WO2020209273A1 - マイクロカプセルの製造方法およびコート液 - Google Patents

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microcapsules
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alginic acid
cell
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勇輔 望月
竜太 竹上
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富士フイルム株式会社
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    • A61L2420/08—Coatings comprising two or more layers

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing microcapsules and a coating liquid used for producing microcapsules.
  • Patent Document 1 describes that droplets formed from a suspension of pancreatic islets containing alginic acid are incubated in a polylysine solution having a molecular weight of 17,000 to produce microcapsules.
  • islet transplantation which is expected as a radical treatment for diabetes
  • islet transplantation using heterologous islets is being actively conducted as a countermeasure against donor shortage.
  • islet transplantation requires protection of islets from heterologous immune rejection.
  • Non-Patent Document 1 describes that cells are immunoseparated with alginate capsules.
  • Patent Document 1 a coating solution containing polylysine for treating droplets formed from a suspension containing cells and alginic acid is used. It has been found that the addition of calcium or barium ions improves the uniformity of the resulting microcapsules.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • ⁇ 1> A method for producing microcapsules in which cells are embedded with alginic acid and polycation.
  • the cells and a cell suspension containing alginic acid are dropped into a calcium ion-containing solution to obtain droplets in which the cells are embedded in alginic acid, and the droplets are immersed in a coating solution containing polycations.
  • the coating liquid contains calcium ions or barium ions at a concentration of 0.1 mM or more and 50.0 mM or less.
  • ⁇ 2> The production method according to ⁇ 1>, wherein the cell suspension has a viscosity of 50 mPa ⁇ s or more and 500 mPa ⁇ s or less.
  • ⁇ 3> The production method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the molecular weight of the polycation is 1 kDa or more and 200 kDa or less.
  • ⁇ 4> The production method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the molecular weight of the polycation is 1 kDa or more and 50 kDa or less.
  • ⁇ 5> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the polycation is poly-L-lysine or poly-L-ornithine.
  • ⁇ 6> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the coating liquid in which the droplets are immersed is shaken.
  • ⁇ 7> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, which comprises immersing the microcapsules in a solution containing alginic acid.
  • ⁇ 8> The production method according to ⁇ 7>, which comprises dispersing the microcapsules after being immersed in the solution containing alginic acid in a solution containing calcium ions or barium ions having a concentration of 0.1 mM or more and 50.0 mM or less.
  • ⁇ 9> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the cell is a cell that releases a physiologically active substance.
  • the physiologically active substance is insulin.
  • the cells are cells in pancreatic islets.
  • the mesenchymal stem cells or the mesenchymal stem cell group are embedded with alginic acid and polycation in the microcapsules together with the cells.
  • the coating liquid used in the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12> which contains the above polycation having a molecular weight of 5 kDa or more and 50 kDa or less, and contains calcium ions or barium ions of 0.1 mM or more.
  • the coating liquid contained at a concentration of 50.0 mM or less.
  • the present invention provides a method for producing microcapsules in which cells are embedded, which can produce microcapsules having a uniform shape and particle size. Since the microcapsules produced by the production method of the present invention have a uniform shape and particle size, they are hard to break and have high storage stability. In addition, the microcapsules produced by the production method of the present invention are suitable for use in transplanting cells into a recipient.
  • the molecular weight means the weight average molecular weight measured by GPC (gel permeation chromatography), and specifically, it may be measured under the following analytical conditions.
  • Eluent 200 mM sodium nitrate aqueous solution
  • Temperature 40 ° C
  • Detector RI (Differential Refractometer)
  • the standard pullulan standard Shodex Pullulan P-5, P-10, P-20, P-50, P-82, P-100, P-200, P-400, P-800, P -1600 was used.
  • the microcapsules may be spherical or substantially spherical particles.
  • the microcapsules produced by the production method of the present invention contain alginic acid and polycations, in which cells are embedded.
  • the microcapsules produced by the production method of the present invention preferably have a core containing cells and a shell containing alginic acid and polycations.
  • the microcapsules may contain proteins such as albumin, peptides, pH buffers, inorganic salts and the like necessary for cell maintenance.
  • Microcapsules are usually particles having a size corresponding to a sphere having a diameter of 100 ⁇ m to 8000 ⁇ m, preferably 300 ⁇ m to 3000 ⁇ m, but the size is not particularly limited. That is, the "micro" of the microcapsules does not have any particular meaning for limiting the size.
  • the microcapsules have an immunoisolation function.
  • Immune isolation is a method of preventing immune rejection.
  • immunoisolation is one of the methods to prevent the recipient's immune rejection during transplantation.
  • immunorejection is the rejection of a recipient to a cell when it is transplanted.
  • Immune isolation isolates cells from the recipient's immune rejection. Immune rejection includes those based on a cell-mediated immune response and those based on a humoral immune response.
  • the microcapsules can adjust the permeability of the substance by adjusting the concentration of alginic acid and the thickness of the polycation coat, and can suppress the permeation of the substance of 150 kDa or more, for example.
  • Microcapsules contain alginic acid. More specifically, the microcapsules may contain a gel formed by cross-linking alginic acid. Alginic acid can be made into a crosslinked hydrogel by adjusting the conditions for forming the solution and the composition of the solution. Methods of embedding cells in alginic acid and microencapsulating them are known, and those known methods can be appropriately referred to and used in the formation of droplets in the production method of the present invention.
  • Alginic acid is a block copolymer composed of glucuronic acid (G) and mannuronic acid (M).
  • Alginic acid naturally exists as a cell wall-constituting polysaccharide or an intercellular filling substance of brown algae, and these can be collected as a raw material.
  • Specific examples of the raw material brown algae include Fucales, Fucales, Ecklonia cava (eg, D. potatorum), Fucales, Fucales, Ascophyllum (eg, A. nodosum), Kelp, Kelp, Ecklonia cava (eg, Kelp, Ecklonia cava), Kelp.
  • Examples thereof include brown algae of the genus Fucales of the family Kelp (eg, Ecklonia cava), the genus Ecklonia cava of the family Kelp (eg, Ecklonia cava), and the genus Fucales of the family Kelp (eg, L. flavikans).
  • brown algae of the genus Fucales of the family Kelp eg, Ecklonia cava
  • the genus Ecklonia cava of the family Kelp eg, Ecklonia cava
  • the genus Fucales of the family Kelp eg, L. flavikans
  • commercially available alginic acid can be used.
  • the content of endotoxin that can be contained in alginic acid (alginic acid raw material used in the production method of the present invention) derived from the above-mentioned raw materials is preferably 1000 EU / g or less, and more preferably 500 EU / g or less. It is preferably 100 EU / g or less, and more preferably 100 EU / g or less.
  • the content of endotoxin as an alginic acid raw material is reflected in the content in microcapsules at approximately 50%. That is, the endotoxin content of the microcapsules is preferably 500 EU / g or less, more preferably 250 EU / g or less, and even more preferably 50 EU / g or less.
  • the endotoxin content can be measured by using any of a gelation method, a turbidimetric method, and a colorimetric method.
  • the G / M ratio of alginic acid is not particularly limited, but the larger the G / M ratio, the greater the gel-forming ability. Therefore, the G / M ratio is preferably large, specifically 0.8 to 2.0. It is preferably 0.8 to 1.6, and more preferably 0.8 to 1.6.
  • alginic acid gels by invading the pocket structure of the M block with a multivalent metal cation to form an egg box.
  • microcapsules that embed cells may be formed by utilizing this gelation.
  • polyvalent metal cations that can cause gelation of alginic acid include calcium (Ca), barium (Ba), aluminum (Al), magnesium (Mg), copper (Cu), strontium (Sr), and cadmium (Cd). ), Zinc (Zn), Nickel (Ni), Cobalt (Co), Manganese (Mn), Iron (Fe), Tin (Sn) and other divalent or trivalent metal ions can be exemplified.
  • calcium ion, magnesium ion, barium ion, and strontium ion are preferable, and calcium ion is more preferable.
  • alginic acid may be in the form of alginate in microcapsules.
  • alginate may be used as an alginic acid raw material for forming microcapsules.
