CZ304654B6 - Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití - Google Patents

Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití Download PDF

Info

Publication number
CZ304654B6
CZ304654B6 CZ2012-842A CZ2012842A CZ304654B6 CZ 304654 B6 CZ304654 B6 CZ 304654B6 CZ 2012842 A CZ2012842 A CZ 2012842A CZ 304654 B6 CZ304654 B6 CZ 304654B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hyaluronan
water
acylated
nanomicellar
acid
Prior art date
Application number
CZ2012-842A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2012842A3 (cs
Inventor
Daniela Šmejkalová
Gloria Huberta-Angeles
Martin Bobek
Martina Hermannová
Lucie Vištejnová
Jaroslav Novotný
Eva Příkopová
Kristina Nešporová
Miroslava Němcová
Klára Šlezingrová
Jaromír Kulhánek
Dagmar Čožíková
Jana Šógorková
Jan KuÄŤera
Pavel Klein
Vladimír Velebný
Original Assignee
Contipro Biotech S.R.O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Contipro Biotech S.R.O. filed Critical Contipro Biotech S.R.O.
Priority to CZ2012-842A priority Critical patent/CZ304654B6/cs
Priority to EP13829034.1A priority patent/EP2934592B1/en
Priority to HUE13829034A priority patent/HUE038664T2/hu
Priority to US14/647,626 priority patent/US9999678B2/en
Priority to DK13829034.1T priority patent/DK2934592T3/en
Priority to PL13829034T priority patent/PL2934592T3/pl
Priority to JP2015543316A priority patent/JP2016500130A/ja
Priority to PCT/CZ2013/000156 priority patent/WO2014082609A1/en
Priority to ES13829034.1T priority patent/ES2683993T3/es
Priority to KR1020157016788A priority patent/KR102191353B1/ko
Priority to BR112015012191A priority patent/BR112015012191A8/pt
Priority to RU2015125076A priority patent/RU2640287C2/ru
Publication of CZ2012842A3 publication Critical patent/CZ2012842A3/cs
Publication of CZ304654B6 publication Critical patent/CZ304654B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A61K31/355—Tocopherols, e.g. vitamin E
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/683—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols
    • A61K31/685—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols one of the hydroxy compounds having nitrogen atoms, e.g. phosphatidylserine, lecithin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/0291—Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/30—Sulfur-, selenium- or tellurium-containing compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/413—Nanosized, i.e. having sizes below 100 nm
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/56—Compounds, absorbed onto or entrapped into a solid carrier, e.g. encapsulated perfumes, inclusion compounds, sustained release forms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/30—Sulfur-, selenium- or tellurium-containing compounds
    • C08K2003/3045—Sulfates

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy hydrofobizovaného hyaluronanu (vzorec I) a dále způsobu enkapsulace biologicky aktivních látek do nanomicel hydrofobizovaného hyaluronanu sloužícího jako nosiče biologicky aktivních hydrofobních látek. Hydrofobizace hyaluronanu je provedena esterifikační reakcí hyaluronanu s karboxylovými kyselinami s dlouhými řetězci, které jsou aktivovány halogenidovým derivátem kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové nebo jiným organickým chloridem. Ve vodě rozpustné hydrofobizované hyaluronany mohou ve vodném prostředí vytvářet nanomicely, ve kterých mohou být nekovalentně fyzikálními interakcemi navázány nepolární látky. Jádro nanomicely tvoří hydrofobní funkční skupiny acylu, zatímco obal nanomicely tvoří hyaluronan. Enkapsulaci látek do nanomicel lze provést metodou výměny rozpouštědel nebo sonikací. Hyaluronové nanomicely podporují penetraci navázaných látek při topických aplikacích a umožňují transfer navázaných látek do buněk. Nanomicely z hydrofobizovaných hyaluronanů jsou využitelné v kosmetických i farmaceutických aplikacích.

