Patents

Search tools Text Classification Chemistry Measure Numbers Full documents Title Abstract Claims All Any Exact Not Add AND condition These CPCs and their children These exact CPCs Add AND condition
Exact Exact Batch Similar Substructure Substructure (SMARTS) Full documents Claims only Add AND condition
Add AND condition
Application Numbers Publication Numbers Either Add AND condition

Deriváty na bázi kyseliny hyaluronové schopné tvorit hydrogely, zpusob jejich prípravy, hydrogely na bázi techto derivátu, zpusob jejich prípravy a pouzití

Abstract

Resení se týká derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce (I), kde Ar je fenyl a R.sub.1.n.je ethylen, nebo Ar je indol a R.sub.1.n.je ethylen, nebo Ar je indol a R.sub.1.n.je karboxyethylen, a kde R.sub.2.n.je alkyl o poctu uhlíku 3 az 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500. Dále je popsán zpusob jeho prípravy, hydrogel na bázi tohoto derivátu, zpusob prípravy hydrogelu a pouzití hydrogelu ve tkánovém inzenýrství, kosmetice, medicíne nebo regenerativní medicíne, zejména ve forme scaffoldu pro lécbu defektu kloubní chrupavky nebo kostních tkání.

Classifications

A61L27/20 Polysaccharides
View 15 more classifications

Landscapes

Show more

CZ2012136A3

Czechia

Other languages
English
Inventor
Wolfová@Lucie
Pravda@Martin
Foglarová@Marcela
Nemcová@Miroslava
Niedoba@Krzysztof
Velebný@Vladimír