  • sodium alginate is preferably mentioned.
  • alginic acid may be an alginic acid derivative.
  • US Pat. No. 9,422,373 can be referred to.
  • the molecular weight of alginic acid is preferably 50 kDa or more, more preferably 100 kDa or more, and even more preferably 150 kDa or more.
  • microcapsules produced by the production method of the present invention further contain polycations (organic polymer compounds having cation residues).
  • alginic acid preferably further forms a polyion complex gel with polycations.
  • a hydrogel formed by ionic cross-linking of alginic acid with a divalent cation can form a semi-permeable membrane by further contacting with a poly cation.
  • microcapsules are typically formed having an inner shell made of alginate gel and an outer shell containing polycations.
  • the microcapsules may also have an additional outermost layer shell (eg envelope). For example, the surface charge can be reduced by forming an additional outermost shell with alginate gel.
  • multi-layer microcapsules of alginate gel / polycation-alginate gel / alginate gel / cells may be formed.
  • the polyion complex refers to a state in which an organic polymer compound having a cation residue and an organic polymer compound having an anion residue form a complex by electrostatic interaction.
  • polycations include polymers having a basic reactive group such as an amine group or an imine group.
  • polyornithine poly-L-ornithine
  • polylysine poly-L-lysine
  • chitosan gelatin, collagen, polyethyleneimine, poly (vinylamine) and poly (allylamine), as well as US2009 / 0214660.
  • examples thereof include the polycation described in 0069 of A1. Of these, polyornithine and polylysine are preferable, and polyornithine is more preferable.
  • the molecular weight of the polycation may be 0.2 kDa or more and 500 kDa or less, preferably 0.5 kDa or more and 300 kDa or less, and further preferably 1 kDa or more and 200 kDa or less.
  • the molecular weight of the polycation is particularly preferably 5 kDa or more and 50 kDa or less.
  • the number of cells embedded in the microcapsules produced by the production method of the present invention may be one or a plurality, but a plurality of cells is preferable.
  • the plurality of cells may be separated from each other or may be an aggregate.
  • the cells may be those obtained directly from a living body, or may be those obtained by inducing differentiation of cells such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and mesenchymal stem cells. ..
  • the cell may be a progenitor cell.
  • a cell as one aspect, a cell that releases a physiologically active substance is preferable. Examples of cells that release physiologically active substances include pancreatic islet cells, mesenchymal stem cells, dopamine-producing neurons, blood coagulation factor-secreting cells, and ⁇ -Gal-producing cells. Examples of physiologically active substances include various hormones, various cytokines, various enzymes, and various other in vivo factors.
  • cells releasing a physiologically active substance are embedded in uniform microcapsules and transplanted, so that the physiologically active substance is slowly released and is difficult to be recognized by the immune system from the transplanted body. It is preferable that the method of the present invention is applied to cells that release a physiologically active substance.
  • insulin is a polypeptide (molecular weight of about 6000) in which the A chain of 21 amino acid residues and the B chain of 30 amino acid residues are connected via a disulfide bond.
  • insulin is secreted from ⁇ cells on the islets of Langerhans in the pancreas.
  • the insulin secreted may be human insulin or other mammalian (eg, porcine) insulin.
  • Insulin may be insulin produced by a genetically modified method.
  • Insulin secretory cells The cells contained in the microcapsules produced by the production method of the present invention are preferably insulin-secreting cells.
  • Insulin-secreting cells are cells that can secrete insulin in response to changes in blood glucose levels.
  • the insulin-secreting cells are not particularly limited, and examples thereof include pancreatic ⁇ -cells existing in the islets of Langerhans in the pancreas.
  • the pancreatic ⁇ cells may be human pancreatic ⁇ cells or pancreatic ⁇ cells such as pigs and mice.
  • the description in JP-A-2007-195573 can be referred to.
  • insulin secretory cells cells derived from human stem cells (see, for example, Junichi Miyazaki, Regenerative Medicine, Vol. 1, No. 2, pp. 57-61, 2002) or small intestinal epithelial stem cells were induced. It may be a cell (see, for example, Mineko Fujimiya et al., Regenerative Medicine, Vol. 1, No. 2, pp. 63-68, 2002), which is an insulin secretory cell incorporating a gene encoding insulin. (See, for example, HC Lee, JW Yoon, et al., Nature, Vol. 408, pp. 483-488, 2000).
  • Insulin-secreting cells may be cell aggregates.
  • the cell aggregate means a cell mass in which a plurality of cells are aggregated and does not correspond to a cell structure described later.
  • An example of a cell aggregate is an islet. That is, it is also preferable to use pancreatic islets as insulin-secreting cells (see, for example, Hiroshi Hori, Kazutomo Inoue, Regenerative Medicine, Vol. 1, No. 2, pp. 69-77, 2002).
  • Microcapsules may contain multiple types of cells. For example, it may contain one cell as well as other cells that assist the function of this cell. Examples of such are examples in which microcapsules embed insulin-secreting cells and mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells present in mesenchymal tissues and have the ability to differentiate into cells belonging to mesenchymal tissues.
  • Mesenchymal tissue refers to tissues such as bone, cartilage, fat, blood, bone marrow, skeletal muscle, dermis, ligaments, tendons, and heart.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells or bone marrow-derived mesenchymal stem cells are more preferable, and adipose-derived mesenchymal stem cells are further preferable.
  • the microcapsules produced by the production method of the present invention may contain mesenchymal stem cells as a group of mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cell group means a group in which a plurality of mesenchymal stem cells are integrated.
  • As the mesenchymal stem cell group cell aggregates or cell structures of mesenchymal stem cells are preferable, and cell structures are more preferable.
  • the cell structure means a structure including a polymer block having biocompatibility and a cell, and a plurality of the polymer blocks are arranged in a gap between the plurality of the cells. ..
  • the microcapsule produced by the production method of the present invention contains mesenchymal stem cells, it is a cell structure containing a biocompatible polymer block and mesenchymal stem cells, and is a plurality of the above-mentioned mesenchymal stem cells. It is preferable to include a cell structure in which a plurality of the above polymer blocks are arranged in the gap between them.
  • a polymer block having biocompatibility and cells are used, and a plurality of polymer blocks are three-dimensionally arranged in a mosaic pattern in the gaps between the cells to achieve high biocompatibility.
  • a cell three-dimensional structure in which cells are uniformly present in the structure is formed.
  • the cell gap In the cell structure, a plurality of polymer blocks are arranged in the gaps between a plurality of cells, but here, the "cell gap" needs to be a space closed by the constituent cells. It suffices if it is sandwiched between cells. It is not necessary that there are gaps between all the cells, and there may be places where the cells are in contact with each other.
  • the distance between the cells through the polymer block that is, the distance between a certain cell and the cell that exists at the shortest distance from the cell is not particularly limited, but the size of the polymer block is used. It is preferable that there is a suitable distance, and the suitable distance is also in the range of a suitable size of the polymer block.
  • the polymer block has a structure sandwiched between cells, it is not necessary that there are cells between all the polymer blocks, and there may be a place where the polymer blocks are in contact with each other.
  • the distance between the polymer blocks via the cells that is, the distance between the polymer blocks and the polymer blocks existing at the shortest distance from the polymer blocks is not particularly limited.
  • the size of the cell mass when one to several cells to be used are gathered is preferable, for example, 10 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, and more preferably 10 ⁇ m or more and 50 ⁇ m. It is as follows.
  • the polymer constituting the biocompatible polymer block is not particularly limited in whether or not it is decomposed in the living body as long as it has an affinity for the living body, but it is preferably composed of a biodegradable material. ..
  • the biodegradable material include polypeptide, polylactic acid, polyglycolic acid, PLGA (polylactic acid-co-glycolic acid), hyaluronic acid, glycosaminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, and carboxymethyl cellulose. , Chitin, and at least one material selected from the group of chitosan.
  • polypeptides are particularly preferable.
  • polypeptide is not particularly limited as long as it has biocompatibility, but for example, gelatin, collagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, entactin, thrombosponectin, and retronectin are preferable and most.
