KR20160139228A

KR20160139228A - 하이브리드 중공 마이크로캡슐, 이를 포함하는 연조직용 스캐폴드, 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20160139228A
Application number: KR1020150073755A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 라자 라자마닉캄; 김종철
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2016-12-07
Also published as: US20160346218A1; KR101772642B1; CN114870084A; CN106178114A

Abstract

본 발명에서는 높은 압축변형 상태로부터 탄력성 있게 회복할 수 있는 가교된 무기입자 네트워크를 포함하는 매크로다공성 물질의 동결을 이용한 제조과정과, 이들 물질의 연조직공학용 스캐폴드 및 약물전달 시스템으로서의 활용 가능성이 제공된다.

Description

하이브리드 중공 마이크로캡슐, 이를 포함하는 연조직용 스캐폴드, 및 이의 제조방법{Hybrid hollow microcapsule, scaffold comprising the same, and preparation method thereof}

본 발명은 하이브리드 중공 마이크로캡슐, 이를 포함하는 연조직용 스캐폴드, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학 분야에서는 원하는 생물의학적 효과를 얻기 위하여 매크로다공성 생체적합성 물질을 세포의 성장과 동물모델 내로의 이식을 위한 템플릿으로 사용한다. 조직공학 용도로 사용하기 위해서는 호스트 조직과의 기계적 특성 유사성이 매우 중요하다. 또한, 해당 물질로부터의 기계적 자극이 줄기세포의 분화반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다.

지방조직(adipose tissue)과 같은 연조직(soft tissue)의 조직공학 용도를 위해서는, 해당 호스트 조직처럼 부드러우면서도 탄력성 있는 회복이 가능한 스캐폴드가 요구된다. 예컨대, 지방조직의 탄성계수는 3 내지 4 kPa 범위이다. 해당 물질은 이식 후 외부에서 힘을 가할 때 내부구조를 유지해야 한다. 종래의 연조직공학 연구는 주로 고분자계의 가교된 매크로다공성 스캐폴드를 중심으로 수행되었다. 이러한 고분자계 스캐폴드는 부드럽긴 하지만 높은 압축변형 하에서 탄력성 있는 회복능력을 가지지 못한다. 또한, 이들 고분자계 스캐폴드의 기계적 강도는 고분자 사슬의 가교밀도를 통해서만 제어가 가능하다.

골재생 용도로 사용할 수 있는 단단한 스캐폴드를 제작하기 위해서는 순수하게 무기조성만을 가지는 물질이 유용하다. 다공성 히드록시아파타이트를 골재생용 스캐폴드로 사용한 예가 다수 보고된 바 있다. 이들 스캐폴드는 부서지기 쉽고 한번 변형되면 회복이 되지 않는다. 또한, 이들 스캐폴드는 분해속도가 느린 것으로 생각된다.

생체모방 히드록시아파타이트/고분자 복합체의 형성방법을 이용하여 골 대체재로서 사용 가능한, 부서지기 쉬운 다공성 물질이 얻어졌다. 본 발명자들은 동결을 이용한 방법을 통해 PEI가 코팅된 무기입자의 네트워크를 포함하며 디에폭시 PEG 가교제에 의해 가교된, 무기함량 ~ 85%의 탄성 스캐폴드를 제작할 수 있음을 보고한 바 있다. 이러한 물질을 조직공학용 스캐폴드로 사용하는 경우 유리된 가교제에 의한 세포독성이 문제가 될 수 있다. 따라서, 가교제를 포함하지 않으면서 부드럽고 무기함량이 높은 탄성 스캐폴드를 제작할 수 있는 방법이 요구된다.

반대 전하를 가지는 고분자 전해질의 층을 탄산칼슘 마이크로입자, 실리카 입자, 멜라민수지 등과 같은 희생코어 상에 한 층씩 흡착하여 고분자전해질 중공캡슐을 합성하는 방법이 보고되었다. 이러한 고분자계 PEM 중공캡슐의 기계적 특성은 주로 PEM 층의 수와 고분자 사슬의 가교밀도에 의해 좌우된다. 무기나노입자 표면에 PEM 셸을 형성한 것과 같은 무기/유기 하이브리드 중공구체의 제조에 관한 연구도 보고되었다. Dmitry G. Shchukin 등은 Y₂O₃-FeO₃와 인산칼슘을 사용하여 PAH/PSS PEM 캡슐을 제조하였으며, Matthieu F. Bedard 등은 금 나노입자를 포함하는(PDADMAC/PSS) 캡슐 셸을 보고하였다.

PEM만으로 구성되는 중공캡슐의 기계적 특성은 주로 AFM 콜로이드 프로브 존재 하에서 힘과 변형의 측정, 삼투압에 의한 변형의 측정, 그리고 좁은 채널을 통해 압착될 때 캡슐에 발생하는 변형의 측정을 통해 측정되었다. 기계적 특성의 측정 결과, PEM 중공캡슐은 최대 20%의 변형으로부터 회복될 수 있음이 확인되었다. 기계적 자극에 의한 약물전달을 위해서는 최대 90%의 압축변형 후에도 회복이 가능한 중공캡슐이 요구된다.

미국 특허 제8,623,085호

Langer R, Vacanti JP "Tissue engineering" Science 260 (5110): 920-926 D.W. Hutmacher "Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage" Biomaterials, 21 (24) (2000), pp. 2529-2543 R. A. Marklein and J. A. Burdick, "Controlling Stem Cell Fate with Material Design" Adv. Mater., 2010, 22, 175-189. L. E. Flynn, "The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells" Biomaterials, 2010, 31, 4715-4724. L. Flynn and K. A. Woodhouse, "Adipose tissue engineering with cells in engineered matrices" Organogenesis, 2008, 4, 228-235

본 발명의 여러 구현예에 따르면, 높은 압축 변형 상태로부터 탄력성 있게 회복할 수 있는 가교된 무기입자 네트워크를 포함하는 매크로다공성 물질의 동결을 이용한 제조과정과, 이들 물질의 연조직 공학용 스캐폴드 및 약물 전달 시스템으로서의 활용 가능성이 제공하고자 한다..

본 발명의 일 측면은 (a) 내부가 비어 있는 중공 코어 고분자 층, (b) 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 무기 나노입자와 캡슐 코팅용 고분자를 포함하는 유무기 복합 층을 포함하고, 상기 유무기 복합 층은 1개의 유무기 복합 층으로 구성된 유무기 복합 단일 층이거나 또는 복수 개의 유무기 복합 층이 층층이 쌓여 형성된 유무기 복합 복수 층이고, 상기 코어 고분자 층과 상기 캡슐 코팅용 고분자는 가교된 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 중공 마이크로캡슐을 포함하는 연조직용 스캐폴드에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 (A) ① 양의 전하를 띠는 희생 코어 또는 ② 음의 전하로 개질된 희생 코어 상에 코어 고분자 층을 형성시키는 단계; (B) ① 상기 희생 코어가 양의 전하를 띠는 희생 코어인 경우에는 상기 코어 고분자 층 위에 무기 나노입자 층과 캡슐 코팅용 고분자 층을 교대로 1회 이상 형성시키고, ② 상기 희생 코어가 음의 전하로 개질된 희생 코어인 경우에는 상기 코어 고분자 층 위에 무기 나노입자 코팅용 조성물로 코팅된 무기 나노입자 층과 캡슐 코팅용 고분자 층을 교대로 1회 이상 형성시키는 단계; (C) 코어 고분자와 캡슐 코팅용 고분자를 가교시키는 단계; 및 (D) 상기 희생 코어를 에칭시켜 제거하는 단계를 포함하는 중공 마이크로캡슐의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 여러 구현예에 따르면, 높은 압축변형 상태로부터 탄력성 있게 회복할 수 있는 가교된 무기입자 네트워크를 포함하는 매크로다공성 물질의 동결을 이용한 제조과정과, 이들 물질의 연조직공학용 스캐폴드 및 약물전달 시스템으로서의 활용 가능성이 제공된다. 이러한 물질의 탄력성은 사용된 입자의 성질과는 무관하고, 생체적합성 무기 나노입자인 히드록시아파타이트, 실리카 나노입자 및 PLGA 나노구체를 천연 생체고분자인 젤라틴 또는 키토산으로 코팅하고, EDC와 텔레킬릭 디에폭시 또는 글루타르알데히드를 가교제로 사용한 물질을 예시하였다. 이들 물질의 기계적 특성과 분해특성은 가교밀도를 통해 제어할 수 있다. 이들 스캐폴드의 회복특성은 세포를 스캐폴드 내에 세포를 로딩하는 데 있어 매우 효과적이다. 생체 외 및 생체 내 실험을 통해 이들 물질이 생체적합성을 가짐을 확인하였다. 같은 방법을 이용하여, EDTA 용액으로 에칭이 가능한 탄산칼슘 마이크로입자 상에 키토산 입자와 7 nm 콜로이드성 실리카, 히드록시아파타이트 또는 마그네타이트 나노입자를 교대로 자기조립방식(Layer-by-Layer, LbL)으로 흡착하여 탄성 하이브리드 중공 마이크로캡슐을 제조할 수 있다. 키토산층을 글루타르알데히드 또는 텔레킬릭 디에폭시로 가교하여 안정화시켰다.

