KR102508357B1

KR102508357B1 - 갈색지방 유래 간엽줄기세포의 골 분화를 이용한 개과 동물의 골 조직 재생용 세포치료제 및 이것의 제조 방법

Info

Publication number: KR102508357B1
Application number: KR1020180126642A
Authority: KR
Inventors: 박현숙; 이순례; 박창원; 김지은; 차상호; 이지현; 조인수
Original assignee: (주)세포바이오; 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2023-03-09
Also published as: KR20200045744A

Abstract

본 발명은 개과 동물의 골 결손을 치료할 수 있는 세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 세포 치료제는 개과 동물의 갈색지방에서 유래한 간엽줄기세포를 연골 또는 골로 분화시켜서, 이러한 초기 분화된 간엽줄기세포를 포함하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포치료제는 이러한 초기 분화된 간엽줄기세포를 하이드로겔 캡슐에 주입하여 동물의 상처 부위에 삽입함으로써 효과적으로 치료효과를 제공할 수 있다.

Description

갈색지방 유래 간엽줄기세포의 골 분화를 이용한 개과 동물의 골 조직 재생용 세포치료제 및 이것의 제조 방법{Cell therapy for Canine bone regeneration using Osteogenic differentiation of brown fat tissue derived stroma cell and methods for producing the same}

본 발명은 개과(canine) 동물의 갈색지방에서 유래한 골분화 유도된 간엽줄기세포를 이용하여 개과 동물의 골질환 치료용 세포치료제 및 이것의 제조방법에 관한 것이다.

현대 사회는 고령화 및 독신가구의 증가에 따라 정신적으로 소외감을 느끼는 인구가 증가하고 경제성장과 더불어 미국, 유럽, 일본 등에서 반려동물의 수가 급격히 증가하고 있다. 미국과 유럽의 경우는 국민 1인당 GDP가 1만 달러에 도달한 경우 반려동물 문화가 시작되고, 2만 달러의 경우 발전단계, 3만 달러에 도달하면 동물의 인격화 단계가 나타난다고 한다. 국내의 경우도 반려동물 시장이 확장하면서 매년 동물 의료 산업이 증대되고 있으며 2020년에는 현재의 3 내지 4배 수준으로 증대될 것으로 예상되고 있고 있다. 반려동물에 대한 양질의 의료서비스 제공 차원과 앞으로 성장할 시장 상황을 고려하여 반려동물을 위한 세포치료제 개발의 필요성이 증가하고 있다.

동물용 골세포치료제 개발은 반려동물의 골 손상, 시력손상 등의 난치성 질환을 치료할 수 있다. 나아가 인체 질환과 유사한 질환동물 모델로서 치료제의 효능 및 독성 평가 등의 전임상 단계의 인체 적용 세포치료제에 대한 평가 지표를 마련할 수 있다. 또한, 인체 질환과 비슷한 질환동물 모델의 사용을 통해 임상연구의 비용부담을 경감시키는 등의 경제적 효과를 얻을 수 있기 때문에 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.

골절 또는 골 결손은 노화가 진행될수록 완전 치유가 어렵고 치유 속도도 느리기 때문에 인간을 포함한 동물에서 생명의 위협을 가할 수 있는 부상이 될 수 있다. 특히, 골 결손으로 인한 합병증으로 불유합(nonunion)이 심각해지면 신체장애를 유발할 수 있어서 삶의 질을 저하시킬 수 있다. 이러한 골절과 관련 질환을 치유하기 위한 다양한 치료법이 수십 년 동안 연구되어 왔으며, 최근 줄기세포 치료법이 효과적인 방법으로 각광을 받고 있다.