  • gelatin, collagen and atelocollagen are preferred.
  • natural gelatin or recombinant gelatin is preferable. More preferably, it is recombinant gelatin.
  • ⁇ Manufacturing method of microcapsules> cells and a cell suspension containing alginic acid are dropped into a calcium ion-containing solution to obtain droplets in which the cells are embedded in alginic acid, and the droplets are polypolized. Includes immersion in a coating solution containing cations.
  • Cells and cell suspensions containing alginic acid are formed by adding an alginic acid solution to cells (eg, cells in buffer).
  • the mixing is preferably carried out by a stirring method having a small shearing force so as not to damage the cells.
  • the cell suspension is preferably prepared using saline or a buffer commonly used for cell treatment.
  • the buffer solution include MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid) buffer solution, citric acid buffer solution, Tris buffer solution, Hepes buffer solution, phosphate buffered saline (PBS) and the like.
  • Mixing may be performed by pipetting, transfer of containers, or the like.
  • a commercially available stirrer for example, Awatori Rentaro (manufactured by Shinky Co., Ltd.) may be used.
  • the concentration of cells in the cell suspension is preferably 1000 cells / mL to 500,000 cells / mL, more preferably 5000 cells / mL to 300,000 cells / mL.
  • the cell suspension preferably has a viscosity of 50 mPa ⁇ s or more and 500 mPa ⁇ s or less. In this range, it is particularly difficult to break and uniform droplets can be easily obtained.
  • Alginic acid may have a concentration having the above viscosity.
  • the cell suspension may contain sodium alginate in an amount of about 1.3% by mass to 10% by mass. It is more preferable that the cell suspension has a viscosity of 100 mPa ⁇ s or more and 450 mPa ⁇ s or less.
  • the prepared cell suspension is dropped into a calcium ion-containing solution.
  • alginic acid is crosslinked and gelled to form droplets embedding cells.
  • the calcium ion-containing solution include a CaCl 2 solution.
  • the concentration of the CaCl 2 solution is preferably 15 to 120 mM, preferably 15 to 110 mM.
  • the dropping may be carried out, for example, over about 3 to 30 minutes, preferably 5 to 10 minutes.
  • the cell suspension may be dropped using an encapsulant.
  • an encapsulation device such as Buchi, Encapsulator B-395 Pro or the like can be used.
  • the cell suspension can be set in the syringe of the encapsulant, extruded from the syringe and dropped. It may be delivered by a perista pump.
  • the cell suspension may be delivered to the droplet-forming portion by, for example, a silicon tube, or may be delivered in a microchannel.
  • the droplet formation may be air-cut or may be vibrated by a voltage.
  • the formed droplets are further transferred to a liquid containing a polycation to coat the surface.
  • a liquid containing a polycation it is sufficient that the above-mentioned polyion complex gel is formed.
  • the coating liquid containing the above polycation a coating liquid containing calcium ions or barium ions at a concentration of 0.1 mM or more and 50.0 mM or less is used.
  • a coating solution containing calcium ions or barium ions at the above concentrations microcapsules that are more uniform than those using a coating solution that does not contain calcium ions or barium ions can be obtained. Found to be obtained.
  • the concentration of calcium ions or barium ions in the coating liquid is preferably 0.1 mM or more and 20.0 mM or less, and more preferably 0.2 mM or more and 10.0 mM or less.
  • the coating liquid may contain calcium ions, may contain barium ions, or may contain both, but it is particularly preferable that the coating liquid contains calcium ions. It is preferable to use calcium chloride (CaCl 2 ) as the calcium ion source.
  • As the solvent of the solution containing the polycation it is preferable to use physiological saline or a buffer solution generally used for cell treatment.
  • the coating liquid is preferably used in an amount of 1.0 mL or more for 5000 droplets. Within this range, droplets are less likely to aggregate and uniform microcapsules can be obtained. Further, by setting the amount to about 500 mL or less for 5000 droplets, it is possible to avoid the addition of more polycation than necessary.
  • the coating liquid in which the droplets are immersed is preferably shaken.
  • microcapsules in which an additional outermost layer shell is formed by alginate gel can be obtained.
  • a coating solution having an alginic acid concentration similar to that in the above cell suspension may be used, or a coating solution having an alginic acid concentration lower than this may be used, for example, 0.
  • a coating liquid of about .001% by mass to 1.2% by mass may be used.
  • physiological saline or a buffer solution generally used for treating cells it is preferable to use physiological saline or a buffer solution generally used for treating cells.
  • microcapsules obtained by the production method of the present invention are dispersed and stored in a solution containing calcium ions or barium ions at a concentration of 0.1 mM or more and 50.0 mM or less, preferably 0.9 mM or more and 45.0 mM or less. Is preferable. Within this range, swelling and contraction of the formed microcapsules can be prevented.
  • Microcapsules can be used to transplant cells into the recipient.
  • the immune system is known to recognize shape and particle size, and non-uniformly shaped implantable structures can evoke the immune system, whereas microcapsules produced by the process of the invention have a shape. And because of its uniform particle size, it is less likely to elicit an immune system and is suitable for transplantation applications.
  • the microcapsules may be transplanted to the recipient as they are, or may be further encapsulated in a transplant chamber formed of, for example, a porous membrane and transplanted.
  • Microcapsules can be used, for example, by transplantation into the abdominal cavity, subcutaneously, peritoneum, or the like. Alternatively, the microcapsules may be administered intravascularly.
  • the recipient to be transplanted is preferably a mammal, more preferably a human.
  • the donor may be the same species or different species.
  • pancreatic islets are used as insulin-secreting cells, they are preferably of heterologous origin, and when cells are used, they are preferably of allogeneic origin.
  • mesenchymal stem cells are preferably allogeneic mesenchymal stem cells.
  • the number of transplants may be one, and may be two or more if necessary.
  • Microcapsules embedding insulin-secreting cells can be used, for example, for the treatment of diseases requiring insulin-secreting cell transplantation.
  • Diseases that require insulin-secreting cell transplantation include diabetes treatment. Diabetes includes type 2 diabetes and type 1 diabetes. In particular, insulin-secreting cell transplantation is considered to be highly effective in type 1 diabetes.
  • the number of insulin-secreting cells used for the treatment of diseases requiring insulin-secreting cell transplantation is small. This is because as the number of cells increases, the volume increases, which not only makes transplantation difficult, but also increases the feeling of foreign body sensation after transplantation.
  • rat-derived islets as insulin-secreting cells used to normalize blood glucose levels in diabetic mice induced with streptozotocin
  • the number of islets required to maintain normal blood glucose levels varies between species, but is known to be largely body weight dependent.
  • MOPS buffer It was prepared by adding 5 mL of 1M MOPS solution (Dojindo 342-06691) to 495 mL of physiological saline (1326, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) in a safety cabinet (BHC-1307 II A2, Japan Airtech Japan, Ltd.). (Ca crosslinked solution) To 495 mL of water for injection (Hikari Pharmaceutical Co., Ltd.), 5 mL of 1M MOPS solution (Dojindo 342-06691) was added, and 5.5 g of calcium chloride (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 036-00485) was added and dissolved. The solution was filter sterilized.
  • Polylysine coating solution 20 mg of poly-L-lysine hydrobromide (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 167-12671) was dissolved in 40 mL of plasma simulated solution and sterilized by a filter.
  • Polyornithine coating solution 20 mg of poly-L-ornithine hydrochloride (Sigma-Aldrich 26982-21-8) is dissolved in 40 mL of plasma simulation solution and sterilized by a filter.
  • ⁇ Capsule formation example 1 Microcapsules containing no cells> The liquid viscosity at which capsules were normally formed was verified without using cells.
  • MOPS buffering of sodium alginate powder (11059994) manufactured by Buchi to 1.2% by mass, 1.3% by mass, 1.8% by mass, 2.4% by mass, and 2.6% by mass, respectively. Dissolved in liquid.
  • Microcapsules of uniform diameter were formed without breaking in the range of viscosity of 50 mPa ⁇ s or more and 500 mPa ⁇ s or less. Based on this result, in the example of forming microcapsules containing the following cells, a cell suspension adjusted to a viscosity in this range was used.
