KR102211806B1

KR102211806B1 - 조직 재생용 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 3d 프린팅용 바이오잉크 소재

Info

Publication number: KR102211806B1
Application number: KR1020180090586A
Authority: KR
Inventors: 양희석; 이민석; 전진
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2021-02-03
Also published as: KR20200017606A

Abstract

본 발명은 물리적으로 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌이 코팅된 것을 특징으로 하는 조직 재생용 지지체와 이의 제조방법, 및 상기 조직 재생용 지지체를 이용한 3D 프린팅용 바이오잉크 소재에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조직 재생용 지지체는 카세인에 포함된 아미노산 서열 (β-casochemotide-1)에 의하여 골 손상부위로 대식세포의 유입과 대식세포에 의한 중간엽줄기세포의 골 분화와, 카세인의 카세인 포스포펩타이드(CPP)에 의해 칼슘을 비롯한 미네랄 이온의 흡착을 향상시킬 수 있으며, 골 손상부위 및 주변부로부터 잔재할 수 있는 재생관련 물질들을 DOPA에 의해 고정화시킴으로써 골 조직의 재생 효과를 극대화할 수 있는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 조직 재생용 지지체는 3D 프린팅용 바이오잉크 소재로 이용되어 조직의 결손이 일어난 환부와 정확히 일치하는 모양의 환부 맞춤형 지지체 제작이 가능하다.

Description

조직 재생용 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 3D 프린팅용 바이오잉크 소재{Support for tissue regeneration, method for thereof, and bioink material for 3D printing using the same}

본 발명은 조직 재생용 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 3D 프린팅용 소재에 관한 것으로서, 상세하게는 카세인 단백질과 도파 물질의 코팅을 통하여 조직의 재생 효과를 극대화할 수 있는 조직재생용 지지체와 이의 제조방법, 및 이를 이용한 3D 프린팅용 바이오잉크 소재에 관한 것이다.

골 결손부위를 재생시키기 위해 천연 단백질 또는 생분해성 고분자로 이루어진 골 재생용 지지체를 이식시킨다.

그러나, 천연 단백질의 경우 숙주 세포의 부착율은 뛰어나나, 조직의 특성을 반영하지 못한 물성과 분해능으로 인해 조직 재생의 효과가 미미하다는 단점이 있다.

또한, 생분해성 고분자는 이식부위에 염증반응을 비롯한 특별한 부작용을 유도하지 않으나, 고분자의 특유의 소수성으로 인해 숙주세포가 자리잡을 수 있는 도메인이 부족하여 낮은 세포 부착율을 보이며 세포의 분화를 유도할 수 기능성을 내포하고 있지 않아 재생효과가 낮은 단점이 있다.

한편, 우유 유래 단백질인 카세인(Casein)이 마이셀 (micelle) 구조를 형성할 수 있는 특징을 이용하여 다른 단백질 및 고분자를 접목시켜 마이크로(micro) 또는 나노입자(nanoparticle)로 제조해 약물을 전달하기 위한 전달 캐리어(delivery carrier)로써 일부 식품의 비타민 및 영양소를 전달하기 위한 연구가 보고된 바 있다. (비특허문헌 1 참조)

그러나, 산업적 용도로 카세인을 이용한 사례가 있으나, 특정 조직을 재생하기 위한 약물 전달체로서의 기능을 하는 연구는 아직까지 보고된 바가 없다.

일부 연구에서 카세인을 이용한 필름 형태의 지지체를 합성하여 중간엽줄기세포의 골 분화 정도를 측정했으나(비특허문헌 2 참조), 실제 동물실험에서 카세인을 이용한 지지체를 제작하여 골 결손 부위에서 재생을 유도한 실험은 아직 전무하다.

또한, 한국공개특허 2009-0020744에서는 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) 균주에 의한 우유 발효물을 유효 성분으로 포함하는 골 대사 개선용 조성물을 제시하였다.

한국공개특허 2009-0020744

Casein-based formulations as promising controlled release drug delivery systems. J contrl Release. 2011 Aug 10;153(3):206-216, Elzoghby AO, El-Fotoh WS, Elgindy NA. Enhancing proliferation and osteogenic differentiation of HMSCs on casein/chitosan multilayer films. Colloids Surf B Biointerfaces. 2016 May 1;141:397-407, Li Y, Zheng Z, Cao Z, Zhuang L, Xu Y, Liu X, Xu Y, Gong Y.

