JP2017518310A - マイクロカプセル化技術及びその生成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「MICROENCAPSULATION TECHNIQUE AND PRODUCTS THEREOF」と題する、2014年6月4日出願の米国仮特許出願第62/007,717号の優先権の利益を主張する。
液体コアアルギン酸塩カプセルを評価するために、予備研究を実施した。簡潔に、40%グルコース及び25または50mMの塩化カルシウムの溶液を、様々な濃度での低粘度アルギン酸ナトリウム中に滴下した。グルコースを使用して、液体コア溶液の粘度及び密度を増加させ、それは、球状の構造物を形成するために必要であるように思われる。カルシウムを液体コア溶液中に溶解して、いったん液滴がインサイドアウトゲル化機構においてアルギン酸塩槽に入ると、アルギン酸塩の迅速なゲル化を開始した。グルコース実験の結果は、液体コア及びアルギン酸塩シェルの明確で円滑な接触面を示した。しかしながら、観察された構造物は、概して円形である一方で、尾に似た特徴を有した。これは、非最適なレオロジー特性による可能性が最も高い。次いで、液体コア構造物を50mMクエン酸ナトリウムに曝露し、軽く混合して、アルギン酸塩シェルが生理学的に関連する濃度のクエン酸塩を使用して溶解され得るかどうかを評価した。実際に、アルギン酸塩シェルは、最終的に溶解し、観察できる微量のゲル化構造物を残さなかった(液体グルコースコアは、単純にバルク溶液中に溶解して戻った)。
次いで、さらなる観察のために、HyStemミクロスフェアを滅菌PBSに移した。
A.アルギン酸塩型を使用して、ヒドロゲルミクロスフェアを生成するための一般的なプロトコル
1.25mMカルシウムイオンを含有するように調節された、所望の最終構成成分濃度における液体ヒドロゲルポリマー溶液を調製する。カチオン濃度は、異なる液滴サイズに対して調節されるべきである。例えば、最大で200mMカルシウムイオン及び/または200mMバリウムイオンが、約400〜600ミクロンの平均サイズ範囲を有する液滴のために使用されている。
2.液滴発生器(例えば、注射器/針、または微粒子/マイクロカプセル化装置)中に溶液を充填し、液滴形成を開始し、所望の液滴サイズを達成するように機器の設定を調節する。
3.室温で、カルシウム不含緩衝液または培地(例えば、PBS)中の0.25%低粘度アルギン酸ナトリウム(w/v)の溶液を含む撹拌槽内に液滴を回収する。アルギン酸塩濃度は、調節され得る。例えば、0.125% w/vアルギン酸ナトリウムは、より小さい液滴のために使用されている。ヒドロゲルポリマー(コア)溶液の粘度及び密度は、最終的に、真に球状の構造物がアルギン酸塩槽との接触後に形成され得るかどうかを示す。これを超えて、液滴の高さ、すなわち、液滴発生出口から槽の表面までの距離は、得られる構造物の形態に関与する。これらのパラメータの特定の値はまた、液滴のサイズ、材料の種類、アルギン酸塩溶液の濃度及び粘度などに応じて異なる。これらの要因は考慮されなければならず、最終的に、目標ヒドロゲルポリマー溶液の組成物に制約を加える。
4.槽内の全ての液滴の回収後、約5分間撹拌し続けて、アルギン酸塩シェルが完全に形成されることを可能にし、液体コア−シェル構造物の凝集を低減または防止する。元の液滴のサイズ(体積)に応じて、このステップは任意であってもよい。より大きい球体(1〜3mm)に対して、これを行うことは、構造物の凝集を制限するように見えた。撹拌の長さは、液滴中で使用される二価カチオン濃度に反比例する。加えて、過剰な撹拌によって液滴変形が生じ得ることがわかっている。約1〜2分の撹拌時間がより小さい液滴に対して十分であることがわかっている。
5.適切なサイズのストレーナまたはスクリーンを使用して、アルギン酸塩溶液から構造物を分離する。
6.使用される特定のヒドロゲル溶液の特定の要件に従って、コアヒドロゲルポリマー溶液を架橋/ゲル化する。このステップは、使用されるヒドロゲル前駆体溶液の種類に応じて異なる。場合によっては、それは、液体コア−シェル構造物を、ヒドロゲル架橋剤を含むコアゲル化槽または器に移すことを伴う。それにもかかわらず、このステップは、各材料と関連する製造業者推奨のゲル化プロトコルとよく似る可能性が高く、アルギン酸塩シェル及び構造物形状を説明するわずかな変化のみを有する。いずれにせよ、本明細書で使用される培地は、硬化中にアルギン酸塩シェルの完全性を維持するために、少なくともある程度の量のカルシウムイオンを含有するべきである。
