Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Derivát kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy, způsob jeho modifikace a použití
CZ304512B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Radovan Buffa Petra Šedová Lucie Wolfová Ivana Basarabová Robert Pospíšil Martina Hašová Kristina Nešporová Vladimír Velebný
Worldwide applications
Application CZ2012-537A events
2012-08-08
2014-03-19
2014-06-11
Description
translated from
Derivát kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy, způsob jeho modifikace a použití
Oblast techniky
Vynález se týká přípravy a použití nového derivátu kyseliny hyaluronové s dvojnou vazbou v polohách 4 a 5 glukosaminové části polysacharidu a aldehydickou skupinou v poloze 6 glukosaminové části polysacharidu podle vzorce X, nebo jeho hydratované formy s geminálním diolem v poloze 6 glukosaminové části polysacharidu a zachovanou dvojnou vazbou v polohách 4 a 5 glukosaminové části polysacharidu podle vzorce ¥.
kde R může být vodík, libovolný kation kovu nebo organický kation.
Tento nenasycený derivát aldehydu hyaluronanu je vhodný na vázání sloučenin obsahujících amino skupinu, a to ve fyziologických podmínkách. V případě, že vázaná sloučenina obsahuje dvě nebo víc amino skupin, lze připravit síťované materiály.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je glykosaminoglykan složený ze dvou opakujících se jednotek β—(1,3)— D-glukuronové kyseliny a β-( 1,4j-/V-acetyl-D-glukosaminu.
Schéma 1 Kyselina hyaluronová
Vyznačuje se velkou molekulovou hmotností 5.104 až 5.106 g.mof1, která závisí na způsobu izolace a výchozím materiálu. Tento značně hydrofilní polysacharid je ve vodě rozpustný ve formě soli v celé šíři pH. Tvoří součást pojivových tkání, kůže, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogenese. Protože je tento polymer tělu vlastní a tudíž biodegradovatelný, stává se vhodným substrátem pro tkáňové inženýrství, nebo jako nosič biologicky aktivních látek.
Modifikace kyseliny hyaluronové na HA-aldehyd
HA-aldehyd se nejčastěji připravuje selektivní oxidací nativního hyaluronanu. Oxidace polysacharidů je proces, ve kterém dochází ke změně oxidačního stupně funkčních skupin polysacharidu. V případě vzniku aldehydu, dochází ke zvýšení oxidačního stavu formálně o jeden stupeň. Často dochází také ke vzniku karboxylových kyselin (oxidace o dva stupně), které mohou být
-1 CZ 304512 B6 vedlejším produktem oxidace na aldehyd. V případě kyseliny hyaluronové je známo několik přístupů k přípravě hyaluronanu s navázanou aldehydickou skupinou (HA-aldehyd). Tyto deriváty hyaluronanu jsou jedním z nejvíce využívaných prekurzorů pro přípravu bio materiálů z chemicky modifikovaného hyaluronanu. Hlavním důvodem je, že aldehydické skupiny jsou stabilní ve fyziologických podmínkách, ale přitom ještě dost reaktivní pro rychlou a efektivní chemickou reakci například s aminy.
Hlavní způsoby přípravy HA-aldehydů popisuje následující schéma 2.
Schéma 2
Zdaleka nejčastějším způsobem zavedení aldehydické skupiny na hyaluronan je oxidace pomocí NaIO4 ve vodě (Schéma 2, struktura 1) (Spiro Robert a kol.: WO 99/01 143, Aeschlimann Daniel, Bulpitt Paul: WO 2007/01 49 441). Tato modifikace vede k otevření sacharidického cyklu za vzniku dvou aldehydických skupin.
Další metodou je oxidace primární hydroxylové skupiny v poloze 6-glukosaminové části polysacharidu na aldehyd (Schéma 2, struktura 2) pomocí systému NaClO/TEMPO ve vodě (Buffa R., Kettou S., Velebný V. a kol. WO 2011/069 475) nebo pomocí Dess-Martin periodátu v DMSO (Buffa R., Kettou S., Velebný V. a kol. WO 2011/069 474). Na rozdíl od struktury 1, aldehydická skupina v této poloze zachovává rigiditu polymemího řetězce.