Description

Nanomicelární kompozice na bázi Cé-Cig-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy Ce~ Cig-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy hydrofobizovaného hyaluronanu a její aplikace jako nosiče biologicky aktivních hydrofóbních látek, kde biologicky aktivní látka je enkapsulována do nanomicel hydrofobizovaného hyaluronanu. Hydrofobizace hyaluronanu je provedena esterifikační reakcí hyaluronanu s karboxylovými kyselinami s dlouhými řetězci, které jsou aktivovány halogenidovým derivátem kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové nebo jiným organickým chloridem R3-CO-CI. Ve vodě rozpustné hydrofobizované hyalurononany mohou ve vodném prostředí vytvářet nanomicely, ve kterých mohou být nekovalentně fyzikálními interakcemi navázány nepolární látky. Jádro nanomicely tvoří hydrofobní funkční skupiny acylu, zatímco obal nanomicely tvoří hyaluronan. Enkapsulaci látek do nanomicel lze provést metodou výměny rozpouštědel nebo sonikací. Hyaluronové nanomicely podporují penetraci navázaných látek při topických aplikacích a umožňují transfer navázaných látek do buněk. Dále se vynález týká i způsobu přípravy stabilizovaných nanomicelámích kompozic. Nanomicely z hydrofobizovaných hyaluronanů jsou využitelné v kosmetických i farmaceutických aplikacích.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je významným polysacharidem složeným ze dvou opakujících se jednotek |3-(l,3)-D-glukuronové kyseliny a (3-(l,4-HV-acetyl-D-glukosammu. Vyznačuje se vysokou molekulovou hmotností 5.104 až 5.106 g-mol“1, která závisí na způsobu izolace a výchozím materiálu. Hyaluronan, tedy kyselina hyaluronová, respektive její sodná sůl, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogenese. Tento značně hydrofilní polysacharid je ve vodě rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.
Nosičové systémy na bázi kyseliny hyaluronové
Kyselina hyaluronová je hydrofilní, a proto v nativní formě nemůže sloužit jako efektivní nosič hydrofóbních látek. Z tohoto důvodu je třeba na polymemí řetězec kyseliny hyaluronové navázat hydrofobní funkční skupiny. V případě dostatečného množství a délky těchto hydrofóbních skupin může docházet k jejich autoagregaci a tvorbě hydrofóbních domén ve struktuře hyaluronanu, do kterých je potom možné nekovalentně navazovat malé molekuly ve vodě nerozpustných látek. Vzniklý útvar se často v literatuře označuje jako polymemí micela, kde jádro micefy je hydrofobní a zajišťuje rozpouštění malých nepolárních molekul, zatímco obal micely je hydrofilní a zajišťuje rozpouštění polymemí micely ve vodném prostředí. Polymemí micela, která svou velikostí (průměrem) nepřekračuje 200 nm se dá nazývat nanomicelou.
Nosičové systémy jako polymemí micely na bázi modifikované kyseliny hyaluronové jsou známé z konjugátů hyaluronanu s alkylaminy (Liu et al., 2011) a kyselinou listovou. Uvedená příprava hyaluronanového derivátu je však uvedena v přítomnosti formamidu, který je vysoce toxický a teratogenní. Podobná příprava polymemích micel byla použita pro získání redox-sensitivních micel (Li et al., 2012). Je zřejmé, že z důvodu použití vysoce toxického reagentu, jsou takovéto micelámí systémy nepoužitelné pro biologické aplikace.