이에 본 발명에서는 우유 유래 단백질인 카세인을 이용하여 실제 다양한 조직의 재생을 위한 지지체로서의 가능성을 확인하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 이러한 조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공하는 데도 있다.

추가로 본 발명은 상기 조직 재생용 지지체를 이용하여 다양한 3D 프린팅용 바이오잉크 소재를 제공하는 데도 그 목적이 있다.

상기 목적을 해결하기 위한 본 발명의 조직 재생용 지지체는 물리적으로 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, 이하 ‘DOPA’라 함)이 코팅된 것을 그 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 물리적 가교는 동결-해동의 과정을 반복 수행하여 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조직 재생용 지지체는 그 표면과 단면에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 긴 체인 형태의 구조체가 적층되어 있는 구조를 가지는 데 특징이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조직 재생용 지지체는 스캐폴드(scaffold) 형태인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 조직 재생용 지지체는 상기 카세인에 포함된 아미노산 서열인 β-casochemotide-1에 의하여 조직 손상 부위로 대식세포(Macrophage)의 유입, 대식세포에 의한 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell)의 유입 및 분화, 및 카세인의 카세인 포스포펩타이드(casein phosphopeptide, 이하 ‘CPP’라 함)에 의한 미네랄 이온의 흡착으로 손상된 조직을 재생시키는 데 특징이 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조직 재생용 지지체는 상기 3,4-디하이드록시페닐알라닌은 조직 손상부위 및 주변부로부터 잔재할 수 있는 재생관련 물질들을 고정화시키는 데 특징이 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조직 재생용 지지체는 이식 후 호스트 유래 세포를 결손 부위로의 유입을 촉진시킴으로, 별다른 세포이식이나 약물 사용 없이 조직의 재생을 유도하는 것을 특징으로 한다.

상기 조직은 손상된 조직의 조직회복에 있어서 대식세포 (Macrophage)가 관여할 수 있는 골, 연골, 피부, 골격근, 근조직, 심근조직, 심장근육, 신생 혈관을 포함하는 조직들 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 조직 재생용 지지체의 제조방법은 카세인 용액과 PVA 수용액을 준비하는 제1단계, 상기 카세인 용액과 PVA 수용액을 혼합하고 물리적 가교시켜 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 제조하는 제2단계, 상기 물리적 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌을 코팅시키는 제3단계, 및 상기 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 동결건조시켜 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드를 제조하는 제4단계를 거치는 것을 특징으로 한다.

상기 카세인 용액은 NaOH를 용매로 사용하여 5~20wt%의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 PVA 용액은 1~20 wt%의 수용액인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 특징을 가지는 조직 재생용 지지체를 이용한 3D 프린팅용 바이오 잉크 소재를 제공하는 데도 있다.

본 발명에 따르면, 우유에서 추출된 카세인 단백질과 물리적 가교된 하이드로겔에 홍합 접착 단백질인 3,4-디하이드록시페닐알라닌을 코팅시킨 조직 재생용 지지체를 제조하였다.

본 발명에 따른 조직 재생용 지지체는 카세인에 포함된 아미노산 서열 (β-casochemotide-1)에 의하여 골 손상부위로 대식세포의 유입과 대식세포에 의한 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell)의 유입, 골 분화와 카세인의 카세인 포스포펩타이드에 의해 칼슘을 비롯한 미네랄 이온의 흡착을 향상시킬 수 있다.

또한, 골 손상부위 및 주변부로부터 유입될 수 있는 골세포 (Osteocytes), 골아세포 (Osteoblasts), 골전구세포 (osteoprogenitor cell) 등과 골 손상 후 잔재할 수 있는 재생관련 물질들을 DOPA에 의해 고정화시킴으로써 골 조직의 재생 효과를 극대화할 수 있는 효과를 가진다.

따라서, 본 발명에 따른 조직재생용 지지체는 이식 후 호스트 유래의 세포(숙주 세포, host cell)를 결손 부위로의 유입을 촉진시킴으로, 별다른 세포이식이 필요하지 않고, 약물 사용 없이 빠른 조직의 재생을 유도할 수 있어 높은 비용 절감효과를 기대할 수 있다.