Worldwide applications
2012 CZ 2013 KR PL HU EP US BR RU DK WO ES JP

Application CZ20120136A events
Show all events

Description

Deriváty na bázi kyseliny hyaluronové schopné tvořit hydrogely, způsob jejich přípravy, hydrogely na bázi těchto derivátu, způsob jejich přípravy a použití
Oblast techniky
Vynalez se týká nového derivátu hyaluronanu vhodného pro přípravu hydrogelů a způsobu jeho přípravy. Dále hydrogelů na bázi tohoto derivátu, jejich vlastností, využití a způsobu přípravy.
Dosavadní stav techniky
Hyaluronan je polysacharid, který se skládá z disacharidických jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a D-V-acetylglukosaminu vázaných alternujícími β-1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Hmotnostní průměr molekulové hmotnosti (pokud bude v dalším textu zmmovana molekulová hmotnost, bude se vždy jednat o hmotnostní průměr molekulové hmotnosti) in vivo bývá v rozsahu 3 kDa - 20 MDa. Jedná se o polysacharid, který je snadno rozpustný ve vodném prostředí, kde v závislosti na molekulové hmotnosti a koncentraci vytváří velmi viskózní roztoky.
Hydrogely jsou materiály, které jsou tvořeny ve vodě nerozpustnou sítí alespoň částečně hydrofilních polymerů *. Cest, kterými lze vytvořit nerozpustnou síť původně hydrofilního polymeru, je několik. Jedná se o hydrofobizaci polymeru 2 či využití ve vodě rozpustného derivátu polymeru nesoucího reaktivní funkční skupiny, které se mohou účastnit dalších chemických reakcí vedoucích ke vzniku trojrozměrné polymemí sítě 35.
Příprava rozpustných derivátů hyaluronanu a jejich následné zesítění bylo popsáno řadou autorů 36. Rovněž bylo v minulosti popsáno využití fenolického derivátu hyaluronanu pro síťovací reakce a přípravu hydrogelů. Calabro et. al. 478 popisují způsob přípravy fenolických derivátů hyaluronanu reakcí karboxylů, přítomných ve struktuře D-glukuronové kyseliny hyaluronanu, s aminoalkyl-deriváty fenolu. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronanu. Pro popsaný průběh syntézy je klíčová aktivace karboxylů hyaluronanu, ke které je v tomto případě využita reakce s dehydratačními činidly typu karbodiimidů (např. EDC). Jako aminoalkylfenol je nejčastěji využíván tyramin 6.
Obecně je zesítění fenolických derivátů hyaluronanu iniciováno přídavkem peroxidázy (napr. křenové peroxidázy - HRP) a zředěného roztoku peroxidu vodíku. Křenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.C. 1.11.1.7) je v současné době široce využívána jako katalyzátor organických a biotransformačních reakcí 913. Vyznačuje se velmi širokou substrátovou specifitou, a je proto schopna oxidovat řadu organických i anorganických sloučenin 13-15.
Jedná se o enzym obsahující jako prostetickou skupinu hem s obsahem železa. To se v neaktivovaném enzymu nachází v oxidačním stupni (III). Při reakci s peroxidy dochází ke vzniku intermediátu, který je označován jako HRP-I. Železo hernu Fe(1II) je oxidováno na oxyferrylovou skupinu (Fe(IV)=O) a na porfyrinovém kruhu zároveň dochází ke vzniku katonického π-radikálu. Takto aktivovaný enzym je schopen vytvářet komplexy s molekulami substrátu, který během této interakce podléhá oxidaci.'416-18
Přeměna oxidované formy enzymu zpět do jeho výchozí podoby probíhá ve dvou stupních. V první fázi dochází k reakci mezi molekulou substrátu (S) a HRP-I za vzniku radikálu substrátu (R·) a částečně redukované formy enzymu HRP-II. HRP-II si stále zachovává oxyferrylovou skupinu (Fe(1V)=O), ale již neobsahuje porfyrinový π-radikál. Během přechodu elektronu na porfyrinový radikál je zároveň proteinem přebrán jeden H+. HRP-II opět podstupuje reakci se substrátem za vzniku R·. Oxyferrylová skupina (Fe(IV)=O) je během této reakce redukována zpět na Fe(III). Tento proces je spojen s transferem 2 H+ na kyslík oxyferrylové skupiny. Jeden proton pochází ze substrátu (nebo solventu), druhý z proteinu. Výsledkem je vznik molekuly vody (Rovnice I a Schéma I).
ka
HRP + H2O2 ------ HRP-I + H2O
HRP-I + S ---HRP-II+ R.
k
HRP-II+ S ------ HRP + R-+H2O
2R· R-R
Rovnice I: Základní popis mechanismu katalýzy oxidace substrátu pomocí HRP
Vzniklé radikály substrátu jsou v řadě případů schopné vzájemně reagovat za vzniku dimerů R-R. Tento proces již není enzymaticky ovlivněn a souvisí se stabilitou a reaktivitou vzniklých radikálů. 14116-26
V případě enzymatické sít ovací reakce fenolického derivátu polysacharidu je tedy substrát (fenol - reaktivní ligand vázaný na polymer) přeměňován enzymem na reaktivní radikál. Tento radikál následně může reagovat s dalším fenolickým radikálem za vzniku dityraminu. Předpokládáme-li volnou pohyblivost molekul substrátu (ligandu) enzymatické reakce a průběh reakce přesně kopírující rovnici I, měl by enzym (je-li použito dostatečné množství peroxidu) postupně přeměnit všechny molekuly substrátu na reaktivní radikály a ty by, při dostatečně dlouhém reakčním čase, postupně všechny podlehly dimerizaci (popř. oligomerizaci). V případě vazby substrátu (ligandu) na polymer, by stupeň zesítění polymeru měl vždy dosáhnout stejné hodnoty, i když doba dosažení této hodnoty by se lišila, podle množství použitého enzymu. V praxi tomu tak však není. V literatuře 27 jsou podrobněji 5 popsány vztahy mezi očekávaným poměrem intramolekulárních a intermolekulámích zesítění a molekulovou hmotností polymerních segmentů mezi místy zesítění (hustotou zesítění, délkou mezi uzly sítě), přičemž intramolekulární interakce vedoucí k zesítění jsou, na rozdíl od intermolekulámích zesítění, uváděny jako elasticky neefektivní.
Dale je z literatury známo, že, v případě využití fenolických derivátů HA množství 10 enzymu ovlivňuje nejen rychlost síťovací reakce, ale výrazným způsobem ovlivňuje i výsledné mechanické vlastnosti hydrogelů46'7,28. Literatura uvádí, že reologickými měřeními bylo zjištěno, že modul pružnosti ve smyku (G') je vyšší, pokud je použita vyšší koncentrace enzymu. Autoři tento jev zdůvodňují vyšší hustotou zesítění hydrogelů. Pokud je nutno připravit maximálně tuhý hydrogel, musí síťovací reakce probíhat za relativně vysoké 15 koncentrace peroxidázy a tedy i rychleji. Příliš rychlý průběh reakce pak ale může vést ke vzniku nehomogenně zesítěného hydrogelů. Ve vzorcích se tak mohou vyskytnout místa, která nejsou zesítěna vůbec. Příliš rychlý průběh reakce může také působit problémy při umíst ování gelu do místa jeho finální aplikace apod.
Příčinou je malá vzdálenost reaktivního centra od základního řetězce polymeru. Malá 20 pohyblivost ligandu snižuje pravděpodobnost efektivní srážky radikálů ligandů za vzniku dityraminu. Proto, je-li v systému malá koncentrace enzymu, vznikne za časovou jednotku malé množství reaktivních forem ligandu. Síťovací reakce tedy jednak probíhá pomalu a jednak je málo efektivní.
Park et. al. se pokusil zvýšit reaktivitu ligandů vázaných na polymeru vložením 25 vhodného spaceru mezi reaktivní ligand a řetězec polymeru. Spis popisuje vložení hydrofilního řetězce mezi řetězec polysacharidu a fenolické či anilinové jádro za účelem zvýšení reaktivity těchto substituentů. Hlavním důvodem pro zavedení hydrofilního řetězce do struktury polymeru bylo zlepšení jeho rozpustnosti a zlepšení přístupnosti reaktivních center (fenolické či anilinové jádro). Snadnější prostorová přístupnost reakčních center 30 zvyšuje pravděpodobnost reakce mezi ligandy. Tento krok vede nejčastěji, při zachování stejné aktivity enzymu, k vyššímu stupni substituce, vyšší koncentraci a lepší homogenitě zesítění hydrogelů. Díky zavedení tohoto hydrofilního řetězce do struktury hydrogelů je navíc dle autora zvýšena jeho biostabilita a mechanické vlastnosti. Park et al. však jako „spacer“ ‘ 4 · ;