Konjugace kyseliny hyaluronové s jinými polymery (polymer kyseliny mléčné nebo glykolové) s vazbou přes karboxylovou skupinu na kyselině D-glukuronové a možnou inkorporaci nízkomolekulámích látek je nárokovaná v patentu US 7 767 806, kde autoři zmiňují biokompatibilitu polymeru, kterou však nepopsali ani neotestovali. V jiném případě byl nízkomolekulámí hyaluro- 1 CZ 304654 B6 nan (9^45 kDa) kovalentně modifikován v místě karboxylové skupiny kyseliny glukoronové hydrofóbními aminy s různou délkou řetězce a kladně nabitým sperminem jako kationickým segmentem (Shen, Li, Tu & Zhu, 2009). Účelem této práce bylo připravit nosič na geny. Použití sperminu pro tyto účely je však limitované kvůli jeho akutní a subakutní toxicitě (Til, Falke, Prinsen & Willems, 1997). Kritická micelámí koncentrace vzniklých polymemích micel o velikosti 125 až 555 nm byla stanovena vyšší než 0,04 mg.ml ’. Kromě toho, že hodnota kritické micelámí koncentrace je příliš vysoká a neumožní extrémní ředění micelámích systémů (např. v krevním řečišti), micely takové velikosti nejsou povařovány za vhodné kandidáty pro pasivní distribuci léčiv v těle, kdy rozměr polymemí micely udává, jestli se dostane do místa tumoru nebo infarktu přes narušenou cévní stěnu. Pro tyto případy se obecně upřednostňují polymemí micely o velikosti 20 až 100 nm (Wang, Mongayt & Torchilin, 2005).
Modifikace karboxylové skupiny kyseliny glukuronové byla využita v případě přípravy polymerních hyaluronových micel na bázi elektrostatické interakce mezi negativně nabitou kyselinou hyaluronovou a pozitivně nabitým styryl pyridinem (Tao, Xu, Chen, Bai & Liu, 2012). Použití těchto polymemích micel in vivo je však limitované z důvodu zatím ne zcela objasněné interakce styryl pyridinia s nervovými konci a dále s muskarinovými receptory, které hrají důležitou úlohu při regulaci uvolňování neurotransmiterů z neuronů (Mazzone, Moři, Burman, Palovich, Belmonte & Canning, 2006).
US patent 7 993 678 a WO 2007/033 677 si nárokuje přípravu aryl/alkyl sukcinových derivátů hyaluronanu, které jsou rovněž využitelné pro enkapsulaci aktivních nepolárních látek. V tomto případě modifikace probíhá na primárních hydroxylových skupinách hyaluronanu, zatímco karboxylová skupina zůstává zachovaná. Nevýhodou dané modifikační reakce je alkalická pH (pH 8,5 až 9,0), při kterém probíhá reakce cyklických anhydridů s hyaluronanem. Takové alkalické pH totiž může vést k hydrolýze anhydridu, a tedy ke snížení efektivnosti modifikace, zejména v průmyslových měřítkách. U připravených aryl/alkyl sukcinových derivátů hyaluronanu se stupněm substituce 44 % byla ve vodě prokázána schopnost tvořit micely (agregovat) od koncentrací vyšších než 0,003 až 0,004 mg-mf’. Velikost polymemích micel byla stanovena v rozmezí 50 až 200 nm. Nevýhodou těchto derivátů je však zvýšený celkový záporný náboj hyaluronanu díky přítomnosti další COO v alkyl/aryl sukcinové modifikující funkční skupině. Záporný náboj molekuly může výrazně negativně ovlivňovat interakci mezi buňkou a nosičovým systémem (Wang, Mongayt & Torchilin, 2005). Limitujícím faktorem pro injekční aplikace takto připravených derivátů je rovněž jejich nízká rozpustnost (Eenschooten, Guillaumie, Kontogeorgis, Stenby & Schwach-Abdellaoui, 2010). Další nevýhodou takovýchto derivátů je labilita esterových vazeb při tepelných sterilizačních procesech, jako je autoklávování. V patentech US 7 993 678 a WO 2007/033 677 je uvedený pouze způsob přímého rozpouštění nepolárních látek v roztocích alkyl/aryl sukcinových derivátů hyaluronanu včetně vzniku stabilní emulze. Hlavní nevýhodou přímého způsobu enkapsulace nepolárních látek jsou výsledné nízké vazebné kapacity polymerních micel (Kedar, Phutane, Shidhaye & Kadam, 2010). V uvedených patentech je sice nárokována struktura modifikovaného hyaluronanu pro nosičové systémy, ale kromě emulzního systému není uveden žádný další možný způsob navázání hydrofóbní látky do dané struktury hyaluronanu. Z tohoto důvodu zcela chybí uvedení i vazebné kapacity polymemího nosičového systému, což je jedna ze základních charakteristik pro reálné posouzení aplikace. Dále nejsou zmíněny parametry cytotoxicity a interakce s buňkou a nedá se tedy posoudit, jestli nárokovaná struktura skutečně může být použita na aktivní transfer hydrofóbních látek do buňky, což je ve farmaceutických aplikacích podstatné.
