ES2869461T3

ES2869461T3 - Técnica de microencapsulación y sus productos

Info

Publication number: ES2869461T3
Application number: ES15803221T
Authority: ES
Inventors: Karthik Ramachandran; Stephen Michael Harrington
Original assignee: Likarda LLC
Current assignee: Likarda LLC
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-03
Publication date: 2021-10-25
Anticipated expiration: 2035-06-03
Also published as: CN106470666A; DK3151809T3; US9642814B2; JP6566970B2; US20150352056A1; EP3151809A1; CA2949716C; BR112016028350B1; AU2015269678B2; EP3151809B1; CN106470666B; BR112016028350A2; WO2015187862A1; AU2015269678A1; EP3151809A4; CA2949716A1; JP2017518310A

Abstract

Un procedimiento de encapsulación de material biológico en una matriz de hidrogel tridimensional, dicho procedimiento comprende: proporcionar una solución precursora de hidrogel, dicha solución comprende un compuesto precursor de hidrogel no alginato, un agente reticulante de hidrogel opcional, dicho material biológico, y un catión divalente seleccionado del grupo que consiste en calcio, bario, estroncio, y combinaciones de los mismos, dispersado o disuelto en un sistema de disolventes; combinar dicha solución precursora de hidrogeles con alginato para producir micropartículas de núcleo/cubierta, cada micropartícula de núcleo/cubierta comprende una cubierta de alginato y un núcleo líquido que comprende dicha solución precursora de hidrogel; reticular de dicho compuesto precursor de hidrogel en dicho núcleo líquido para producir micropartículas reticuladas núcleo/cubierta, cada micropartícula reticulada núcleo/cubierta comprende dicha cubierta de alginato y un núcleo que comprende una matriz de hidrogel tridimensional y dicho material biológico, quedando dicho material biológico atrapado en dicha matriz de hidrogel; y eliminar dicha cubierta de alginato para producir microperlas de hidrogel autosostenibles, cada microperla de hidrogel comprende dicha matriz de hidrogel tridimensional y material biológico atrapado en la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Técnica de microencapsulación y sus productos

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procesos y técnicas para preparar microesferas de hidrogel no alginato y los productos resultantes de las mismas.

Descripción de la técnica relacionada

La encapsulación de células en una micropartícula de hidrogel es una técnica prometedora en medicina regenerativa por dos razones fundamentales. En primer lugar, la estructura de la matriz de hidrogel es tal que las células encapsuladas pueden intercambiar nutrientes y moléculas terapéuticas con el entorno circundante, mientras que otros tipos de células, concretamente las células inmunitarias del huésped, no pueden penetrar y mediar en el rechazo inmunitario de las células encapsuladas cuando se trasplantan. En segundo lugar, las micropartículas de hidrogel son muy adecuadas para el trasplante de células encapsuladas. Su pequeño tamaño físico y su forma esférica permiten una administración sencilla y fácil a través de una jeringa y una aguja, en lugar de un procedimiento quirúrgico invasivo. Además, este pequeño tamaño físico genera una resistencia mínima a la difusión molecular hacia y desde las células encapsuladas, en comparación con construcciones de gel más grandes y "en volumen".

Los procedimientos actuales utilizados para fabricar microesferas de hidrogel que contienen células son muy limitados. Hasta la fecha, las microperlas sólo pueden fabricarse con polímeros de alginato o agarosa debido a sus mecanismos de gelificación únicos y simplistas. Desgraciadamente, ninguno de estos materiales es deseable con respecto a la salud o la función celular. Existen muchos materiales de hidrogeles novedosos que son muy superiores al alginato o la agarosa en este sentido. Sin embargo, debido a sus mecanismos específicos de gelificación, no pueden prepararse como microperlas esféricas que contengan células vivas. La presente invención proporciona un procedimiento para producir tales construcciones, y es aplicable para una amplia variedad de materiales de formación de hidrogeles

El documento GB 2192171 A divulga un procedimiento para preparar perlas poliméricas que tienen una cubierta de alginato que puede ser retirada con un dispositivo inyector complejo que está equipado con una pluralidad de agujas coaxiales, gotículas que tienen un núcleo de polímero líquido que está rodeado por una solución de alginato líquido y una capa de gas.

Sumario de la invención

En el presente documento se describen procedimientos para encapsular material biológico en una matriz de hidrogel tridimensional. Los procedimientos generalmente comprenden proporcionar una solución precursora de hidrogel que comprenda un compuesto precursor de hidrogel, el material biológico y un catión divalente seleccionado del grupo que consiste en calcio, bario, estroncio y combinaciones de los mismos, dispersado o disuelto en un sistema de disolventes. La solución precursora del hidrogel se combina con el alginato para producir micropartículas de núcleo/cubierta. Cada una de las micropartículas núcleo/cubierta comprende una cubierta de alginato y un núcleo líquido que comprende la solución precursora del hidrogel. El compuesto precursor del hidrogel en el núcleo líquido se reticula para dar lugar a micropartículas reticuladas en el núcleo/cubierta. Cada una de las micropartículas reticuladas núcleo/cubierta comprende la cubierta de alginato y un núcleo que comprende una matriz de hidrogel tridimensional y el material biológico. Ventajosamente, el material biológico está suspendido, encapsulado o atrapado en la matriz de hidrogel. A continuación, se retira la cubierta temporal de alginato para obtener microesferas de hidrogel autoportantes. Cada una de las microperlas de hidrogel comprende la matriz de hidrogel tridimensional y el material biológico atrapado en la misma.

En el presente documento también se describen microesferas de hidrogel tridimensionales preparadas según las técnicas inventivas. Las microperlas son cuerpos autoportantes que comprenden una matriz de hidrogel tridimensional y material biológico atrapado en la misma.

También se describe en la presente memoria una composición para el trasplante en un sujeto. La composición comprende una pluralidad de microesferas de hidrogel tridimensionales preparadas según las técnicas inventivas. Las microperlas son cuerpos autoportantes que comprenden una matriz de hidrogel tridimensional y material biológico atrapado en la misma.

Breve descripción de los dibujos

La figura (Fig.) 1 es una imagen de microscopio de una micropartícula núcleo/cubierta con la cubierta de alginato y un núcleo líquido que comprende la solución precursora de hidrogel del Ejemplo 1;

La Fig. 2 es una imagen de microscopio de una micropartícula reticulada núcleo/cubierta con la cubierta de alginato y el núcleo de hidrogel del Ejemplo 1;

La Fig. 3 es una imagen de microscopio de una micropartícula reticulada con núcleo/capa después de 20 minutos en citrato del Ejemplo 1;

La Fig. 4 es una imagen de microscopio de una micropartícula reticulada con núcleo/capa después de 45 minutos en citrato del Ejemplo 1;

La Fig. 5 es una imagen al microscopio de las microperlas después de retirar la cubierta; y

La Fig. 6 es una imagen al microscopio de las microperlas después de un último lavado con citrato, que muestra sólo el núcleo de hidrogel que queda del Ejemplo 1.