  • ⁇ Capsule formation example 1 Microcapsules containing islets> Capsules containing both pancreatic islets and Dynabeads M-450 Goat anti-Mouse IgG were prepared, and the degree of invasion of externally fluorescently labeled mouse-derived antibody IgG was compared for each capsule to evaluate homogeneity.
  • (1) 350 ⁇ L of alginic acid solution (Buchi, 11061528) having the viscosity shown in Table 2 was gently mixed in a syringe so that Dynabeds was 15 ⁇ g / mL.
  • (2) 8200 islets see Dong-Sheng Li. et. Al. 2009 Nature Protocol, 4, (11) 1649-1652.) Extracted from Lewis Rat were dispersed in 100 ⁇ L of MOPS buffer. It was gently mixed in a syringe with 350 ⁇ L of the solution prepared in (1).
  • the islet suspension was placed in a 1 mL syringe and set in a microencapsulator (Buchi, Encapsulator B-395 Pro, nozzle diameter 400 ⁇ m, air dripping).
  • the liquid was sent at 1.0 mL / min, dripping with 2.5 L / min air, the nozzle height was 8 cm, and the liquid was dropped onto the Ca crosslinked liquid.
  • the Ca crosslinked solution was stirred at 200 rpm with a magnetic stirrer at 100 mL, and stirring was continued for 7 minutes after the dropping.
  • the Ca cross-linked solution is filtered using a cell strainer (Falcon 352360) having a mesh diameter of 100 ⁇ m, and the capsules are transferred to the polycation coating solution (Ca concentration shown in Table 2) in the amount shown in Table 2.
  • a sample was prepared by shaking and rotating on a shaking stirrer (AsOne SRR-2) at 70 rpm for 2 minutes. No shaking rotation was performed only for Example 16 in Table 2.
  • Example 16 was an example in which shaking was not performed when coating poly-L-lysine, but Example 2 which was an equivalent example in which shaking was performed had more uniform antibody blocking properties.
  • a uniform microcapsule that was hard to break was obtained in the range where the calcium concentration in the polylysine coat solution was 0.1 to 50 mM.

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Abstract

細胞がアルギン酸およびポリカチオンで包埋されたマイクロカプセルの製造方法であって、上記細胞およびアルギン酸を含む細胞懸濁液をカルシウムイオン含有溶液に滴下して、上記細胞がアルギン酸に包埋された液滴を得ること、および上記液滴をポリカチオンを含むコート液に浸漬して上記マイクロカプセルを得ることを含み、上記コート液がカルシウムイオンまたはバリウムイオンを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下の濃度で含む、上記製造方法が提供される。本発明の製造方法により、形状および粒子径が均一なマイクロカプセルを製造することができる。

Description

マイクロカプセルの製造方法およびコート液
　本発明は、マイクロカプセルの製造方法およびマイクロカプセルの製造に用いられるコート液に関する。
　組織や細胞を生物適合性材料を用いてマイクロカプセル化して移植する方法については従来から研究が重ねられている（例えば、特許文献１）。
　特許文献１においてはアルギン酸を含む膵島の懸濁液から形成した液滴を分子量１７，０００のポリリジン溶液中でインキュベートしてマイクロカプセルを製造することが記載されている。
　また、糖尿病における根本治療として期待が寄せられる膵島移植では、ドナー不足の対策として異種膵島を用いた膵島移植の研究が盛んに行われている。しかしながら、異種膵島移植の実現には膵島を異種免疫拒絶反応から保護する必要がある。膵島移植に限らず、細胞移植における免疫拒絶の対策として、ヒドロゲルなどを用いた免疫隔離膜の研究が進められている。非特許文献１には、アルギン酸カプセルにより細胞を免疫隔離することが記載されている。
特開昭６０―２５８１２１号公報
Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５４（３）：６８７－６９３（２００５）
　本発明者らが、特許文献１に記載の方法でマイクロカプセルを製造し、その性能を確認していたところ、免疫隔離機能が不十分な例が見られた。得られるマイクロカプセルの形状がいびつであったり、また、粒子径が不均一であるものが観察され、免疫隔離機能が不均一であるためと推定された。
　上記に鑑み、本発明は、細胞を包埋したマイクロカプセルの製造方法として、形状および粒子径が均一なマイクロカプセルを製造することができる方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討を行い、特許文献１に記載の方法において、細胞とアルギン酸とを含む懸濁液から形成した液滴を処理するポリリジンを含むコート液に、カルシウムイオンまたはバリウムイオンを加えることにより、得られるマイクロカプセルの均一性が向上することを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下＜１＞～＜１３＞が提供される。
＜１＞細胞がアルギン酸およびポリカチオンで包埋されたマイクロカプセルの製造方法であって、
上記細胞およびアルギン酸を含む細胞懸濁液をカルシウムイオン含有溶液に滴下して、上記細胞がアルギン酸に包埋された液滴を得ること、および
上記液滴をポリカチオンを含むコート液に浸漬して上記マイクロカプセルを得ることを含み、
上記コート液がカルシウムイオンまたはバリウムイオンを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下の濃度で含む、上記製造方法。
＜２＞上記細胞懸濁液が５０ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有する＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞上記ポリカチオンの分子量が１ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下である＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞上記ポリカチオンの分子量が１ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下である＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
＜５＞上記ポリカチオンがポリ－Ｌ－リジンまたはポリ－Ｌ－オルニチンである＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の製造方法。
＜６＞上記液滴を浸漬した上記コート液が振とう処理される＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の製造方法。
＜７＞上記マイクロカプセルをさらにアルギン酸を含む溶液に浸漬することを含む＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の製造方法。
＜８＞アルギン酸を含む上記溶液に浸漬した後の上記マイクロカプセルを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下濃度のカルシウムイオンまたはバリウムイオンを含む溶液に分散することを含む＜７＞に記載の製造方法。