도 1은 스캐폴드의 이미지이다. (a) 10% HAp, 1% 젤라틴 및 4mg EDC 스캐폴드 ~ 팽윤되었을 때, ~90% 압축되었을 때, 회복되었을 때; (b) 10% HAp, 1% 젤라틴 및 0.1mg EDC 스캐폴드가 물이 없는 상태와 있는 상태의 이미지.
도 2는 스캐폴드의 이미지이다. (a) 10% HAp, 1% 젤라틴 및 0.1mg EDC; (b) 10% HAp, 1% 젤라틴 및 0.5mg EDC; (c) 10% HAp, 1% 젤라틴 및 2mg EDC; (d) 10% HAp, 1% 젤라틴 및 4mg EDC; (e) 20% HAp, 1% 젤라틴 및 4mg EDC; (f) 10% 0.5um-SiO₂, 1% 젤라틴 및 4mg EDC
도 3은 순수(bare) 히드록시아파타이트 나노입자(HAp), 시트레이트 캡핑된 히드록시아파타이트 나노입자(Cit-Hap), 젤라틴으로 코팅된 Cit-Hap (Gel-Cit-HAp) 및 10% HAp, 1%젤라틴 및 4mg EDC 스캐폴드에 대한 열중량 분석(thermo gravimetric analysis). 그래프는 습기에 의한 중량 손실을 피하기 위해서 120 ℃에서부터 도시하였다.
도 4는 스캐폴드의 유변학적 측정 결과이다. (a) 10% HAp 및 1% 젤라틴의 스캐폴드의 진동수 스윕(frequency sweeps), 4개의 서로 다른 EDC 함량의 스캐폴드(즉 0.5, 1, 1.5 및 2mg EDC). (b) EDC 함량 증가에 따른 전단응력 변화 그래프. (c) 물을 용매로 사용하였을 때 스캐폴드의 팽윤율.
도 5는 다양한 조건에서 스캐폴드의 in-vitro 효소 분해 프로파일(enzymatic degradation profiles) (중량 손실 0%는 스캐폴드가 입자로 완전하게 분해됨을 의미한다)
도 6은 NIH 3T3으로 시딩(seeding)하고 3일 동안 배양(incubation)한 후 10% HAP 1% 젤라틴 0.5mg EDC 스캐폴드의 SEM 사진이다.
도 7은 2주 동안 마우스에 피하 주입된 HAp-젤라틴 스캐폴드에 대한 조직학적 분석. (A) 헤마톡실린-에오진 염색된(hematoxylin-eosin staining) 스캐폴드의 단면 이미지 (S: 스캐폴드, dark purple; M: muscle). 오른쪽 삽입 사진은 in-vivo 임플란트 상태에 대한 이미지. (B) 콜라겐에 대해 시리어스 레드 염색(sirius red staining)이 있는 스캐폴드의 단면 이미지(collagen: dark red) (C) 경계면에서 C의 확대도 (immune cells: dark purple dots without pale purple boundaries). (D) D-섹션의 확대도 (settled cells: pale purple area with purple dots; blood vessel: bundle of bright red dots surrounded by purple area).
도 8은 상이한 크기의 하이브리도 중공 캡슐이 (a), (b) 제조공정, (c) 광학 이미지이다.
도 9는 (i) 실시예 6-1에서 제조한 탄성 하이브리드 중공 캡슐에 대해 (a) narrow patch clamp를 통해서 스퀴징 하기 전과 (b) 스퀴징 하고 난 후에 대한 형광 광학 이미지; (ii) HHC에 대해 상이한 PSS 70K Da Mw 농도에서 수행한 삼투압 유도 파괴(rupture)에 대한 광학 이미지이다.
도 10은 실시예 9에서 수행한 중공 마이크로 캡슐의 약물 로딩 및 외력에 의한 약물 방출에 대한 실험 결과이다. 적용된 외력 사이클(a)와 각 사이클에서 방출된 약물의 양(b), 그리고 그것의 누적그래프(c)가 제시되어 있다. 누적 그래프에는 각 외력 사이클 시점에 해당하는 캡슐의 대표적인 형광이미지가 첨부되어 있다(스케일바 10ㅅm).

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명에 있어서, 유무기 복합 층의 최외각 층은 캡슐 코팅용 고분자 층이어야 하고, 상기 코어 고분자 층과 상기 캡슐 코팅용 고분자는 가교되는 것이 바람직하며, 이를 통해서 세척 단계에서 무기 나노입자가 유실되는 것을 막을 수 있기 때문이다.

위와 같은 본 발명의 일 측면은 아래 2가지의 대표적인 구현예에 의해 구현될 수 있다.

첫 번째 대표적인 구현예에 따르면, 상기 유무기 복합 층은 (b1) 상기 무기 나노입자로 구성된 무기 나노입자 층과 (b2) 상기 캡슐 코팅용 고분자로 구성된 캡슐 코팅용 고분자 층이 순서대로 1회 이상 교대로 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 형성된 1개 또는 복수 개의 유무기 복합 층으로 구성된 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

두 번째 대표적인 구현예에 따르면, 상기 유무기 복합 층은 (b1') 무기 나노입자 코팅용 고분자로 코팅된 상기 무기 나노입자로 구성된 코팅 무기 나노입자 층과 (b2) 상기 캡슐 코팅용 고분자 층이 교대로 1회 또는 복수 회 반복하여 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 형성된 1개 또는 복수 개의 유무기 복합 층으로 구성되고, 상기 무기 나노입자 코팅용 고분자는 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

이하에서는 먼저 첫 번째 대표적인 구현예에 따른 발명에 대해서 먼저 기술한다.

위에서 살펴본 바와 같이, 첫 번째 대표적인 구현예에 따르면, 상기 유무기 복합 층은 (b1) 상기 무기 나노입자로 구성된 무기 나노입자 층과 (b2) 상기 캡슐 코팅용 고분자로 구성된 캡슐 코팅용 고분자 층이 순서대로 1회 이상 교대로 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 형성된 1개 또는 복수 개의 유무기 복합 층으로 구성된 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

예를 들어, 상기 유무기 복합 층은 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 (b1) 상기 무기 나노입자로 구성된 무기 나노입자 층과 (b2) 상기 캡슐 코팅용 고분자로 구성된 캡슐 코팅용 고분자 층이 순서대로 형성된 층일 수도 있다. 또는 상기 유무기 복합 층은 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 (b1)층, (b2)층, (b1)층, (b2)층이 순서대로 형성된 층일 수도 있다.

일 구체적인 구현예에 따르면, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 양의 전하를 띠는 고분자의 단독 고분자 코어 층일 수도 있고, (ii) 양의 전하를 띠는 고분자 층과 음의 전하를 띠는 고분자 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층이고, 상기 복합 고분자 코어 층의 최외각 고분자 층은 양의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

이와 같이, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 양의 전하를 띠는 고분자의 단독 고분자 코어 층일 수도 있다. 또는, 상기 중공 코어 고분자 층은 (ii) 양의 전하를 띠는 고분자 층과 음의 전하를 띠는 고분자 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층일 수 있으며, 특히 (ii)인 경우 (i)인 경우에 비해 희생 코어의 표면을 더욱 매끈하게 하여 유무기 복합 층 형성이 더욱 용이하게 만들 수 있는 유리한 효과를 얻을 수 있다.