V publikaci (Smejkalová, Hermannová, Šuláková, Průšová, Kučerík & Velebný, 2012) jsou uvedeny hydrofóbní domény hyaluronanu vznikající při agregaci acylových řetězců C6 kovalentně navázaných na hyaluronan. V těchto derivátech však nebyla kompletně odstraněna zbytková rozpouštědla a vznik polymemích micel a jejich charakterizace není náplní publikace. Navíc, symetrické anhydridy, použité v publikaci nebyly použitelné pro vazbu dlouhých alkylových řetězců. Karboxylové kyseliny s dlouhými alifatickými řetězci jsou rovněž velmi drahé a během
-2CZ 304654 B6 přípravy je navíc ztracen nejméně jeden mol kyseliny na mol reagentu. Článek rovněž nepojednává o cytotoxicitě připravených derivátů.
Příprava butyrových esterů polysacharidů včetně farmaceutické kompozice je nárokována v patentu EP 0 941 253. Nárokovaná metodika přípravy však vede pouze k velmi nízkým stupňům substitucí (max. 3%). Množství nekovalentně vázané hydrofobní látky na tyto deriváty je negativně ovlivněno tímto nízkým stupněm substituce. Butyrové estery hyaluronanu byly dále připravené v patentu WO 2005/092 929, kde jsou však vyžadovány bezvodé podmínky, a tedy transformace hyaluronanu na kvartem! ammoniovou sůl, která může být doprovázena degradací hyaluronanu. Dosažený stupeň substituce je nižší než 0,1 %, tyto esterové deriváty tedy nejsou vhodné pro přípravu nosičových systémů. Podobných výsledků bylo dosaženo i při současné esterifikací hyaluronanu anhydridem kyseliny butyrové a chloridem kyseliny retinové (WO 2004/056 877).
Kompozici polymemích micel na bázi modifikovaného hyaluronanu (HA)-[O(C=O)NH-M]p, kde M představuje modifikující jednotku, jejíž součástí je alkylová funkční skupina C2_i6 a p je násobkem 3 až 4, a farmaceuticky aktivní enkapsulované molekuly je nárokována patentem US 2010/0 316 682 a EP 1 538 166A1. Hlavní nevýhodou těchto derivátů je, že na provedení modifikace hyaluronanu s dlouhým řetězcem je použit dibutylcín laurát, potenciální imunotoxická a teratogenní látka. Tato látka se většinou používá na modifikace lepidel a je na seznamu Evropské agentury pro životní prostředí kvůli své akutní toxicitě (Boyer, 1989). Další nevýhodou nárokovaných derivátů je jejich konjugace s polymery, např. polyethylenglykolem, které nejsou tělu vlastní a mohou při intravenózních nebo topických aplikacích vést k zánětlivým reakcím, popř. ke vzniku cytotoxických degradačních produktů. Navíc, opakovaná aplikace polymemích micel, kde polyethylenglykol představuje hydrofilní segment, vedla kjejich zrychlenému odbourávání z krevního řečiště z důvodu vytvoření anti-PEG IgM protilátek (Gong, Chen, Zhang, Wang & Wang, 2012).