＜９＞上記細胞が生理活性物質を放出する細胞である＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１０＞上記生理活性物質がインスリンである＜９＞に記載の製造方法。
＜１１＞上記細胞が膵島中の細胞である＜９＞または＜１０＞に記載の製造方法。
＜１２＞上記マイクロカプセルにおいて、上記細胞とともに間葉系幹細胞または間葉系幹細胞群がアルギン酸およびポリカチオンで包埋されている＜９＞～＜１１＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１３＞＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の方法に用いられるコート液であって、分子量が５ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下である上記ポリカチオンを含み、カルシウムイオンまたはバリウムイオンを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下の濃度で含む、上記コート液。
　本発明により、形状および粒子径が均一なマイクロカプセルを製造することができる、細胞を包埋したマイクロカプセルの製造方法が提供される。本発明の製造方法により製造されたマイクロカプセルは形状および粒子径が均一であるため、破壊しにくく保存安定性が高い。また、本発明の製造方法により製造されたマイクロカプセルは細胞をレシピエントに移植するための用途に適している。
粘度の異なる細胞懸濁液から形成したマイクロカプセルの光学顕微鏡像を示す図である。 カルシウム濃度の異なるポリリジンコート液を用いて形成した実施例１～４、比較例１、２のマイクロカプセルの光学顕微鏡像を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。本明細書において「～」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
　本明細書において分子量は、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィ）で測定した重量平均分子量を意味し、具体的には以下の分析条件で測定したものであればよい。
装置：ＨＬＣ－８２２０ＧＰＣ，ＴＯＳＯＨ
カラム：ＴＳＫＧＥＬ　Ｇ５０００ＰＷＸＬ、Ｇ４０００ＰＷＸＬ、もしくはＧ２５００ＰＷＸＬ
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出器：ＲＩ（示差屈折計）
　なお、分子量の算出には標準プルラン標品Ｓｈｏｄｅｘ　Ｐｕｌｌｕｌａｎ　Ｐ－５、Ｐ－１０、Ｐ－２０、Ｐ－５０、Ｐ－８２、Ｐ－１００、Ｐ－２００、Ｐ－４００、Ｐ－８００、Ｐ－１６００を使用した。
＜マイクロカプセル＞
　マイクロカプセルは、球状または略球状の粒子であればよい。本発明の製造方法で製造されるマイクロカプセルは、アルギン酸およびポリカチオンを含み、これらにより細胞が包埋されている。本発明の製造方法で製造されるマイクロカプセルは、細胞を含むコアを有し、アルギン酸およびポリカチオンを含むシェルを有することが好ましい。マイクロカプセルは、細胞の維持のために必要なアルブミンなどのタンパク質、ペプチド、ｐＨ緩衝剤、無機塩等を含んでいてもよい。
　マイクロカプセルは通常、直径１００μｍ～８０００μｍ、好ましくは直径３００μｍ～３０００μｍの球に相当するサイズの粒子であるが、サイズは特に限定されない。すなわち、マイクロカプセルの「マイクロ」は特にサイズを限定するための意味を有するものではない。
　マイクロカプセルは、免疫隔離機能を有していることが好ましい。免疫隔離は免疫拒絶反応の防止方法である。一般的には、免疫隔離は移植の際のレシピエントの免疫拒絶反応を防止する方法の一つである。ここで、免疫拒絶反応は、細胞が移植される場合、この細胞に対するレシピエントの拒絶反応である。免疫隔離により、レシピエントの免疫拒絶反応から細胞が隔離される。免疫拒絶反応としては、細胞性免疫応答に基づくものおよび液性免疫応答に基づくものが挙げられる。
　マイクロカプセルは、アルギン酸の濃度やポリカチオンコートの厚みを調節することにより、物質の透過性を調製することができ、例えば、１５０ｋＤａ以上の物質の透過を抑制することができる。
［アルギン酸］
　マイクロカプセルは、アルギン酸を含む。より具体的には、マイクロカプセルはアルギン酸が架橋して形成されるゲルを含んでいればよい。アルギン酸は、溶液を形成する際の条件や溶液の組成を調整することにより、架橋ヒドロゲルとすることができる。細胞をアルギン酸中に包埋してマイクロカプセル化する方法は公知であり、本発明の製造方法における液滴の形成においてはそれらの公知の方法を適宜参照して用いることができる。
　アルギン酸は、グルクロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）よりなるブロック共重合体である。アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖または細胞間充填物質として天然に存在しており、これらを原料として採取可能である。原料褐藻類の具体例としては、ヒバマタ目ダービリア科ダービリア属（例えばＤ．ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）、ヒバマタ目ヒバマタ科アスコフィラム属（例えばＡ．ｎｏｄｏｓｕｍ）、コンブ目コンブ科コンブ属（例えばマコンブ、ナガコンブ）、コンブ目コンブ科アラメ属（例えばアラメ）、コンブ目コンブ科カジメ属（例えばカジメ、ウロメ）、コンブ目レッソニア科レッソニア属（例えばＬ．ｆｌａｖｉｋａｎｓ）の褐藻類を例示できる。また、市販のアルギン酸を使用することもできる。
　上記のような原料に由来してアルギン酸（本発明の製造方法に用いられるアルギン酸原料）に含まれ得るエンドトキシンの含有量は１０００ＥＵ／ｇ以下であることが好ましく、５００ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、１００ＥＵ／ｇ以下であることがさらに好ましい。
　アルギン酸原料のエンドトキシンの含有量はマイクロカプセルにおける含有量としては、概ね５０％で反映される。すなわち、マイクロカプセルのエンドトキシンの含有量は５００ＥＵ／ｇ以下であることが好ましく、２５０ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、５０ＥＵ／ｇ以下であることがさらに好ましい。
　エンドトキシンの含有量は、ゲル化法、比濁法、比色法いずれかの方法を用いて測定することができる。
　アルギン酸のＧ／Ｍの比は特に限定されないが、Ｇ／Ｍの比が大きいほどゲル形成能が大きいため、Ｇ／Ｍの比は大きいことが好ましく、具体的には０．８～２．０であることが好ましく、０．８～１．６であることがさらに好ましい。
　アルギン酸は、Ｍブロックが有するポケット構造に多価金属カチオンが侵入してエッグボックスを形成し、ゲル化すると考えられている。本発明の製造方法においては、このゲル化を利用して細胞を包埋するマイクロカプセルが形成されていればよい。アルギン酸のゲル化を引き起こし得る多価金属カチオンの具体例としては、カルシウム（Ｃａ）、バリウム（Ｂａ）、アルミニウム（Ａｌ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、スズ（Ｓｎ）等の２価または３価の金属イオンを例示できる。これらのうちカルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンが好ましく、カルシウムイオンがより好ましい。
　すなわち、アルギン酸はマイクロカプセルにおいてアルギン酸塩の形態であってもよい。また、マイクロカプセルを形成するアルギン酸原料としてアルギン酸塩を用いてもよい。このときのアルギン酸塩の例としてはアルギン酸ナトリウムが好ましく挙げられる。
　また、アルギン酸はアルギン酸誘導体であってもよい。アルギン酸の誘導体については、米国特許第９４２２３７３号明細書を参照することができる。
　アルギン酸の分子量は５０ｋＤａ以上が好ましく、１００ｋＤａ以上がより好ましく、分子量１５０ｋＤａ以上がさらに好ましい。
［ポリカチオン］
　本発明の製造方法で製造されるマイクロカプセルは、さらにポリカチオン（カチオン残基を有する有機高分子化合物）を含む。マイクロカプセルにおいて、アルギン酸は、さらにポリカチオンとポリイオンコンプレックスゲルを形成していることが好ましい。例えば、アルギン酸が二価カチオンでイオン的に架橋され形成されたヒドロゲルは、さらにポリカチオンと接触することによって半透過性膜を形成することができる。この際、典型的には、アルギン酸ゲルからなる内側シェルとポリカチオンを含む外側シェルを有するマイクロカプセルが形成される。このマイクロカプセルはさらに追加の最外層シェル（例えば包膜）を有していてもよい。例えば、アルギン酸ゲルで追加の最外層シェルを形成することにより、表面の荷電を小さくすることができる。具体的には、アルギン酸ゲル／ポリカチオン－アルギン酸ゲル／アルギン酸ゲル／細胞の多層マイクロカプセルを形成してもよい。
　ここでポリイオンコンプレックスとは、カチオン残基を有する有機高分子化合物とアニオン残基を有する有機高分子化合物とが、静電的な相互作用により複合体を形成している状態を指す。