t i Í 4 It f J * á používají hydrofilni polymer PEG o molekulové hmotnosti 3500 Da, a proto se ve výsledku spíše jedná o kopolymer. Takovým zásahem do struktury hydrogelu, i při malém stupni substituce, vsak dochází k zásadním změnám fyzikálních vlastností původního polymeru. Navíc v případě hyaluronanu vede sice vyšší koncentrace zesítění ke zvýšení tvrdosti 5 hydrogelu, ale současně i ke zvýšení jeho křehkosti, což je pro zamýšlené použití ve tkáňovém inženýrství nežádoucí. U materiálu určeného pro scaffoldy, například, ale nejen, pro scaffoldy do kloubní chrupavky, se klade velký důraz na to, aby byl dostatečně pevný a odolný, pncemz materiál, který je křehký, se při větším zatížení ihned nevratně deformuje a v případě hydrogelů dochází i k jeho úplné destrukci.
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu tedy je nalézt takový materiál, který by byl dostatečně pevný a současně i houževnatý a u něhož by nedošlo k nijak zásadním změnám biologických a fyzikálních vlastností oproti původnímu polymeru. Pevnost hydrogelu na bázi hyaluronanu lze obecně zvýšit zvýšením koncentrace zesítění, a to například zvýšením koncentrace polymeru 15 v roztoku, z něhož se hydrogel tvoří, nebo zvýšením stupně substituce polymeru. Oba tyto způsoby však v dosavadním stavu techniky vedly v případě hyaluronanu i ke zvýšení křehkosti výsledného hydrogelu, což výrazně omezuje možnost použití hydrogelu.
Problém, který řeší tento vynález, spočívá v nalezení takových derivátů, které by vedly ke zvýšeni reaktivity hgandů a zvýšení tuhosti hydrogelů, při zachování fyzikálních a 20 biologických vlastností původního polymeru. Překvapivě bylo zjištěno, že zavedením poměrně krátkého spaceru (o molekulové hmotnosti přibližně 130 Da) podle vynálezu mezi reaktivní ligand a HA má za následek již při velmi nízkém stupni substituce výrazné zvýšení houževnatosti výsledného hydrogelu.
V jednom aspektu se tedy vynález týká derivátu HA nesoucího reaktivní ligandy vázané 25 prostřednictvím hydrofobních spacerů, s cílem zvýšit pohyblivost ligandů a zvýšit tak pravděpodobnost jejich efektivní srážky a to i v případě, kdy je jich v systému malá koncentrace (nízký stupeň substituce a malá aktivita enzymu). Bylo zjištěno, že i přes velice nízké hmotnostní zastoupení spaceru v hydrogelu, tvořící např. pouhá 0,01 - 0,02 %, dochází k výraznému navýšení houževnatosti a pevnosti tohoto hydrogelu oproti hydrogelu 30 z analogického HA derivátu bez vloženého spaceru (tzn. stejná koncentrace, molární hmotnost a stupeň substituce/zesítění). Vynález se tedy týká tohoto nového derivátu hyaluronanu vhodného pro přípravu hydrogelů a způsobu jeho přípravy. Dále se týká hydrogelů na bázi toho derivátu, jejich využití a postupu přípravy.
*
Hydrogel je připraven způsobem využívajícím zesítění řetězců modifikovaného hyaluronanu reakcí, která je katalýzo vána křenovou peroxidázou či jejími analogy. Vhodné deriváty hyaluronanu obsahují ve své struktuře fenolická či heteroarylfenolická jádra kovalentně vázaná k základnímu řetězci polysacharidu. Proces zesítění lze popsat jako kaskádu na sebe navazujících chemických reakcí, která začíná vznikem reaktivních forem kyslíku (ROS) v systému. Ty jsou ke směsi přidány nebo je jejich vznik umožněn přítomností chemických sloučenin, které slouží jako jejich „generátor“. ROS aktivují enzym peroxidázu, či její analoga, která následně katalyzují dimerizaci (popř. oligomerizaci) aromatických či heteroaromatických jader přítomných ve struktuře derivátu hyaluronanu. Tím dochází ke vzniku trojrozměrné polymemí sítě.
Dle tohoto vynálezu je k přípravě hydrogelů využíván hyaluronan modifikovaný navázáním ligandu obsahujícího aminoalkylfenol či aminoalkylheteroarylfenol (např. tyramin, 5-hydroxy-tryptofan, serotonin). Deriváty hyaluronanu popisované v tomto vynálezu obsahují ligand, který je navázán na polysacharid prostřednictvím spaceru. Přítomnost tohoto spaceru ve struktuře derivátu HA vede díky jeho flexibilitě k navýšení elasticity a volnosti možností konformacmch uspořádání zúčastněných segmentů polymeru a tím i možnosti disipace deformační energie. Zavedení spaceru také zvětšuje vzdálenost reaktivního aromatického centra (fenolu, heteroaryl fenolu) od základního řetězce polymeru, zlepšuje jeho přístupnost pro interakci s enzymem a zásadním způsobem ovlivňuje průběh síťovací reakce a vlastnosti vzniklého hydrogelů.
Ve svém prvním aspektu se vynález týká derivátu na bázi kyseliny hyaluronové podle obecného vzorce (I)
kde Ar je fenyl a R( je ethylen, nebo Ar je indol a R, je ethylen, nebo Ar je indol a R, je karboxyethylen, a kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500.
V dalším aspektu se vynález týká způsobu přípravy derivátu podle obecného vzorce (I), kde se nejprve připraví aldehydický derivát kyseliny hyaluronové podle vzorce (II),
kde aldehydický derivát se připraví s použitím oxidačního systému 4-acetamidoTEMPO/NaClO v protickém prostředí a má stupeň substituce 5 -15 % a molekulovou hmotnost v rozmezí 10000 g/mol až 2000000 g/mol, dále se zvlášť připraví sloučenina obecného vzorce (III)
(III) kde Ar je fenyl a R, je ethylen, nebo Ar je indol a R, je ethylen, nebo Ar je indol a Rj je karboxyethylen, a kde kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500, pnčemz sloučenina obecného vzorce (III) se připraví reakcí prekurzoru spaceru podle vzorce (IV)
Z-NH—R2—COOH (IV), kde Z je chránící skupina běžně používaná k ochraně primární aminoskupiny, s ligandem podle vzorce (V) (V), v aprotickém prostředí při teplotě v rozmezí 40 °C až 150 °C po dobu 1 až 24 hodin v přítomnosti činidla aktivujícího karboxylové funkční skupiny, za vzniku sloučeniny obecného vzorce (VI)
Z-NH—R2—CO-NH-Rj-Ar-OH (VI), ze které se sloučenina obecného vzorce (III) připraví odstraněním chránící skupiny Z.
a pak se aldehydický derivát kyseliny hyaluronové podle vzorce (II) nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce (III) při pH v rozmezí 3 až 8 při laboratorní teplotě po dobu 1 až 72 hodin v přítomnosti pikolin-boranového komplexu za vzniku derivátu podle vzorce (I).
Derivát podle vynálezu tedy obsahuje ligand, schopný podstupovat oligomerizaci působením vhodného činidla, a flexibilní spacer, který je vložen mezi řetězec hyaluronanu a • 7 ligand. Ligand dle obecného vzorce (V) podle vynálezu je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující tyramin, serotonin a 5-hydroxytryptofan. Sloučenina obecného vzorce (IV), tj. prekurzor spaceru, je s výhodou vybrána ze skupiny aminokyselin zahrnující deriváty ω-[(?βΓΖbutoxykarbonyl)amino]karboxylových kyselin, kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7.
Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu probíhá reakce prekurzoru spaceru s ligandem v prostředí THF nebo DMF při teplotě 50 °C po dobu 2 až 6 hodin v přítomnosti 1,1 '-karbodiimidazolu.