Descripción detallada

La invención se refiere a un proceso de gelificación de adentro hacia afuera para generar microcápsulas de hidrogel (también conocidas como microperlas). Más particularmente, se describen en la presente memoria procedimientos de encapsulación de material biológico en la matriz de hidrogel tridimensional de microesferas. El proceso generalmente comprende la formación de una mezcla de un compuesto precursor de hidrogel, un material biológico opcional y un catión divalente. A continuación, la mezcla se combina con alginato, para generar una cubierta de alginato alrededor de las gotículas de la mezcla, seguida de la gelificación del núcleo del precursor del hidrogel, y la eliminación de la cubierta de alginato para producir microperlas autoportantes.

En un aspecto, se proporciona una solución precursora de hidrogel. La solución de precursor de hidrogel se prepara dispersando el compuesto de precursor de hidrogel en un sistema de disolvente para formar una solución antes de mezclarla con los demás componentes. Los sistemas de disolventes preferentes para la solución precursora del hidrogel incluyen agua, agentes tamponantes (por ejemplo, histidina, HEPES), agentes modificadores de la densidad (por ejemplo, iodixanol, ficoll), agentes modificadores de la viscosidad (por ejemplo, PEG, carboximetilcelulosa, goma xantana), o mezclas de los mismos. El compuesto precursor del hidrogel se incluirá en la solución a un nivel de aproximadamente 0,4% a aproximadamente 4,0% peso/volumen (4-40 mg/mL), en base al volumen total de la solución.

Los compuestos precursores de hidrogeles apropiados incluyen polímeros, oligómeros y/o monómeros formadores de hidrogeles, y como tales son capaces de formar una estructura o matriz reticulada o en red (es decir, "hidrogel") mediante polimerización y/o reticulación, en la que los materiales líquidos y biológicos pueden ser retenidos, suspendidos, atrapados y/o encapsulados dentro de los espacios intersticiales o poros de la estructura o matriz gelificada resultante. Los compuestos precursores de hidrogeles para su uso en la invención son preferentemente compuestos precursores de hidrogeles no alginatos. Es decir, la solución precursora del hidrogel está preferentemente libre de compuestos de alginato, es decir, compuestos basados en alginato, ácido algínico o sales o derivados de los mismos. El término "sustancialmente libre", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa que el ingrediente no se añade intencionadamente a la composición, aunque pueden producirse impurezas incidentales. En tales realizaciones, las composiciones de soluciones precursoras de hidrogeles comprenden menos de aproximadamente el 0,05% en peso, preferentemente menos de aproximadamente el 0,01%, y más preferentemente aproximadamente el 0% en peso de dicho ingrediente, en base al peso total de la emulsión tomada como el 100% en peso.

Cualquier compuesto precursor de hidrogel reticulable sería adecuado para su uso con la invención, siendo los compuestos preferentes los copolímeros de no alginato biocompatibles, y particularmente los copolímeros de bloque de no alginato, así como otros tipos de monómeros y/u oligómeros reticulables. Los compuestos precursores ejemplares incluyen, sin limitación, polisacáridos no alginatos, ácido hialurónico modificado, colágeno/gelatina, polietilenglicol, quitosano, agarosa y similares. Un compuesto precursor de hidrogel particularmente preferente es el ácido hialurónico. En una o más realizaciones, los hidrogeles son hidrogeles de gelificación lenta. Los hidrogeles biocompatibles son también particularmente preferentes, dependiendo del uso final designado del hidrogel. Tal y como se utiliza en el presente documento, "biocompatible" significa que no es perjudicial para los tejidos vivos y, más concretamente, que no es biológicamente o de otro modo indeseable, en el sentido de que puede ser administrado a un sujeto sin excesiva toxicidad, irritación o respuesta alérgica o inmunogénica, y que no causa ningún efecto biológico indeseable, ni interactúa de manera indeseable con ninguno de los demás componentes de la composición en la que está contenido. Los hidrogeles biocompatibles se seleccionarán para minimizar cualquier degradación del material biológico y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como será conocido por un experto en la materia. Otros ingredientes opcionales que pueden incluirse con el precursor del hidrogel son la fibronectina, la laminina, el colágeno, otros componentes de la matriz extracelular y otros similares, incluidas sus versiones sintéticas.

La solución precursora del hidrogel comprende además un catión divalente. Los cationes divalentes adecuados para su uso en la invención incluyen cualquier ión capaz de formar un gel al interactuar con el alginato. Más concretamente, los cationes divalentes son preferentemente biocompatibles. En una o más realizaciones, los cationes divalentes se seleccionan del grupo que consiste en calcio, bario, estroncio y combinaciones de los mismos. Los cationes divalentes se dispersan o disuelven en el sistema de disolventes junto con el compuesto precursor del hidrogel. Los cationes divalentes deben incluirse en la solución en un nivel de aproximadamente 0,025 moles/litro a aproximadamente 0,25 moles/litro, en base al volumen total de la solución tomado como 100%.

La solución precursora del hidrogel comprende además un material biológico. Los materiales biológicos ejemplares incluyen poblaciones de células, grupos de células, tejidos, combinaciones de los mismos y fragmentos de los mismos. Los materiales biológicos pueden ser derivados o aislados de forma natural, o pueden ser células, grupos, tejidos o similares modificados genéticamente. Ejemplos no limitantes de materiales biológicos para su uso en la invención incluyen islotes, racimos de islotes, hepatocitos, células madre y células y tejidos relacionados, así como células endocrinas, racimos de células madre, racimos de tiroides, racimos de glándulas suprarrenales, racimos de hipófisis y otros racimos celulares tridimensionales para tratamientos con ingeniería de tejidos o basados en células. En la invención también podrían utilizarse combinaciones de tipos de células y/o tejidos.