Paclitaxel byl úspěšně inkorporován do micel modifikovaného hyaluronanu poly(mléčnou-eoglykolovou kyselinou, PLGA) (Kim, Lee, Jang & Park, 2009). Inkorporace proběhla metodou dialýzy, kdy se modifikovaný polymer i vázaná látka rozpustily v DMSO a vzniklý roztok byl dialyzován proti H2O. Vazebná kapacita připravených polymemích micel v tomto případě dosahovala 4,5 % (hmotn.). Nevýhodou těchto nosičových systémů je přítomnost polymeru PLGA, který nepatří mezi polymery tělu vlastní a nemusí při topických a intravenózních aplikacích představovat plně biodegradabilní systém. Další nevýhodou je zbytkové DMSO ve finálních produktech.
Modifikace hyaluronanu karboxylovými kyselinami s dlouhým řetězcem
Modifikace polysacharidů karboxylovými kyselinami nej častěji vyžaduje komerčně dostupný anhydrid dané kyseliny (WO 1996/035 720, WO 2007/033 677, (Smejkalová, Hermannová, Šuláková, Průšová, Kučerík & Velebný, 2012), EP 0 893 451). Hlavní nevýhodou těchto komerčně dostupných anhydridů je jejich náchylnost k hydrolýze a možná přítomnost nečistot. Pro některé kyseliny nejsou jejich anhydridy komerčně dostupné (např. kyselina undekanová) nebo jsou dostupné a jejich cena je velmi vysoká (např. kyselina olejová, linolová, linolenová). Nedostupnost, vysoká cena a nestabilita těchto anhydridů potom znesnadňují přípravu modifikovaných polysacharidů ve velkém měřítku.
Anhydrid kyseliny může být nahrazen jiným derivátem kyseliny použitelných pro esterifikací hyaluronanu. Patent WO 2010/105 582 si nárokuje aktivaci karboxylových kyselin ethylchlorformiátem, v bezvodých podmínkách, za vzniku O-acyl-O'-alkylkarbonátů dále použitelných pro esterifikací hyaluronanu. Nevýhodou takovéto aktivace je vznik toxických a potenciálně výbušných plynů. Podobná aktivace alkylchlorformiátem je nárokovaná v patentu US 5 550 225. Aktivace alkylchlorformiátem je rovněž uvedena v patentu US 3 720 662 a CZ 20060605.
-3 CZ 304654 B6
Známá je rovněž esterifikace polysacharidů karboxylovými kyselinami v přítomnosti imidazolu (US 2012/0 172 587). Nárokovaná metoda přípravy však vyžaduje vysoké reakční teploty (90 až 200 °C), které nejsou v případě hyaluronanu aplikovatelné vzhledem k jeho degradaci i při vyšších teplotách.
Evropský patent EP 0 893 451 si nárokuje esterifikaci polysacharidů anhydridy karboxylových kyselin za použití metody superkritické extrakce. Nevýhodou tohoto postupu jsou požadavky vysokého tlaku a vysoké náklady na pořízení výrobního zařízení.
Z těchto důvodů je velmi důležité nalézt alternativní metodu aktivace karboxylových kyselin s dlouhými řetězci, která by byla aplikovatelná in sítu. Jedním z možných řešení je aktivace karboxylových kyselin za použití derivátu 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny za vzniku anhydridu. Anhydrid 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny v kombinaci s katalyzátorem DMAP byl poprvé použit v mírných reakčních podmínkách pro rychlou esterifikaci makrocylických látek (Inanaga, Hirata, Saeki, Katsuki & Yamaguchi, 1979). Tato metoda esterifikace však nebyla dosud použita na modifikaci polysacharidů, zejména kyseliny hyaluronové, z důvodu možné exotermní reakce provázané degradací polysacharidu.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je syntéza hydrofobizovaného hyaluronanu a jeho aplikace jako nanomicelámího polymerního nosiče biologicky aktivních hydrofóbních látek ve vodném prostředí, přičemž zůstává zachován nativní charakter a biologická aktivita vázaných látek.