또한 이러한 조직재생용 지지체는 3D 프린팅용 바이오 잉크 소재로 이용되어, 3D 프린터를 이용해 조직의 결손이 일어난 환부와 정확히 일치하는 모양의 지지체 제작을 통해 기존 지지체보다 빠른 환부와의 결합을 유도하면서 Casein-DOPA의 시너지 효과에 의해 주변 조직 세포의 부착, 증식 및 분화가 향상되어 보다 빠른 조직 재생효과를 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 조직 재생용 지지체인 DOPA가 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 2는 실시예 1과 비교예 1에 따른 지지체의 미세구조를 주사전자현미경(SEM)으로 확인한 결과이고,
도 3과 4는 실시예 1과 비교예 1에 따른 지지체의 수화(hydration) 전, 후의 인장강도를 시험 결과이며,
도 5는 실시예 1과 비교예 1에 따른 지지체의 In vitro 분해 실험 결과이고,
도 6은 실시예 1에 따른 Casein-DOPA 지지체에서 Na 이온의 잔류 유무를 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)를 이용하여 확인한 결과이고,
도 7은 카세인 지지체의 세포 독성 실험 결과이고,
도 8은 실시예 1과 비교예 1의 지지체를 마우스 골 결손 부위에 이식한 후 마우스 골 결손 모델 실험 결과이고,
도 9와 10은 실시예 1과 비교예 1의 지지체를 마우스 골 결손 부위에 이식한 후 회수한 두개골에 대한 조직학 분석 결과이고,
도 11은 실시예 1과 비교예 1의 지지체를 마우스 골 결손 부위에 이식한 후 회수한 두개골에 대한 면역 조직학 분석 결과이고,
도 12와 13은 Negative control(No treatment), 비교예 1, 및 실시예 1에 따른 지지체의 Live micro-CT 촬영, 분석 프로그램을 통해 확인한 마우스 골 재생 실험 결과이고,
도 14와 15는 비교예 1, 및 실시예 1에 따른 지지체를 마우스 골 결손모델에 처리한 후, 이를 두개골로부터 회수하여 마우스 뒷다리에 다시 이식한 후 Live micro-CT로 마우스 이소성 골 형성 분석을 수행한 결과이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 발명은 조직 재생용 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 3D 프린팅용 바이오잉크 소재로 사용하는 데 관한 것이다.

본 발명에 따른 조직 재생용 지지체는 물리적으로 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 홍합 유래 접착 단백질인 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 코팅시킨 것을 특징으로 한다.

카세인은 우유에서 유래된 천연 단백질로써, 카세인에 포함된 다양한 펩타이드들이 생체 내에서 유익한 반응을 이끌어 낼 수 있다는 잠재성이 보고된 바 있다.

그 중에서 β-casochemotide-1(아미노산 서열 YPVEP)은 면역 반응을 증진시켜 중간엽 세포의 분화를 유도할 수 있는 대식세포를 조직 손상 부위로 유입, 대식세포에 의한 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell)의 유입 및 분화시키며, 및 카세인의 카세인 포스포펩타이드(CPP)는 미네랄 이온의 흡착을 향상시켜 손상된 조직을 재생시키는 역할을 하는 데 특징이 있다.

본 발명에서는 카세인의 이러한 특징을 이용하여 조직 재생용 지지체의 천연 단백질로 이용하였다.

그러나 카세인은 천연 단백질의 한 종류로써 낮은 분해능을 가지고 있는 바, 본 발명에서는 생체적합성 고분자인 폴리비닐알콜(Polyvinyl alcohol, PVA)을 상기 카세인과 물리적으로 가교시켜 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔 형태로 사용하여 약한 물성을 보완하였다.

폴리비닐알콜은 대표적인 생체적합성 친수성 고분자로서 유기 용매를 이용한 화학적 가교는 인체에 유해하기 때문에 동결-해동 과정을 반복하여 물리적 가교를 시키는 것이 바람직하다.

상기 물리적 가교 방법은 공지된 온도 조건에서 동결과 해동의 과정을 적절히 반복하여 소정의 하이드로겔 지지체를 제조할 수 있으며, 구체적으로는 -20℃ 내지 -80℃에서 동결, 4℃ ~ 25℃에서 해동시키는 동결-해동 주기를 3회 내지 10회 반복하는 것이 바람직하다.