지난 30년 동안 골수유래 줄기세포(Bone Marrow-derived Stem Cells; MSCs)는 재생 의학 연구를 위한 대중적인 세포 공급원으로 사용되어 왔으나, 골수유래 줄기세포는 분리 절차가 기증자와 환자를 침해하며, 줄기세포의 수 자체가 적다는 단점이 있다. 지방조직이 체내에 풍부하게 존재하므로 지방유래 줄기세포(Adipose-derived stem cells; ADMSCs)는 골 재생 치료를 위한 세포 공급원으로 많이 사용되고, 골수 또는 혈관에서 유래하는 세포 공급원에 비해 쉽게 구할 수 있다. 또한, 지방유래 줄기세포는 골수유래 줄기세포보다 골 형성과 혈관 신생을 개선시켜 더 나은 골 치료 효과를 보인다. 그런데, 인간 외 동물과 관련된 줄기세포치료의 성공사례는 지속적으로 증가하고 있지만 이는 인간 줄기세포 치료제의 효능 혹은 안전성을 확보하기 위한 비임상 시험이나 사전 시험에 불과하여 본격적인 반려동물을 위한 세포치료제의 개발이 필요하다. 특히, 노령견에서는 골관절염, 골다공증 등 뼈와 관련한 질환이 다발하는데, 그 치료법이 소염진통제나 면역억제제 등에 국한되어 있는 실정이므로, 적극적 치료제의 개발이 요구된다.

대한민국 공개특허 제10-2010-0084142호

본 발명은 개과 동물의 골 질환의 치료용 세포 치료제를 개발하여, 골 분화와 세포 간 신호전달같은 골 형성 생체 활성을 통하여 뼈의 치유력을 증가시키는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 기존 골 결손 질환의 세포 치료제 방법인 자가이식 또는 동종이식에 의하여 유발되는 합병증, 공급 부족, 면역결핍 및 질병 전염과 같은 임상적 과제를 해결하고자 한다. 또한, 본 발명은 개과 동물의 지방 유래 간엽줄기세포를 채취하여 이를 골분화 유도시켜 골 결손 또는 골 손상의 치료를 위한 세포치료제를 제조하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태로서, 개과 동물의 지방에서 추출한 간엽줄기세포를 12 내지 48시간동안 골세포로 분화 유도시킨 줄기세포를 포함하는 개과 동물의 골 결손 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 개과 동물의 지방은 갈색 지방인 것을 특징으로 한다.

상기 지방에서 추출된 줄기세포는 CD44, CD73, CD90가 양성 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태로서, 개과 동물의 지방에서 추출된 줄기세포를 포함하는 치료용 조성물을 하이드로 겔 내에 캡슐화하여 세포 치료제를 제공하는 것이다.

상기 골세포 분화는 3차원적 분화 방법에 의하여 유도되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 양태로서, 개과 동물의 골결손 치료제를 제조하는 방법을 제공하는데, 다음의 단계를 포함한다:

(i) 개과 동물의 지방에서 줄기세포를 추출하는 단계;

(ii) 상기 추출된 지방줄기세포를 12 내지 48시간동안 골세포로 분화 유도시키는 단계; 및

(iii) 상기 골세포로 분화 유도된 줄기세포를 하이드로겔 캡슐에 삽입하는 단계.

본 발명에 따른 개과 동물의 골질환 치료용 세포치료제는 골 형성 및 골 분화와 같은 뼈 형성 생체 활성 작용에 의하여 뼈 치유를 증가시킨다. 이러한 생체 활성 작용에 의하여 이식된 줄기세포가 세포 성장, 세포 증식, 영양 공급 및 뼈 조직 침착을 촉진하기 위해 물리적 및 생화학적으로 지지함으로써 골 질환을 효과적으로 치유할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 골 결합의 이식 부위의 모양과 크기에 맞는 생체적합성 하이드로 겔에 세포를 캡슐화시켜, 세포치료제를 구성하는 세포의 손실을 방지하고, 생체 내 다른 부위로의 이동을 방지하는 효과를 제공한다.