Hydrofobizace hyaluronanu dlouhými alifatickými estery (C6-C18) je založena na přímé aktivaci karboxylových kyselin s dlouhými řetězci za vzniku anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové (Schéma 1). Tento anhydrid v dalším kroku reaguje s hyaluronanem za vzniku acylovaného hyaluronanu. Hlavní výhodou této aktivace je možné přímé využití alifatických karboxylových kyselin. Na rozdíl od podobných hydrofobizačních reakcí hyaluronanu uvedených v části stavu techniky nevyžaduje představená modifikace komerčně dostupný anhydrid. Další výhodou představené aktivace je průběh reakce při mírných podmínkách (od pokojové teploty až do 50 °C) a krátká reakční doba. Uvedená aktivace rovněž nevyžaduje nadměrné molámí množství alifatických kyselin a nevyžaduje speciální bezvodé podmínky jako v případě přihlášky vynálezu WO 2010/105 582. Aktivační reagent je stabilní a při jeho použití k hydrofobizaci polysacharidů nedochází k produkci toxických plynů nebo explozivních produktů jako v případě ethylchlorformiátu. Další výhodou aktivačního činidla je to, že nevytváří vedlejší reakční produkty a nezpůsobuje síťovací reakce.
Aktivace karboxylových kyselin derivátem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny s následnou aplikací na esterifikaci hyaluronanu je znázorněno na schématu 1 níže:
-4CZ 304654 B6
A)
Λ»
Cí
Cl R',N, organické rozpouštědlo
OK.-TCB-A
OK-TCB-A = anhydrid organické* kyseliny a kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoove
B)
R= Na+ nebo H\ R’ = H nebo -C(=O)CxHy nebo -C(=O)CH=CH-het. R4 = -H, -N(CH3)2, R'3= -CH,CH3
Schéma 1
Dále se vynález týká použití hydrofobizovaného hyaluronanu pro přípravu nanomicelámích systémů a aplikaci navázaných látek v nanomicelách hyaluronanu na kůži, vlasy a sliznice, přičemž jsou možné i jiné topické aplikace. Enkapsulované biologicky aktivní látky jsou v nanomicelách hyaluronanu vázány nekovalentně fyzikálními interakcemi s hydrofobními funkčními skupinami polymemího nosiče. Takto enkapsulované látky efektivně penetrují do vrchní části kůže (epidermis), a do celé struktury chlupů a vlasů a do epitelu sliznic. Výhodou je, že hloubka penetrace aktivních látek vázaných v nanomicelách je větší, než hloubka penetrace stejných látek rozpuštěných přímo v nepolárních rozpouštědlech.
Oproti podobným polymemím systémům (US patent US 7 993 678, WO 2007/033 677), hyaluronové nanomicelámí konjugáty vykázaly nečekaně 3 až 10 násobně nízkou kritickou micelámí koncentraci a současně relevantně vysokou stabilitu v solném a ve vodném prostředí. Velmi nízká hodnota kritické micelámí koncentrace je výhodná pro možné intravenózní aplikace hyaluronových nanomicel. Vysokou stabilitu hyaluronových nanomicel lze oproti podobným systémům na bázi většiny jiných polymerů popsaných v části stavu techniky s výhodou použít na lyofilizaci materiálu, kdy není potřeba pro zachování enkapsulace do roztoku před vlastním vymražením přidávat lyoprotektant.
Výhodou nárokových hydrofobizovaných hyaluronanů je absence syntetických polymerů (PLGA, PEG atd.) a kopolymerů, které jsou často nutné pro vytvoření nanomicel a které můžou vyvolat při opakovaném podání vznik protilátek (Gong, Chen, Zheng, Wang & Wang).