7.任意のさらなる所望の硬化(hardening)、硬化(curing)、またはインキュベーションは、この時点で行われ得る(例えば、丁重な取り扱いを必要とする生存細胞をカプセル化する場合)。そうでなければ、すぐにステップ8に進む。
8.次いで、一時的なアルギン酸塩シェルを除去する。例えば、次いで、コア/シェル構造物を槽に移し、かつ/または適切なキレート剤で洗浄して、アルギン酸塩シェルを除去する。今は固体のコア−シェル構造物を、PBS(または他のカルシウム不含緩衝液)中の25〜50mMクエン酸ナトリウムの溶液に移し、24℃〜37℃で20〜40分間軽く混合すると同時に、シェル分解の進行を視覚的に監視する。ミクロスフェア対クエン酸塩溶液の特定の体積比は、識別されていない。クエン酸塩の非常に低いコストを考慮すると、このステップは、アルギン酸塩シェルの完全除去を確実にするために、かなり大過剰なクエン酸塩溶液を使用して単純に行われるべきである。
9.追加のクエン酸塩溶液を用いて、適切なサイズのストレーナまたはスクリーンを使用して、構造物を洗い流し、シェルが目視検査によって完全に溶解するまで、新鮮なクエン酸塩溶液中の混合を繰り返す。洗浄中の流体の機械的剪断が、「新鮮な」クエン酸塩溶液よりもむしろ、このステップが残りのアルギン酸塩シェル材料の除去において効果的であった理由である可能性が高い。したがって、この洗浄ステップをより早く実施することは、このプロセスを潜在的に短縮し得る。
10.ミクロスフェア(マイクロビーズ)がここで使用される準備ができている。使用するために、所望の培地または緩衝剤に移す。
1.GMPグレードのグリコシル(HyStem−Cヒドロゲルのチオール化ヒアルロン酸ポリマー構成成分)を、緩衝臓器保存溶液を使用して、10mg/mLで再構成した。溶液は、HTK保存溶液である。
2.塩化カルシウム粉末をグリコシル溶液に添加して、約25mMのカルシウムイオン濃度を得た。
3.次いで、Ca2+/グリコシルヒドロゲルポリマー溶液を、1〜2cmの高さから、注射器及び27Gの先端が丸い針を使用して、撹拌0.25%(w/v)アルギン酸塩槽(Protanal LF 10/60)に滴下添加した。時々、液滴サイズを減少させるために、注射器を軽くたたくことによって、液滴を機械的に阻害した。
4.球状の液体グリコシルコア−アルギン酸塩シェル構造物は、液滴の槽との接触後すぐに形成され、さらに5分間撹拌して、シェルが完全に形成されることを可能にし、凝集を低減した。概して球状である一方で、構造物は、尾に似た特徴を有し、いくつかは他よりも大きかった。これらは、グリコシル溶液の粘度、例えば、濃度の調節、または他の粘度改変剤の添加によって、容易に排除されるはずである。
5.250ミクロンナイロンメッシュスクリーンを用いて、構造物を回収し、後の処理のために、PBS中の10mM Ca2+中で保管した(シェル除去)。このステップは、場合によっては任意であってもよい。
6.構造物を、1×の最終濃度で、Extralink(3400g/molのPEGジアクリレート)を含有する管に移し(すなわち、ステップ1で使用された該緩衝液中の2.5mLのGMPグレードのExtralinkの1つのバイアル)、室温で2日間インキュベートした。より短いインキュベーション時間が、ある特定の実施形態で使用されてもよい。
7.次いで、構造物を、PBS中の50mMクエン酸ナトリウムの溶液に移し、約45分間オービタルシェーカー上で軽く混合した。光学顕微鏡法を介して、アルギン酸塩シェル分解を監視した。20〜45分の間、変化はあまり見られなかった。一般的なプロトコル解釈書で示唆されるように、洗浄ステップは、シェル除去プロセスを促進するように思われた。
8.次いで、構造物を、新鮮なクエン酸塩溶液を用いて、250ミクロンナイロンメッシュスクリーンで洗い流し、次いで、アルギン酸塩シェルの視覚的な証拠が残らなくなるまで、クエン酸ナトリウム中でさらに混合し、固体の球状のグリコシルコアのみを残した。アルギン酸塩が、洗浄ステップ単独によって完全に除去された可能性がある。しかしながら、これは、クエン酸塩溶液に戻され、数分間混合される前に、顕微鏡法を介して検証されていない。
9.グリコシル球体を室温において、PBS中で保存した。