En una o más realizaciones, se pueden incluir en la solución precursora del hidrogel aditivos adicionales, medios, nutrientes, tampones de pH, agentes modificadores de la densidad, agentes modificadores de la viscosidad o similares. En algunas realizaciones, la solución precursora del hidrogel consiste esencialmente o incluso consiste en el compuesto precursor del hidrogel, el catión divalente y los materiales biológicos, dispersados o disueltos en el sistema de disolventes. La solución de precursor de hidrogel permanece en forma líquida hasta la gelificación, como se describe a continuación, y como tal, en una o más realizaciones, la solución está preferentemente libre de agentes de reticulación de hidrogel. En una o más realizaciones, la densidad de la solución precursora de hidrogel se "ajusta" a la densidad del material biológico para mejorar la capacidad de mantener el material biológico suspendido en toda la solución precursora de hidrogel (y en toda la gotícula resultante, como se verá más adelante). Así, en algunas realizaciones, puede ser deseable aumentar la viscosidad del precursor del hidrogel lo suficiente para frenar o evitar la migración o "sedimentación" del material biológico en el borde del núcleo líquido antes de la gelificación/reticulación, como se explica con más detalle a continuación.

La solución precursora del hidrogel se combina a continuación con el alginato. En una o más realizaciones, la solución de precursor de hidrogel se añade gotícula a gotícula a una solución de alginato para formar una cubierta de alginato en gotículas individuales de la solución de precursor de hidrogel. Por ejemplo, la solución líquida precursora del hidrogel se extruye o se dispensa desde un aparato adecuado para formar gotículas. Se puede utilizar cualquier aparato adecuado, y generalmente comprenderá una cámara para mantener la solución de precursor de hidrogel, estando la cámara en comunicación fluida con un pasaje de fluido que termina en una salida o punta dispensadora. La punta dispensadora tendrá un orificio a través del cual la solución de precursor de hidrogel es expulsada como una gotícula. La técnica puede ejecutarse utilizando un aparato sencillo, como una jeringa y una aguja, así como máquinas específicamente diseñadas para la generación de gotículas. El tamaño deseado de la gotícula puede controlarse en función de la dimensión de la sección transversal del orificio, la viscosidad de la solución precursora del hidrogel y la viscosidad relativa de la solución de alginato. La invención es particularmente adecuada para las gotículas que tienen una dimensión máxima de superficie a superficie (es decir, en el caso de una gotícula esférica, su diámetro) menor de aproximadamente 5 mm, preferiblemente menor de aproximadamente 2 mm, más preferiblemente menor de aproximadamente 1 mm, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 50 |jm y aproximadamente 750 jm.

En general, la solución de alginato comprenderá un baño de alginato de sodio, y preferentemente un baño agitado o de agitación de alginato de sodio disperso en un sistema de disolventes. Podrían utilizarse otras sales de alginato (además del alginato de calcio). En la invención se pueden utilizar varios tipos de alginatos formadores de gel, pero des-reticulables, dependiendo de las propiedades deseadas. En general, se prefieren los alginatos de baja viscosidad/bajo peso molecular y de alta G, como los extraídos de la Laminaria hyperborea. Los alginatos están disponibles comercialmente según sus diferentes propiedades en varias fuentes, incluyendo FMC BioPolymer (Filadelfia, PA). La cantidad de alginato en la solución puede variar, pero puede ir desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 2,0% peso/volumen, en base al volumen total de la solución tomado como 100%. En general, la viscosidad de la solución de alginato debe ser menor que la viscosidad de la solución precursora del hidrogel. La viscosidad de una solución de alginato depende de la concentración de alginato y del peso molecular medio del polímero de alginato (es decir, de la longitud de las moléculas de alginato o del número de unidades de monómero en las cadenas); las cadenas más largas dan lugar a viscosidades más altas a concentraciones similares. En una o más realizaciones, la viscosidad de la solución de alginato oscilará entre 1 y 20 cP, y preferentemente entre 1 y 4 cP a temperatura ambiente (-20 a 25°C). Más concretamente, la relación entre la viscosidad de la solución precursora del hidrogel y la viscosidad de la solución de alginato debe ser superior a 1 a temperatura ambiente. En una realización más, la relación entre la viscosidad de la solución precursora del hidrogel y la viscosidad de la solución de alginato es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1. En una o más realizaciones, la relación de viscosidad del precursor de hidrogel es de aproximadamente 20:1. En una o más realizaciones, la viscosidad de la solución de precursor de hidrogel es de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 cP, siendo particularmente preferible de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 cP a temperatura ambiente.

Ventajosamente, el catión divalente en la solución precursora del hidrogel reacciona con el alginato para dar lugar a una micropartícula núcleo/cubierta para cada gotícula que comprende una cubierta de alginato y un núcleo líquido que comprende la solución precursora del hidrogel. Las micropartículas de núcleo/cubierta pueden colocarse en una solución adicional que contenga catión divalente, si se desea un mayor endurecimiento de la cubierta de alginato. Independientemente de lo anterior, se apreciará que este enfoque tiene una ventaja significativa, ya que crea un molde o encapsulante temporal (extraíble), poroso y sustancialmente esférico para contener la solución de precursor de hidrogel. Como se apreciará, "sustancialmente esférica" significa que la micropartícula del núcleo/cubierta puede ser esférica con una forma más "regular", o puede tener una forma más irregular (elipsoidal, oblonga, etc.).

Se apreciará que para el éxito de la encapsulación por la cubierta de alginato, los "núcleos" de las gotículas deben penetrar en la superficie de la solución de alginato después de ser dispensados. Es decir, las gotículas deben tener suficiente velocidad y/o impulso para romper la tensión superficial de la solución de alginato. Los expertos en la materia reconocerán que se pueden manipular varias variables para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, la solución de alginato puede agitarse o revolverse para reducir la tensión superficial de la solución. Del mismo modo, se apreciará que las viscosidades relativas de la gotícula y del baño de alginato pueden ajustarse para facilitar la entrada de la gotícula en el baño de alginato. Del mismo modo, la velocidad requerida de las gotículas se reducirá para las gotículas de mayor tamaño (es decir, las gotículas que tienen más masa, lo que da lugar a un impulso adecuado a menor velocidad). También se puede variar la altura desde la que se dispensan las gotículas. En una o más realizaciones, las gotículas se dispensan desde una altura (calculada desde la superficie de la solución de alginato hasta la punta dispensadora) de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 cm. En una o más realizaciones, la velocidad objetivo de las gotículas es de aproximadamente 1,5 m/s a aproximadamente 5 m/s, y preferentemente de aproximadamente 1,5 m/s a aproximadamente 4 m/s.