Zajímavým způsobem zavedení aldehydické skupiny na hyaluronan je možnost navázat tuto skupinu přes linker (Schéma 2, struktura 3). Zde jsou možné různé přístupy, například zavedení vicinálního diolu na karboxylovou skupinu hyaluronanu přes amid a následná oxidace diolu s NaIO4, která dává aldehyd vázaný přes linker (Hilbom J. a kol: WO 2010/138 074). Tato strategie může mít výhodu v tom, že aldehydická skupina je stericky přístupnější pro případné další modifikace.
V další přihlášce vynálezu (Aeschlimann Daniel a Bulpitt Paul: WO 200701 49 441) byla zmíněná možnost připravit HA-aldehyd pomocí redukce karboxylové skupiny hyaluronanu s použitím činidla 9-BBN (9-borabicyclo[3,3,l]nonan). Výsledkem je hyaluronan s aldehydickou skupinou v poloze 6 glukuronové části polysacharidu (Schéma 2, struktura 4).
-2CZ 304512 B6
Kondenzace HA-aldehydu s N-nukleofily
Hlavní aplikační výhodou kondenzace HA-aldehydů s V-nukleofily (aminy) je, že může být uskutečněna ve fyziologických podmínkách. Obecně tuto reakci popisuje následující schéma 3:
Schéma 3
H2N—X
HA - CHO -► HA - CH = N - X
Hydrolytická stabilita vzniklého iminového -CH=N- spojení je do značné míry závislá na charakteru skupiny X. Pokud je X atom, kteiý nanese volný elektronový pár, například -CH2- skupina, vzniklá hydrolyticky velmi nestabilní imin HA-CH=N-CH2-. Pokud je X atom, který nese volný elektronový pár, vzniká hydrolyticky stabilnější konjugát (oxim HA-CH=N-O-, hydrazon HA-Ť3H=N-NH-, semikarbazon HA CH=N NH C() a podobně), kde je iminová vazba CH=N- stabilizována konjugací s volným elektronovým párem atomu X. Je známo mnoho patentů popisujících vázání aminů obecného vzorce NH2-X-, kde X je dusík nebo kyslík, na hyaluronan oxidovaný na aldehyd, a kde finální materiály vznikají při fyziologicky akceptovatelných podmínkách, takže jsou použitelné na širokou škálu biomedicínských aplikací. Z novějších lze zmínit patent (Bergman K., a kol: WO 2009/108 100), kde se obecně nárokují materiály na bázi kyseliny hyaluronové modifikované elektrofilními skupinami jako je aldehyd, maleinimid, akrylát, akrylamid, metakrylát, metakrylamid, vinylsulfon a aziridin. Jako síťovací nukleofily jsou zmíněny hydrazidy, semikarbazidy, thiosemikarbazidy, aminooxy, thiolové a β-aminothiolové skupiny. Podobná je další přihláška vynálezu (Hilbom J. a kol: WO 2010/138 074) popisující vázání N, S nebo současně N a S nukleofilů přímo na hyaluronan oxidovaný na aldehyd pomocí oxidace s jodistanem sodným.
Pokud je X alifatický uhlík (Schéma 3), je obecně známo, že vzniklé iminy nejsou hydrolyticky stabilní (vazba -C=N- nemá partnera na konjugaci) a vratně přecházejí na výchozí aldehyd a amin (Buffa R., Kettou S., Velebný V. a kol. WO 2011/069 474). Situaci popisuje Schéma 4.
Schéma 4
Další možností, jak stabilizovat zmíněné iminy, je rozšířit konjugaci z opačné strany, čili ze strany aldehydu, to znamená poskytnout vzniklému iminu konjugaci s násobnou -C=C- vazbou. Obecnou reakci popisuje Schéma 5.
Schéma 5
HA - C=C - CHO
H2N—X
-►
HA-C=C-CH = N-X
-3CZ 304512 B6
Tento přístup je v literatuře zmíněn jen velmi zřídka, a to například pro reakce aromatických aldehydů s aminy za vzniku tzv. Schiffových bází, kde je stabilita podpořena konjugací s aromatickým cyklem Ar-CHO + H2N-R —> Ar-CH=N-R. V případě polysacharidů nebo polymerů obecně však nebyl nalezen analogický příklad. U této modifikace polymerů by bylo nutné zavést na aldehyd aromatickou skupinu nebo obecně nějaké konjugované násobné vazby přes linker, což je technologická komplikace a není zaručena biokompatibilita materiálu. Tento způsob však otevírá i další potenciální komplikaci. V případě přítomnosti aromatického systému nebo více konjugovaných násobných vazeb už může materiál absorbovat ve viditelné oblasti, takže látka bude barevná, což obecně není žádoucí (možná fotosenzitivita, komplikace v analytice při in vitro studiích).