다만, 이와 같이 양의 전하를 띠는 고분자와 음의 전하를 띠는 고분자를 반복해서 코팅하는 대신에, 어느 한 종류의 고분자의 코팅을 수 차례 반복해서도 위와 같은 매끈한 표면을 얻을 수는 있다. 다만, 양의 전하를 띠는 고분자와 음의 전하를 띠는 고분자를 반복해서 코팅하는 것이 자기조립 방식에 의해 더욱 쉽게 매끈한 표면을 달성할 수 있고, 이에 따라 무기 나노입자 층과 캡슐 코팅용 고분자 층이 교대로 적층된 유무기 복합층을 더욱 마일드한 조건에서 더욱 높은 수율로 적층할 수 있다는 점을 확인하였다. 뿐만 아니라, 여러 층으로 LbL 방식으로 적층하게 되면 고분자 단일층에 비하여 기계적 물성과 안정성이 증가됨을 확인하였다.

또한, 상기 복합 고분자 코어 층은 단일 층일 때는 양의 전하를 띠는 고분자의 단일 층인 것이 바람직하고, 복합 층일 때는 최외각 고분자 층이 양의 전하를 띠는 복합 층인 것이 바람직하며, 이는 코어 고분자 층 표면에 통상 음의 전하를 띠는 무기 나노입자와 양의 전하를 띠는 고분자 층을 교대로 LbL 방식으로 적층하는 데에 유리하기 때문이다.

또한, 상기 복합 고분자 코어층은 두께가 8 내지 12 nm, 바람직하게는 9 내지 11 nm인 것이 반복되는 극심한 탄성 변형에서도 우수한 안정성을 유지할 수 있다는 점에서 유리하다는 점을 확인하였다.

다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 양의 전하를 띠는 고분자는 키토산, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(PAH), 폴리달릴디메틸 암모늄크로라이드(PDADMAC) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되고; 상기 음의 전하를 띠는 고분자는 알긴산, 헤파린, 폴리스틸렌 설포네이트(PSS), 폴리아크릴릭 에시드(PAA) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 키토산 단독 고분자 코어 층이거나, 또는 (ii) 중공 키토산 층과 상기 중공 키토산 층 위에 알긴산 층과 키토산 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층이고, 상기 복합 고분자 코어 층의 최외각 고분자 층은 키토산 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 유무기 복합 층은 상기 (무기 나노입자 층 - 캡슐 코팅용 고분자 층)의 유무기 복합 층 1 내지 30개로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

이와 같이, 상기 (b) 복합 층은 상기 (무기 나노입자 - 캡슐 코팅용 고분자)의 유무기 복합 층이 1 내지 30개 형성되어 구성될 수도 있고, 바람직하게는 2 내지 10개, 가장 바람직하게는 2개 내지 5개의 유무기 복합 층으로 구성될 수도 있다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 무기 나노입자는 실리카, 히드록시아파타이트, 마그네타이트, 금, 은 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

본 발명에 있어서, 히드록시아파타이트는 시트레이트, 및 이들 2종 이상의 혼합물에 의해서 캡핑하는 것이 바람직하며, 그 이유는 음의 전하 반발력을 통해 물에서 분산 안정성을 크게 향상시킬 수 있기 때문이며, 이와 같은 캡핑이 없이는 소니케이팅과 같은 추가 단계가 필요하다. 또한, 캡핑을 통해서 비캡핑 나노입자들이 빨리 침전될 수 있도록 하여 자기조립 단계가 원활이 이루어질 수 있도록 하는 장점도 있다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 캡슐 코팅용 고분자는 양의 전하를 띠는 고분자인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로 캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 유무기 복합 층은 1개 내지 10개의 (실리카 층 - 키토산 층)이 순차적으로 적층된 복합 층, 1개 내지 10개의 (히드록시아파타이트 층 - 키토산 층)이 순차적으로 적층된 복합 층, 1개 내지 10개의 (마그네타이트 층 - 키토산 층)이 순차적으로 적층된 복합 층 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 중공 마이크로캡슐은 상기 맨 바깥에 위치한 캡슐 코팅용 고분자 층 표면에 최외각 고분자 층을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 최외각 고분자 층은 음의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

이와 같은 추가 코팅 등을 통해서 최외각 고분자 층을 양의 전하 또는 음의 전하로 하전할 수 있으며, 이는 삼투압 실험에서 사용되는 삼투 유도 고분자 전해질과 반대 전하를 가지게 함으로써 삼투압 실험을 용이하게 할 수 있다는 점에서 유리하다. 예를 들어, 삼투 유도 고분자 전해질로서 음의 전하를 갖는 폴리스티렌 술포네이트를 사용하는 경우에는 양의 전하를 띠는 것이 유리할 수 있다.

특히, 최외각 고분자 층이 키토산인 경우에는 키토산이면 입자끼리 가교가 일어나 균일한 입자 형성이 어려울 수도 있으나, 아래 실시예 6-1, 실시예 6-2, 실시예 7, 실시예 8에 제시한 바와 같이 최외각 층이 키토산이 아닌 알지네이트 층인 경우에는 입자와 입자가 서로 가교되지 않아 입자가 서로 뭉쳐서 가교되는 것이 방지되는 장점이 있다.

이하에서는 두 번째 대표적인 구현예에 따른 발명에 대해서 먼저 기술한다.

예를 들어, 상기 유무기 복합 층은 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 (b1') 무기 나노입자 코팅용 고분자로 코팅된 상기 무기 나노입자로 구성된 코팅 무기 나노입자 층과 (b2) 상기 캡슐 코팅용 고분자로 구성된 캡슐 코팅용 고분자 층이 순서대로 형성된 층일 수도 있다. 또는 상기 유무기 복합 층은 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 (b1')층, (b2)층, (b1')층, (b2)층이 순서대로 형성된 층일 수도 있다.

본 발명에 있어서, "코팅" 무기 나노입자 층은 "고분자로 코팅된" 무기 나노입자 층을 의미한다.

일 구체적인 구현예에 따르면, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 음의 전하를 띠는 고분자의 단독 고분자 코어 층일 수도 있고, (ii) 음의 전하를 띠는 고분자 층과 양의 전하를 띠는 고분자 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층이고, 상기 복합 고분자 코어 층의 최외각 고분자 층은 음의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

이와 같이, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 음의 전하를 띠는 고분자의 단독 고분자 코어 층일 수도 있다. 또는, 상기 중공 코어 고분자 층은 (ii) 음의 전하를 띠는 고분자 층과 양의 전하를 띠는 고분자 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층일 수 있다.

다만, 이와 같이 양의 전하를 띠는 고분자와 음의 전하를 띠는 고분자를 반복해서 코팅하는 대신에, 어느 한 종류의 고분자의 코팅을 수 차례 반복해서도 위와 같은 매끈한 표면을 얻을 수는 있다. 다만, 양의 전하를 띠는 고분자와 음의 전하를 띠는 고분자를 반복해서 코팅하는 것이 자기조립 방식에 의해 더욱 쉽게 매끈한 표면을 달성할 수 있고, 이에 따라 무기 나노입자 층과 캡슐 코팅용 고분자 층이 교대로 적층된 유무기 복합층을 더욱 마일드한 조건에서 더욱 높은 수율로 적층할 수 있다는 점을 확인하였다.