El compuesto precursor del hidrogel en el núcleo líquido se reticula a continuación para producir micropartículas reticuladas núcleo/cubierta. La reticulación puede llevarse a cabo mediante varios mecanismos, dependiendo del compuesto precursor del hidrogel en cuestión. En una o más realizaciones, las micropartículas de núcleo/cubierta se combinan con un reticulador de matriz de hidrogel, preferentemente en solución. El reticulador se filtra a través de la cubierta de alginato hacia las micropartículas del núcleo/cubierta, lo que resulta en la gelificación (reticulación) del compuesto precursor del hidrogel para formar una matriz de hidrogel tridimensional. El reticulador corresponderá al compuesto precursor del hidrogel, pero puede variarse para controlar la velocidad y el nivel de reticulación alcanzado en la matriz reticulada resultante. Los reticuladores adecuados incluyen reticuladores foto o térmicos, reticuladores químicos, como los reticuladores a base de PEG (por ejemplo, PEGDA), y similares. También se podrían utilizar precursores de hidrogeles autorreticulantes.

También se apreciará que un reticulador de hidrogel podría disolverse en el baño inicial de alginato para facilitar la gelificación del hidrogel y la formación de la cubierta de alginato de forma algo simultánea en "un solo paso" sin tener que transferir las micropartículas a un recipiente separado para la reticulación del hidrogel. Asimismo, el agente de reticulación del hidrogel podría incluirse en la solución inicial del precursor del hidrogel a un pH determinado (por ejemplo, pH < 7) para pausar efectivamente la gelificación, mientras que el baño de alginato podría prepararse a pH 8, lo que reduce significativamente el tiempo de gelificación del precursor del hidrogel. Del mismo modo, se puede utilizar un sistema de hidrogel foto-reticulable, que implicaría la exposición de la micropartícula del núcleo/carcasa a una radiación activadora (por ejemplo, luz UV) para iniciar la formación del hidrogel en los núcleos líquidos.

También se apreciará que podrían utilizarse diferentes reticuladores para cambiar la velocidad de gelificación/reticulación. Los datos presentes indican que incluso un reticulador potente (por ejemplo, 3400 Dalton PEG) es capaz de difundirse a través de la cubierta de alginato y reaccionar con el compuesto precursor del hidrogel para iniciar la gelificación.

Independientemente del mecanismo de gelificación utilizado, cada micropartícula reticulada núcleo/cubierta comprenderá una cubierta de alginato distinta y un núcleo ahora consolidado o "gelificado" que comprenda una matriz de hidrogel tridimensional con el material biológico suspendido, atrapado o encapsulado en la matriz de hidrogel. Se apreciará que este enfoque tiene una ventaja significativa, ya que permite la gelificación de la solución precursora del hidrogel dentro del molde poroso en condiciones fisiológicas. La matriz de hidrogel resultante se caracteriza por ser un armazón semirrígido permeable a los líquidos y los gases, pero que no presenta flujo y conserva su integridad en el estado estacionario. La matriz de hidrogel es un cuerpo tridimensional autoportante. El término "cuerpo autoportante" significa que la matriz de hidrogel, una vez formada, conserva su forma sin necesidad de una estructura de soporte externa, y no es susceptible de deformarse simplemente debido a sus propias fuerzas internas o a su peso. El cuerpo autoportante no es flexible, permanentemente deformable ni fluido, como una gelatina, masilla o pasta, sino que es resiliente, de manera que el cuerpo matriz puede ceder o deformarse temporalmente bajo la fuerza. En otras palabras, el cuerpo autosostenible se recuperará o recuperará su forma después de una pequeña compresión y/o flexión, apreciándose que la matriz de hidrogel se agrietará, romperá o cederá si se ejerce una presión o fuerza externa suficiente.

A continuación, se retira la cubierta de alginato de las micropartículas reticuladas núcleo/cubierta para obtener microperlas de hidrogel autosostenibles. En una o más realizaciones, las micropartículas reticuladas con núcleo/cubierta se ponen en contacto con un agente quelante apropiado, preferentemente en solución, y durante un período de tiempo suficiente para debilitar, disolver o alterar de otro modo (y por tanto eliminar) la cubierta de alginato. Preferiblemente, las micropartículas reticuladas de núcleo/cubierta se ponen en contacto con el agente quelante apropiado bajo agitación. Los quelantes ejemplares incluyen el citrato, así como otros agentes quelantes conocidos para los cationes divalentes (por ejemplo, el calcio, el bario o el estroncio), como el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), el EGTA (ácido etilenglicolatetraacético), los fosfatos (por ejemplo, el ortofosfato, las sales de fosfato, etc.), y similares. Además, el catión divalente utilizado en la formación de la cubierta de alginato podría desplazarse (aunque muy lentamente) con el tiempo en una solución salina que contenga, por ejemplo, concentraciones muy bajas de calcio. La cubierta de alginato también pudo romperse y desprenderse mediante la agitación mecánica de las micropartículas. Las micropartículas reticuladas con núcleo/cubierta también pueden recogerse en un tamiz o colador y lavarse con una solución quelante adicional si se desea, hasta eliminar la cubierta de alginato.

Independientemente de la forma de realización, la eliminación de la cubierta de alginato produce una microperla de hidrogel que comprenda el constituyente biológico encapsulado, atrapado o suspendido dentro de la matriz de hidrogel tridimensional. Se apreciará que este enfoque tiene una ventaja significativa en el sentido de que permite la disolución y eliminación del molde esférico poroso en condiciones fisiológicas después de la gelificación exitosa de la matriz de hidrogel. La microperla de hidrogel resultante es una cápsula tridimensional (por ejemplo, sustancialmente esférica) de tipo matricial, lo que significa que mantiene el material de relleno a lo largo de la perla, en lugar de tener una cubierta distinta como en una cápsula de tipo núcleo-cubierta. Como se ha señalado anteriormente, la microesfera de hidrogel también es un cuerpo autoportante. Las microperlas de hidrogel resultantes pueden recogerse de la solución mediante un tamiz de malla u otro dispositivo, y pueden lavarse o suspenderse en medio o nutrientes adecuados, según se desee. En una o más realizaciones, las microperlas resultantes tienen una forma sustancialmente esférica. Ventajosamente, el tamaño de las partículas es altamente personalizable dependiendo de las capacidades del generador de gotículas seleccionado. En una o más realizaciones, las microperlas o micropartículas de hidrogel resultantes tienen una dimensión media (promedio) máxima de superficie a superficie (es decir, en el caso de una microperla esférica, su diámetro) menor de aproximadamente 5 mm, preferiblemente menor de aproximadamente 2 mm, más preferiblemente de aproximadamente 50 pm a aproximadamente 2 mm, incluso más preferiblemente de aproximadamente 50 pm a aproximadamente 750 pm, y más preferiblemente de aproximadamente 50 pm a aproximadamente 500 pm.