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je kyselina hyaluronová strukturního vzorce X nebo Y, která má modifikované některé glukosaminové cykly polysacharidů s dvojnou vazbou v polohách 4 a 5, a současně je přítomna aldehydická skupina, respektive geminální diol (struktura Y) v poloze 6 glukosaminové části polysacharidů
kde R může být vodík, libovolný kation kovu nebo organický kation. Neomezujícím příkladem R je například kation sodíku, draslíku, vápníku nebo organický kation typu tetrabutylamonium nebo protonizovaný triethylamin. Tento derivát má s výhodou molekulovou hmotnost v rozsahu lxlO3 až 5x105 g.moT1.
Toto řešení umožňuje stabilizovat konjugáty hyaluronanu s aminoslouěeninami pomocí násobné vazby ze strany aldehydu, takže na takto modifikovaný hyaluronan je možné vázat ve fyziologických podmínkách prakticky jakoukoliv sloučeninu obsahující amino skupinu.
Toto je významný rozdíl oproti nasyceným aldehydům hyaluronanu, které dokážou ve fyziologických podmínkách pevně vázat sloučeniny obecného vzorce H2N-X-, kde X je atom nesoucí volný elektronový pár, obyčejně kyslík nebo dusík. Jelikož jen málo přírodních látek obsahuje seskupení H2N-X-, dává řešení popsané v tomto vynálezu velkou výhodu nejenom jako potenciální nosič biologicky aktivních látek, ale taky v tkáňovém inženýrství, kde se velmi často používají deriváty hyaluronanu síťované ve fyziologických podmínkách s biologicky akceptovatelnými amino sloučeninami.
Dále se vynález týká způsobu přípravy derivátu strukturního vzorce X nebo Y, kde se nejprve oxiduje kyselina hyaluronová na HA-aldehyd v poloze 6 glukosaminové části (dále v textu ozna-4CZ 304512 B6 čováno jako Krok 1), a potom se HA-aldehyd dehydratuje buď v roztoku, nebo jednoduchým zahřátím bez přítomnosti rozpouštědel, bází nebo jiných aditiv (dále v textu označováno jako Krok 2). Tyto dva kroky jsou detailněji rozebrány níže:
Krok 1:
Selektivní oxidace primární hydroxylové skupiny kyseliny hyaluronové v poloze 6 glukosaminové části polysacharidu na aldehyd. Reakce lze provést například použitím oxidačního systému 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxyl radikálu R‘-TEMPO / NaClO ve vodě, kde R1 je vodík nebo skupina V-acetyl:
oxidace
H2O
Tento krok probíhá s výhodou ve vodě při teplotě -5 až 10 °C, molámí množství NaClO je v rozmezí 0,05 až 0,7 eq. a molámí množství R'-TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové. Výchozí kyselina hyaluronová může mít molekulovou hmotnost v rozsahu 1 xl04 až óxlO”6 g.moT1.
Krok 2:
možnost 1: Dehydratace HA-aldehydu v polárním aprotickém rozpouštědle a vodě při teplotě 30 až 80 °C, s výhodou při 50 až 60 °C, nebo možnost 2: Zahřátí čistého nasyceného HA-aldehydu v suchém stavu na teplotu 50 až 100 °C, s výhodou na 70 až 80 °C.
První možnost je dehydratace ve vodně-organickém prostředí, kde organické rozpouštědlo je mísitelné s vodou a objemový poměr rozpouštědlo/voda je v rozsahu 3/1 až 1/2. S výhodou lze v tomto kroku použít báze s omezenými nukleofilními vlastnostmi, například organické báze, např. triethylamin nebo V-diisopropyl-V-ethylamin, nebo anorganické báze, např. Ca(OH)2. Množství báze v reakci je 0,01-20 ekvivalentů přepočteno na dimer hyaluronanu, s výhodou 5 až 10 ekvivalentů. Báze může podporovat eliminaci tím, že odštěpí proton v alfa poloze aldehydu (poloha 5 cyklu) a vzniklý karbanion eliminuje hydroxy skupinu v poloze 4 za vzniku násobné vazby. Jako organická rozpouštědla je možné použít aprotická polární rozpouštědla mísitelná s vodou, s výhodou DMSO nebo sulfolan. Reakce s výhodou probíhá 12 až 150 hodin.