상기 폴리비닐알콜 고분자 수용액의 농도는 1~20중량%인 것이 조직 재생용 하이드로겔 지지체의 안정한 구조 획득 측면에서 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 조직 재생용 지지체는 카세인에 일부 소수성 도메인이 존재하기 때문에 상기 물리적 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 홍합 유래 접착 단백질인 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA)로 코팅시키는 것이 바람직하다.

상기 DOPA의 코팅을 통하여 본 발명에 따른 조직 재생용 지지체를 조직의 결손부위에 이식 시, 카세인에 부족한 친수성을 부여하여 숙주 세포의 부착을 용이하게 하고, 결손 주변부의 재생에 유익한 물질을 고정화하여 숙주 골세포의 부착, 분화 그리고 증식을 향상시키는 효과를 부여할 수 있다.

또한, 상기 3,4-디하이드록시페닐알라닌은 조직 손상부위 및 주변부로부터 잔재할 수 있는 재생관련 물질들을 고정화시키는 데 특징이 있다.

본 발명에 따른 조직 재생용 지지체인 DOPA가 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔은 동결 건조시켜 스캐폴드(scaffold) 형태의 지지체를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 DOPA가 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드 지지체는 그 표면 및 단면에 걸쳐 다공성 구조를 이루고 있으며, 이로 인해 인체 삽입 후 다양한 세포의 유입을 용이하게 할 수 있는 특징을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 DOPA가 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드 지지체는 긴 체인 형태의 구조체가 적층된 층상형 구조를 이루고 있다.

이러한 구조적 특징은 물리적 가교 과정인 동결-해동 주기 중 형성될 수 있는 카세인과 PVA 사이의 수소결합 (hydrogen bond), 카세인과 PVA에 의한 중합체 내 얼음 결정(Crystallites)의 형성, 및 온도 저하에 의해 발생되는 전하를 띄는 다중 이온(charged poly ion)과 프로틴-염 마크로이온의 반데르발스 및 정전기적 인력으로 인해 발생된 응집으로 액체-액체 간 상분리(Liquid-Liquid phase separation) 현상에 의해 긴 체인 형태의 겔 구조체가 적층되어 형성된 것으로 볼 수 있다.

다음 도 1은 본 발명에 따른 조직 재생용 지지체인 DOPA가 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드의 제조과정을 나타낸 것으로, 이를 이용하여 구체 제조방법을 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 조직 재생용 지지체의 제조방법은 카세인 용액과 PVA 수용액을 준비하는 제1단계, 상기 카세인 용액과 PVA 수용액을 혼합하여 물리적 가교시켜 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 제조하는 제2단계, 상기 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 DOPA를 코팅시키는 제3단계, 및 상기 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 동결건조시켜 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드를 제조하는 제4단계를 거친다.

상기 제1단계에서는 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔의 제조를 위하여 각각의 카세인 용액과 PVA 수용액을 제조한다.

상기 카세인 용액은 1N NaOH를 용매로 사용하여 5~20wt%의 농도로 제조하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 카세인 용액의 농도가 5중량% 미만인 경우에는 카세인이 가진 효과를 충분히 발휘할 수 없고, 20중량%를 초과하는 경우에는 함량 초과에 따른 추가 효과가 없기 때문에 바람직하지 못하다. 본 발명에서는 카세인 용액의 용매로서 NaOH를 사용하고 있어, 차후 제조된 지지체를 체내 이식 시 잔존 Na에 의해 숙주 세포에 영향을 미칠 수 있는 우려가 있으나, XPS 촬영을 통한 실험 결과 Na 이온은 잔류하지 않는 것으로 확인하였다.

또한, 상기 PVA 용액은 증류수를 용매로 사용하여 1~20 wt%의 수용액으로 제조하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 PVA 수용액의 농도가 1중량% 미만인 경우 PVA 첨가에 따른 효과가 없고, 20중량%를 초과하는 경우 점도가 너무 높아 핸들링이 어렵기 때문에 바람직하지 못하다.

제2단계는 상기 제조된 카세인 용액과 PVA 수용액을 혼합하여 교반시킨 다음, 혼합된 두 용액을 일정한 용기에 옮긴 후 동결-해동의 과정(freeze-thaw cycle)을 반복하여 물리적으로 가교시켜 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 제조한다. 구체적으로는 -20℃ 내지 -80℃에서 동결, 4℃ ~ 25℃에서 해동시키는 동결-해동 주기를 3회 내지 10회 반복하는 것이 바람직하다.