Se apreciará que las microperlas o partículas formadas durante el proceso anterior pueden ser filtradas y/o lavadas entre varios pasos del proceso para aislar las microperlas o partículas de la solución de formación antes de proceder al siguiente paso.

En resumen, el procedimiento descrito en el presente documento permite la fabricación de microesferas de hidrogel sin alginato en condiciones biológicamente relevantes. La microencapsulación de células o tejidos vivos tiene un gran atractivo en la ingeniería de tejidos y en la terapia celular, pero los materiales que actualmente pueden formularse como microcápsulas se limitan esencialmente al alginato y, en algunos casos, a la agarosa, ninguno de los cuales posee claves biológicas importantes para apoyar o dirigir la función celular. Por lo tanto, una característica importante de este procedimiento es la microencapsulación de células o grupos de células en materiales de hidrogeles no alginatos para mejorar la actividad biológica y la biocompatibilidad. Además, la elección de materiales alternativos (por ejemplo, hidrogeles reticulados covalentemente, tamaños variables de reticuladores y química de reacción, etc.) podría permitir un nivel mucho mayor de control de las propiedades estructurales, mecánicas y de degradación de las microcápsulas resultantes. Ventajosamente, debido a la cubierta temporal de alginato, las microcápsulas pueden crearse incluso cuando se utilizan precursores de hidrogeles de gelificación lenta.

Otra ventaja clave es que el proceso es compatible con las células, a diferencia de otros procedimientos de fabricación de microesferas que utilizan disolventes orgánicos o son tóxicos para los tejidos vivos. Otras ventajas de los procedimientos descritos son que las microesferas de hidrogel mejoran la biocompatibilidad del material biológico implantado, reduciendo la fibrosis. Además, las microperlas permiten un mayor control y apoyo de la función celular y tisular en las mismas, mejorando la bioactividad de cualquier implante creado con dichas microperlas. Además, el uso de la cubierta de alginato temporal permite utilizar una mayor variedad de hidrogeles para crear las microperlas, lo que permite al experto un mayor control sobre las propiedades mecánicas deseadas de la microperla resultante (por ejemplo, módulo elástico, dureza, etc.). Además, esta técnica también permite al experto seleccionar los hidrogeles en función de otras características deseadas, como controlar la tasa de degradación del hidrogel, una vez implantado (por ejemplo, pudiendo elegir entre geles reticulados covalentes o iónicos para la inmunoprotección a largo plazo (terapia de trasplante celular) o el soporte celular a corto plazo (ingeniería de tejidos)). Del mismo modo, al poder seleccionar entre una gama de hidrogeles, sin dejar de formar microperlas, el experto también tiene más control de la microestructura deseada de la matriz de hidrogel, como el tamaño de los poros y las propiedades de difusión de las microperlas resultantes.

Las microesferas de hidrogel resultantes tienen varios usos, incluyendo, sin limitación, la reversión de la diabetes a través de islotes o células de islotes encapsulados, la entrega de células modificadas o células madre para la reparación de huesos o cartílagos, la protección de las células terapéuticas trasplantadas o grupos de células del sistema inmune del huésped en general.

Las ventajas adicionales de las diversas realizaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la materia tras la revisión de la divulgación en el presente documento y los ejemplos de trabajo a continuación. Se apreciará que las diversas realizaciones descritas en el presente documento no son necesariamente excluyentes entre sí, a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, una característica descrita o representada en una realización puede estar también incluida en otras realizaciones, pero no está necesariamente incluida. Así, la presente invención abarca una variedad de combinaciones y/o integraciones de las realizaciones específicas descritas en el presente documento.

Como se utiliza en el presente documento, la frase "y/o", cuando se utiliza en una lista de dos o más elementos, significa que cualquiera de los elementos enumerados puede emplearse por sí mismo o que puede emplearse cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados. Por ejemplo, si se describe que una composición contiene o excluye los componentes A, B y/o C, la composición puede contener o excluir A solo; B solo; C solo; A y B en combinación; A y C en combinación; B y C en combinación; o A, B y C en combinación.

La presente descripción también utiliza intervalos numéricos para cuantificar ciertos parámetros relacionados con varias realizaciones de la invención. Debe entenderse que cuando se proporcionan intervalos numéricos, dichos intervalos deben interpretarse como un soporte literal para las limitaciones de la reivindicación que sólo recitan el valor inferior del intervalo, así como las limitaciones de la reivindicación que sólo recitan el valor superior del intervalo. Por ejemplo, un intervalo numérico divulgado de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 proporciona apoyo literal para una reivindicación que recita "mayor que aproximadamente 10" (sin límites superiores) y una reivindicación que recita "menos de aproximadamente 100" (sin límites inferiores).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos exponen procedimientos de acuerdo con la invención. No obstante, debe entenderse que dichos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y que nada de lo que contienen debe tomarse como una limitación del ámbito general de la invención.

Ejemplo 1

Se realizó un trabajo de antecedentes para evaluar las cápsulas de alginato de núcleo líquido. Brevemente, se añadió gotícula a gotícula una solución de 40% de glucosa y 25 o 50 mM de cloruro de calcio en alginato de sodio de baja viscosidad a varias concentraciones. Se utilizó glucosa para aumentar la viscosidad y la densidad de la solución líquida del núcleo, lo que parece ser necesario para formar construcciones esféricas. El calcio se disolvió en la solución líquida del núcleo para iniciar la rápida gelificación del alginato una vez que la gotícula entró en el baño de alginato en un mecanismo de gelificación de adentro hacia afuera. Los resultados de los experimentos con glucosa mostraron interfaces claras y suaves del núcleo líquido y la cubierta de alginato. Sin embargo, las construcciones observadas, aunque en general son redondas, poseen rasgos similares a una cola. Esto se debió probablemente a unas propiedades reológicas no óptimas. A continuación, las construcciones de núcleo líquido se expusieron a 50 mM de citrato de sodio y se agitaron ligeramente para evaluar si las cubiertas de alginato podían disolverse utilizando concentraciones fisiológicamente relevantes de citrato. De hecho, las cubiertas de alginato acabaron disolviéndose, sin dejar rastro observable de las construcciones gelificadas (el núcleo de glucosa líquida simplemente se disolvió de nuevo en la solución a granel).