Druhá, technologicky velmi atraktivní možnost, jak uskutečnit krok 2, je zahřívat výchozí nasycený aldehyd v suchém stavu bez přítomnosti jakýchkoliv aditiv na vyšší teplotu, s výhodou na teplotu 70 až 80 °C po dobu 12 hodin až 10 dnů, s výhodou 4 až 5 dnů.
Vynález se dále týká použití nenasyceného HA-aldehydu pro vázání aminů. Konkrétněji se vynález týká způsobu modifikace derivátu kyseliny hyaluronové, podle vzorce X nebo Y, kde derivát reaguje s aminem obecného vzorce H2N-R2, kde R2 je alkylový, aromatický, heteroaromatický,
-5CZ 304512 B6 lineární nebo rozvětvený řetězec Ci - C30, volitelně s obsahem N, S nebo O atomů. Uvedeným aminem může být například aminokyselina, peptid nebo polymer, který obsahuje volnou amino skupinu, přičemž takovým polymerem může být například deacetylovaná kyselina hyaluronová, kyselina hyaluronová s navázanou amino skupinou přes linker, nebo želatina, nebo jiný biologicky akceptovatelný polymer. Množství aminu, aminokyseliny, peptidu nebo volných amino skupin polymeruje s výhodou v rozmezí 0,05 až 2 ekvivalenty vzhledem k dimeru hyaluronanu.
Na přípravu těchto konjugátů nejsou nutné žádné specifické podmínky. Reakce může probíhat ve vodě, ve fosfátovém pufřu nebo v systému voda-organické rozpouštědlo při teplotě v rozmezí 20 až 60 °C po dobu 10 minut až 150 h. Organické rozpouštědlo může být vybráno ze skupiny zahrnující s vodou mísitelné alkoholy, zejména isopropanol nebo etanol, a s vodou mísitelná polární aprotická rozpouštědla, zejména dimethylsulfoxid, přičemž obsah vody ve směsi je minimálně 50 % objemových. Reakce běží hladce ve fyziologických podmínkách, například ve fosfátovém pufřu při pH = 7,4 a teplotě 37 °C, se širokou škálou různých aminů, počínaje jednoduchými aminokyselinami a složitými peptidy konče. V těchto podmínkách je také možné bez problémů vázat hydraziny, hydroxylaminy, hydrazidy, semikarbazidy nebo tiosemikarbazidy. Pokud jsou vázány sloučeniny obsahující dvě nebo více aminoskupin, je možné připravit nerozpustné síťované deriváty se širokou škálou viskoelastických vlastností.
o
COONa //
ch3co
Vyšší stabilita vazby aminu a nenasyceného HA-aldehydu v porovnání s jeho nasyceným analogem umožňuje připravit stabilnější a lépe prosíťované nerozpustné biomateriály založené na hyaluronanu. Podrobněji je toto tvrzení popsáno v části Příklady provedení vynálezu, příklad 21, kde se porovnává nasycený a nenasycený derivát HA-aldehydu s podobným stupněm substituce a molekulovou hmotností z hlediska finálních Teologických vlastností po síťování s deacetylovaným hyaluronanem.
Oproti analogům zmíněným v části „Dosavadní stav techniky“ je navržený způsob modifikace výhodnější v tom, že umožňuje pevněji vázat na kyselinu hyaluronovou ve fyziologických podmínkách podstatně širší škálu sloučenin obsahujících aminoskupinu. Tato skutečnost je velkou výhodou pro aplikaci hlavně v tkáňovém inženýrství, kde lze použít mnoho biokompatibilních síťovacích amino-linkerů ve fyziologických podmínkách i v přítomnosti živých buněk. Modifikované deriváty lze použít například pro přípravu síťovaných materiálů a hydrogelů, pro přípravu materiálů pro tkáňové inženýrství nebo pro biomedicínské aplikace. Na síťování lze použít i polysacharidy nebo obecně polymery, které obsahují amino skupiny. Také v oblasti nosičů biologicky aktivních látek lze popsaný vynález s výhodou použít. Navržený způsob umožňuje imobilizovat na hyaluronan širší škálu biologicky aktivních aminů (např. peptidů), které pak mohou být přirozeně uvolněny v nativní (aktivní) podobě. Bylo zjištěno, že při nižším pH je vazba amin nenasycený HA-aldehyd hydrolyticky méně stabilní, takže lze připravené konjugáty využít také jako pH responsivní biomateriály (nosiče, gely ...). Bylo prokázáno, že samotný nenasycený HAaldehyd není cytotoxický, takže jeho konjugáty jsou vhodným kandidátem pro různé biomedicínské aplikace. Ačkoli byl odborník v oboru mohl očekávat, že konjugace ze strany aldehydu s C=C- násobnou vazbou povede ke zvýšené toxicitě, protože například akrolein CH2=CH-CHO je silně toxická a dráždivá látka, není tomu tak. Derivát podle vynálezu má dvojnou vazbu přímo
-6CZ 304512 B6 ve skeletu polymeru (bez linkeru) a výsledný substrát nevykázal toxické vlastnosti. Deriváty podle vzorce X nebo Y lze použít pro přípravu materiálů s antirakovinovým účinkem, jako nosičů biologicky aktivních látek v kosmetice a farmacii nebo jako nosičů biologicky aktivních látek s kontrolou uvolňování pomocí změny hodnoty pH.