또한, 상기 복합 고분자 코어 층은 단일 층일 때는 음의 전하를 띠는 고분자의 단일 층인 것이 바람직하고, 복합 층일 때는 최외각 고분자 층이 음의 전하를 띠는 복합 층인 것이 바람직하며, 이는 코어 고분자 층 표면에 코팅 무기 나노입자 층을 LbL 방식으로 적층하는 데에 유리하기 때문인데, 통상 무기 나노입자는 음의 전하를 띠지만 양의 전하를 띠는 고분자로 코팅되어 있기 때문에 코어 고분자 층 표면에 LbL 방식으로 적층되는 코팅 무기 나노입자 층은 양의 전하를 띠기 때문이다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 중공 코어 고분자 층은 알지네이트 단독 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 유무기 복합 층은 상기 (코팅 무기 나노입자 층 - 캡슐 코팅용 고분자 층)의 유무기 복합 층 1 내지 30개로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

이와 같이, 상기 (b) 복합 층은 상기 (코팅 무기 나노입자 - 코팅용 고분자)의 유무기 복합 층이 1 내지 30개 형성되어 구성될 수도 있고, 바람직하게는 2 내지 10개, 가장 바람직하게는 2개 내지 5개의 유무기 복합 층으로 구성될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 히드록시아파타이트는 시트레이트, 및 이들 2종 이상의 혼합물에 의해서 캡핑하는 것이 바람직하며, 그 이유는 음의 전하 반발력을 통해 물에서 분산 안정성을 크게 향상시킬 수 있기 때문이다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 무기 나노입자 코팅용 고분자는 양의 전하를 띠는 고분자이고, 상기 캡슐 코팅용 고분자는 음의 전하를 띠는 고분자인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로 캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 유무기 복합 층은 1개 내지 10개의 (키토산으로 코팅된 실리카 층 - 알지네이트 층)이 순차적으로 적층된 복합 층인 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐이 개시된다.

또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 중공 마이크로캡슐은 상기 맨 바깥에 위치한 캡슐 코팅용 고분자 층 표면에 최외각 고분자 층을 추가로 포함하고, 상기 최외각 고분자 층은 양의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐이 개시된다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 중공 마이크로캡슐을 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 상기 약물 전달체는 기계적 자극에 의해 응답성을 보이는(mechanical stimuli responsive) 또는 기계적 자극에 의해 조절 가능한(mechanical stimuli controlled) 약물 방출의 거동을 보이는 것을 특징으로 하는 약물 전달체가 개시된다.

일 구현예에 따르면, 상기 양의 전하를 띠는 희생 코어는 탄산칼슘 마이크로입자이고, 상기 음의 전하로 개질된 희생 코어는 포스페이트로 개질된 탄산칼슘 마이크로입자이며, 상기 코어 고분자 층과 상기 캡슐 코팅용 고분자 층은 자기조립방식에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐의 제조방법이 개시된다.

본 발명에서, 상기 포스페이트로 개질은 탄산칼슘을 pH 9 내지 11의 Na₂HPO₄ 용액과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.

또한 본 발명에서 있어서, 키토산은 글루타르알데히드와 같은 가교제를 이용하여 화학적으로 가교될 수 있고, 알지네이트는 Ca²⁺ 이온으로 가교될 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 (C) 가교 단계는 영하(subzero)의 온도에서 수행되는 것이 바람직하고, 특히 그 가교 대상이 되는 고분자가 키토산인 경우가 더욱 바람직하다. 이 경우에 가교된 결합의 유연성이 크게 증가하고 이에 따라 제조된 고분자 층의 탄성도 크게 향상되는 것을 확인하였다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

본 발명의 여러 구체적인 실시예에 따르면, HAp 함량이 최대 95%이며 초기 형태로부터 약 90% 변형된 후에도 탄력성 있게 회복 가능한, 생체흡수성, 생체적합성 탄성 매크로다공성 히드록시아파타이트-젤라틴 하이브리드 스캐폴드의 제조방법 등이 제공된다. 젤라틴 코팅된 HAp 입자를 EDC로 가교하였으며 -5 ℃ 내지 -80 ℃에서 동결건조를 통해 다공성 구조를 얻었다. 제조된 스캐폴드의 탄성특성은 사용된 입자의 성질과는 무관한데, 이는 PLGA 나노구체를 사용하여 제조한 스캐폴드에 의해 입증되었다. EDC 농도와 입자 함량을 변화시켜 압축탄성률이 다른 물질들을 제조하였다. 생체 외 및 생체 내 실험을 통해 이들 스캐폴드의 생체적합성을 확인하였다.

또한, 본 발명은 최대 90%의 탄성 변형 회복력을 보이는 가교된 하이브리드 실리카 나노입자/생체적합성 고분자 중공 마이크로캡슐의 동결을 이용한 합성방법을 제공한다. EDTA 용액으로 에칭이 가능한 탄산칼슘 마이크로입자 상에 키토산 입자와 7 nm 콜로이드성 실리카 입자를 교대로 LbL 흡착하여 캡슐을 제조하였으며 키토산층을 글루타르알데히드로 가교하였다.

본 발명에 따른 탄성 스캐폴드의 제조방법은 히드록시아파타이트, 실리카 또는 PLGA 나노입자를 생체적합성 주성분으로서 최대 95%까지 사용하고, 젤라틴, 키토산 또는 헤파린을 이들 입자를 코팅하기 위한 생체고분자로 사용하며, EDC, 텔레킬릭 디에폭시 또는 글루타르알데히드를 가교제로 사용한다.

또한, 본 발명에 따른 중공캡슐은 실리카, 히드록시아파타이트 또는 마그네타이트 나노입자를 무기성분으로, 키토산, 젤라틴 또는 알지네이트를 고분자성분으로, 글루타르알데히드 또는 텔레킬릭 디에폭시를 가교제로, 그리고 탄산칼슘을 희생코어로 사용하여 제조한다.

실시예

실시예 1: EDC 가교제로 가교된 히드록시아파타이트/젤라틴 스캐폴드의 제조 및 특성 확인(시트레이트 캡핑된 HAp @ EDC-가교된 젤라틴)

시트레이트로 캡핑되고 젤라틴(돼지 유래 B형 젤라틴)으로 코팅된 크기 ~200 nm의 히드록시아파타이트 나노입자를 -18 ℃에서 가교하여 부드럽고 탄력성 있는 회복이 가능한 매크로다공성 히드록시아파타이트/젤라틴 스캐폴드를 제조하였다. 동결되기 전의 최종 용액을 고분자 대 입자의 중량비가 1:10이 되도록 유지하였다. 즉, 0.6 mL의 탈이온수 내에서 60 mg의 입자를 6 mg의 젤라틴으로 코팅하였으며, EDC의 양을 0.1 mg, 0.5 mg, 2 mg 및 4 mg으로 달리하였다(도 2a~d의 SEM 이미지 참조). 도 1a는 4 mg EDC 스캐폴드의 디지털 이미지로서, 큰 압축변형 후에도 스캐폴드가 회복됨을 분명하게 보여준다. 입자들을 젤라틴과 격렬하게 혼합, 교반하여 코팅한 후 가교제인 EDC를 동결 직전에 가하였다. 고분자의 가교밀도가 제조된 스캐폴드의 기계적 특성에 큰 영향을 미친다. 0.1 mg의 EDC를 사용하여 가교밀도가 가장 낮은 경우, 젤리와 같이 매우 부드러운 스캐폴드가 얻어졌으며 용매(물) 내에서만 완전한 형태를 유지할 수 있었다(도 1b). 젤라틴의 농도를 0.6 mL의 탈이온수 내에서 입자 60 mg 대비 3 mg으로 낮춘 경우에도 동일한 결과가 관찰되었다. 또한, 적당한 강도를 가지는 스캐폴드를 얻기 위한 젤라틴의 최종 용액 내 최적농도는 1 중량%였다.

동결온도를 -5 내지 -80 ℃ 범위에서 변화시키고 최종 용액 내 입자 함량을 변화시킴으로써 스캐폴드의 다공성을 조절할 수 있다. 모든 온도에서 가교시간은 24시간으로 하였다. 입자 함량이 증가함에 따라 다공성은 감소하나 스캐폴드의 기계적 강도는 증가한다. 히드록시아파타이트 입자의 농도를 20 중량%(0.6 mL의 탈이온수 내에서 120 mg)로, 젤라틴의 농도를 1%(0.6 mL의 탈이온수 내에서 6 mg)로, 그리고 EDC의 농도를 0.6 mL의 최종 용액 내에서 4 mg으로 변화시켜 스캐폴드를 제조한 경우에도 이러한 거동이 관찰되었다(도 2e).