도 1은 ADMSC는 Flow Cytometry 분석 결과 CD44, CD73 및 CD90과 같은 전형적인 간엽 줄기세포와 유사한 CD 마커를 나타내었다. 이 세포들은 전형적인 간엽 줄기세포와 동일한 CD44, CD73 및 CD90의 양성 반응을 보였으나 CD73은 매우 낮은 발현 수준이었다.
도 2는 개의 지방유래 간엽줄기세포와 인간의 지방유래 간엽줄기세포의 구성을 확인하기 위한 젤 사진이다. 여기서 UCP 1은 갈색지방 표지자이다. 인간의 지방 유래 간엽줄기세포(hADMSC)는 음성대조군으로 이용되었다. 인간의 경우 UCP 1이 발현을 하지 않아 백색지방이 대부분임을 알 수 있다. 개의 지방유래 간엽줄기세포(cADMSC)에서는 UCP1이 대부분 발현되어, 갈색지방으로 이루어짐을 확인할 수 있었다.
도 3은 골 분화 유도기간에 따른 세포생존율을 확인하였다. 그 결과, 분화 유도 기간에 따라 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다.
도 4는 ADMSC의 골 형성 유도를 ALP 활성 분석에 의해 확인하였다.
도 5는 본 발명의 세포 치료제와 대조군, 미분화 간엽줄기세포를 각각 쥐의 두개골에 이식한 후 그 치료효과를 엑스레이 사진으로 확인한 결과이다. G1은 아무것도 넣지 않은 대조군이고, G2는 분화시키지 않은 간엽줄기세포를 이식한 군이고, G3는 골분화 유도한 줄기세포를 이식한 시험군이다.
도 6은 본 발명의 세포 치료제와 대조군을 각각 주입한 개의 대퇴골 치료 효과를 엑스레이 사진으로 확인한 결과이다. Dog1은 대조군이고, Dog2는 세포치료제만 주입한 군이고, Dog 3은 세포치료제와 면역억제제를 주입한 군이다. 면역처리제 없이 분화세포만을 처리한 Dog2에서 골재생효과가 가장 우수함을 확인하였다.
도 7은 세포 캡슐화를 위한 하이드로겔의 캡슐 제조의 모식도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본원 명세서에서 사용되는 “개과 동물(canine)”은 늑대, 코요테 및 여우와 같은 야생, 동물원 및 사육(domestic)견들이다. 개과 동물은 개, 예를 들어, 순종 및/또는 잡종 반려견(companion dog), 쇼견(show dog), 사역견(working dog), 목양견(herding dog), 수렵견(hunting dog), 호위견(guard dog), 경찰견(police dog), 경주견(racing dog) 및/또는 실험견(laboratory dog)과 같은 개들, 특히 사육견도 포함한다.

본원 명세서에서 사용되는 “간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSC)”란 중배엽에서 유래되며, 간엽 조직(예, 조골세포로부터 유래된 뼈), 치아 조직, 연골, 힘줄, 골수 기질 또는 근육 등의 세포를 형성하는 증식성 전구 세포 또는 부분 분화된 세포를 의미한다. 간엽줄기세포는 골수, 골막, 해면질 골, 지방, 활액막, 평활근, 폐, 유치, 탯줄, 제대혈 그리고 제대 등 다양한 조직에서 얻을 수 있다.

본원 명세서에서 사용되는 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다. 특히, 줄기세포의 분화는 줄기세포가 특정 기능을 가지는 세포로 방향성을 가지고 발달하는 현상을 의미하는 것이다.

본원 명세서에서 사용되는 용어 “골세포로 초기 분화 유도된 세포”는 골 발달(bone development) 단계에 있어서 미성숙 골모세포 혹은 골모세포 전구세포 (pre-osteoblast) 분화 단계까지 분화된 세포를 의미하는 것으로서, 골모세포 전구세포(pre-osteoblast) 또는 성숙한 골모세포까지를 포함한다. 줄기 세포에서 골분화가 진행됨에 따라, 골원성 세포의 특징적인 인자들을 발현하기 시작한다. 예를 들면, 간엽 줄기 세포에 의해 발현되는 골아세포 분화의 초기 표식이 되는 알칼라인 포스파타아제의 발현 수준이 증가된다.

본원 명세서에서 사용되는 용어 “골 재생능”은 손상, 결실 또는 결손된 뼈를 재생(regeneration) 또는 치유하는 것을 의미한다. 본원 명세서에서 사용되는 용어 “연골 재생능”은 손상, 결실 또는 결손된 연골을 재생 또는 치유하는 것을 의미한다.

