante 14 días, el método del ejemplo comparativo 2 (biogel sintético biodegradable al 0 %) durante 5 días o el método del ejemplo anterior (biogel sintético biodegradable al 10 %) durante 5 días y luego se investigó el grado de diferenciación osteogénica de cada tipo de células madre mesenquimatosas mediante tinción con rojo de alizarina.

Como resultado, no se indujo la diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimatosas cuando dicha diferenciación osteogénica se indujo durante 5 días por el método del ejemplo comparativo 1 o el método del ejemplo comparativo 2, pero la diferenciación osteogénica se indujo favorablemente con independencia del origen de las células madre mesenquimatosas cuando dicha diferenciación osteogénica se indujo tridimensionalmente sobre el biogel sintético biodegradable durante 5 días (figura 8).

Como se describe anteriormente, se verificó que la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimatosas requiere aproximadamente 2-5 semanas en el método de diferenciación osteogénica convencional, pero que la diferenciación osteogénica tiene lugar dentro de 3-7 días cuando se usa el método de diferenciación osteogénica de la presente descripción, que comprende colocar la membrana de polímero sobre el recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto, recubrirla con el hidrogel, sembrar las células madre mesenquimatosas sobre el mismo, cultivar las células madre mesenquimatosas en el medio de tratamiento previo a la diferenciación osteogénica y tratar las células madre mesenquimatosas con el medio de inducción de la diferenciación osteogénica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para inducir la diferenciación osteogénica de células madre durante 3-7 días que comprende: colocar una membrana porosa sobre el fondo de un recipiente de cultivo celular de manera que no haya contacto; aplicar una solución de hidrogel sobre una superficie de la membrana porosa para recubrirla con una concentración de hidrogel del 1-10 % a través de una transición de fase sol-gel;

sembrar las células madre sobre el recubrimiento de hidrogel; y

cultivar las células madre en un medio inducción de la diferenciación osteogénica,

2. El método de la reivindicación 1, en donde el medio fluye entre la membrana porosa y el recipiente de cultivo celular para aumentar el área superficial de contacto entre las células madre y el medio, con lo que se acorta la duración de la inducción de la diferenciación osteogénica.

3. El método de la reivindicación 1, en donde las células madre son células madre mesenquimatosas del cordón umbilical, células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo, células madre mesenquimatosas derivadas de células madre embrionarias, células del ligamento periodontal o células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la transición de fase sol-gel se realiza a 37 °C durante 1 a 2 horas.