처리하지 않은 히드록시아파타이트 입자, 시트레이트 캡핑한 히드록시아파타이트 입자, 젤라틴으로 코팅된 히드록시아파타이트 입자 및 히드록시아파타이트 10%/젤라틴 1%/EDC 4 mg 조성의 스캐폴드에 대해 열중량분석(TGA)을 수행하였다. 분석을 위해 얇은 디스크 형태의 스캐폴드를 동결건조하여 사용하였다. 분석 결과, 스캐폴드는 무기함량이 90%, 유기함량이 10%였다(도 3).

높이 2 mm, 직경 8 mm의 스캐폴드 디스크에 대해 유동학 분석을 실시하였다. 선형적인 진동변형을 유도하기 위하여 각주파수를 ω = 10 rad/s, 변형률을 γ = 0.025%로 하였다. 모든 실험에서 ω 및 γ 값을 일정하게 하였다. 스캐폴드의 전단탄성률은 0.1 mg EDC 스캐폴드의 경우 300 Pa, 2 mg EDC 스캐폴드의 경우 7 kPa로 가교밀도가 증가함에 따라 증가하였다(도 4a, b).

스캐폴드의 팽창률을 중량측정법에 의해 측정하였다. 동결건조된 HAp 스캐폴드의 무게를 측정한 후 탈이온수에 5분 동안 담갔다. 팽창된 샘플 표면의 물을 여과지로 닦아낸 다음 무게를 측정한 후, 스캐폴드의 팽창률 SR을 식 (1) SR = (Wh-Wd)/Wd에 의해 계산하였다. 식에서, Wh는 팽창된 스캐폴드의 평형중량, Wd는 건조된 스캐폴드의 중량이다. 4종의 동일한 샘플에 대해 각각 3회 측정한 후 평균을 구하였다.

스캐폴드의 팽창률과 기계적 특성은 다음의 두 가지 변수를 통해 제어할 수 있다. 첫째로 동결단계 전에 EDC 함량을 달리하여 스캐폴드의 가교밀도를 변화시킬 수 있으며, 둘째로 젤라틴과 EDC의 양을 일정하게 함으로써 입자의 슬러리 농도를 변화시킬 수 있다. 고분자로만 이루어진 스캐폴드의 경우 후자는 해당되지 않는다. 도 4 a~b에 도시한 유동학 데이터로부터 이러한 사실을 확인할 수 있다. 이러한 성질을 고려하여 특정 조건 하에서 제조된 스캐폴드의 기계적 특성을 이용하는 용도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 0.5 mg EDC 스캐폴드는 지방조직과 유사하게 3 kPa의 탄성률을 가지므로 지방조직용 조직공학의 용도로 사용할 수 있다. 스캐폴드의 팽창률과 저장탄성률은 예측한 바와 같이 가교밀도가 증가함에 따라 감소한다(도 4 c).

세척, 오토클레이브 가열 및 동결건조한 디스크 형태의 HAp-Gel 스캐폴드의 분해특성을 분석하였다. 샘플을 직경 8 mm, 두께 1.5~2 mm의 크기로 자른 후 중량을 측정하였다. 10% 젤라틴으로만 된 스캐폴드를 대조군으로 사용하였다. 가교된 젤라틴을 인산염 완충액(PBS) 내에서 콜라게나제 존재 하에 효소분해하였다. 효소용액은 0.16 mg/mL의 PBS(1%, pH 7.4)와 Clostridium histolyticum 유래 콜라게나제, 활성화제로서 1.45 mg/mL 염화칼슘 PBS 용액, 항균제로서 0.01 mg/mL(0.001%) 아지드화나트륨을 사용하여 제조하였다. 가교밀도가 다른 각 스캐폴드를 48웰 조직배양접시 상에서 1.5 mL의 효소용액에 담근 후 인큐베이터 내에서 37 ℃로 유지하였다. 스캐폴드의 생체 외 효소분해에 소요되는 시간은 가교밀도가 증가함에 따라 증가하였으며 모든 조건 하에서 2주 이내에 분해가 완료되었다(도 5). 20% HAp 스캐폴드의 경우 효소가 입자 네트워크로 구성된 치밀한 벽을 통과해야 하기 때문에 더 많은 시간이 소요되었다.

NIH 3T3 섬유아세포를 37 ℃에서 10% 우태아혈청과 1% 항생제 용액이 첨가된 DMEM-F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12) 완전배지 내에서 5% CO2분위기 하에 배양하였다. 배지는 48시간 마다 교환해 주었다. 0.25% 트립신을 사용하여 세포를 배양접시에서 회수한 후, 5x105개의 세포를 포함하는 약 100 ㅅL의 세포 현탁액을 동결건조 및 살균처리한 스캐폴드 상에 분주하였다. 스캐폴드를 1시간 동안 인큐베이션한 후 완전배지 용액에 담갔다. 도 6은 스캐폴드의 세포적합성 확인을 위해 NIH 3T3 세포가 분주된 히드록시아파타이트 10%/젤라틴 1%/EDC 4 mg 스캐폴드를 3일간 인큐베이션한 후 촬영한 SEM 이미지이다. SEM 이미지로부터 세포들이 스캐폴드 벽에 잘 부착되어 있음을 알 수 있다.

합성된 스캐폴드를 탈이온수로 세척한 후 오토클레이브에서 가열하였다. 살균처리된 스캐폴드를 세포 배양배지(DMEM, Sigma-Aldrich, MO, USA) 내에서 생리적 조건으로 전처리하였다. 이어, 스캐폴드를 무균조건에서 동결건조하였다. 광주과학기술원(GIST) 동물실험윤리위원회의 승인 하에 동물실험을 수행하였다. 수컷 생쥐(Balb/c, 5월령, 오리엔트바이오, 한국 경기)를 이소플루란을 사용하여 마취하고 살균처리된 스캐폴드를 피하공간에 이식하였다. 2주 후에 생쥐를 희생시킨 후 스캐폴드를 회수하였다. 회수된 샘플을 포름알데히드 용액 내에서 고정한 후 파라핀으로 포매하였다. 마이크로톰(Leica RM2135, Wetzlar, Germany)을 사용하여 파라핀 블록 내의 스캐폴드를 6 μm 두께로 박절하였다. 샘플 슬라이드를 헤마톡실린-에오신과 시리우스 레드로 염색한 후 명시야 현미경(Axioskop40, Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 관찰하였다. 도 7에서 보듯이, 2주 동안 이식된 스캐폴드는 매우 얇은 콜라겐층으로 둘러싸여 있었으며 소수의 면역세포가 스캐폴드와 생체의 경계에 위치하고 있었다. 또한, 다수의 혈관이 관찰되어 상당량의 조직이 생체로부터 이식된 스캐폴드 내로 성장하였음이 확인되었다. 따라서, 스캐폴드가 생체 내에서 우수한 생체적합성을 가짐이 확인되었다.

실시예 2: EDC 가교제로 가교된 실리카/젤라틴 스캐폴드의 제조(실리카 @ EDC-가교된 젤라틴)

크기 500 nm의 실리카 나노입자 10 중량%를 e-튜브 내에서 볼텍싱하여 1% 젤라틴으로 코팅하였다. 용액의 최종부피는 0.6 mL이었으며 입자와 고분자의 양은 각각 60 mg과 6 mg이었다. 4 mg의 EDC 가교제를 최종 용액에 가하고 -18 ℃에서 24시간 동안 동결하여 가교를 완료하였다. 얻어진 스캐폴드의 기계적 특성은 실시예 1의 히드록시아파타이트 10%/젤라틴 1%/EDC 4 mg 스캐폴드와 유사하였다(도 2f). 스캐폴드의 벽은 주로 실리카 입자로 구성되어 있었다.