본원 명세서에서 사용되는 용어 “캡슐화”는 알지네이트와 같은 하이드로겔에 줄기세포를 혼합하여 특정한 모형을 만들어 결손 또는 손상된 부위에 삽입하기 용이하게 제작하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명에 따른 개과 동물에서 유래한 지방추출 줄기세포를 이용하여 골재생능을 갖는 세포 치료제 및 그 제조방법에 대하여 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명이 이러한 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태로서, 개과 동물의 지방에서 추출된 줄기세포를 12 내지 48시간동안 골세포로 초기 분화 유도시킨 줄기세포를 포함하는 개과 동물의 골결손 치료용 세포 치료제를 제공할 수 있다.

상기 줄기세포는 다양한 세포공급원에서 채취할 수 있다. 탯줄유래 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래 간엽줄기세포는 골 형성 조건 하에서 골 조직 형성을 촉진할 수 있을 뿐 아니라 골 분화능을 제공한다.

상기 지방유래 간엽줄기세포는 갈색지방에서 채취되는 것을 특징으로 한다. 지방은 갈색지방과 백색지방으로 분류되는데, 개과 동물의 경우 갈색지방의 비율이 백색지방보다 월등히 높다.

지방유래 간엽줄기세포는 그 생존률이 시간이 지날수록 급격히 떨어지므로 간엽줄기세포의 생존률이 높으면서 골 재생능이 우수한 줄기세포의 분화 시간을 찾는 것이 중요하다. 이에, 본 발명의 세포치료제에 사용되는 줄기세포는 골세포로 초기 분화를 약 12 내지 48시간동안 유도한 경우에 골 재생능이 우수하면서 생존율이 높음을 확인하였다.

본 발명의 다른 양태로서, 개과 동물의 골결손 치료제를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 다음 단계를 포함한다:

(i) 개과 동물의 지방에서 줄기세포를 추출하는 단계;

(ii) 상기 추출된 줄기세포를 12 내지 48시간동안 골세포로 분화 유도시키는 단계; 및

(iii) 상기 골세포로 분화 유도된 줄기세포를 하이드로겔의 캡슐에 삽입하는 단계.

[실시예 1: 줄기세포의 준비 및 배양]

1-1. 세포 배양

개과 동물의 지방조직에서 유래된 간엽 줄기세포(cADMSCs)의 분리를 위해 약 2-3g의 지방 조직을 획득하였다. 먼저, 지방조직을 5% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, USA)을 함유한 PBS로 2회 세척한 후, 지방조직을 가능한 한 잘게 저몄다. 이 지방조직에 재조합 콜라게아나제(CEFO Co., Korea)를 첨가하여 37 ℃ 항온 배양기에서 30분간 반응시켰다. 상기 미분화된 cADMSC를 37 ℃, 5% CO₂-가습 항온 조건에서 0.5 % 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 CEFO gro ™ cADMSC (CEFO Co., KOREA) 배지를 사용하여 유지시켰다.

1-2. 세포 특성 규명

cADMSCs 세포 특성 분석을 위하여 세포표면 발현 단백질로 CD44, CD73, CD90과 같은 항체를 BD Science사에서 구매하여 확인하였다. 상기 세포는 1% BSA가 함유된 차가운 인산 완충용액 (PBA, 1% BSA in Phosphate buffer saline)으로 2회 세척한 후, 1% PBA용액에 1/100로 희석된 1차 항체와 함께 냉장 조건에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 이후 1% PBA로 2회 세척하고 2차 항체와 함께 냉암소(冷暗所)에서 30분 동안 반응시키고 PBS (Phosphate Buffer Saline)로 2회 세척한 후 2% 포름말데히드에 고정하였다. 준비된 샘플은 빛이 차단된 상태로 보관되었으며 유세포분석기(flow chytometry)인 FACSCalibur™(BD Science)를 이용하여 샘플당 2,000개의 세포를 읽어 분석하였다. 세포표면 발현 단백질의 분석은 BD CellQuest™Pro 프로그램을 이용하여 분석하였다 (도 1).