Después de haber identificado las concentraciones de reactivos aceptables y la técnica general, se utilizó un hidrogel de HA disponible en el mercado (HyStem) como solución de núcleo líquido. Debido a su mayor viscosidad (se desconoce la métrica exacta), sólo se utilizó el componente de ácido hialurónico, Glycosil, para aumentar la probabilidad de éxito en este experimento. El Glycosil de calidad GMP se disolvió en solución HTK al 1X (2 mL), y luego se añadió a un vial que contenía cloruro de calcio para conseguir una solución líquida final del núcleo de IX Glycosil y 25 mM de cloruro de calcio (solución HTK como disolvente). Esto se añadió gotícula a gotícula a través de una aguja de punta roma de 27 G en un baño de alginato de sodio agitado al 0,25% (Protanal LF 10/60, baja viscosidad, alto contenido de G) desde una altura de 1-2 cm. En el baño de alginato se formaron construcciones de doble capa generalmente esféricas. Véase la Fig. 1. La mayoría parecía tener pequeños rasgos de cola, similares a los observados en los experimentos con glucosa. Sin embargo, un pequeño porcentaje de las construcciones aparecían significativamente esféricas sin ninguna cola visible, lo que puede indicar que las propiedades reológicas de esta formulación en particular están cerca, pero no del todo afinadas para esta técnica.

Las construcciones líquidas de núcleo-cubierta se dejaron agitando durante 5 minutos y luego se recogieron con un tamiz de malla de nylon de 250 uM, y se transfirieron a PBS que contenía ~10 mM de cloruro de calcio para reforzar la cubierta de alginato y proteger la integridad de la construcción durante el endurecimiento del núcleo.

Las construcciones se transfirieron posteriormente a un vial que contenía el reticulador HyStem, PEGDA, a una concentración IX (es decir, 1 vial en 2,5 mL de volumen total) para recrear la concentración normal del reticulador. El PEGDA (3400 Dalton) permea tanto la cubierta de alginato como el núcleo de HyStem, permitiendo que el reticulante se difunda finalmente por toda la construcción. Este parámetro está claramente sujeto a variaciones, ya que la proporción entre el total de PEGDA y los componentes de HyStem fue mucho mayor que si el gel se hiciera a granel. En este caso, sólo había un par de cientos de microlitros de Glycosil en el recipiente, en lugar de los 2,0 mL normales de Glycosil Gelin-S. En cualquier caso, esto se eligió simplemente como punto de partida, y puede ser modificado.

Tras la incubación a temperatura ambiente durante el fin de semana, las construcciones se observaron mediante microscopía óptica. Las construcciones resultantes se muestran en la Fig. 2. Curiosamente, parece que o bien los núcleos se encogen, o bien las cubiertas se expanden, ya que hay espacios vacíos entre las dos capas que originalmente estaban en contacto directo. Las construcciones se transfirieron a una placa de Petri que contenía 10 mL de citrato de sodio 50 mM en PBS y se colocaron en una agitación orbital a bajas rpm para crear una agitación suave y un flujo de fluido. Las construcciones se observaron durante 45 minutos, tiempo durante el cual las cubiertas de alginato se deterioraron significativamente y, en algunos casos, desaparecieron por completo, y los núcleos HyStem permanecieron sin cambios y en su geometría esférica original. Véase la Fig. 3. Después de 45 minutos, las construcciones (véase la Fig. 4) se recogieron en un tamiz de malla de nylon de 250 uM, se devolvieron a la placa de Petri y se lavaron con una nueva alícuota de 10 mL de citrato de sodio 50 mM. Véase la Fig. 5. Poco después de este paso (cuestión de minutos), prácticamente todas las construcciones estaban desprovistas de cualquier cubierta visible, y sólo quedaban los núcleos de HyStem endurecidos. Véase la Fig. 6.

Las microesferas HyStem se transfirieron a continuación a PBS limpio para su posterior observación.

Ejemplo 2

A. Protocolo general para producir microesferas de hidrogel utilizando un molde de alginato

1. Preparar la solución líquida de polímero de hidrogel a las concentraciones finales deseadas de los componentes, ajustadas para que contengan 25 mM de ion calcio. La concentración de cationes debe ajustarse para diferentes tamaños de gotículas. Por ejemplo, se han utilizado hasta 200 mM de iones de calcio y/o 200 mM de iones de bario para gotículas con un intervalo de tamaño medio de aproximadamente 400-600 micrómetros.

2. Cargar la solución en el generador de gotículas (por ejemplo, jeringa/aguja, o un dispositivo de micropartículas/microencapsulador) e iniciar la formación de gotículas, ajustando la configuración del instrumento para lograr el tamaño de gotícula deseado.

3. Recoger las gotículas en un baño de agitación que contenga una solución de alginato de sodio de baja viscosidad al 0,25% (p/v) en un tampón o medio sin calcio (por ejemplo, PBS) a temperatura ambiente. La concentración de alginato puede ajustarse. Por ejemplo, se ha utilizado alginato de sodio al 0,125% p/v para gotículas más pequeñas. La viscosidad y la densidad de la solución de polímero de hidrogel (núcleo) dictan en última instancia si se pueden formar o no construcciones verdaderamente esféricas al entrar en contacto con el baño de alginato. Además, la altura de la gotícula, es decir, la distancia desde la salida que genera la gotícula hasta la superficie del baño, también influirá en la morfología de las construcciones resultantes. Los valores específicos de estos parámetros también variarán en función del tamaño de la gotícula, el tipo de material, la concentración y la viscosidad de la solución de alginato, etc. Estos factores deben tenerse en cuenta y, en última instancia, impondrán restricciones a la composición de la solución de polímero de hidrogel objetivo. 4. Una vez recogidas todas las gotículas del baño, continuar agitando durante ~5 minutos para permitir que se formen completamente las cubiertas de alginato y reducir o evitar la agregación de las construcciones líquidas de núcleo y cubierta. Dependiendo del tamaño (volumen) de la gotícula original, este paso puede ser opcional. En el caso de las esferas de mayor tamaño (1-3 mm), parece que esto limita la agregación de las construcciones. La duración de la agitación es inversamente proporcional a la concentración de catión divalente utilizada en las gotículas. Además, se ha comprobado que la deformación de las gotículas puede producirse con una agitación excesiva. Se ha comprobado que un tiempo de agitación de aproximadamente 1-2 minutos es suficiente para las gotículas más pequeñas.