다음 도 1을 참조하면, 혼합된 두 용액은 고르게 분산되어 있다가 동결(freezing) 과정을 거치게 되면 낮은 온도로 인해 얼음 결정들이 생성된다. 또한, 해동(thawing) 과정을 거치게 되면 얼음 결정들이 녹으면서 미세 결정들(crystallites)이 생성됨과 동시에, 폴리비닐알콜이 물리적으로 가교되게 된다.

제3단계는 상기 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 DOPA 용액에 침지시켜 DOPA를 코팅시킨다. 이 경우, 다음 도 1에서와 같이, 물리적 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 DOPA가 고르게 코팅되도록 한다.

상기 DOPA 용액은 Tris 완충용액 (10 mM, pH 8.5)에 0.2% (w/v)의 농도로 제조하며, 상기 물리적 가교된 카세인-PVA 하이드로겔을 DOPA 용액에 10~20시간 동안 담지해 궤도형 쉐이커 (Orbital Shacker)에서 코팅시키는 것이 바람직하다. DOPA 코팅 두께는 DOPA 용액에 담지하는 시간을 조절하여 소정의 목적에 부합되도록 조절할 수 있음은 물론이다.

마지막 제4단계에서는 동결 건조시켜 용매를 증발시켜 스캐폴드 형태의 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 지지체를 제조할 수 있게 된다.

본 발명에 따른 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 조직 재생용 지지체는 손상된 다양한 조직에 이식시키는 경우, 호스트 유래의 세포를 결손 부위로의 유입을 촉진시킴으로써 별다른 세포 이식이 필요치 않다.

뿐만 아니라, 종래와 같이 조직 재생을 위하여 별도의 약물을 주입시켜야 했던 것과는 달리, 약물의 사용 없이도 조직의 재생을 효과적으로 유도할 수 있으며, 이로 인해 높은 비용 절감효과를 기대할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 조직 재생용 지지체는 3D 프린팅용 바이오 잉크 소재로 이용되어, 3D 프린터를 이용해 조직의 결손이 일어난 환부와 정확히 일치하는 모양의 지지체 제작을 통해 기존 지지체보다 빠른 환부와의 결합을 유도하면서 Casein-DOPA의 시너지 효과에 의해 주변 조직 세포의 부착, 증식 및 분화가 향상되어 보다 빠른 조직 재생효과를 기대할 수 있다.

본 발명에서는 상기 동결 건조 시키기 전 단계의 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 지지체를 3D 프린팅용 바이오 잉크 소재로 사용하여 다양한 형태의 지지체로 제조할 수 있으며, 이는 조직의 재생을 위한 다양한 지지체로 이용할 수도 있음은 물론이다.

본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 사용된 ‘조직 재생용 지지체’에서 ‘조직’이란 손상된 조직의 조직회복에 있어서 대식세포 (Macrophage)가 관여할 수 있는 골, 연골, 피부, 골격근, 근조직, 심근조직, 심장근육, 신생 혈관을 포함하는 조직들 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 의미이다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예 1 : DOPA 코팅된 카세인 - 폴리비닐알콜 지지체의 제조

12.5 mL의 1N NaOH를 용매로 사용하여 1.0 g의 카세인을 용해시켜 8% (w/v)의 카세인 용액을 제조하였다.

12.5 mL의 증류수를 용매로 사용하여 0.5 g의 PVA를 130 ℃로 가열하여 용해시켜 4% (w/v)의 농도의 PVA 수용액을 제조하였다.

상기 카세인 NaOH 용액과 PVA 수용액을 서로 섞어 균일하게 교반시켰다. 교반된 Casein-PVA 혼합 용액은 페트리 디쉬에 옮겨 동결-해동 주기를 가교 조건으로 -80℃에서 1시간 동결, 상온(18℃)에서 1시간 동안 해동의 과정(Freeze-Thaw cycle)을 3회 진행하여 물리적 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 제조하였다.

상기 물리적 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 Tris 완충용액 (10 mM, pH 8.5)에 0.2% (w/v)의 농도의 DOPA 용액에 16시간 동안 침지시켜 DOPA를 코팅시켰다.

DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜을 동결 건조시켜 DOPA 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드(이하 ‘Casein-DOPA 지지체’라 함)를 제조하였다.