Realizace řešení popsaného v tomto vynálezu není technologicky komplikovaná a nevyžaduje použití drahých chemikálií, rozpouštědel nebo izolačních postupů.
Přehled obrázku na výkrese
Obrázek 1 znázorňuje elastický materiál připravený podle příkladu 20.
Příklady provedení vynálezu
DS = stupeň substituce = 100 % * (molámí množství navázaného substituentu nebo modifikovaného dimeru) / (molámí množství všech dimerů polysacharidů)
Zde používaný výraz ekvivalent (eq) se vztahuje na dimer kyseliny hyaluronové, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozí kyseliny hyaluronové (zdroj: CPN spol. sr.o., Dolní Dobrouč, (ČR) je hmotnostně střední a byla stanovena metodou SEC-MALLS.
Příklad 1 Příprava HA-aldehydu oxidovaného v poloze 6-glukosaminové části.
Oxidace kyseliny hyaluronové
Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (1 g, 2xl05 g.mol1), s obsahem NaCl 1%, KBr 1%), TEMPO (0,01 eq) a NaHCO3 (20 eq.), se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,5 eq) pod dusíkem. Směs se míchala 12 h při teplotě -5 °C, pak se přidal 0,1 g etanolu a směs byla míchaná ještě 1 hodinu. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2 % a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3-krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7-krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 10 % (stanoveno z NMR) *H NMR (D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-CH(OH)2)
HSQC (D2O) cross signál 5,26 ppm ('H) - 90ppm(13C) (polymer-C7/(OH)2)
Příklad 2 Dehydratace HA-aldehydu
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) ve vodě se přidalo 6,7 ml DMSO a báze DIPEA (5 eq). Směs se míchala 72 h při teplotě 40 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 6 % (stanoveno z NMR), Mw = 1 lxl 04 g.mol“1 (stanoveno SEC MALLS)
Ή NMR (D2O) δ 9,24 (s, IH, -CH=O), 6,32 (m, IH, -C//=C-CH=O)
UV-Vis (D2O) 252 nm, π- π* přechod α,β-nenasycený aldehyd
-7CZ 304512 B6
Příklad 3 Dehydratace HA-aldehydu
Do čtyřprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) ve vodě se přidalo 7,5 ml DMSO a báze DIPEA (5 eq). Směs se míchala 72 h při teplotě 50 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 4 Dehydratace HA-aldehydu
Do dvouprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) ve vodě se přidalo 2,5 ml DMSO a báze DIPEA (5 eq). Směs se míchala 72 h při teplotě 50 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 2 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 5 Dehydratace HA-aldehydu
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) ve vodě se přidalo 6,7 ml sulfolanu. Směs se míchala 72 h při teplotě 60 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 1 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 6 Dehydratace HA-aldehydu
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) ve vodě se přidalo 6,7 ml sulfolanu a báze Et3N (5 eq). Směs se míchala 72 h při teplotě 50 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 7 Dehydratace HA-aldehydu
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) ve vodě se přidalo 6,7 ml sulfolanu a báze DIPEA (2 eq). Směs se míchala 12 h při teplotě 80 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 2 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 8 Dehydratace HA-aldehydu
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) ve vodě se přidalo 6,7 ml sulfolanu a báze Ca(OH)2 (1 eq). Směs se míchala 150 h při teplotě 30 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 2 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 9 Dehydratace HA-aldehydu
HA-aldehyd (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) se zahříval v tuhém stavu 5 dnů při 80 °C. Pak byl analyzován pomocí NMR.