실시예 3: EDC 가교제로 가교된 PLGA/젤라틴 스캐폴드의 제조(PLGA @ EDC-가교된 젤라틴)

용매유화법에 의해 크기 약 500 nm의 PLGA 나노입자를 합성하였다. 물 내에서 PLGA 분산액의 안정성을 높이기 위하여 얻어진 입자를 젤라틴으로 코팅하였다. 코팅된 입자의 분산액을 45 ℃로 가열하여 안정성을 높였다. 입자 대 고분자의 중량비는 10:1이었다. 0.6 mL의 최종 탈이온수 분산액 내 EDC의 양은 4 mg이었다. -25 ℃에서 24시간 동안 가교를 수행하였다.

실시예 4: 텔레킬릭 디에폭시 가교제로 가교된 히드록시아파타이트/키토산 스캐폴드의 제조(시트레이트 캡핑된 HAp @ TKD-가교된 키토산)

크기 약 200 nm의 시트레이트 캡핑된 히드록시아파타이트 나노입자 10 중량%를 e-튜브 내에서 볼텍싱하여 1% 젤라틴으로 코팅하였다. 용액의 최종부피는 0.6 mL이었으며 입자와 고분자의 양은 각각 60 mg과 6 mg이었다. 5 mg의 텔레킬릭 디에폭시 가교제를 최종 용액에 가하고 -18 ℃에서 24시간 동안 동결하여 가교를 완료하였다.

실시예 5: 글루타르알데히드 가교제로 가교된 히드록시아파타이트/키토산 스캐폴드의 제조(시트레이트 캡핑된 HAp @ GA-가교된 키토산)

크기 약 200 nm의 시트레이트 캡핑된 히드록시아파타이트 나노입자 10 중량%를 e-튜브 내에서 볼텍싱하여 1% 키토산으로 코팅하였다. 용액의 최종부피는 0.6 mL이었으며 입자와 고분자의 양은 각각 60 mg과 6 mg이었다. 5 mg의 글루타르알데히드 가교제를 최종 용액에 가하고 -18 ℃에서 24시간 동안 동결하여 가교를 완료하였다.

실시예 6: 탄산칼슘 입자를 템플릿으로 사용한 실리카/키토산 하이브리드 중공캡슐의 제조

보고된 방법에 따라 탄산칼슘 마이크로입자를 희생코어로 사용하여 중공캡슐을 제조하였다. 평균크기 6 내지 20 μm의 구형 탄산칼슘 입자를 간단한 침전반응에 의해 합성하였다. 동일 부피의 등몰 탄산나트륨 용액과 염화칼슘 용액을 빠르게 혼합한 후 100 mL의 둥근바닥 플라스크 내에서 1000 RPM으로 교반하였다. CaCO₃ 코어의 크기는 반응시간과 반응물의 농도를 변화시켜 조절할 수 있다. 코어는 pH 7에서 불용성이었으나 pH ≤ 4의 산성 pH에서는 완전히 용해되었다.

두 가지의 다른 코팅방법을 이용하여 하이브리드 중공캡슐을 제조하였다. 첫 번째 방법에서는 구형 탄산칼슘 희생입자 상에 키토산과 7 nm Ludox SM 콜로이드성 실리카 입자를 교대로 코팅하였고, 두 번째 방법에서g는 키토산으로 코팅된 7 nm Ludox SM 콜로이드성 실리카 입자와 알지네이트를 칼슘 포스페이트로 개질된 구형 탄산칼슘 희생입자 상에 교대로 코팅하였다.

(1) 첫 번째 방법(① 포스페이트 개질된 CaCO ₃ @ Chi - Alg - Chi - (SiO ₂ - Chi) ₃ - Alg)

도 8a에 제시한 바와 같이, 탄산칼슘 입자를 0.2 M의 Na₂HPO₄와 pH 10에서 반응시킴으로써(pH는 NaOH 용액으로 조절함) 탄산칼슘 입자 표면을 포스페이트 이온으로 개질하였다. 본격적인 고분자 코팅 전에, 키토산-알지네이트-키토산으로 이루어진 고분자 기재(base)를 다음과 같이 형성시켰다.

무게를 알고 있는 개질된 탄산칼슘 코어를 탈이온수에 분산시키고 10분 동안 초음파 처리한 후, 0.5 M의 NaCl 용액 내 5% 키토산 용액과 10 분간 혼합하였다. 그리고 나서, 0.5 M의 NaCl 용액 내 1% 알지네이트 용액과 10 분간 혼합함으로써 알지네이트로 코팅하였다. 알지네이트 코팅된 CaCO₃를 0.5 M의 NaCl 용액 내 5% 키토산 용액과 10분 동안 혼합하여 키토산으로 코팅하고, 이어 Chi-Alg-Chi로 코팅된(본 발명에서 코팅 순서는 좌측에서 우측의 층 순서대로 코팅됨을 표시함) CaCO₃ 입자를 2.5% 7 nm Ludox SM 콜로이드성 실리카 입자와 10분 동안 혼합하여 제4 층인 7 nm Ludox SM 콜로이드성 실리카 입자층을 코팅하였다. 제5 층으로 키토산 층을 위와 같은 방법으로 코팅하였다. 각 단계 후에 0.1 M NaCl로 3회 세척하였다. 위 제4 및 제5 단계를 반복하여 원하는 수의 층을 형성하였다.

(2) 두 번째 방법(② CaCO ₃ @ Alg - (Chi @ SiO ₂ - Alg) ₃ )

도 8b에 제시한 바와 같이, 개질되지 않은 CaCO₃ 입자를 희생 코어로 사용하였고, 알지네이트 코팅된 CaCO₃를 키토산 코팅된 7 nm Ludox SM 콜로이드성 실리카 입자의 분산액과 10분 동안 혼합하여 제2 층인 키토산 코팅된 7nm Ludox SM 콜로이드성 실리카 입자층을 형성하였고,

Alg-Chi@SiO₂로 코팅된(Chi@SiO₂는 키토산으로 코팅된 실리카 입자를 의미함) CaCO₃ 입자를 1% 알긴산 나트륨과 10분 동안 혼합하여 제3 층인 알지네이트층을 형성하였다. 각 단계 후에 0.5 M NaCl로 3회 세척하였으며, 상기 제2 및 제3 단계를 반복하여 원하는 수의 층을 형성하였다. 두 방법의 경우 모두 응집을 막기 위해 알지네이트를 최종 층으로 하였다.

(3) 가교 및 에칭(① Chi - Alg - Chi - (SiO ₂ - Chi) ₃ - Alg, ② Alg - (Chi @ SiO ₂ - Alg) ₃ )

이 두 경우 모두 가교는 다음과 같이 동일하게 수행하였는바, 위 두 가지 방법에 의해 제조된 다층의 캡슐 입자를 200 μL의 50% 글루타르알데히드 용액과 혼합하고 -18 ℃에서 동결한 후 24시간 동안 가교하였다.

가교가 완료된 후 입자를 물과 CaCO₃로 3회 세척하고 pH 7.5의 0.1 M EDTA 용액으로 3시간 동안 에칭하였다.

(4) 탄성 거동 관찰

크기가 다른 탄산칼슘 코어를 사용하여 거의 동일한 방법으로 다양한 크기의 하이브리드 중공캡슐(HHC)을 얻을 수 있었다(도 8b). HHC를 내경이 캡슐 대비 80% 작은 좁은 패치클램프를 통해 압착한 후 변형과 회복을 측정하여 탄성거동을 확인하였다(도 9i). 캡슐은 80~90%까지 변형된 후 완전한 회복이 가능하였다. HHC는 삼투압에 의한 변형 후에도 회복능력을 보인 반면, 셸에 입자를 포함하지 않는 대조군 캡슐은 삼투압이 가해지자 부서졌다(도 9ii). 삼투압 실험은 최종층이 키토산층인 캡슐을 다양한 농도의 폴리(스티렌 설포네이트)(PSS, Mw 70 kDa) 용액 내에서 10분 동안 인큐베이션하여 수행하였다.

실시예 7: 히드록시아파타이트/키토산 하이브리드 중공캡슐의 제조(포스페이트 개질된 CaCO ₃ @ Chi - Alg - Chi - (시트레이트 캡핑된 HAp - Chi) ₃ - Alg)

히드록시아파타이트 입자는 시그마 알드리치에서 구매하여, 0.1 M HCl로 조절된 pH 6 및 실온 조건 하에서 12 시간 동안 0.2M Trisodium citrate로 처리하였다. 입자는 탈이온수로 완벽하게 세척하였고, 평균 크기는 150 nm, 제타 포텐셜은 -27 mV임을 확인하였다.