비교예 1 : DOPA 코팅되지 않은 카세인 - 폴리비닐알콜 지지체의 제조

상기 실시예 1에서, DOPA 코팅 과정을 거치지 않고 물리적 가교된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 동결 건조시켜 카세인-폴리비닐알콜 스캐폴드(이하 ‘casein 지지체’라 함)를 제조하여 본 발명과 비교하였다.

실험예 1 : 지지체의 미세구조 확인

상기 실시예 1과 비교예 1에 따른 지지체의 미세구조를 주사전자현미경(SEM)으로 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 2에 나타내었다.

다음 도 2를 참조하면, 실시예 1과 비교예 1의 두 지지체 모두 층상형 구조를 이루고 있음을 확인하였고, 표면 및 단면의 사진으로부터 지지체 전반에 걸쳐 다공성 구조를 이루고 있으며, 긴 체인 형태의 구조체가 적층되어 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 동결 주기 중 카세인과 PVA에 의한 중합체 내에 형성된 얼음 결정들이 해동 과정에서 녹아 없어지면서 큰 공극을 형성하게 되어 표면과 단면에 전반적으로 다공성 구조를 이루는 것으로 확인된다.

실험예 2 : 지지체의 인장 강도 시험

상기 실시예 1과 비교예 1에 따른 지지체의 물성 확인을 위하여 수화(hydration)시키기 전, 후로 나누어 인장강도를 시험하였으며, 그 결과를 다음 도 3과 4에 나타내었다.

다음 도 3과 4를 참조하면, 수화시키기 전에는 실시예 1과 비교예 1의 두 지지체 모두 매우 약한 인장력을 보여주었으나, 수화시킨 후 재료가 팽윤되면서 인장강도 측정 전 길이를 충분히 상회하는 인장력을 두 그룹 모두 보유하고 있음을 확인하였다.

실험예 3 : In vitro 분해 실험

골 조직 특성상 결손 부위의 재생에 긴 시간이 소요되기 때문에, 빠른 시간 안에 분해되는 천연 단백질로 구성된 지지체의 단점이 보완되었는지 확인하기 위해 비교예 1의 Casein 지지체, 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체의 In vitro 분해 실험을 진행하였다. 분해 실험은 인산완충생리식염수 (phosphate buffer saline), 0.1M 농도의 NaOH 용액 그리고 0.25% 농도의 Trypsin-EDTA 용액을 사용하여 1, 2, 4, 8주 동안의 무게 변화를 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 5에 나타내었다.

다음 도 5를 참조하면, 비교예 1의 Casein 지지체, 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체 모두 빠른 분해 양상을 보여주지 않았으며, 두 지지체 모두 지지체로써의 역할을 충분히 할 수 있음이 확인 되었다.

실험예 4 : X- ray photoelectron spectroscopy ( XPS )를 이용한 표면 분석

본 발명 실시예 1에 따른 Casein-DOPA 지지체 제조시, 카세인의 경우 용매로서 NaOH에 용해시켰기 때문에, 이식 시 잔존 Na에 의해 숙주 세포에 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려하여, XPS를 촬영하여 Na 이온의 잔류 유무를 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 6에 나타내었다.

다음 도 6을 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체 내에서 Na은 검출되지 않았음을 확인하였다.

실험예 5 : 세포 독성 실험

카세인과 생체적합성 고분자인 PVA로 이루어진 지지체가 세포독성을 유발할 수 있는지 확인하기 위해 섬유아세포를 카세인 지지체에 5일 동안 배양 후 Live & Dead assay를 진행하였으며, 그 결과를 다음 도 7에 나타내었다.

다음 도 7을 참조하면, 세포가 잘 부착되면서 독성을 유발하지 않는다는 것을 확인하였다.

실험예 6 : 마우스 골 결손 모델 진행

실제로 상기 두 지지체(비교예 1의 Casein 지지체, 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체)가 결손 부위에서 골 재생을 유도해 낼 수 있는지 확인하기 위해 마우스 골 결손 모델을 통해 확인하였다. 상기 두 지지체를 마우스 골 결손 부위에 이식하고 8주 후 마우스 두개골을 회수하여 micro-CT 촬영하고, 분석 프로그램을 통한 그 결과를 다음 도 8에 나타내었다.

다음 도 8을 참조하면, 비교예 1의 카세인 지지체와 비교했을 때, 본 발명 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체에 의해 결손 부위 전 면적이 신생 골로 덮여져 있었으며, 결손 부위에 대한 Bone volume과 Bone mineral density가 유의하게 높은 수치를 보임을 확인할 수 있었다.