DS 3 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
-8CZ 304512 B6
PříkladlO Dehydratace HA-aldehydu
HA-aldehyd (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) se zahříval 12 h tuhém stavu při 10 °C. Pak byl analyzován pomocí NMR.
DS 2 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 11 Dehydratace HA-aldehydu
HA-aldehyd (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 1) se zahříval v tuhém stavu 10 dnů při 50 °C. Pak byl analyzován pomocí NMR.
DS 2 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 2)
Příklad 12 Vázání aminů na α,β-nenasycený HA-aldehyd
Do jednoprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,1 g, stupeň substituce DS=6 %, příklad 2) v 0,lM vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 se přidal n-butylamin (2 eq). Směs se míchala 5 h při teplotě 37 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR) *H NMR (D2O) δ 7,74 (s, 1H, -CH=N-Bu), 5,68 (m, 1H, -C//=C-CH=N-Bu)
HSQC (D2O) cross signál 7,74 ppm (' H) - 158 ppm (13C) -CH=N-Bu cross signál 5,68 ppm (*H) - 112 ppm (13C) -C7f=C-CH=N-Bu
Příklad 13 Vázání aminů na α,β-nenasycený HA-aldehyd
Do jednoprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,1 g, stupeň substituce DS=6 %, příklad 2) v 0,1 M vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 se přidal n-butylamin (0,05 eq). Směs se míchala 150 h při teplotě 20 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 2 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 12)
Příklad 14 Vázání aminů na α,β-nenasycený HA—aldehyd
Do jednoprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,1 g, stupeň substituce DS=6%, příklad 2) ve vodě se přidal n-butylamin (0,3 eq). Směs se míchala 10 min při teplotě 60 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 12)
Příklad 15 Vázání lysinu na α,β-nenasycený HA-aldehyd
Do jednoprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,1 g, stupeň substituce DS=6%, příklad 2) v 0,1 M vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 se přidal lysin (0,3 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR)
Ή NMR (D2O) δ 7,76 (s, 1H, -Ctf=N-lysin), 5,65 (m, 1H, -C7/=C-CH=N-lysin)
-9CZ 304512 B6
Příklad 16 Vázání pentapeptidu pal-KTTKS (palmytoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser) na α,βnenasycený HA-aldehyd
Do jednoprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,1 g, stupeň substituce DS=6 %, příklad 2) v 0,1 M vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 se přidalo 5 ml IPA a pak roztok substituovaného pentapeptidu pal-KTTKS (0,1 eq) v 5 ml isopropylalkoholu. Směs se míchala 72 h při teplotě 20 °C. Výsledný roztok byl odpařen na rotační vakuové odparce na třetinu objemu a pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 1 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O) δ 7,75 (s, IH, -Ctf=N-peptid), 5,66 (m, IH, -C//=C-CH=N-peptid)
Příklad 17 Síťování α,β-nenasyceného HA-aldehydu lysinem
Do pětiprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,1 g, stupeň substituce DS=6 %, příklad 2) v 0,lM vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 se přidal jednoprocentní roztok lysinu ve vodě (0,1 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Byl pozorován nárůst viskozity výsledného roztoku.
Příklad 18 Síťování α,β-nenasyceného HA-aldehydu dihydrazidadipatem
Do pětiprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,015 g, stupeň substituce DS=6 %, příklad 2) v 0,1 M vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 se přidal jednoprocentní roztok dihydrazidadipátu ve vodě (0,1 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Byl pozorován nárůst viskozity výsledného roztoku.
Příklad 19 Příprava deacetylovaného hyaluronanu
Do tříprocentního roztoku hyaluronanu (lg, 83xl04 g-mol1) v hydrazin hydrátu s obsahem 30 g hydrazin sulfátu se přidalo 65 ml sulfolanu a směs se zahřívala 48 hodin při 70 °C. Výsledný roztok je zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCCE) 3-krát 5 litrů (lx denně) a oproti destilované vodě 7-krát 5 litrů (2x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 32 % (stanoveno z NMR), Mw 37x103 g.moT1 (Stanoveno SEC-MALLS) 'H NMR (1% NaOD v D2O) δ 2,75 (s, IH, -C7T-NH2)
Příklad 20 Síťování α,β-nenasyceného HA-aldehydu pomocí deacetylovaného hyaluronanu
Do tříprocentního roztoku nenasyceného HA-aldehydu (0,025 g, stupeň substituce DS=6 %, příklad 2) v 0,1 M vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 se přidal tříprocentní roztok deacetylovaného hyaluronanu (0,015 g, příklad 19) νΟ,ΙΜ vodném fosfátovém pufru při pH 7,4 (0,1 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Byl pozorován výrazný nárůst viskozity výsledného roztoku.