Na rozdíl od podobných polymerních micelámích systémů, tvorba nanomicel není založena na modifikovaném hyaluronanu se zvýšeným celkovým záporným nábojem, a tedy není z tohoto důvodu negativně ovlivněna interakce nosičového systému s buňkami.
-5CZ 304654 B6
Některé z nanomicelámích útvarů, zejména ty obsahující delší acelové řetězce na hyaluronanu, mohou tvořit v solném prostředí gelovou fázi, kterou lze s výhodou použít pro určité aplikace vyžadující vyšší viskozitu nosičového systému.
Rozměr připravených nanomicelámích systémů se nejčastěji pohybuje v rozmezí 20 až 100 nm, což je optimální velikost pro farmaceutické aplikace, ve kterých se využívá zvýšený permeabilní a retenční efekt (EPR efekt). Tato velikost nemusí být vždy dosažitelná polymemích micel popsaných v části stav techniky.
Další výhodou hyaluronových nanomicel je přenos navázaných látek z hydrofobních domén nanomicely do buňky.
Inovovaný způsob enkapsulace je založen na přípravě směsi modifikovaného hyaluronanu rozpuštěného ve vodě a biologicky aktivní rozpuštěné v organickém rozpouštědle, energetickém narušení hydratační obálky hyaluronanu a následným odstraněním organického rozpouštědla z roztoku. Tento způsob na rozdíl od běžných enkapsulačních postupů není založen na rozpustnosti polymeru v organickém rozpouštědle a z tohoto důvodu nevyžaduje ztrátu nativního charakteru hyaluronanu a výraznou modifikaci polymemího řetězce zejména v místě karboxylových skupin, které jsou důležité pro rozpoznání hyaluronanu buněčnými receptory. Preferované organické rozpouštědlo je takové, které má nižší teplotu varu než voda. Vazebnou kapacitu hyaluronových nanomicel výrazně zvyšuje kompletní evaporace zbylé vodné fáze s následnou rehydratací nanomicel. Nenavázanou biologicky aktivní látku lze odstranit filtrací a výsledné nanomicely lze přímo lyofilizovat a skladovat v suchém stavu do doby následné rehydratace.
Vynález se tedy týká nanomicelámí kompozice na bázi C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I,
(I), kde Rje tf nebo Na+, a kde R1 je H nebo -C(=O)CxHy nebo -C(=O)CH=CH-het, kde x je celé číslo v rozmezí 5 až 17 a y celé číslo v rozmezí 11 až 35 a CxHy je lineární nebo rozvětvený nasycený, nenasycený řetězec C5-C17 a het je heterocyklický nebo heteroaromatický zbytek s volitelným obsahem N, S nebo O atomů, přičemž alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1-C(=O)CxHy nebo -C(=O)CH=CH-het, a kde n je v rozmezí 12 až 4000, přičemž nanomicely obsahují hydrofobní jádro tvořené C6-Ci8-acylovými skupinami navázanými na hyaluronan a hydrofilní obal tvořený hydrofilními funkčními skupinami hyaluronanu, a jednu nebo více biologicky aktivních látek fyzikálně vázaných v nanomicele. Ve výhodném provedení vynálezu je C6-Ci8-acylovaná HA, oleyl HA, tzn. ve vzorci I je R H nebo Na+ a R1 je -C(=O)(CH2)7-CH=CH-(CH2)7CH3. Kompozice dále obsahuje vodu, může obsahovat i soli (např. 0,9 % NaCl). Ve výhodném provedení nanomicelámí kompozice obsahuje 0,3 až 50 % hmotnostních biologicky aktivní látky vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, přičemž biologicky aktivní látka je vybrána ze skupiny zahrnující farmaceuticky a kosmeticky aktivní látky zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fýtokomplexy nebo íytoaktivní látky, minerální nebo rostlinné oleje, nebo jejich směs. Příklady biologicky použitelných aktivních látek zahrnují například tokoferol, paclitaxel, fosfotidylcholin nebo koenzym Q10. V jednom výhodném provedení obsahuje kompozice vyšší koncentraci C6Ci8-acylovaného hyaluronanu než je jeho kritická agregační koncentrace. Koncentrace C6-Ci8acylované hyaluronanu v kompozici ve vodném roztoku je v rozmezí 0,0001 mg.ml'1 až