　ポリカチオンの例としては、アミン基またはイミン基などの塩基性反応基を有するポリマーが挙げられる。具体的な例としては、ポリオルニチン（ポリ－Ｌ－オルニチン）、ポリリジン（ポリ－Ｌ－リジン）、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（アリルアミン）のほか、ＵＳ２００９／０２１４６６０　Ａ１の００６９に記載のポリカチオンが挙げられる。これらのうちポリオルニチンおよびポリリジンが好ましく、ポリオルニチンがより好ましい。ポリカチオンの分子量は、０．２ｋＤａ以上５００ｋＤａ以下であればよく、０．５ｋＤａ以上３００ｋＤａ以下が好ましく、１ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下がさらに好ましい。特に、ポリカチオンの分子量を１ｋＤａ以上とすることでアルギン酸とポリカチオンとの架橋を十分にして膨潤を防止することができる。また、ポリカチオンの分子量を２００ｋＤａ以下とすることでカプセル間での架橋を防止して均一にコートすることができる。ポリカチオンの分子量は、５ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下が特に好ましい。
　ポリカチオンで架橋されたアルギン酸ヒドロゲルについては、Journal of biomedicalmaterials research PartB 101B 258-268(2013年)を参照することができる。
［細胞］
　本発明の製造方法で製造されるマイクロカプセルにおいて包埋される細胞は１つであっても複数であってもよいが複数であることが好ましい。複数の細胞は、互いに分離したものであってもよく、集合体であってもよい。
　細胞は、生体から直接取得したものであってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞等の細胞を分化誘導したものであってもよい。細胞は、前駆細胞であってもよい。
　細胞としては、一態様として、生理活性物質を放出するものが好ましい。生理活性物質を放出する細胞としては、膵島細胞、間葉系幹細胞、ドーパミン産生神経細胞、血液凝固因子分泌細胞、α-Gal産生細胞が挙げられる。生理活性物質の例としては、各種ホルモン、各種サイトカイン、各種酵素、その他各種生体内因子が挙げられる。より具体的な例としては、インスリン、ドーパミン、第VIII因子等が挙げられる。本発明の方法は生理活性物質を放出する細胞が均一なマイクロカプセルに包埋されて移植されることにより、生理活性物質が徐放されかつ、被移植体からの免疫系から認識されづらくなるため、本発明の方法が生理活性物質を放出する細胞に適用されることが好ましい。
　ここで、インスリンとは、２１アミノ酸残基のＡ鎖と３０アミノ酸残基のＢ鎖がジスルフィド結合を介してつながったポリペプチド（分子量約６０００）である。ほ乳類の生体内においてインスリンは、膵臓のランゲルハンス島にあるβ細胞から分泌されている。本発明において生物学的構成物としてインスリン分泌細胞を用いる場合、分泌するインスリンは、ヒト型のインスリンでもよく、その他のほ乳類（例えばブタ型）型のインスリンでもよい。インスリンは遺伝子組み換えの方法により作製されたインスリンでもよい。遺伝子組み換えインスリンの取得方法としては、例えば、門脇孝編：糖尿病ナビゲーター（２７０～２７１頁、田尾健、岡芳和「現在と将来のインスリン製剤」、メディカルレビュー社、２００２年参照）の記載を参照できる。各種、インスリン類似体（例えば、H．C．Lｅｅ，J．W．Yｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、第４０８巻、４８３～４８８頁、２０００年参照）を用いてもよい。
（インスリン分泌細胞）
　本発明の製造方法で製造されるマイクロカプセルに含まれる細胞はインスリン分泌細胞であることが好ましい。インスリン分泌細胞とは、血糖値変化に応答してインスリンを分泌できる細胞をいう。インスリン分泌細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば、膵臓のランゲルハンス島に存在する膵β細胞を挙げることができる。膵β細胞としては、ヒトの膵β細胞でもよく、ブタ、マウスなどの膵β細胞であってもよい。ブタからの膵β細胞の抽出方法は特開２００７－１９５５７３号公報の記載を参考にすることができる。また、インスリン分泌細胞としては、ヒト幹細胞から誘導された細胞（例えば、宮崎純一、再生医療、第１巻、第２号、５７～６１頁、２００２年参照）、または小腸上皮幹細胞から誘導された細胞（例えば、藤宮峯子ら、再生医療、第１巻、第２号、６３～６８頁、２００２年参照）であってもよく、インスリンをコードする遺伝子を組み込んだ、インスリン分泌性の細胞であってもよい（例えば、Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．Ｙｏｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、第４０８巻、４８３～４８８頁、２０００年参照）。
　インスリン分泌細胞は細胞集合体であってもよい。本明細書において、細胞集合体とは、複数個の細胞が集合した細胞塊であって、後述する細胞構造体に該当しないものを意味する。細胞集合体の一例としては、膵島が挙げられる。すなわち、インスリン分泌細胞としては、膵島を用いることも好ましい（例えば、堀洋、井上一知、再生医療、第１巻、第２号、６９～７７頁、２００２年参照）。
　マイクロカプセルは、複数種の細胞を含んでいてもよい。例えば、一つの細胞とともに、この細胞の機能を補助する他の細胞をさらに含んでいてもよい。
　このような例としては、例えばマイクロカプセルがインスリン分泌細胞および間葉系幹細胞を含埋する例が挙げられる。
（間葉系幹細胞）
　間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とは間葉系組織に存在する体性幹細胞であり、間葉系組織に属する細胞への分化能を有する。間葉系組織とは、骨、軟骨、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、心臓等の組織をいう。間葉系幹細胞としては、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞がより好ましく、脂肪由来間葉系幹細胞がさらに好ましい。
本発明の製造方法で製造されるマイクロカプセルは、間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞群として含んでいてもよい。間葉系幹細胞群とは、複数の間葉系幹細胞が一体化している集団を意味する。間葉系幹細胞群としては、間葉系幹細胞の細胞集合体または細胞構造体が好ましく、細胞構造体がより好ましい。
　本明細書において、細胞構造体は、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている構造体を意味する。本発明の製造方法で製造されるマイクロカプセルが間葉系幹細胞を含むとき、生体親和性を有する高分子ブロックと間葉系幹細胞とを含む細胞構造体であって複数個の上記間葉系幹細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含むことが好ましい。
　細胞構造体では、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを用いて、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体が形成される。
　細胞構造体では、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
　また、高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の高分子ブロック間の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１～数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
　生体親和性高分子ブロックを構成する高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性材料で構成されることが好ましい。生分解性材料としては、具体的にはポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸－co－グリコール酸）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、および、キトサンの群から選択される少なくとも１つの材料である。上記の中でも、ポリペプチドが特に好ましい。ポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、天然ゼラチン、またはリコンビナントゼラチンが好ましい。さらに好ましくは、リコンビナントゼラチンである。
　細胞構造体の詳細および好ましい態様については、国際公開２０１１／１０８５１７号、特開２０１４－１２１１４号公報、国際公開２０１４／１３３０８１号、特開２０１５－１３４１９３号公報および国際公開２０１５／１９０４３０号に記載されており、上記文献の内容は全て引用により本明細書に取り込むものとする。
＜マイクロカプセルの製造方法＞
　本発明のマイクロカプセルの製造方法は、細胞およびアルギン酸を含む細胞懸濁液をカルシウムイオン含有溶液に滴下して、上記細胞がアルギン酸に包埋された液滴を得ること、および上記液滴をポリカチオンを含むコート液に浸漬することを含む。
　細胞およびアルギン酸を含む細胞懸濁液は、アルギン酸溶液を細胞（例えば緩衝液中の細胞）に添加して形成される。混合は細胞にダメージを与えないようにするため、せん断力の小さい撹拌方法で行なうことが好ましい。
　細胞懸濁液は、生理食塩水または細胞の処理に一般的に用いられる緩衝液を用いて調製することが好ましい。緩衝液としては、例えば、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。
　混合は、ピペッティング、容器の移し替えなどで行なえばよい。市販の撹拌機（例えば、あわとり練太郎（シンキー（株）製））を用いてもよい。
　細胞懸濁液における細胞の濃度は１０００個／ｍＬ～５０００００個／ｍＬが好ましく、５０００個／ｍＬ～３０００００個／ｍＬがより好ましい。