CaCO₃ 입자 표면은 pH 10에서(NaOH로 pH는 조절함) 2 시간 동안 0.2 M Na₂HPO₄와 반응시켜 포스페이트로 개질하였다. 본격적인 고분자 코팅 전에, 음으로 하전된 포스페이트 개질 입자에 키토산-알지네이트-키토산 3개 층으로 이루어진 고분자 기재(base)를 다음과 같이 형성시켰다.

무게를 알고 있는 개질된 탄산칼슘 코어를 탈이온수에 분산시키고 10분 동안 초음파 처리한 후, 0.5 M의 NaCl 용액 내 5% 키토산 용액과 10 분간 혼합하였다. 그리고 나서, 0.5 M의 NaCl 용액 내 1% 알지네이트 용액과 10 분간 혼합함으로써 알지네이트로 코팅하였다. 알지네이트 코팅된 CaCO₃를 0.5 M의 NaCl 용액 내 5% 키토산 용액과 10분 동안 혼합하여 키토산으로 코팅하였다.

이어 Chi-Alg-Chi로 코팅된(본 발명에서 코팅 순서는 좌측에서 우측의 층 순서대로 코팅됨을 표시함) CaCO₃ 입자를 2.5% HAp 입자와 10 분동안 혼합하여 제4 층인 시트레이트 캡핑된 히드록시아파타이트 입자 (평균 직경 150 nm)를 형성하였다. 제5 층으로 키토산 층을 위와 같은 방법으로 코팅하였다. 각 단계 후에 0.1 M NaCl로 3회 세척하였다. 위 제4 및 제5 단계를 반복하여 원하는 수의 층을 형성하였다.

가교 단계는 다음과 같다. 다층의 CaCO₃ 입자를 200 μL의 50% 글루타르알데히드 용액과 혼합하고 -18 ℃에서 동결한 후 24시간 동안 가교하였다. 가교가 완료된 후 입자를 물과 CaCO₃로 3회 세척하고 pH 5.5의 0.1 M EDTA 용액으로 3시간 동안 에칭하였다.

실시예 8: Fe ₃ O ₄ /키토산 하이브리드 중공캡슐의 제조(포스페이트 개질된 CaCO ₃ @ Chi - Alg - Chi - (마그네타이트 - Chi ) ₃ - Alg )

FeCl₃ㅇ6H₂O (0.1 M) 용액과 FeCl₂ㅇ4H₂O (0.2 M) 용액은 1 M HCl을 이용하여산성 pH로 조절하였고, 5% SDS 계면활성제를 혼합시켜 입자의 응집을 조절하였다. 이 혼합 용액에 암모늄 히드록사이드를 pH 12가 될 때까지 천천히 비활성 대기 조건에서 첨가하였다. 합성된 입자는 부틸 알코올로 세척하였고, 600 ℃에서 라우르산과 마그네틱 입자를 혼합함으로써(비율 3/2) 라우르산을 입자 표면에 코팅하였다. 미코팅 라우르산은 아세톤으로 세척하였고, 계면활성제로 물에 재분산되었다(resuspended).

이어 Chi-Alg-Chi로 코팅된(본 발명에서 코팅 순서는 좌측에서 우측의 층 순서대로 코팅됨을 표시함) CaCO₃ 입자와 2.5% 철 산화물 나노입자와 10 분동안 혼합함으로써 에 철 산화물 마그네틱 나노입자(평균 직경 15 nm)를 제4 층으로 형성하였다. 제5 층으로 키토산 층을 위와 같은 방법으로 코팅하였다. 각 단계 후에 0.1 M NaCl로 3회 세척하였다. 위 제4 및 제5 단계를 반복하여 원하는 수의 층을 형성하였다.

실시예 9: 약물 전달체 제조 및 특성 실험

(1) 중공 캡슐의 제조

위 실시예 6의 첫 번째 방법을 따라서, (Chi - Alg - Chi) - (SiO₂- Chi)₁- Alg 의 구조를 갖는 1층의 하이브리드 중공 캡슐(1L-HHC)과 (Chi - Alg - Chi) - (SiO₂ - Chi)₃- Alg의 구조를 갖는 3층의 하이브리드 중공 캡슐(3L-HHC)을 각각 제조하였다. 또한, 대조를 위하여 무기 나노입자가 없는 (Chi - Alg - Chi) - (Alg - Chi)₃- Alg 구조의 3층 중공 캡슐(3L-HC) 역시 제조하였다.

(2) 중공 캡슐 내 약물 탑재 및 방출 시험

모델 약물이 분산되어 있는 0.1 M NaCl 용액에 위에서 제조한 중공 캡슐을 분산시키고 12 시간 동안 실온에서 방치하여, 중공 캡슐 내 약물을 탑재하였다. FITC, PEI 800 Mw, PEI 1300 Mw, FITC-Dextran 4 kDa, Lysozyme 14 kDa, FITC-BSA과 같이 다양한 분자량의 모델 약물을 사용하였다.

피란하(Piranha) 용액(3:1, H₂O₂/H₂SO₄)으로 표면이 친수화 처리된 유리 슬라이드 위에 양으로 하전된 Mw 70 kDa 키토산을 코팅하고 나서, 위에서 제조한 약물 탑재 중공 캡슐(음으로 하전된 Alg가 최외각 고분자 층임)을 코팅하였다. 수동으로 각각 100, 250, 500 g의 압력을 6 초 동안 가한 후, 방출된 용액을 수집하고, 새로운 물로 다시 채웠다. 압력을 없애 탄성 변형에서 회복된 상태로 10 분 동안 두고 나서 확산되어 배출된 용액을 관찰하였다.

FITC, FITC-Dextran 및 FITC-BSA이 탑재된 캡슐의 약물 방출량은 493 nm에서 흡광도 측정을 통해(?) 분석하였고, PEI 방출량은 570 nm에서 닌하이드린법에 의해 분석하였으며, Lysozyme 방출량은 275-280 nm에서 흡광도 측정을 통해 분석하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 하이브리드 중공 캡슐인 3L-HHC는 모든 약물을 방출할 때까지 총 6회의 사이클 동안 매 사이클마다 평균 13.5%로 조절된 방출 거동을 보였다. 반면 대조를 위한 중공 캡슐인 3L-HC는 최초 압축에서 49.7%의 방출량을 보였고, 3회째 사이클에서 모든 약물이 방출되는 결과를 확인하였다.

실시예 9: 중공 마이크로 캡슐의 약물 로딩 및 외력에 의한 약물 방출 (대조군 캡슐(Chi-Alg-Chi)-(Alg-Chi) ₃ 과 하이브리드 캡슐 (Chi-Alg-Chi)-(SiO ₂ -Chi) ₃ 의 비교)

중공 마이크로 캡슐에 로딩할 분자량이 작은 모델 약물로서 fluorescein 과 분자량이 큰 모델 약물로서 형광이 (FITC)표지된 덱스트란(MW: 4kDa)이 사용될 수 있었다. 중공 캡슐들은 위의 모델 약물들이 0.1 w/v%로 녹아있는 0.1 M NaCl 용액에서 12 시간 동안 실온에서 방치하여 모델 약물을 로딩할 수 있다. 이 중에서 한 가지 예로 형광 표지 덱스트란이 로딩된 중공 마이크로 캡슐이 외부의 압력에 의해서 약물이 방출하는 것을 관찰하였다.