Příklad 21 Porovnání mechanických a viskoelastických vlastností hydrogelů na bázi síťovaného α,β-nenasyceného HA-aldehydu a síťovaného nasyceného HA-aldehydu.
- síťování s deacetylovaným hyaluronanem
-10CZ 304512 B6
Materiál 1: Nenasycený HA-aldehyd (0,06 g, DS = 6 %, Mw =11 xlO4 g.mol \ příklad 2) 3% roztok v PBS pH 7,4 + deacetylovaný hyaluronan (0,02 g, příklad 19) 3% roztok v PBS pH 7,4.
Materiál 2: Nasycený HA-aldehyd (0,06 g, DS = 7 %, Mw = lxlO5 g.mol-1) 3% roztok v PBS pH 7,4 + deacetylovaný hyaluronan (0,02 g, příklad 19) 3% roztok v PBS pH 7,4.
Z výše popsaných materiálů byly připraveny vzorky hydrogelů, a to smícháním a důkladnou homogenizací jejich obou složek (3% roztoku nenasyceného HA-aldehydu v PBS / 3% roztok nasyceného HA-aldehydu a 3% roztoku deacetylovaného hyaluronanu v PBS). Vzorky byly vždy ponechány po dobu 240 minut dozrát při laboratorní teplotě, kdy poté dochází ke vzniku homogenního transparentního gelu. Všechny vzorky měly stejné rozměry a byly proměřovány za konstantních laboratorních podmínek (teplota, tlak, vlhkost).
U vzorků byly stanovovány jejich mechanické vlastnosti. Konkrétně se jednalo o Youngův modul pružnosti v kompresi udávající tvrdost / pružnost materiálu, houževnatost udávající pevnost vzorku a jakou energii je materiál schopný absorbovat, aniž by došlo kjeho trvalé deformaci. Dále mezi pevnosti v kompresi udávající, jaké maximální zatížení je materiál schopný absorbovat, aniž by došlo kjeho trvalé deformaci, a v rámci viskoelastických vlastností modul pružnosti ve smyku a ztrátový úhel.
| Materiál j | Youngův modul | i Mez pevnosti | 1 Houževnatost | Modul | j Ztrátový úhel |
| číslo | pružnosti v kompresi (kPa) | (kPa) j | (J/m3) | pružnosti ) δ(°) ve smyku ! ! (Pa) | |
| l | 0,844 | I 382,06 | | 29690 | 160 | 2,36 |
| 2 | 0,482 | j ............309,29 | 1........ 19488 | “55“ | 10,3 |
Dosažené výsledky uvedené v rámci tohoto příkladu ukazují výhodnost použití nenasyceného HA-aldehydu oproti nasycenému HA-aldehydu z pohledu přípravy tužších a houževnatějších (lépe prosíťovaných) materiálů vhodných pro tkáňové inženýrství.
Claims (15)
Hide Dependent
translated from
Claims (15)
Hide Dependent
translated from
1. Derivát kyseliny hyaluronové, modifikovaný dvojnou vazbou v polohách 4 a 5 glukosaminové části polysacharidu a současně oxidovaný na aldehyd v poloze 6 glukosaminové části polysacharidu, podle strukturního vzorce X, nebo jeho hydrátovaná forma podle strukturního vzorce Y /
CH3CO kde R je vodík, libovolný kation kovu nebo organický kation vybraný ze skupiny obsahující organický kation typu tetrabutylamonium nebo protonizovaný triethylamin.
2. Derivát kyseliny hyaluronové podle nároku 1, vyznačující se tím, že má molekulovou hmotnost v rozmezí 1 až 5 xlO5 g.mol“1 a Rje kation sodíku, draslíku, vápníku nebo organický kation typu tetrabutylamonium nebo protonizovaný triethylamin.