　細胞懸濁液は５０ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有することが好ましい。この範囲で特に壊れにくく均一な液滴が得られやすい。アルギン酸は上記粘度となる濃度とすればよい。例えば、細胞懸濁液はアルギン酸ナトリウムを１．3質量％～10質量％程度で含んでいればよい。細胞懸濁液は、１００ｍＰａ・ｓ以上４５０ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有することがより好ましい。
　調製された細胞懸濁液はカルシウムイオン含有溶液中に滴下される。この工程でアルギン酸が架橋してゲル化し、細胞を包埋した液滴が形成される。カルシウムイオン含有溶液としては、例えば、ＣａＣｌ２溶液が挙げられる。ＣａＣｌ２溶液の濃度は１５～１２０ｍＭが好ましく、１５～１１０ｍＭであることが好ましい。滴下は、例えば、約３～３０分、好ましくは５～１０分かけて行なえばよい。
　細胞懸濁液の滴下は封入機を用いて行なえばよい。封入機としてはＢｕｃｈｉ，Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ　Ｂ－３９５　Ｐｒｏなどのカプセル化装置を用いることができる。細胞懸濁液は封入機のシリンジにセットし、シリンジから押し出して滴下することができる。ペリスタポンプによって送り出してもよい。カプセル化装置において、細胞懸濁液は、例えば、シリコンチューブで液滴化部まで送液してもよいし、マイクロ流路内で送液してもよい。液滴化は、エアーカットしてもよいし、電圧で振動させてもよい。
　形成された液滴は、さらに、ポリカチオンを含む液に移し、表面をコートすることが好ましい。ここで、上述のポリイオンコンプレックスゲルが形成されていればよい。本発明の製造方法においては、上記のポリカチオンを含むコート液として、カルシウムイオンまたはバリウムイオンを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下の濃度で含むコート液が用いられる。下記の実施例で示すように、本発明者らは、カルシウムイオンまたはバリウムイオンを上記の濃度で含むコート液を用いることにより、これを含まないコート液を用いた場合よりも均一なマイクロカプセルが得られることを見出した。従来技術（例えば、特許文献１やＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：６２（７），８８８－８９３，１９９６など）では、上記コート液にカルシウムイオンは添加されておらず、上記の結果は驚くべきものであった。コート液におけるカルシウムイオンまたはバリウムイオンの濃度は、０．１ｍＭ以上２０．０ｍＭ以下が好ましく、０．２ｍＭ以上１０．０ｍＭ以下がより好ましい。コート液はカルシウムイオンを含んでいてもよく、バリウムイオンを含んでいてもよく、両者を含んでいてもよいが、カルシウムイオンを含んでいることが特に好ましい。カルシウムイオン源としては、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を用いることが好ましい。ポリカチオンを含む液の溶媒としては、生理食塩水または細胞の処理に一般的に用いられる緩衝液を用いることが好ましい。
　コート液は、液滴５０００個に対して１．０ｍＬ以上の量で用いることが好ましい。この範囲で液滴が凝集しにくく、均一なマイクロカプセルを得ることができる。また、液滴５０００個に対して５００ｍＬ以下程度の量とすることにより、必要以上のポリカチオンの添加を避けることができる。
　液滴が浸漬しているコート液は振とう処理されることが好ましい。
　上述のように、この表面をさらにアルギン酸ゲルでコートすることも好ましい。得られたマイクロカプセルをさらにアルギン酸を含む溶液に浸漬することにより、アルギン酸ゲルで追加の最外層シェルが形成されたマイクロカプセルを得ることができる。このときに用いられるコート液としては、上記の細胞懸濁液におけるアルギン酸濃度と同様のアルギン酸濃度のコート液を用いてもよく、これより低いアルギン酸濃度のコート液を用いてもよく、例えば、０．００１質量％～１．２質量％程度のコート液であってもよい。溶媒としては、生理食塩水または細胞の処理に一般的に用いられる緩衝液を用いることが好ましい。
　本発明の製造方法により得られたマイクロカプセルは、０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下、好ましくは０．９ｍＭ以上４５．０ｍＭ以下の濃度でカルシウムイオンまたはバリウムイオンを含む溶液に分散して保存することが好ましい。この範囲で、形成されたマイクロカプセルの膨潤や収縮を防止することができる。
＜マイクロカプセルの用途＞
　マイクロカプセルは、細胞をレシピエントに移植するために用いることができる。免疫系は形状や粒子径を認識することが知られており、不均一形状の移植用構造物は免疫系を惹起する可能性があるが、本発明の製造方法により製造されたマイクロカプセルは形状および粒子径が均一であるため、免疫系を惹起しにくく、移植の用途に適している。
　マイクロカプセルは、そのままレシピエントに移植されてもよく、さらに、例えば多孔質膜で形成された移植用チャンバーに封入して移植してもよい。
　マイクロカプセルは例えば、腹腔内、皮下または腹膜などに移植して用いることができる。または、マイクロカプセルは、血管内に投与されてもよい。
　移植を受けるレシピエントは哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
　例えば細胞としてインスリン分泌細胞を用いる場合であって、ドナーがあるとき、ドナーとしては同種でもよく、異種でもよい。インスリン分泌細胞として膵島を用いる場合は異種由来であり、細胞を用いる場合は同種由来であることが好ましい。
　間葉系幹細胞を用いる場合、間葉系幹細胞は、同種由来の間葉系幹細胞が好ましい。
　移植回数は、１回でもよく、必要に応じ２回以上であってもよい。
　インスリン分泌細胞を包埋したマイクロカプセルは、例えば、インスリン分泌細胞移植を必要とする疾患の治療のために使用することができる。インスリン分泌細胞移植を必要とする疾患としては、糖尿病治療が挙げられる。糖尿病としては、２型糖尿病および１型糖尿病が挙げられる。特に、１型糖尿病において、インスリン分泌細胞移植の効果が高いと考えられる。
　インスリン分泌細胞移植を必要とする疾患の治療のために用いるインスリン分泌細胞の数は少ないことが好ましい。細胞数が増えると体積が増え、移植が困難になるだけでなく、移植後の異物感も増大するためである。
　ストレプトゾトシンで糖尿病を誘導された糖尿病マウスの血糖値を正常化するために用いられるインスリン分泌細胞としてラット由来の膵島を用いる際、１００個以上でかつ５０００個未満の膵島を用いることが好ましく、１００個以上でかつ２５００個未満の膵島を用いることがより好ましく、１００個以上でかつ１２５０個未満の膵島を用いることがさらに好ましい。
　種間で正常な血糖値の維持に必要な膵島の個数は異なるが、大まかに体重に依存することが知られている。
　以下に実施例と比較例を挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
＜試薬等の調製＞
（ＭＯＰＳ緩衝液）
　安全キャビネット（日本エアーテック株式会社BHC-1307 II A2）内で１Ｍ　ＭＯＰＳ液（Ｄｏｊｉｎｄｏ　３４２－０６６９１）５ｍＬを４９５ｍＬの生理食塩水（大塚製薬株式会社１３２６）に添加して調製した。
（Ｃａ架橋液）
　注射用水（光製薬（株））４９５ｍＬに１Ｍ　ＭＯＰＳ液（Ｄｏｊｉｎｄｏ　３４２－０６６９１）５ｍＬを添加し、さらに塩化カルシウム（富士フイルム和光純薬（株）０３６－００４８５）５．５ｇを添加し溶解した。溶液はフィルター滅菌した。
（血漿模擬液）
　ＮａＣｌ（富士フイルム和光純薬（株））７．９ｇ、ＫＣｌ（富士フイルム和光純薬（株））０．４１ｇ、ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ（富士フイルム和光純薬（株））０．４７ｇ、ＣａＣｌ２（富士フイルム和光純薬（株））０．３０ｇ、を注射用水（光製薬（株））１Ｌに溶解する。さらにＰＢＳ（ｐＨ７．４　ｇｉｂｃｏ　１００１００２３）５００ｍＬを添加する。滅菌フィルターをかける。
（Ｃａ無し血漿模擬液）
　ＮａＣｌ（富士フイルム和光純薬（株））７．９ｇ、ＫＣｌ（富士フイルム和光純薬（株））０．４１ｇ、ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ（富士フイルム和光純薬（株））０．４７ｇを注射用水（光製薬（株））１Ｌに溶解する。さらにＰＢＳ（ｐＨ７．４ｇｉｂｃｏ１００１００２３）５００ｍＬを添加する。滅菌フィルターをかけた。
（ポリリジンコート液）
　ポリ－Ｌ－リジン臭化水素酸塩（富士フイルム和光純薬（株）１６７－１２６７１）２０ｍｇを４０ｍＬの血漿模擬液に溶解し、フィルター滅菌した。
（ポリオルニチンコート液）
　ポリ－Ｌ－オルニチン塩酸塩（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ　２６９８２－２１－８）２０ｍｇを４０ｍＬの血漿模擬液に溶解し、フィルター滅菌する。
（０．０３％アルギン酸コート液）
　１．８％アルギン酸溶液（Ｂｕｃｈｉ、１１０６１５２８）をＣａ無し血漿模擬液で０．０３％になるよう希釈した。
＜カプセル形成例１：細胞を含まないマイクロカプセル＞
　細胞を用いず、カプセルが正常に形成される液粘度を検証した。
（１）Ｂｕｃｈｉ社製のアルギン酸ナトリウム粉末（１１０５９９９４）をそれぞれ１．２質量％、１．３質量％、１．８質量％、２．４質量％、２．６質量％となるよう、ＭＯＰＳ緩衝液に溶解した。
（２）それぞれの粘度をＥＭＳ－１０００（京都電子工業株式会社）で計測（サンプル量：４００ｕｌ、液温度：２５．０℃、回転数：１０００ｒｐｍ、測定時間：５秒）したところ、４２ｍＰａ・ｓ、５９ｍＰａ・ｓ、１６１ｍＰａ・ｓ、４３２ｍＰａ・ｓ、５２０ｍＰａ・ｓであった。