5. Separe las construcciones de la solución de alginato utilizando un colador o tamiz de tamaño adecuado. 6. Reticulación/gelificación de la solución de polímero del núcleo del hidrogel según el requisito específico de la solución de hidrogel concreta que se utilice. Este paso variará en función del tipo de solución precursora de hidrogel que se utilice. En algunos casos, implicará la transferencia de las construcciones líquidas de núcleocubierta a un baño o recipiente de gelificación del núcleo que contenga reticulador de hidrogel. En cualquier caso, es probable que este paso sea muy similar al protocolo de gelificación recomendado por el fabricante asociado a cada material, con sólo ligeras modificaciones para tener en cuenta la cubierta de alginato y la geometría de la construcción. Sea cual sea el caso, el medio utilizado en este caso debe contener al menos alguna cantidad de iones de calcio para mantener la integridad de la cubierta de alginato durante el endurecimiento.

7. Cualquier endurecimiento, curado o incubación adicional que se desee puede realizarse en este punto (por ejemplo, si se encapsulan células vivas que requieren una manipulación suave). En caso contrario, pase inmediatamente al paso 8.

8. A continuación, se retira la cubierta temporal de alginato. Por ejemplo, las construcciones núcleo/cubierta se transfieren a un baño y/o se lavan con el quelante apropiado para eliminar la cubierta de alginato. Transfiera las construcciones de núcleo-cubierta ahora sólidas a una solución de 25-50 mM de citrato de sodio en PBS (u otro tampón libre de calcio), y agite suavemente durante 20-40 minutos a 24-37 °C, mientras controla visualmente el progreso de la degradación de la cubierta. No se ha identificado la relación de volumen específica entre las microesferas y la solución de citrato. Dado el bajo coste del citrato, este paso debería realizarse simplemente utilizando un exceso bastante grande de la solución de citrato para asegurar la eliminación completa de la cubierta de alginato.

9. Lavado las construcciones utilizando un colador o tamiz de tamaño adecuado con solución de citrato adicional, repita la agitación en solución de citrato fresca hasta que las cubiertas se disuelvan completamente por inspección visual. Es probable que el cizallamiento mecánico del fluido durante el lavado sea la razón por la que este paso fue eficaz para eliminar el material restante de la cubierta de alginato, en lugar de la solución de citrato "fresca". Por lo tanto, realizar este paso de lavado antes podría acortar este proceso.

10. Las microesferas (microperlas) ya están listas para ser utilizadas. Transferir al medio o tampón deseado para su uso.

B. Ejemplo de procedimiento utilizado para producir microesferas "HyStem" utilizando el procedimiento del molde de alginato

1. El Glycosil de calidad GMP (el componente polimérico de ácido hialurónico tiolado de los hidrogeles HyStem-C) se reconstituyó a 10 mg/mL utilizando una solución de conservación de órganos tamponada. La solución es HTK Preservation Solution.

2. Se añadió polvo de cloruro de calcio a la solución de Glycosil para conseguir ~25 mM de concentración de iones de calcio.

3. A continuación, la solución de polímero de hidrogel Ca2+/Glicosil se añadió gotícula a gotícula a un baño de alginato al 0,25% (p/v) agitado (Protanal LF 10/60) utilizando una jeringa y una aguja de punta roma de 27 G desde una altura de 1-2 cm. A veces, para disminuir el tamaño de la gotícula, se perturbó mecánicamente la gotícula golpeando repetidamente la jeringa.

4. Las construcciones líquidas esféricas de Glycosil con núcleo de alginato se formaron instantáneamente al entrar en contacto la gotícula con el baño, y se agitaron durante 5 minutos más para permitir que la cubierta se formara completamente y se redujera la agregación. Aunque en general son esféricas, las construcciones tienen rasgos similares a cola, algunas más grandes que otras. Estas deberían eliminarse fácilmente ajustando la viscosidad de la solución de Glycosil, por ejemplo, la concentración, o añadiendo otros agentes modificadores de la viscosidad.

5. Las construcciones se recogieron con un tamiz de malla de nylon de 250 micrómetros y se almacenaron en 10 mM de Ca2+ en PBS para su posterior procesamiento (eliminación de la cubierta). Este paso puede ser opcional en algunos casos.

6. Las construcciones se transfirieron a un tubo que contenía Extralink (diacrilato de PEG de 3400 g/mol) a una concentración final de 1X (es decir, 1 vial de Extralink de calidad GMP en 2,5 mL en dicha solución tamponada utilizada en el paso 1), y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. En algunas realizaciones se pueden utilizar tiempos de incubación más cortos.

7. A continuación, las construcciones se transfirieron a una solución de citrato de sodio 50 mM en PBS y se agitaron suavemente en un agitador orbital durante ~45 minutos. La degradación de la cubierta de alginato se supervisó mediante microscopía óptica. No se notaron muchos cambios entre los 20 y 45 minutos. Como se alude en el comentario general del protocolo, la etapa de lavado parece facilitar el proceso de eliminación de la cubierta.

8. A continuación, las construcciones se lavaron en un tamiz de malla de nylon de 250 micrómetros con una solución fresca de citrato, y luego se agitaron de nuevo en citrato de sodio hasta que no quedó ninguna evidencia visual de la cubierta de alginato, dejando sólo el núcleo esférico sólido de Glycosil. Es posible que el alginato se haya eliminado por completo sólo con el paso de lavado. Sin embargo, esto no se verificó mediante microscopía antes de ser devuelto a la solución de citrato y agitado durante varios minutos.

9. Las esferas de Glycosil se almacenaron en PBS a temperatura ambiente.

C. Ejemplo de procedimiento utilizado para producir microesferas "HyStem" utilizando el procedimiento del molde de alginato con reticulante en el precursor del hidrogel

1. La solución precursora del hidrogel se preparó como sigue: 1% p/v Glycosil (HA tiolado, MW ~250 kDa), 200 mM de cloruro de calcio, 100 mM de histidina y 0,25% de PEGDA 3400 (pH 6,5, viscosidad ~ 50 cP).

2. Se dejaron caer gotículas de precursor de hidrogel de aproximadamente 600 micrómetros de diámetro en un baño de agitación de alginato de baja viscosidad Protanal LF 10/60 al 0,125% (viscosidad ~ 2.5 cP) desde una altura de 17 cm con una velocidad inicial de aproximadamente 1,5 m/s a temperatura ambiente para formar micropartículas de núcleo/cubierta.

3. Las micropartículas del núcleo de la cubierta se agitaron en el baño de alginato durante 2 minutos, y luego se recogieron utilizando un tamiz de 250 micrómetros.

4. Las micropartículas núcleo/cubierta se transfirieron a PBS (pH 7,4) y se incubaron durante la noche para permitir la reticulación del hidrogel (Glycosil y PEGDA).