1-3. 세포 제조 및 보존

1-1항에서 3일 동안 배양기에서 유지된 중간엽 줄기세포(cADMSCs)를 PBS로 2회 세척한 후, 트립시나이제를 3분간 처리하여 1500rpm에서 원심분리한 후 세포계수기로 세포수를 측정하고, 5x10

개의 세포를 CEFO FM ™ cADMSC (CEFO Co., KOREA) 1ml에 혼합하여 동결보존하였다.

[실시예 2: 줄기세포의 골분화 유도]

2-1. 골 분화

골 형성 분화를 위해, 패시지 3의 cADMSC를 패시지 5까지 계대배양 하였다. 골세포 분화를 위해, 15% 폴록사머 하이드로겔(Sigma)이 코팅된 배양용기(Hyperflask, Corning Co.)에 계대 5의 cADMSC (50,000 세포/cm²)에 접종하고, 24시간 정도 지나 세포밀도가 80%에 도달하였을 때 골분화 유도배지인 CEFOgro^™DM Osteo로 교체하여 18시간 동안 골 형성을 유도하였다.

2-2. 골 분화의 분석

15% 폴록사머 하이드로겔 기반의 3차원 세포분화 방법으로 분화 유도된 세포의 골 형성 분화의 분석을 위해, 상기 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 4℃에서 10 분간 70% 에탄올로 고정시킨 후, 증류수로 3회 세척하였다. 알칼리 포스파타아제(ALP) 활성 분석을 수행하여 골 분화 정도를 확인하였다. ALP 분석을 위해, 분석 키트를 GeneTex inc.에서 구입하여, 권장 프로토콜에 따라 수행하였다. 세포 생존력은 뼈 분화 기간에 따라 propidium Iodide staining 원리에 기초한 자동 세포 계수기(ADAM, Nano & Tek)를 사용하여 분석하였다. PI 염색 및 분석 방법은 제조업체가 제공한 프로토콜에 따랐다.

[실시예 3: 줄기세포 캡슐화]

3-1 : 개의 대퇴골 모델용 줄기세포 캡슐화

개과 동물의 긴 뼈에 세포를 이식하기 위해, 골 분화된 세포를 하이드로 겔로 캡슐화하였다(4 x 10⁶ cells / capsule). 하이드로 겔 기반 임플란트에 대해 하이드로겔 및 금형을 다음과 같이 준비하였다: 알긴산 나트륨 (W201502, Sigma-Aldrich) 2.5 % 프리 겔 용액을 세포 배양액에 60 ℃에서 1 시간 동안 녹여 제조하였다. 3D 프린터(In vivo bio-printer, Rokit, Korea)를 이용하여 PCL 기반 원통형 금형(지름 : 4.5mm, 높이 : 20mm)을 제작하였다. 세포의 캡슐화를 위해, 세포를 수확하고 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 이어서, 세포가 잘 혼합된 예비-겔 용액을 금형 내로 주입하였고, 가교제(5 % 염화칼슘)를 사용하여 15분 동안 가교 결합시켰다. 세포를 함유한 알긴사 나트륨 기반의 하이드로 겔을 세포 배지를 통해 3회 세척하였다. 이식될 때까지 4℃에서 캡슐화된 세포를 CEFO-vive™ (CEFO Co., Korea) 1ml를 이용하여 보관하였다(도 7)

[실시예 4: 동물 실험]

4-1: 쥐 두개골 결손 모델

쥐 두개골 결손 모델을 이용한 줄기세포의 효능을 확인하기 위하여 cADMSC를 증식용 배지인 CEFOgro™cADMSC로 배양하여 증식한 미분화 cADMSC와 15% 폴록사머 하이드로겔 기반의 3차원 분화 시스템이 적용되어 18시간 동안 골분화 유도된 세포를 1X10⁶ cells로 각각 준비하였다.