Dále je výhodné, když se odstranění chránicí skupiny Z provede prostřednictvím trifluoroctové nebo chlorovodíkové kyseliny.
Pro potřeby vynálezu jsou jako meziprodukt spacer-ligand označovány sloučeniny obecného vzorce:
HO-Ar-R1-NH-CO-R2-NH2
S výhodou je jako spacer použita sloučenina obecného vzorce:
-CO-R2-NH2
- kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7.
Způsob přípravy derivátu podle vynálezu může být charakterizován schématem 1 :
nh-r2 + H°-a/knh2
HO spacer ligand
1. Acylace
2. Odehraném'
spacer - ligand reduktivní aminace
Schéma L: Příklad možného způsobu přípravy derivátu HA-spacer-ligand dle vynálezu
Dále se vynález týká hydrogelu vzniklého zesítěním derivátu podle obecného vzorce (I) a způsobů jeho přípravy. Tento způsob přípravy hydrogelu spočívá v tom, že se na derivát podle obecného vzorce (I) působí generátorem reaktivních fenoxyradikálů, s výhodou 5 systémem křenová peroxidáza a zdroj hydroxylových radikálů, kterým může být roztok peroxidu vodíku ve vodě, nebo systémem oxidáza-kyslík-substrát, např. galaktózooxidázagalaktóza nebo glukózooxidaza-glukóza, při pH v rozmezí 4 až 10.
K ohgomenzaci reaktivních ligandů je tedy využíváno činidel, která jsou schopná vyvolat vznik fenoxyradikálů z aromatických jader ligandů. Dle tohoto vynálezu je s výhodou 10 využíváno systému peroxid/křenová peroxidáza. Peroxid může být do systému přidáván ve formě ředěného roztoku, nebo je generován chemickou reakcí in situ. Peroxid vodíku je mozne ve směsi generovat pomocí různých druhů enzymů (oxidáz) z kyslíku, jako akceptoru elektronu a příslušného donoru elektronů v oxidačně - redukční reakci. S výhodou lze použít kombinaci galaktóza oxidáza nebo glukóza oxidáza a jejich substráty: galaktóza a glukóza.
Jinými činidly, která jsou schopná vyvolat vznik fenoxyradikálů v přítomnosti molekulárního kyslíku, jsou enzymy tyrozináza, laktáza atd.
Vlastnosti těchto hydrogelů jsou, jak je obecně známo, ovlivňovány jak chemickou strukturou polymeru a jeho koncentrací, tak zvolenými typy síťovacích činidel a jejich použitým množstvím. Fyzikálně-chemické vlastností polymeru (derivátu HA) jsou především 20 ovlivňovány strukturou monomeru, konformací segmentů polymemího řetězce, stupněm zesitěm a molámí hmotností. Tímto jsou také ovlivněny mechanické vlastnosti polymeru. Při mechanickém namáhání polymeru dochází kjeho deformaci, kdy se část absorbované deformační energie disipuje - spotřebuje na změnu konformací uzlů sítě a segmentů polymemího řetězce a část energie se nevratně přemění na teplo. Velikost disipované energie 25 a tím i možnost zaujmutí různých konformačních uspořádání v rámci struktury polymeru souvisí s tuhosti makromolekulámích řetězců a odráží mim elastického odporu materiálu proti deformaci. Polymerní materiály složené z tuhých neohebných řetězců a jejich segmentů pak mohou vykazovat malou míru elastického odporu proti deformaci a křehkost.
Navýšení elasticity těchto polymerů se provede způsobem podle vynálezu, kde se zavedou 30 flexibilní segmenty do struktury polymeru. Ty se vyznačují vyšší volností pohybu jednotlivých molekul kolem svých vazeb, a tím dosahují navýšení možností jejich konformačních uspořádání při působení deformační energie a možnosti její disipace. Zavedení vhodného flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu tak vede k dosažení vyšší elasticity, houževnatosti a pevnosti výsledného materiálu, což je velice přínosné např. u hydrogelů cílených pro scaffoldy v rámci léčby defektů některých tkání vystavených větším zátěžím, jako je např. kloubní chrupavka nebo kosti. Jak bylo popsáno výše, zavedení flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu může být 5 s výhodou také použito v případě, kdy jsou mechanické vlastnosti hydrogelů závislé na koncentraci enzymu použitého jako katalyzátoru síťovací reakce. Zavedením flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu je u reaktivních skupin derivátu polymeru zajištěna, a to i po částečném zesítění polymeru, dostatečná sterická přístupnost reaktivních skupin pro vzájemnou dimerizaci.
Toto řešení má za následek zefektivnění síťovací reakce, což se projevuje dosažením vyšší homogenity připravených hydrogelů a vede tak k překonání technologických problémů spojených se zesítěním hyaluronanu modifikovaného hydroxyfenylem či heteroarylfenolem (tyraminem, serotoninem aj.) v případě, že síťovacími činidly jsou křenová peroxidáza a peroxid vodíku (či jiný typ generátoru fenoxyradikálů).
Překvapivě jsme ale navíc zjistili, že zavedení námi zvolených spacerů mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu vede i při velice nízkém stupni substituce k výraznému navýšení hodnot elasticity, houževnatosti a pevnosti výsledného hydrogelů na bázi tohoto derivátu HA.
Dále se vynález týká využití hydrogelů na bázi derivátů podle vynálezu, a to především v oblasti tkáňového inženýrství, kosmetice, medicíně a regenerativní medicíně. Využití 20 hydrogelů popisovaných v tomto vynálezu je cíleno zejména na základní materiál pro tvorbu scaffoldů ve tkáňovém inženýrství, především do oblasti léčby kloubních a kostních defektů, jako krytí pro hojení ran, jako biodegradabilní bariéra bránící vzniku pooperačních srůstů, k augmentaci měkkých tkání a výplně tkáňových defektů apod. Při použití hydrogelů jakožto materiálu pro scaffoldy se může jednat o scaffoldy oseté nebo neoseté. U osetých scaffoldů se 25 typ buněk, které se zabudují do scaffoldů, volí dle cíleného místa aplikace.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 Znázorňuje deformační vlastnosti („stress-strain“ křivky) získané v rámci měření deformace hydrogelů na bázi derivátů připravených dle příkladů VIII, IX, XI a XII v kompresi.
Příklady provedení vynálezu
1. Příklad syntézy derivátů
Syntéza derivátů hyaluronanu probíhala v několika krocích (viz schéma 1). Prvním z nich je příprava aldehydického derivátu hyaluronanu (příklad 1.7). Dalším krokem je syntéza různých meziproduktů spacer-ligand (příklady 1.1 až 1.6), které byly následně navázány na hyaluronan procesem reduktivní aminace (příklady 1.9 - 1.14).
Součástí příkladu je i syntéza derivátu hyaluronanu, ve kterých je ligand (tyramin, hydroxytryptofan) vázán přímo na polysacharid bez využití spaceru (příklady VIII). Tento derivát a z něj připravované hydrogely sloužily k porovnání vlastností s deriváty popisovanými v tomto vynálezu (deriváty HA-spacer-ligand - deriváty IX až XIV).
Přiklad 1.1: Syntéza 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamidu (meziprodukt spacer-ligand (I))
6-[(ferAbutoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1'-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmolý Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,59 g, 4,3 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 . ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
m = 0,75 g (70 % teorie)
H NMR (D2O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH2-hexanové kyseliny); l,48(m, 2 Η, β-CH2hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, ó-CH2-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2-Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).