1.ヒドロゲル前駆体溶液を以下の通り調製した。1% w/vグリコシル(チオール化HA、MW約250kDa)、200mM塩化カルシウム、100mMヒスチジン、及び0.25% PEGDA3400(pH6.5、粘度、約50cP)。
2.直径が約600ミクロンのヒドロゲル前駆体の液滴を、室温において、約1.5m/sの初期速度で、17cmの高さから、0.125% Protanal LF 10/60低粘度アルギン酸塩(粘度、約2.5cP)の撹拌層内に滴下して、コア/シェル微粒子を形成した。
3.コアシェル微粒子をアルギン酸塩槽内で2分間撹拌し、次いで、250ミクロンスクリーンを使用して回収した。
4.コア/シェル微粒子をPBS(pH7.4)に移し、ヒドロゲルの架橋(グリコシル及びPEGDA)を可能にするために一晩インキュベートした。
5.一晩のインキュベーション後、アルギン酸塩シェルが完全に溶解するまで、コア/シェル微粒子を、50mMクエン酸ナトリウムを含有する0.85%塩化ナトリウム(またはカルシウム不含PBS)の撹拌層に移した。
A.アルギン酸塩型方法を使用して、UV架橋「HyStem−C」ミクロスフェアを生成するために使用される例示的な手順
1.以下の組成及び物理的特性を用いて、ヒドロゲル前駆体溶液を調製した。
・1.0%(w/v)グリコシル(ヒドロゲル前駆体ポリマー)
・0.5%(w/v)Gelin−S(生物活性剤)
・1.0%(w/v)4側鎖ポリエチレングリコールノルボルネン(ヒドロキシルラジカル触媒チオール反応性架橋剤、MW:10kDa、JenKem USA)
・12%(v/v)イオジキサノール(密度改変剤)
・200mM CaCl2
・10mM HEPES
・pH 室温で約7
・密度=室温で1.08g/mL
・粘度 室温で約60cP
2.以下の組成及び物理的特性を用いて、アルギン酸塩槽を調製した。
・0.12%(w/v)Protanal LF 10/60低粘度アルギン酸塩
・0.1% Tween 20(界面活性剤)
・0.1% Irgacure 2959(光開始剤、Sigma Aldrich)
・10mM HEPES
・pH 室温で約7
・密度 室温で約1.0g/mL
・粘度 室温で約2.5cP
3.ヒドロゲル前駆体溶液の液滴を、液滴発生器を使用して、約20cmの高さから、撹拌アルギン酸塩槽内に導入して、約1mmのコア直径のコア/シェル微粒子を生成した。
4.コア/シェル粒子形成の直後に、撹拌槽を、光開始剤(Irgacure 2959)を用いて、粒子及びアルギン酸塩溶液を含有するガラス容器の側壁を通じて、長波紫外線ランプ(Ultraviolet Products、LLC、Model UVL−56、6ワット、365nm)で照射した。撹拌を5分間続けた。
5.5分間の初期撹拌後、アルギン酸塩槽を、10mM HEPESを含有する生理食塩水で1:1に希釈して、凝集及びアルギン酸塩シェルの異常増殖を防止した。UV照射及び撹拌をさらに25分間続けた。
6.最後に、1.0Mクエン酸ナトリウムを、25mMクエン酸塩イオンの最終濃度まで、槽に添加した。アルギン酸塩シェルは、約5分後に完全に溶解して、架橋HyStemヒドロゲルマイクロビーズを明らかにした。次いで、250ミクロンスクリーンを使用して、HyStemビーズを回収した。
Claims (22)
- 3次元ヒドロゲルマトリクス中に生物学的材料をカプセル化する方法であって、
ヒドロゲル前駆体溶液を提供すること(前記溶液は、溶媒系中に分散または溶解される、ヒドロゲル前駆体化合物と、前記生物学的材料と、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される二価カチオンとを含む)と、
前記ヒドロゲル前駆体溶液をアルギン酸塩と組み合わせて、コア/シェル微粒子を得ること(各コア/シェル微粒子は、アルギン酸塩シェルと、前記ヒドロゲル前駆体溶液を含む液体コアとを含む)と、
前記液体コア中の前記ヒドロゲル前駆体化合物を架橋して、コア/シェル架橋微粒子を得ること(各コア/シェル架橋微粒子は、前記アルギン酸塩シェルと、3次元ヒドロゲルマトリクス及び前記生物学的材料を含むコアとを含み、前記生物学的材料は、前記ヒドロゲルマトリクス中に封入される)と、