5. Después de la incubación durante la noche, las micropartículas de núcleo/cubierta se transfirieron a un baño de agitación de cloruro de sodio al 0,85% (o PBS sin calcio) que contenía 50 mM de citrato de sodio hasta que las cubiertas de alginato se disolvieron completamente.

Ejemplo 3

A. Ejemplo de procedimiento utilizado para producir microesferas "HyStem-C" reticuladas por UV utilizando el procedimiento del molde de alginato

1. La solución precursora del hidrogel se preparó con la siguiente composición y propiedades físicas.

• 1,0% (p/v) Glycosil (polímero precursor del hidrogel)

• 0,5% (p/v) Gelin-S (agente bioactivo)

• 1,0% (p/v) Polietilenglicol norborneno de 4 brazos (reticulante reactivo al tiol catalizado por radicales hidroxilos, pm: 10 kDa, JenKem USA)

• 12% (v/v) de iodixanol (agente modificador de la densidad)

• 200 mM CaCl²

• 10 mM HEPES

• pH ~ 7 a temperatura ambiente

• Densidad = 1,08 g/mL a temperatura ambiente

• Viscosidad ~ 60 cP a temperatura ambiente

2. El baño de alginato se preparó con la siguiente composición y propiedades físicas.

• 0,12% (p/v) Protanal LF 10/60 Alginato de baja viscosidad

• 0,1% Tween 20 (tensioactivo)

• 0,1% Irgacure 2959 (fotoiniciador, Sigma Aldrich)

• 10 mM HEPES

• pH ~ 7 a temperatura ambiente

• Densidad ~ 1,0 g/mL a temperatura ambiente

• Viscosidad ~ 2,5 cP a temperatura ambiente

3. Se introdujeron gotículas de la solución precursora del hidrogel en el baño de alginato agitado utilizando un generador de gotículas desde una altura de aproximadamente 20 cm para generar micropartículas de núcleo/cubierta de aproximadamente 1 mm de diámetro de núcleo.

4. Inmediatamente después de la formación de la partícula núcleo/cubierta, se irradió el baño agitado con una lámpara ultravioleta de onda larga (Ultraviolet Products, LLC, modelo UVL-56, 6 vatios, 365 nm) a través de la pared lateral del recipiente de vidrio que contenía las partículas y la solución de alginato con el fotoiniciador (Irgacure 2959). Se continuó agitando durante 5 minutos.

Tras 5 minutos de agitación inicial, el baño de alginato se diluyó 1:1 con solución salina que contenía 10 mM de HEPES para evitar la agregación y el sobrecrecimiento de las cubiertas de alginato. La irradiación UV y la agitación se continuaron durante 25 minutos más.

Por último, se añadió al baño citrato de sodio 1,0 M hasta alcanzar una concentración final de 25 mM de ion citrato. Las cubiertas de alginato se disolvieron completamente después de aproximadamente 5 minutos para revelar las microperlas de hidrogel HyStem reticuladas. A continuación, se recogieron las perlas de HyStem con un tamiz de 250 micrómetros.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de encapsulación de material biológico en una matriz de hidrogel tridimensional, dicho procedimiento comprende:

proporcionar una solución precursora de hidrogel, dicha solución comprende un compuesto precursor de hidrogel no alginato, un agente reticulante de hidrogel opcional, dicho material biológico, y un catión divalente seleccionado del grupo que consiste en calcio, bario, estroncio, y combinaciones de los mismos, dispersado o disuelto en un sistema de disolventes;

combinar dicha solución precursora de hidrogeles con alginato para producir micropartículas de núcleo/cubierta, cada micropartícula de núcleo/cubierta comprende una cubierta de alginato y un núcleo líquido que comprende dicha solución precursora de hidrogel;

reticular de dicho compuesto precursor de hidrogel en dicho núcleo líquido para producir micropartículas reticuladas núcleo/cubierta, cada micropartícula reticulada núcleo/cubierta comprende dicha cubierta de alginato y un núcleo que comprende una matriz de hidrogel tridimensional y dicho material biológico, quedando dicho material biológico atrapado en dicha matriz de hidrogel; y

eliminar dicha cubierta de alginato para producir microperlas de hidrogel autosostenibles, cada microperla de hidrogel comprende dicha matriz de hidrogel tridimensional y material biológico atrapado en la misma.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto precursor de hidrogel es ácido hialurónico.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha solución precursora de hidrogel comprende además fibronectina, laminina, colágeno, componentes de la matriz extracelular o versiones sintéticas de los mismos.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho material biológico se selecciona del grupo que consiste en poblaciones de células, grupos de células, tejidos, combinaciones de los mismos y fragmentos de los mismos.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho material biológico se selecciona del grupo que consiste en islotes, hepatocitos, células madre, células endocrinas, tejidos relacionados con islotes, hepatocitos, células madre, células endocrinas, y racimos de islotes, racimos de hepatocitos, racimos de células madre, racimos de tiroides, racimos de glándulas suprarrenales, racimos de hipófisis, y combinaciones de los mismos.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha solución precursora de hidrogel consiste esencialmente en dicho compuesto precursor de hidrogel, un catión divalente, material biológico y, opcionalmente, un agente reticulante de hidrogel dispersado o disuelto en el sistema de disolventes.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha combinación comprende la adición de dicha solución de precursor de hidrogel gotícula a gotícula a una solución de alginato para producir dichas micropartículas de núcleo/cubierta.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha adición comprende generar gotículas de dicha solución precursora de hidrogel y dejar caer dichas gotículas en dicha solución de alginato para producir dichas micropartículas de núcleo/cubierta, en las que dicha gotícula tiene preferentemente una dimensión máxima de superficie a superficie menor de aproximadamente 5 mm.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la relación entre la viscosidad de la solución precursora del hidrogel y la viscosidad de la solución de alginato es mayor que 1, a temperatura ambiente.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha reticulación comprende:

poner en contacto dichas micropartículas de núcleo/cubierta con un reticulador de matriz de hidrogel; o exponer dichas micropartículas de núcleo/cubierta a una radiación activadora para iniciar la reticulación.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha eliminación comprende:

poner en contacto dichas micropartículas reticuladas con un agente quelante para debilitar, disolver o interrumpir dicha cubierta de alginato; o

agitar físicamente dichas micropartículas reticuladas de núcleo/cubierta para romper dicha cubierta de alginato.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho agente quelante se selecciona del grupo que consiste en citrato, EDTA, EGTA, fosfatos y mezclas de los mismos.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha microperla de hidrogel tiene una dimensión máxima de superficie a superficie menor de aproximadamente 5 mm.