I3C NMR(D2O, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (βC-hexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (Cl arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).
Příklad 1.2: Syntéza 4-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyI)ethyl]butanamidu (meziprodukt spacer-ligand (II))
4-[(fórr-butoxykarbonyl)amino]butanová kyselina (0,50 g, 2,5 mmol) byla rozpuštěna v 25 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1 '-karbodiimidazol (0,40 g, 25 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,34 g, 25 mmol). Směs byla 5 dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem.
Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
m = 0,44 g (80 % teorie)
H NMR (D2O, ppm) δ: 1,75 (m, 2 H, p-CH2-butanové kyseliny); 2,16 (t, 2 H, -CH2-CO-); 15 2,59 (m, 2 H, -CH2-In); 2,78 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,20 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,69 (d, 2 H, arom); 6,99 (d, 2 H, arom).
C NMR(D2O, ppm) δ: 23 (β-C- butanové kyseliny); 25 (t, 2 H, -C-CO-); 32 (-C-NH2); 45 (CH2-Ar); 60 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 117 (Cl arom); 129 (C2 arom.); 155 (C4 arom); 171 (-CO-).
Pnklad 1.3: Syntéza 8-amino-A42-(4-hydroxyfenyl)ethyl]oktanamidu (meziprodukt spacer-ligand (III))
8-|(/m-butoxykarbonyl)amino]oktanová kyselina (0,50 g, 1,9 mmol) byla rozpuštěna v 25 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1 '-karbodiimidazol (0,31 g, 1,9 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba 25 promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,26 g, 1,9 mmol). Směs byla dale zahřivana dalších 6 hodin. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílu). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 30 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem.
Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
m - 0,40 g (75 % teorie)
H NMR (CDCI3, ppm) δ: 1,16-1,34 (m, 6 H, C4 až C6 -CH2-oktanové kyseliny); 1,56 — 1.44 (m, 4 H. C3 a C7 oktanové kyseliny); 2,58 (m, 2 H, -CH2-Ar); 2,78 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,19 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,68 (d, 2 H. arom); 6,98 (d, 2 H, arom).
C NMR(CDC13, ppm) δ: 21 (C7 oktanové kyseliny); 24 (C4 oktanové kyseliny); 26 (C6oktanové kyseliny); 28 (C5-oktanové kyseliny); 33 (C3-oktanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (Cl arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).
Příklad 1.4: Syntéza 4-amino-A-[2-(5-hydroxy-l H-indol-3-yl)ethyl]butanamidu (meziprodukt spacer-ligand (IV))
4-[(rer^butoxykarbonyl)amino]butanová kyselina (0,50 g, 2,5 mmol) byla rozpuštěna ve 25 ml VA-dimethylformamidu (DMF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1'-karbodiimidazol (0,40 g, 2,5 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán roztok 5-hydroxytryptamin hydrochloridu (0,52 g, 2,5 mmol) a triethylaminu (0,68 ml; 4,9 mmol) ve 25 ml DMF. Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Směs byla zředěna přídavkem ethylacetátu (100 ml). Vzniklý roztok byl promyt 300 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
m = 0,43 g (65 % teorie)
H NMR: (DMSO, ppm) δ: 1,77 (m, 2 H, 3-CH2-butanové kyseliny); 2,20 (t, 2 H, -CH2CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2-In); 2,81 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,30 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,60 (d, 1 H, C6-arom); 6,82 (s, 1 H, C4-arom); 7,03 (s, 1 H, C2-arom); 7,13 (d, 1 H, C7-arom).
C NMR (DMSO, ppm) δ: 23 (β-C- butanové kyseliny); 25 (t, 2 H, -C-CO-); 32 (-C-NH2); 39 (CH2-In); 60 (-C-NH-CO-); 102 (C4 arom); 110 (C6 arom); 111 (C7 arom.); Ill (C3 arom.); 123 (C2 arom); 127 (C7 - C- NH- arom); 131 (C4-C-C3- arom); 150 (C5 arom); 171 (-CO-).
Příklad 1.5: Syntéza 6-amino-A-[2-(5-hydroxy-lH-indol-3-yl)ethyl]hexanamidu (meziprodukt spacer-ligand (V))
6-[(fórt-butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml W-dimethylformamidu (DMF). K roztoku kyseliny byl přidán l,l'-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán roztok 5-hydroxytryptamin hydrochloridu (0,91 g, 4,3 mmol) a triethylaminu (0,68 ml, 49 mmol) ve 25 ml DMF. Směs byla dále zahřívána dalších 6 hodin. Směs byla zředěna přídavkem ethylacetátu (100 ml). Vzniklý roztok byl promyt 300 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
m = 0,75 g (60 % teorie)
H NMR: (DMSO, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH2-hexanové kyseliny); l,48(m, 2 Η, β-ΟΗ2hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, d-CH2-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2-In); 2,91 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,60 (d, 1 H, C6arom); 6,82 (s, 1 H, C4-arom); 7,03 (s, 1 H, C2-arom); 7,13 (d, 1 H, C7-arom).
,3C NMR (DMSO, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-C-hexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-In); 63 (-C-NH-CO-); 102 (C4 arom); 110 (C6 arom); 111 (C7 arom.); Ill (C3 arom.); 123 (C2 arom); 127 (C7 - C- NHarom); 131 (C4-C-C3- arom); 150 (C5 arom); 171 (-CO-).
Příklad 1.6: Příprava 2-[(6-aminohexanoyl)amino]-3-(5-hydroxy-l/Aindol-3-yl)propanové kyseliny (meziprodukt spacer-ligand VI)
6-[(fórr-butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (0,50 g, 2,2 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1'-karbodiimidazol (0,35 g, 2,Z mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán 5-hydroxytryptofan (0,48 g, 2,2 mmol). Směs byla dále zahřívána dalších 6 hodin. Směs byla zředěna přídavkem ethylacetátu (100 ml). Vzniklý roztok byl promyt 300 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad 5 molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
m = 0.62 g (85 % teorie)
H NMR: (DMSO, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH2-hexanové kyseliny); l,48(m, 2 Η, β-ΟΗ2hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, d-CH2-hexanové kyseliny); 2,19 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2 51 (m, 2 H, -CH2-In); 2,90 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,81 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); (m, 2 H, -CH210 NH-CO-); 6,61 (d, 1 H, C6-arom); 6,95 (s, 1 H, C4-arom); 7,02 (s, 1 H, C2-arom); 7,13 (d, 1 .< H, C7-arom).
C NMR (DMSO, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-C-hexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 55 (-C-NH-CO-);102 (C4 arom); 110 (C6 arom); 111 (C7 arom.); Ill (C3 arom.); 123 (C2 arom); 127 (C7 - C- NH15 arom); 131 (C4-C-C3- arom); 150 (C5 arom); 171 (-CO-).
Příklad 1.7: Příprava aldehydického derivátu (HA-CHO) - obecný postup (VII)
Hylauronan (10,00 g, Mw. = 2 MDa) byl rozpuštěn v 750 ml 2,5% (w/w) roztoku Na2HPO4 · 12 H2O. Roztok byl vychlazen na 5 °C. K vzniklému roztoku bylo přidáno 2,60 g NaBr a 0,05 g 4-acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-l-oxylu. Po důkladné homogenizaci 20 roztoku byly k reakční směsi přidány 3 ml roztoku NaClO (10-15% dostupného Cl2). Reakce pokračovala za stálého míchání 15 min. Reakce byla ukončena přídavkem 100 ml 40% roztoku propan-2-olu. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován precipitací propan-2-olem.