前記アルギン酸塩シェルを除去して、自己支持型ヒドロゲルマイクロビーズを得ること(各ヒドロゲルマイクロビーズは、前記3次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む)と、を含む、前記方法。 - 前記ヒドロゲル前駆体化合物は、非アルギン酸塩化合物である、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル前駆体化合物は、ヒアルロン酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル前駆体溶液は、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、細胞外マトリクス成分、またはそれらの合成型をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的材料は、細胞集団、細胞塊、組織、これらの組み合わせ、及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的材料は、膵島、肝細胞、幹細胞、内分泌細胞;膵島、肝細胞、幹細胞、内分泌細胞に関連する組織、及び膵島塊、肝細胞塊、幹細胞塊、甲状腺塊、副腎塊、下垂体塊、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル前駆体溶液は、前記溶媒系中に分散または溶解される、前記ヒドロゲル前駆体化合物、二価カチオン、及び生物学的材料から本質的になる、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル前駆体溶液は、任意のヒドロゲル架橋剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウムである、請求項1に記載の方法。
- 前記組み合わせは、アルギン酸塩の溶液に前記ヒドロゲル前駆体溶液を滴下添加して、前記コア/シェル微粒子を得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記添加は、前記ヒドロゲル前駆体溶液の液滴を生成し、前記液滴をアルギン酸塩の前記溶液に滴下して、前記コア/シェル微粒子を得ることを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記液滴は、約5mm未満の最大表面間寸法を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル前駆体溶液の粘度対前記アルギン酸塩溶液の粘度の比は、室温で1よりも大きい、請求項10に記載の方法。
- 前記架橋は、前記コア/シェル微粒子をヒドロゲルマトリクス架橋剤と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記架橋は、前記コア/シェル微粒子を活性化放射線に曝露して、架橋を開始することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記除去は、前記コア/シェル架橋微粒子をキレート剤と接触させて、前記アルギン酸塩シェルを弱める、溶解する、または崩壊させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記キレート剤は、クエン酸塩、EDTA、EGTA、リン酸塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記除去は、前記コア/シェル架橋微粒子を物理的に撹拌して、前記アルギン酸塩シェルを破壊することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒドロゲルマイクロビーズは、約5mm未満の最大表面間寸法を有する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に従って調製される3次元ヒドロゲルマイクロビーズであって、3次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む、前記マイクロビーズ。
- 前記マイクロビーズは、約50μm〜約2mmの平均最大表面間寸法を有する、請求項20に記載のマイクロビーズ。
- 請求項1に記載の方法に従って調製される複数の3次元ヒドロゲルマイクロビーズを含む、対象における移植のための組成物であって、前記マイクロビーズのそれぞれは、3次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む、前記組成物。
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