（３）それぞれの液を１ｍＬ分シリンジに入れ、マイクロカプセル化装置（ＥｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒＢ－３９５Ｐｒｏ、ノズル径４００μｍ、エアードリッピング）にセットした。１．０ｍＬ／ｍｉｎで送液して、２．５Ｌ／ｍｉｎエアーでドリッピングし、ノズル高８ｃｍとして、Ｃａ架橋液に滴下した。その時、Ｃａ架橋液は１００ｍＬでマグネチックスターラーにより２００ｒｐｍで撹拌をし、滴下後に７分間撹拌を継続した。
　その後、光学顕微鏡で形態を観察し、壊れたカプセルの率、およびカプセル径の均一性を評価した。
（壊れたカプセル率の判定基準）
Ａ評価；壊れたカプセルが確認されない
Ｂ評価：壊れたカプセルが確認され、その数割合が１０％未満
Ｃ評価：壊れたカプセルが確認され、その数割合が１０％以上
（カプセルの一辺が破裂した形状となっているものを壊れたカプセルとしてカウントした。）
（カプセル径の均一性の判定基準）
　カプセル径の均一性の評価としてランダムに２０カプセルの直径を光学顕微鏡像より計測した。
Ａ評価：カプセル径の標準偏差が平均値の１０％未満
Ｂ評価：カプセル径の標準偏差が平均値の１０％以上、２０％未満
Ｃ評価：カプセル径の標準偏差が平均値の２０％以上

　結果を表１に示す。各粘度のマイクロカプセルの光学顕微鏡像を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　５０ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下の粘度の範囲で、壊れなく、均一な径のマイクロカプセルが形成された。この結果を踏まえ、以下の細胞を含むマイクロカプセルの形成例ではこの範囲の粘度に調整された細胞懸濁液を用いた。
＜カプセル形成例１：膵島を含むマイクロカプセル＞
　膵島とＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－４５０　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧをともに封入したカプセルを作製し、外部より蛍光標識されたマウス由来の抗体ＩｇＧの侵入の度合いをカプセル毎に比較し、均一性を評価した。
（１）３５０μＬの表２に記載の粘度となる濃度のアルギン酸溶液（Ｂｕｃｈｉ、１１０６１５２８）にＤｙｎａｂｅａｄｓが１５μｇ／ｍＬとなるようにシリンジ中で穏やかに混合した。
（２）Ｌｅｗｉｓ　Ｒａｔより抽出した膵島８２００個（Ｄｏｎｇ－Ｓｈｅｎｇ　Ｌｉ．　ｅｔ．　ａｌ．　２００９　Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，　４，（１１）　１６４９－１６５２．を参考）を１００μＬのＭＯＰＳ緩衝液に分散した。３５０μＬの（１）で調整した液とシリンジ中で穏やかに混合した。
（３）１ｍＬシリンジに膵島懸濁液を入れ、マイクロカプセル化装置（Ｂｕｃｈｉ、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ　Ｂ－３９５　Ｐｒｏ、ノズル径４００μｍ、エアードリッピング）にセットした。１．０ｍＬ／ｍｉｎで送液、２．５Ｌ／ｍｉｎエアーでドリッピング、ノズル高８ｃｍとし、Ｃａ架橋液に滴下した。その時、Ｃａ架橋液は１００ｍＬでマグネチックスターラーにより２００ｒｐｍで撹拌をし、滴下後に７分間撹拌を継続した。
（４）１００μｍのメッシュ径を有するセルストレーナ（Ｆａｌｃｏｎ　３５２３６０）を用いＣａ架橋液を濾過し、表２に記載の量のポリカチオンコート液（表２に記載のＣａ濃度）にカプセルを移す。この時、振とう撹拌機（ＡｓＯｎｅ　ＳＲＲ－２）上７０ｒｐｍで振とう回転させて２分間処理しサンプル作製した。なお、表２の実施例１６のみについては振とう回転を行なわなかった。
（５）その後それぞれを４５ｍＬの血漿模擬液中で１分間ずつ２回カプセルを洗浄した。
（６）０．０３％アルギン酸溶液（４５ｍＬ）中で１分間浸漬コートした。
（７）血漿模擬液４５ｍＬで１分間、１回洗浄した。
（８）表２に記載のＣａ濃度とした血漿模擬液（分散液）中で保管した。
（抗体ブロック性の評価）
（１）カプセルを１個ずつガラスボトム９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに１カプセルずつ入れた（全量各５０μＬ）。
（２）血漿模擬液で３００倍希釈したＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ４８８（Ａｂｃａｍ）を２．５μＬ各ウェルに添加した。
（３）Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ４８８を投入６０分後にカプセル内部へのＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ４８８の侵入を蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ　ＢＺ－Ｘ）を用い、下記条件で観察した。
・静止画×１０レンズを使用
・蛍光：緑、露光時間１ｓ（退色軽減モード）
・暗視野／位相差：露光時間１／１０００ｓ
（４）１０カプセルについて観察を行い、蛍光抗体投入後３０分後にカプセル内部のＤｙｎａｂｅａｄｓ部が発光しているものの比率で評価した。
Ａ：　　発光無し
Ｂ：　　１カプセル以上３カプセル以下が発光
Ｃ：　　４カプセル以上が発光

　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　表２からわかるように、カルシウムイオンを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下の濃度で含む実施例において、良好な抗体ブロック性が得られた。実施例１６はｐｏｌｙ－Ｌ－リジンをコートする際に振とうを行なわなかった例であるが、振とうを行った同等の例である実施例２のほうが抗体ブロック性が均一であった。
　また、ポリリジンコート液中のカルシウム濃度の異なる実施例１～４、比較例１、２について、壊れたカプセル率を上記の基準で評価した。結果を表３に示す。また、各実施例および比較例のマイクロカプセルの光学顕微鏡像を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ポリリジンコート液中のカルシウム濃度が０．１～５０ｍＭである範囲で、壊れにくく均一なマイクロカプセルが得られた。

Claims (13)

  1. 細胞がアルギン酸およびポリカチオンで包埋されたマイクロカプセルの製造方法であって、
    前記細胞およびアルギン酸を含む細胞懸濁液をカルシウムイオン含有溶液に滴下して、前記細胞がアルギン酸に包埋された液滴を得ること、および
    前記液滴をポリカチオンを含むコート液に浸漬して前記マイクロカプセルを得ることを含み、
    前記コート液がカルシウムイオンまたはバリウムイオンを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下の濃度で含む、前記製造方法。
  2. 前記細胞懸濁液が５０ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有する請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記ポリカチオンの分子量が１ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下である請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 前記ポリカチオンの分子量が１ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下である請求項１または２に記載の製造方法。
  5. 前記ポリカチオンがポリ－Ｌ－リジンまたはポリ－Ｌ－オルニチンである請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 前記液滴を浸漬した前記コート液が振とう処理される請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 前記マイクロカプセルをさらにアルギン酸を含む溶液に浸漬することを含む請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. アルギン酸を含む前記溶液に浸漬した後の前記マイクロカプセルを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下濃度のカルシウムイオンまたはバリウムイオンを含む溶液に分散することを含む請求項７に記載の製造方法。
  9. 前記細胞が生理活性物質を放出する細胞である請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 前記生理活性物質がインスリンである請求項９に記載の製造方法。
  11. 前記細胞が膵島中の細胞である請求項９または１０に記載の製造方法。
  12. 前記マイクロカプセルにおいて、前記細胞とともに間葉系幹細胞または間葉系幹細胞群がアルギン酸およびポリカチオンで包埋されている請求項９～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に用いられるコート液であって、分子量が５ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下である前記ポリカチオンを含み、カルシウムイオンまたはバリウムイオンを０．１ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下の濃度で含む、前記コート液。
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