IČ (KBr): 3417, 2886,2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038,945,893 cm’1.
H NMR (D2O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminální glykol -CH-(OH)2).
Příklad 1.8: Syntéza tyraminovaného derivátu (VIII)
Aldehydícký derivát HA (VII) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody.
Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. Následně byl k reakční směsi přidán 30 tyramin (1,70 g) ve formě roztoku ve 100 ml 40% propan-2-olu. Směs byla dále míchána po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě. Dále byl ke směsi přidán roztok pikolin-boran komplexu (0,50 g) v 50 ml 40% propan-2-olu. Reakční směs byla dále míchána 12 hodin při laboratorní teplotě. Nízkomolekulámí balastní látky byly z produktu odstraněny ultrafiltrací. Produkt byl získán precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).
IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm'1.
'H NMR (D2O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,66 - 2,77 (m, 4 H, -CH2-CH2-NH-), 3,00 (s, 1H, H-CH-NH-), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,04 (d, 2H. arom).
Příklad 1.9: Příprava tyraminovaného derivátu HA s C6 spacerem (IX)
Aldehydický derivát HA (VII) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6amino-V-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).
IČ (KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038,945 ,893 cm1
H NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
Příklad 1.10: Příprava derivátu HA s C4 spacerem a 5-hydroxytryptaminem (X)
Aldehydický derivát HA (VII) (3,00 g) a Na2HPO4 . 12 H2O (7,50 g) byl rozpuštěn ve 300 ml demineralizované vody. K roztoku HA-CHO byl přidán 4-amino-V-[2-(5-hydroxy-l/7indol-3-yl)ethyl]butanamid (0,40 g, 1,5 mmol) - (meziprodukt (IV)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,16 g, 1,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).
i · - : . ‘
IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945 ,893 cm’1.
'H NMR (D2O) δ: 1,73 (m, 2 Η, β -CH2- aminobutanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3), 2,60 (m, 2H, γ -CH2- aminobutanové kyseliny), 2,93 (m, 2H, Ind-CH2-), 3,37 - 3,93 (m, 5 skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,85 (d, 1H, arom.), 7,09 (s, 1H. arom), 7,21 (s, 1H. arom), 7,40 (s, 1H. arom).
Příklad 1.11: Příprava tyraminovaného derivátu HA s C4 spacerem (XI)
Aldehydický derivát HA (VII) (3,50 g) byl rozpuštěn v 350 ml demineralizované vody.
Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 410 amino-V-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]butanamid (0,40 g, 1,8 mmol) - (meziprodukt (II)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolm-boran (0,19 g, 1,8 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě.
Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-oIu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 15 dny).
IČ (KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038. 945 ,893 cm'1.
H NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH320 ), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
Příklad 1.12: Příprava tyraminovaného derivátu HA s C8 spacerem (XII)
Aldehydický derivát HA (VII) (2,90 g) byl rozpuštěn ve 300 ml demineralizované vody. 25 Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 8amino-JV-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]oktanamid (0,40 g, 1,4 mmol) - (meziprodukt (III)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,15 g, 1,4 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát 30 byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).
·
IČ (KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945 ,893 cm'1.
H NMR (D2O) δ: 1,16-1,34 (m, 6 H, C4 až C6 -CH2-oktanové kyseliny); 1,56 - 1,44 (m, 4 H, C3 a C7 oktanové kyseliny); 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,58 (m, 2 H, -CH2-Ar); 2,78 (m, 2 H, -CH2-NH-), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
Příklad 1.13 : Příprava derivátu HA s C6 spacerem a 5-hydroxytryptaminem (XIII)
Aldehydický derivát HA (VII) (5,00 g) a Na2HPO4 . 12 H2O (12,5 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. K roztoku HA-CHO byl přidán 6-amino-V-[2-(5-hydroxy-177-indol-3-yl)ethyl]hexanamid (0,73 g, 2,5 mmol) - (meziprodukt (V)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,27 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).
IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078. 1038, 945 ,893 cm'1.
H NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,85 (d, 1H, arom.), 7,09 (s, 1H. arom), 7,21 (s, 1H. arom), 7,40 (s, 1H. arom).
Příklad 1.14 : Příprava derivátu HA s C6 spacerem a 5-hydroxytryptofanem (XIV)
Aldehydický derivát HA (VII) (3,50 g) a Na2HPO4 . 12 H2O (8,75 g) byl rozpuštěn v 350 ml demineralizované vody. K roztoku HA-CHO byl přidán 2-[(6-aminohexanoyl)amino]-3(5-hydroxy-lH-indol-3-yl)propanové kyseliny (0,60 g, 1,8 mmol) - (meziprodukt (VI)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,19 g, 1,8 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).
IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236. 1204, 1154, 1078. 1038, 945 ,893 cm'1.
. 18 . ' ‘Η NMR (D20) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny)!,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m. skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,85 (d, 5 1H. arom.), 7,09 (s, 1H. arom), 7,21 (s, 1H. arom), 7,40 (s, 1H. arom).
Příklad 1.15 : Obecný postup přípravy hydrogelů na bázi derivátu HA se spacerem a 5—hydroxytryptofanem a na bázi tyraminovaného derivátu
Vybraný derivát HA je rozpuštěn νΟ,ΙΜ PBS pH 7,4. Množství derivátu je voleno dle požadované koncentrace. K roztoku derivátu je přidáno požadované množství enzymu. Po 10 důkladné homogenizaci je přidán zředěný roztok peroxidu vodíku. Směs je opět homogenizována a dochází ke vzniku transparentního gelu.
Příklad 1.16: Příprava hydrogelů na bázi tyraminovaného derivátu
- 60 mg (dle požadované koncentrace roztoku polymeru) derivátu HA připraveného dle příkladu 1.8 (VIII) je rozpuštěno ve 2 ml 0,1 M PBS o pH 7,4. K roztoku derivátu je přidáno 15 20 ul roztoku enzymu HRP (24 mg enzymu HRP rozpuštěné v 1 ml 0,1 M PBS o pH 7.4). Po důkladné homogenizaci je přidáno 100 μΐ roztoku H2O2 (33 μΐ 30% H2O2 rozpuštěno v 10 ml 0,lM PBS o pH 7,4). Směs je zhomogenizována a dochází ke vzniku transparentního gelu.
Příklad 1.17 Příprava hydrogelů na bázi tyraminovaného derivátu HA se spacerem
- 60 mg (dle požadované koncentrace roztoku polymeru) derivátu HA připraveného dle 20 příkladu 1.9 (IX), 1.11 (XI) nebo 1.12 (XII) je rozpuštěno v 2 ml 0,lM PBS o pH 7,4.
K roztoku derivátu je přidáno lOul roztoku enzymu HRP (2,4mg enzymu HRP rozpuštěné v Iml 0,lM PBS o pH 7,4). Po důkladné homogenizaci je přidáno 100 μΐ roztoku H2O2 (33μ1 30% H2O2 rozpuštěno v 10ml 0,lM PBS o pH 7,4). Směs je zhomogenizována a dochází ke vzniku transparentního gelu.
2. Rozdíly ve vlastnostech hydrogelů
Příklad 2.1 : Rozdíl v mechanických vlastnostech hydrogelů v závislosti na typu použitého derivátu HA a množství přidaného enzymu