실험예 7 : 조직학 분석

상기 실험예 6에서 회수한 각각의 마우스 두개골에 대한 조직학 분석을 진행하였고 그 결과를 다음 도 9와 10에 나타내었다.

다음 도 9와 10을 참조하면, Fast green/sirius red 염색에서 비교예 1의 카세인 지지체의 경우 섬유아 조직만 형성된 반면, 본 발명 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체는 지지체를 따라 신생골이 잘 형성되어 있음을 확인하였고, 골 결손부위에 대한 뼈 형성 영역, 골 밀도 부분에서 비교예 1인 카세인 지지체와 비교했을 때, 유의하게 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

실험예 8 : 면역 조직학 분석

카세인이 보유하고 있는 면역조절 펩타이드에 의해 숙주 면역세포의 신생혈관 형성 관련 성장인자 방출로 인해 숙주혈관의 결손부위로의 유입 향상과 카세인 인산펩타이드 (Casein phosphopeptide)에 의해 결손부위의 미네랄 침착 촉진에 대한 정성적 검증을 위해 혈관마커인 CD31과 골 재생 마커인 Osteopontin (OPN)을 염색하여, 상기 실험예 6에서 회수한 각각의 마우스 두개골에 대한 면역 조직학 분석을 진행하였고 그 결과를 다음 도 11에 나타내었다.

다음 도 11을 참조하면, 본 발명 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체에서 혈관마커인 CD31과 골 재생 마커인 OPN이 비교예 1의 Casein 지지체와 비교했을 때, 골 결손 부위에서 더 강하게 발현됨을 확인하였다.

실험예 9 : 마우스 골 결손 모델 실험

본 실험에서는 Casein이 가지고 있는 생활성 펩타이드인 β-casochemotide-1, CPP와 DOPA에 의한 시너지 효과에 의해서 골 결손 부위에서 더 빠른 골 재생 치료효과를 유도할 수 있는지에 대해 검증하기 위해 time point를 세분화하여 분석하였다. 아무것도 처리하지 않은 것(No treatment)을 Negative control로 하여 각 time point(2주, 4주, 8주) 별로 비교예 1과 실시예 1에 따른 지지체의 Live micro-CT 촬영, 분석 프로그램을 통해 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 12와 13에 나타내었다.

다음 도 12와 13을 참조하면, 본 발명 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체의 경우 2주차부터 미량의 미네랄이 침착되는 것을 시작으로 4주차부터 골 결손부위 대부분이 재생된 것을 확인할 수 있었으며, 8주차에서는 4주차보다 더 높은 골밀도를 보임을 확인하였다.(노란색 부분이 신생골임)

이에 비해, 비교예 1에 따른 Casein 지지체의 경우 4, 8주차에서 골 결손부위 면적 대비 작은 부분의 신생골이 형성되었으나, Negative control 그룹과 비교하였을 때, 유의한 차이를 보이지 않았다.

이러한 결과로부터 본 발명에 따라 제조된 Casein-DOPA 지지체가 Casein이 가지고 있는 생활성 펩타이드인 β-casochemotide-1, CPP와 DOPA에 의한 시너지 효과에 의해서 골 결손 부위에서 더 빠른 골 재생 치료효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.

실험예 10 : 마우스 이소성 골 형성 분석

본 실험에서는 Casein이 가지고 있는 생활성 펩타이드인 β-casochemotide-1, CPP와 DOPA에 의한 시너지 효과로 Casein-DOPA 지지체로 숙주세포(Host cell)의 유입의 촉진과 그로 인한 골 분화의 향상이 실제로 일어나는지 확인하기 위해 마우스 골 결손모델에 비교예 1의 Casein 지지체 및 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체를 그룹별로 1주, 2주 처리하고 재료를 두개골로부터 회수하여 마우스 뒷다리에 다시 이식하여 이식부위에 미네랄이 침착하는지, time point를 2, 4주로 나누어 Live micro-CT로 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 14와 15에 나타내었다.

다음 도 14와 15를 참조하면, 2주후 Casein 지지체(비교예 1)의 경우 1주, 2주 동안 처리한 것과 상관없이 미네랄 침착을 유도하지 못하였으나, 본 발명 실시예 1에 따른 Casein-DOPA 지지체의 경우, 2주 동안 처리하였을 때, 1주 동안 처리하였을 때 보다 더 높은 Bone volume(BV)과 Bone mineral density(BMD)가 나타남을 확인하였다.