3. Způsob přípravy derivátu kyseliny hyaluronové definovaného v nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová v prvém kroku oxiduje v poloze 6 glukosaminové části s výhodou pomocí systému R’-TEMPO/NaClO, kde R1 je vodík nebo skupina Nacetyl, ve vodě při teplotě -5 až 10 °C, molámí množství NaClO je v rozmezí 0,05 až 0,7 ekvivalentu a molámí množství R]-TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 ekvivalentu vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové, načež se oxidovaná kyselina hyaluronová ve druhém kroku dehydratuje v polohách 4 a 5 glukosaminové části ve směsi voda/polámí aprotické rozpouštědlo při teplotě 30 až 80 °C, s výhodou při teplotě 50 až 60 °C.
4. Způsob přípravy podle nároku 3, vyznačující se tím, že směs dále obsahuje bázi v množství 0,01 až 20 ekvivalentů, s výhodou 5 až 10 ekvivalentů, vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové, přičemž báze je vybrána ze skupiny zahrnující organické báze, například triethyl amin nebo diisopropylethylamin, nebo anorganické báze, například Ca(OH)2.
5. Způsob přípravy podle nároku 3, vyznačující se tím, že aprotické rozpouštědlo je mísitelné s vodou a zahrnuje například DMSO nebo sulfolan, a objemový poměr rozpouštědlo/voda je v rozsahu 3/1 až 1/2.
6. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 3až5, vyznačující se tím, že reakce probíhá po dobu 12 až 150 hodin.
7. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 3až6, vyznačující se tím, že oxidovaná kyselina hyaluronová ve druhém kroku dehydratuje v pevné fázi bez použití rozpouštědel nebo jiných aditiv zahřátím na teplotu 50 až 100 °C, s výhodou 70 až 80 °C po dobu 12 hodin až 10 dnů, s výhodou 4 až 5 dnů.
8. Způsob přípravy podle kteréhokoliv z nároků 3 až 7, vyznačující se tím, že výchozí kyselina hyaluronová má molekulovou hmotnost v rozsahu lx 104 g.mol“1 až 5x 106 g.mol'1.
9. Způsob modifikace derivátu kyseliny hyaluronové definovaného v nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že derivát reaguje s aminem obecného vzorce H2N-R2, kde R2 je alkylový, aromatický, heteroaromatický, lineární nebo rozvětvený řetězec Ci až C30, volitelně s obsahem N, S nebo O atomů.
10. Způsob modifikace derivátu kyseliny hyaluronové podle nároku 9, vyznačující se tím, že derivát reaguje s aminokyselinou nebo s peptidem.
11. Způsob modifikace derivátu kyseliny hyaluronové podle nároku 9, vyznačující se tím, že derivát reaguje s polymerem, který obsahuje volnou amino skupinu.
-11 CZ 304512 B6
12. Způsob modifikace derivátu kyseliny hyaluronové podle nároku 11, vyznačující se tím, že polymerem je například deacetylovaná kyselina hyaluronová, kyselina hyaluronová s navázanou amino skupinou přes linker, nebo želatina, nebo jiný biologicky akceptovatelný polymer.
13. Způsob modifikace podle kteréhokoli z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že množství aminu, aminokyseliny, peptidu nebo volných amino skupin polymeru je v rozmezí 0,05 až 2 ekvivalentů vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové.
- 12CZ 304512 B6
14. Způsob modifikace podle kteréhokoli z nároků 9 až 13, vyznačující se tím, že reakce s aminem, aminokyselinou, peptidem nebo polymerem obsahujícím volnou amino skupinu probíhá ve vodě, ve fosfátovém pufru nebo v systému voda-organické rozpouštědlo při teplotě v rozmezí 20 až 60 °C po dobu 10 minut až 150 h.
15. Způsob modifikace podle nároku 14, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující s vodou mísitelné alkoholy, zejména isopropanol nebo ethanol, a s vodou mísitelná polární aprotická rozpouštědla, zejména dimethylsulfoxid, přičemž obsah vody ve směsi je minimálně 50 % objemových.
16. Použití derivátů definovaných v kterémkoli z nároků 1 a 2 jako nosičů biologicky aktivních látek v kosmetice a farmacii nebo jako nosičů biologicky aktivních látek s kontrolou uvolňování pomocí změny hodnoty pH.
15 17. Použití derivátů připravených způsobem definovaným v kterémkoli z nároků 9 až 15 pro přípravu síťovaných materiálů a hydrogelů, pro přípravu materiálů pro tkáňové inženýrství nebo pro biomedicínské aplikace.