V závislosti na typu použitého derivátu byly dle příkladů 1.16 nebo 1.17 připraveny vzorky hydrogelů z derivátů VIII (tyraminovaný bez vložení spaceru), IX, XI a XII (s vloženým spacerem). Vzorky byly po důkladné homogenizaci ponechány po dobu 120 minut dozrát při laboratorní teplotě. Anology derivátů použité pro přípravu porovnávaných hydrogelů se vždy vyznačovaly srovnatelnou molekulovou hmotností a stupněm substituce. Všechny vzorky měly stejné rozměry a byly proměřovány za konstantních laboratorních podmínek (teplota, tlak, vlhkost).
U vzorků byl stanovován Youngův modul pružnosti v kompresi, houževnatost, mez pevnosti v kompresi a odpovídající deformace vzorku; rámci viskoelastických vlastností vzorků potom modul pružnosti ve smyku a ztrátový úhel.
Ze získaných výsledků jasně vyplývá, že zavedení flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu vede k dosažení vyšší elasticity, houževnatosti a pevnosti hydrogelů na bázi těchto derivátů, oproti hydrogelům na bázi analogických derivátů 10 hyaluronanu bez spaceru.
Tab. 1 Znázorňuje porovnání mechanických vlastností hydrogelu v závislosti na typu použitého derivátu pro jeho přípravu. Koncentrace (%) znamená koncentraci polymeru v roztoku, z nějž se hydrogel připravil, stupeň substituce (%) udává stupeň substituce reaktivním / síťovacím ligandem, tj. počet navázaných ligandů na 100 strukturních jednotek 15 polymeru, kde v případě HA je strukturní jednotkou polymeru míněn disacharid (neboli dimer) glykosamin+kyselina glukuronová.
Tab. 1
Typ použitého derivátu Derivát HA dle příkladu VIII Derivát HA dle příkladu IX Derivát HA dle příkladu vin Derivát HA dle příkladu XI Derivát HA dle příkladu XII
Mw (kDa) / koncentrace (%) 320/3 250/3 280/2 280/2 285 /2
Stupeň substituce ______(%) 3 3 2 1 1
Youngův modul pružnosti v kompresi (kPa) 6,59 5,68 8,99 3,87 8,19
Mez pevnosti (kPa) 73 310 108 167 218
Deformace v mezi pevnosti (%) 67 68 58 65 65
Houževnatost (J/m3) 9150 23460 8050 9670 13650
Ztrátový úhel (°) 0,12 0,18 0,19 0,96 0,43
Modul pružnosti ve smyku (Pa) 1861 1534 876 504 1105
1. Slaughter, B. V.; Khurshid, S. S.; Fisher, O. Z.; Khademhosseini, A.; Peppas, N. A., Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials 2009, 21 (32-33), 3307-3329.
2. Benedetti, L.; Cortivo, R.; Berti, T.; Berti, A.; Pea, F.; Mazzo M.; Moras. M.: Abatangelo, G„ Biocompatibility and biodegradation of different hyaluronan derivatives (Hyaff) implanted in rats. Biomaterials 1993,14 (15), 1154-1160.
3. Calabro, A.; Gross, R. A.; Darr, A. B. Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof. 2004.
4. Calabro, A.; Akst, L.; Alam, D.; Chan, J.; Darr, A. B.; Fukamachi, K.; Gross, R. A.; Haynes, D.; Kamohara, K.; Knott, D. P.; Lewis, H.; Melamud, A.; Miniaci, A.; Strome, NL Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof 2008 (WO2006/010066).
5. Tan, H., Chu, C. R.; Payne, K. A.; Marra, K. G., Injectable in situ forming biodegradable chitosan-hyaluronic acid based hydrogels for cartilage tissue engineering. Biomaterials 2009, 30 (13), 2499-2506.
6. Darr, A.; Calabro, A., Synthesis and characterization of tyramine-based hyaluronan hydrogels. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2009, 20 (1), 33-44.
7. Kurisawa, M.; Lee, F.; Chung, J. E. Formation of Hydrogel in the Presence of Peroxidase and Low Concentration of Hydrogen Peroxide 2009 (WO2009/148405).
8. Lee, F.; Chung, J. E.; Kurisawa, M., An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acid—tyramine hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate. Soft Matter 2008, 4, 880-887.
9. Akkara, J. A., Senecal, K. J.; Kaplan, D. L., Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane. Journal of Polymer Science Part A' Polymer Chemistry 1991, 29(11), 1561-1574.
10. Shutava, T., Zheng, Z.; John, V.; Lvov, Y., Microcapsule modification with peroxidase-catalyzed phenol polymerization. Biomacromolecules 2004, 5 (3), 914-21.
11. Ghan, R., Shutava, T.; Patel, A.; John, V. T.; Lvov, Y., Enzyme-Catalyzed Polymerization of Phenols within Polyelectrolyte Microcapsules. Macromolecules 2004 37 (12),4519-4524.
12. Higashimura, H.; Kobayashi, S., Oxidative Polymerization. John Wiley & Sons Inc · 2002. ’
13. Veitch, N. C., Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry 2004, 65 (3), 249-259.
14. Gilabert, M. A.; Fenoll, L. G.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Ruiz, P. A.; Tudela, J.; Garcia-Canovas, F.; Rodriguez-Lopez, J. N., Stereospecificity of horseradish peroxidase Biol Chem 2004, 385 (12), 1177-84.
15. Uyama, H.; Kobayashi, S., Enzymatic Synthesis of Polyphenols. Current Organic Chemistry 2003, 7, 1387.
16. Gilabert, M. A., Fenoll, L. G.; Garcia-Molina, F.; Tudela, J.; Garcia-Canovas, F.; Rodriguez-Lopez, J. N., Kinetic characterization of phenol and aniline derivates as substrates of peroxidase. Biol Chem 2004, 385 (9), 795-800.
17. Gilabert, M. A.; Hiner, A. N.; Garcia-Ruiz, P. A.; Tudela, J.; Garcia-Molina, F.; Acosta, M.; Garcia-Canovas, F.; Rodriguez-Lopez, J. N., Differential substrate behaviour of phenol and aniline derivatives during oxidation by horseradish peroxidase: kinetic evidence for a two-step mechanism. Biochim Biophys Acta 2004,1699 (1-2), 235-43.
18. Hewson, W. D.; Dunford, Η. B., Oxidation of p-cresol by horseradish peroxidase compound I. J Biol Chem 1976, 251 (19), 6036-42.
19. Burner, U.; Obinger, C„ Transient-state and steady-state kinetics of the oxidation of aliphatic and aromatic thiols by horseradish peroxidase. FEBS Letters 1997, 411 (2-3) 269274.
‘ ‘ ' z0. Patel, P. K.; Mondal, M. S.; Modi, S.; Behere, D. V., Kinetic studies on the oxidation ot phenols by the horseradish peroxidase compound II. Biochim Biophys Acta 1997,1339 (1),
21. Hewson, W. D.; Dunford, Η. B., Stoichiometry of the reaction between horseradish peroxidase and p-cresol. J Biol Chem 1976, 251 (19), 6043-52.
22. Job, D.; Dunford, Η. B., Substituent effect on the oxidation of phenols and aromatic amines by horseradish peroxidase compound I. Eur JBiochem 1976, 66 (3), 607-14.
23. Dunford, Η. B.; Cotton, M. L„ Kinetics of the oxidation of p-aminobenzoic acid catalyzed by horseradish peroxidase compounds I and II. J Biol Chem 1975, 250 (8) 2920-32 24. Kalyanaraman, B.; Felix, C. C.; Sealy, R. C., Peroxidatic oxidation of catecholamines. A kinetic electron spin resonance investigation using the spin stabilization approach. Journal oj Biological Chemistry 1984, 259 (12), 7584-7589.
25. Won, K„ Kim, Y. H., An, E. S.; Lee, Y. S.; Song, B. K., Horseradish PeroxidaseCatalyzed Polymerization of Cardanol in the Presence of Redox Mediators. Biomacromolecules 2003, 5 (1), 1-4.
26. Xu, Y.-P.; Huang, G.-L.; Yu, Y.-T., Kinetics of phenolic polymerization catalyzed by peroxidase in organic media. Biotechnology and Bioengineering 1995, 47 (1), 117-119.
27. Tonelli, A. E„ Effects of crosslink density and length on the number of intramolecular crosslinks (defects) introduced into a rubbery network. Polymer 1974,15 (4), 194-196.
28. Jin, R.; Hiemstra, C.; Zhong, Z.; Feijen, J., Enzyme-mediated fast in situ formation of hydrogels from dextran-tyramine conjugates. Biomaterials 2007, 28 (18), 2791-2800.
29. Park, K.-D.; Joung, Y.-K.; Park, K.-M. In situ Forming Hydrogel and Biomedical Use Thereof 2011 (WO2011/028031).
·
PATENTOVÉ NÁROKY
1. Derivát na bázi kyseliny hyaluronové podle obecného vzorce (I)