유리 표면에 캡슐이 붙을 수 있게 처리한 후, 약물이 로딩된 캡슐을 고르게 표면에 펴준 후, 6 초 간 0.98 N의 기계적인 압축력을 주고 10 분 간 외력 없이 이완시키는 과정을 반복하여 약물의 방출을 관찰하였다(도 10a). 중공 마이크로 캡슐의 종류는 2가지를 사용하였는데, 대조군(control)으로 키토산 및 알긴산의 (Chi-Alg-Chi)-(Alg-Chi)₃ 코팅으로 이루어진 캡슐이 사용되었고, 실험군으로 실리카 입자가 포함된 (Chi-Alg-Chi)-(SiO₂-Chi)₃의 하이브리드 중공 캡슐(3L-HHC)이 사용되었다. 각각의 외력 사이클에 의해 방출된 형광 표지 덱스트란은 493 nm 파장에서 정량하여 시간에 따라 제시되었다(도 10b). 도 10c는 도 10b의 결과를 누적 그래프로 나타낸 것이며 각각의 외력 사이클의 해당 시점에서 대표적인 캡슐의 형광현미경 이미지도 제시되어 있다.

Claims

(a) 내부가 비어 있는 중공 코어 고분자 층, (b) 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 무기 나노입자와 캡슐 코팅용 고분자를 포함하는 유무기 복합 층을 포함하고,
상기 유무기 복합 층은 1개의 유무기 복합 층으로 구성된 유무기 복합 단일 층이거나 또는 복수 개의 유무기 복합 층이 층층이 쌓여 형성된 유무기 복합 복수 층이고,
상기 코어 고분자 층과 상기 캡슐 코팅용 고분자는 가교된 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 유무기 복합 층은 (b1) 상기 무기 나노입자로 구성된 무기 나노입자 층과 (b2) 상기 캡슐 코팅용 고분자로 구성된 캡슐 코팅용 고분자 층이 순서대로 1회 이상 교대로 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 형성된 1개 또는 복수 개의 유무기 복합 층으로 구성된 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제2항에 있어서, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 양의 전하를 띠는 고분자의 단독 고분자 코어 층일 수도 있고, (ii) 양의 전하를 띠는 고분자 층과 음의 전하를 띠는 고분자 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층이고, 상기 복합 고분자 코어 층의 최외각 고분자 층은 양의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제3항에 있어서, 상기 양의 전하를 띠는 고분자는 키토산, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(PAH), 폴리달릴디메틸 암모늄크로라이드 (PDADMAC) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되고; 상기 음의 전하를 띠는 고분자는 알긴산, 헤파린, 폴리스틸렌 설포네이트(PSS), 폴리아크릴릭 에시드(PAA) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제2항에 있어서, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 키토산 단독 고분자 코어 층이거나, 또는 (ii) 중공 키토산 층과 상기 중공 키토산 층 위에 알긴산 층과 키토산 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층이고, 상기 복합 고분자 코어 층의 최외각 고분자 층은 키토상 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제2항에 있어서, 상기 (b) 유무기 복합 층은 상기 (무기 나노입자 층 - 캡슐 코팅용 고분자 층)의 유무기 복합 층 1 내지 30개로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 실리카, 히드록시아파타이트, 마그네타이트, 금, 은 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제2항에 있어서, 상기 캡슐 코팅용 고분자는 양의 전하를 띠는 고분자인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로 캡슐.
제2항에 있어서, 상기 (b) 유무기 복합 층은 1개 내지 10개의 (실리카 층 - 키토산 층)이 순차적으로 적층된 복합 층, 1개 내지 10개의 (히드록시아파타이트 층 - 키토산 층)이 순차적으로 적층된 복합 층, 1개 내지 10개의 (마그네타이트 층 - 키토산 층)이 순차적으로 적층된 복합 층 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐.
제2항에 있어서, 상기 중공 마이크로캡슐은 상기 맨 바깥에 위치한 캡슐 코팅용 고분자 층 표면에 최외각 고분자 층을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제5항에 있어서, 상기 최외각 고분자 층은 음의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 유무기 복합 층은 (b1') 무기 나노입자 코팅용 고분자로 코팅된 상기 무기 나노입자로 구성된 코팅 무기 나노입자 층과 (b2) 상기 캡슐 코팅용 고분자 층이 교대로 1회 또는 복수 회 반복하여 상기 중공 코어 고분자 층 표면에 형성된 1개 또는 복수 개의 유무기 복합 층으로 구성되고,
상기 무기 나노입자 코팅용 고분자는 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제12항에 있어서, 상기 중공 코어 고분자 층은 (i) 음의 전하를 띠는 고분자의 단독 고분자 코어 층일 수도 있고, (ii) 음의 전하를 띠는 고분자 층과 양의 전하를 띠는 고분자 층이 1회 이상 교대로 형성되어 구성된 복합 고분자 코어 층이고, 상기 복합 고분자 코어 층의 최외각 고분자 층은 음의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제13항에 있어서, 상기 양의 전하를 띠는 고분자는 키토산, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(PAH), 폴리달릴디메틸 암모늄크로라이드 (PDADMAC) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되고; 상기 음의 전하를 띠는 고분자는 알긴산, 헤파린, 폴리스틸렌 설포네이트(PSS), 폴리아크릴릭 에시드(PAA) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제12항에 있어서, 상기 중공 코어 고분자 층은 알지네이트 단독 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제12항에 있어서, 상기 (b) 유무기 복합 층은 상기 (코팅 무기 나노입자 층 - 캡슐 코팅용 고분자 층)의 유무기 복합 층 1 내지 30개로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제2항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 실리카, 히드록시아파타이트, 마그네타이트, 금, 은 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제12항에 있어서, 상기 무기 나노입자 코팅용 고분자는 양의 전하를 띠는 고분자이고, 상기 캡슐 코팅용 고분자는 음의 전하를 띠는 고분자인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로 캡슐.
제12항에 있어서, 상기 (b) 유무기 복합 층은 1개 내지 10개의 (키토산으로 코팅된 실리카 층 - 알지네이트 층)이 순차적으로 적층된 복합 층인 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐.
제12항에 있어서, 상기 중공 마이크로캡슐은 상기 맨 바깥에 위치한 캡슐 코팅용 고분자 층 표면에 최외각 고분자 층을 추가로 포함하고, 상기 최외각 고분자 층은 양의 전하를 띠는 고분자 층인 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 중공 마이크로캡슐은 외부 힘을 부가하였을 때 모양이 변형되고, 상기 부가되었던 외부 힘을 제거하였을 때 모양이 회복되는 탄성을 가지는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 중공 마이크로캡슐은 상기 외부 힘의 반복적인 부가 및 제거 후에도 상기 모양의 변형 및 회복의 특성이 유지되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 중공 마이크로캡슐을 포함하는 연조직용 스캐폴드.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 중공 마이크로캡슐을 포함하는 약물 전달체.
제24항에 있어서, 상기 약물 전달체는 기계적 자극에 의해 조절 가능한(mechanical stimuli controlled) 약물 방출의 거동을 보이는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
(A) ① 양의 전하를 띠는 희생 코어 또는 ② 음의 전하로 개질된 희생 코어 상에 코어 고분자 층을 형성시키는 단계,
(B) ① 상기 희생 코어가 양의 전하를 띠는 희생 코어인 경우에는 상기 코어 고분자 층 위에 무기 나노입자 층과 캡슐 코팅용 고분자 층을 교대로 1회 이상 형성시키고,
② 상기 희생 코어가 음의 전하로 개질된 희생 코어인 경우에는 상기 코어 고분자 층 위에 무기 나노입자 코팅용 조성물로 코팅된 무기 나노입자 층과 캡슐 코팅용 고분자 층을 교대로 1회 이상 형성시키는 단계,
(C) 코어 고분자와 캡슐 코팅용 고분자를 가교시키는 단계,
(D) 상기 희생 코어를 에칭시켜 제거하는 단계를 포함하는 중공 마이크로캡슐의 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 상기 (C) 단계는 영하의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐의 제조방법.
제27항에 있어서, 상기 가교제는 글루타르알데히드, 텔레킬릭 디에폭시, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드(EDC), N,N-카보닐 다이이미다졸(CDI) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐의 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 양의 전하를 띠는 희생 코어는 탄산칼슘 마이크로입자이고, 상기 음의 전하로 개질된 희생 코어는 포스페이트로 개질된 탄산칼슘 마이크로입자이며,
상기 코어 고분자 층과 상기 캡슐 코팅용 고분자 층은 자기조립방식에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 중공 마이크로캡슐의 제조방법.