이는 앞서 언급했던 본 발명 실시예 1의 Casein-DOPA 지지체가 내포하고 있는 β-casochemotide-1, CPP와 DOPA에 의한 시너지 효과에 의해 골 재생이 유도된 것으로 충분히 증명할 수 있음을 알 수 있다.

Claims

폴리비닐알콜(PVA)을 가열하여 물에 용해시킨 폴리비닐알콜 수용액과 카세인(casein)을 용해시킨 카세인 NaOH 용액을 각각 제조하고, 이들을 혼합하여 물리적 가교시킨 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌이 코팅된 조직 재생용 지지체로서,
상기 물리적 가교시킨 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌이 코팅된 조직 재생용 지지체는 그 표면과 내부 전반에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 긴 체인 형태의 구조체가 적층된 스캐폴드 형태를 가지며,
상기 카세인의 용매로 사용된 NaOH의 Na 이온이 잔류되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 물리적 가교시킨 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌이 코팅된 조직 재생용 지지체.
제1항에 있어서,
상기 물리적 가교는 -20℃ 내지 -80℃에서 동결, 4℃ ~ 25℃에서 해동시키는 동결-해동 주기를 3회 내지 10회 반복하여 이루어지는 것인 조직 재생용 지지체.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 조직 재생용 지지체는 상기 카세인에 포함된 아미노산 서열인 β-casochemotide-1 (아미노산 서열 YPVEP)에 의하여 조직 손상 부위로 대식세포(Macrophage)의 유입, 대식세포에 의한 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell)의 유입, 분화, 및 카세인의 카세인 포스포펩타이드에 의한 미네랄 이온의 흡착으로 손상된 조직을 재생시키는 것인 조직 재생용 지지체.
제1항에 있어서,
상기 3,4-디하이드록시페닐알라닌은 조직 손상부위 및 주변부로부터 잔재할 수 있는 세포와 재생관련 물질들을 고정화시키는 것인 조직 재생용 지지체.
제1항에 있어서,
상기 조직 재생용 지지체는 이식 후 호스트 유래 세포를 결손 부위로의 유입을 촉진시킴으로, 별다른 세포이식이나 약물 사용없이 조직의 재생을 유도하는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 지지체.
제1항에 있어서,
상기 조직은 손상된 조직의 조직회복에 있어서 대식세포 (Macrophage)가 관여할 수 있는 골, 연골, 피부, 골격근, 근조직, 심근조직, 심장근육, 신생 혈관을 포함하는 조직들 중에서 선택되는 1종 이상인 것인 조직 재생용 지지체.
카세인(casein)을 용해시킨 카세인 NaOH 용액과 폴리비닐알콜(PVA)을 가열하여 물에 용해시킨 폴리비닐알콜 수용액을 각각 제조하는 제1단계,
상기 카세인 NaOH 용액과 폴리비닐알콜 수용액을 혼합하고 물리적 가교시켜 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 제조하는 제2단계,
상기 물리적 가교시킨 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA) 용액에 10~20시간 동안 담지해 상기 물리적 가교시킨 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에서 카세인에 존재하는 소수성 도메인을 코팅시켜 친수성을 부여하도록 코팅시키는 제3단계, 및
상기 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA) 코팅된 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔을 동결건조시키는 제4단계를 거쳐 그 표면과 내부 전반에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 긴 체인 형태의 구조체가 적층된 형태의 물리적 가교시킨 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌이 코팅된 조직 재생용 지지체의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 카세인 NaOH 용액은 5~20중량%의 농도인 것인 조직 재생용 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 폴리비닐알콜 수용액은 1~20중량%의 농도인 것인 조직 재생용 지지체의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 물리적 가교는 -20℃ 내지 -80℃에서 동결, 4℃ ~ 25℃에서 해동시키는 동결-해동 주기를 3회 내지 10회 반복하는 것인 조직 재생용 지지체의 제조방법.
제1항에 따른 물리적 가교시킨 카세인-폴리비닐알콜 하이드로겔에 3,4-디하이드록시페닐알라닌이 코팅된 조직 재생용 지지체를 이용한 3D 프린팅용 바이오잉크 소재.