Claims (12)
Hide Dependent

1. Derivát na bázi kyseliny hyaluronové podle obecného vzorce (I)
kde Ar je fenyl a R, je ethylen, nebo Ar je indol a R, je ethylen, nebo Ar je indol a Rj je karboxyethylen, a kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500.
2. Způsob přípravy derivátu podle obecného vzorce (I), vyznačující se tím, že se nejprve připraví aldehydický derivát kyseliny hyaluronové podle vzorce (II),
kde aldehydický derivát se připraví s použitím oxidačního systému 4-acetamidoTEMPO/NaClO v protickém prostředí a má stupeň substituce 5 -15 % a molekulovou hmotnost v rozmezí 10000 g/mol až 2000000 g/mol, dále se zvlášť připraví sloučenina obecného vzorce (III)
(ΠΙ) kde Ar je fenyl a Ri je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je karboxyethylen, a kde kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500, přičemž sloučenina obecného vzorce (III) se připraví reakcí prekurzoru spaceru podle vzorce (IV)
Z-NH—R2—COOH (IV), kde Z je chránící skupina běžně používaná k ochraně primární aminoskupiny, • 23 · ' s ligandem podle vzorce (V)
HO. /RKMu ^Ar NH2 (V), v aprotickém prostředí při teplotě v rozmezí 40 °C až 150 °C po dobu 1 až 24 hodin v přítomnosti činidla aktivujícího karboxylové funkční skupiny, za vzniku sloučeniny obecného vzorce (VI)
Z-NH—R2—CO-NH-Rj-Ar-OH (VI), ze které se sloučenina obecného vzorce (III) připraví odstraněním chránící skupiny Z, a pak se aldehydický derivát kyseliny hyaluronové podle vzorce (II) nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce (III) při pH v rozmezí 3 až 8 při laboratorní teplotě po dobu 1 až 72 hodin v přítomnosti pikolin-boranového komplexu za vzniku derivátu podle vzorce (I).
3. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že ligand dle obecného vzorce (V) je vybrán ze skupiny zahrnující tyramin, serotonin a 5-hydroxytryptofan.
4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 až 3, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce (IV), tj. prekurzor spaceru, je vybrána ze skupiny aminokyselin zahrnující deriváty co-[(ter/-butoxycarbonyl)amino]karboxylových kyselin, kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7.
5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároku 2 až 4, vyznačující se tím, že reakce prekurzoru spaceru s ligandem probíhá v prostředí THF nebo DMF při teplotě 50 °C po dobu 2 až 6 hodin v přítomnosti 1,1 '-karbodiimidazolu.
6. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že odstranění chránící skupiny Z se provede prostřednictvím trifluoroctové nebo chlorovodíkové kyseliny.
7. Hydrogel na bázi zesíťovaného derivátu podle obecného vzorce (I)
kde Ar je fenyl a R, je ethylen, nebo Ar je indol a R, je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je karboxyethylen, a kde kde R2 je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500.
8. Způsob výroby hydrogelů definovaného v nároku 7, vyznačující se tím, že se na derivát podle obecného vzorce (I) působí generátorem reaktivních fenoxyradikálů při pH v rozmezí 4 až 10.
9. Způsob výroby podle nároku 8, vyznačující se tím, že generátor reaktivních fenoxyradikálů je vybrán ze skupiny zahrnující systém křenová peroxidáza a zdroj hydroxylových radikálů, kde zdrojem hydroxylových radikálu může být roztok peroxidu vodíku ve vodě, nebo systém oxidáza-kyslík-substrát, např. galaktózooxidáza- galaktóza nebo glukózooxidáza-glukóza.
10. Použití hydrogelů definovaného v nároku 7 pro výrobu přípravků pro kosmetiku, medicínu, či regenerativní medicínu.
11. Použití podle nároku 10, kde přípravky zahrnují krytí pro hojení ran, biodegradabilní bariéry bránící vzniku pooperačních srůstů, přípravky pro augmentaci měkkých tkání, výplně tkáňových defektů, scaffoldy pro tkáňové inženýrství.
12. Použití podle nároku 10, kde přípravky zahrnují oseté nebo neoseté scaffoldy pro léčbu defektů kloubní chrupavky a kostních defektů.