쥐 두개골 결손은 4mm 원형으로 좌, 우 양쪽에 1개씩 펀칭하여 마리당 2개의 두개골 결손을 만들었고 세포 팰렛과 피브린을 섞어 100㎕를 만든 후 골 결손 부위에 이식하고 이식 부위를 PCL membrane으로 덮은 후 봉합하였다. 후속 처리로 면역억제제(cyclosporin A)를 8주간 5㎎/㎏으로 처리하였다. 8주후 피브린만처리한 대조군과 미분화 cADMSC를 처리한 시험군1과 골분화 유도된 cADMSC를 처리한 시험군2를 희생시킨 후 microCT(Quantum FX, PerkinElmer, USA)를 사용하여 이미지를 촬영하고 분석하였다.

4-2: 개의 대퇴골 결손 모델 실험 및 분석

본 실험에서는 9 개월 된 수컷 개(Beagle, Woojung BSC, Korea)를 사용하였다. 상기 동물은 상대 습도 50 ± 10 % 및 12 시간 명암 사이클을 사용하여 22 ± 2˚C의 방에서 유지되었다. 동물에게 사료와 물을 자유롭게 먹였다. 동물 실험은 실험 동물의 보살핌과 사용을 위한 National Institutes of Health 지침에 따라 수행되었으며, 대구 경북 의료 혁신 재단 (DGMIF) 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다. 개를 대조군, 세포와 스캐폴드를 투여한 그룹(C / S), 세포와 스캐폴드와 면역억제제를 투여한 그룹(C / S / I, Cyclosporin, 25mg / kg / day)의 3그룹으로 나누었다. 개과 동물 대퇴 분절은 앞서 설명한대로 12마리의 성숙한 골격을 가진 22-25kg사이의 체중을 가진 비글견들을 마취한 후에 SPF시설에서 무균상태로 준비하였다. 수술부위인 대퇴골의 외피를 절개하고 골 손상부위를 덮고 있는 골막을 제거하였다. 21mm의 골 결손을 인위적으로 대퇴골의 골간중심부에 만들고, 이 부분을 4.5 X 135mm의 지지대로 고정하였다. 결함 부위는 앞서 하이드로겔에 캡슐화시킨 3차원 골분화 유도된 동종의 cADMSC를 이식한 후 PCL membrane으로 덮은 후 봉합했다. 절개한 외피는 스테플러로 봉합하였다. 후속 처리로 면역억제제(cyclosporin A)를 2주간 5㎎/㎏으로 처리하였다. 체중을 1주 간격으로 측정하고 혈청을 2주 간격으로 수집하였다. 12주 후에 동물을 희생시키고 대퇴골을 분리하였다. 수술 후, 4, 8, 12 주 간격으로 Ventral-Dorsal 위치에서 엑스레이(ELMO-T3, DK Medical Systems, Korea)를 사용하여 동물을 촬영하였다. 괴사 후, 분리된 대퇴골은 제조사 방법에 따라 microCT(Quantum FX, PerkinElmer, USA)를 사용하여 이미지를 촬영하였고, 골밀도(BMD)를 측정하였다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

개과 동물의 지방조직의 갈색지방에서 추출한 간엽줄기세포를 12 내지 48시간 동안 골세포로 초기 분화 유도한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 개과 동물의 골 결손 치료용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 갈색지방에서 추출된 줄기세포는 CD44, CD73, CD90이 양성 발현되는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 골 결손 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 골세포로 초기 분화가 유도된 줄기세포는 하이드로 겔로 캡슐화되는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 골 결손 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 골세포로 초기 분화는 3차원적 분화 방법에 의하여 유도된 것을 특징으로 하는 개과 동물의 골 결손 치료용 조성물.
개과 동물의 골결손 치료제를 제조하는 방법으로서,
(i) 개과 동물의 지방조직의 갈색지방에서 간엽줄기세포를 추출하는 단계;
(ii) 상기 추출된 간엽줄기세포를 12 내지 48시간 동안 골세포로 초기 분화 유도시키는 단계; 및
(iii) 상기 골세포로 초기 분화 유도된 간엽줄기세포를 하이드로겔의 캡슐에 삽입하는 단계를 포함하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 골세포 초기 분화 유도 단계는 하이드로겔을 사용한 3차원적 분화 방법에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.