-6CZ 304654 B6 mg.ml'1, s výhodou 1 až 20mg.ml'1. V dalším výhodném provedení je biologicky aktivní látkou minerální nebo rostlinný olej v množství 0,05 až 40 % hmotn. vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, s výhodou 1 až 20 % hmotn. V ještě dalším výhodném provedení obsahuje kompozice biologicky aktivní látku, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, a v níž je rozpouštěna další biologicky aktivní látka. Touto biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, může být například minerální nebo rostlinný olej, a uvedenou další biologicky aktivní látkou může být například farmaceuticky nebo kosmeticky aktivní látka, zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fytokomplexy nebo íytoaktivní látky nebo jejich směs. Nanomicelámí kompozice podle vynálezu může být ve formě roztoku nanoemulze, mikroemulze, koacervátu nebo gelu.
Dále se vynález týká způsobu přípravy výše uvedeného C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, obsaženého v nanomicelámí kompozici podle vynálezu, kde hyaluronan reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru s C6-Ci8 karboxylovou kyselinou aktivovanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3-CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený Ci-C3o alkyl, případně obsahující heteroaromatické nebo aromatické funkční skupiny. Příkladem heteroaromatické skupiny je pyridin nebo jeho deriváty (například podle vzorce i), příkladem aromatické skupiny je benzen ajeho halogenové deriváty (například podle vzorce ii):
(i) (ϋ)
Hyaluronan může být ve formě volné kyseliny nebo stabilní farmaceuticky přijatelné soli, například Na, K, Ca, Mg, Zn, nebo li soli, a má molekulovou hmotnost, od 5x103 g/mol do l,6xl06 g/mol, s výhodou od 15xl03 g/mol do 250xl03 g/mol, nejlépe 15xl03 až 50xl03 g/mol. Způsob přípravy podle vynálezu se provádí tak, že se rozpustí hyaluronan ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, kterým je polární organické rozpouštědlo, přičemž obsah vody je v rozmezí od 10 do 99 % objemových, s výhodou 50 % objemových. Aprotickým rozpouštědlem mísitelným s vodou může být například dimethylsulfoxid (DMSO), tetrahydrofurane(THF), aceton, acetonitril nebo izopropanol (IPA). V reakční směsi je přítomna báze R'3N, kde R' je lineární nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec CnHm, kde n je celé číslo v rozmezí 1 až 4 a m je celé číslo v rozmezí 3 až 9, jako např. triethylamin, v množství 0,01 až 20 ekvivalentů, s výhodou 6 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu, a katalyzátor vybraný ze skupiny zahrnující substituované pyridiny, jako dimethylaminopyridin ajeho deriváty, v množství 0,01 až 1 ekvivalent, s výhodou 0,05 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu. Ve způsobu podle vynálezu se nejprve provede aktivace C6-Ci8 karboxylové kyseliny v polárním organickém rozpouštědle, v přítomnosti báze a kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové nebo jejích derivátů, nebo v přítomnosti báze a organického chloridu, následně se směs obsahující aktivovanou C6-Ci8 karboxylovou kyselinu přidá k hyaluronanu rozpuštěného ve směsi vody, organického rozpouštědla, báze a katalyzátoru a nechá se proběhnout reakce za vzniku acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I. C6-Ci8 karboxylová kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu kapronovou, enanthovou, kaprylovou, pelargonovou, kaprinovou, palmitovou, stearovou, olejovou, linolovou a linolenovou. Množství aktivované C6-C18 karboxylové kyseliny je v rozmezí 0,01 až 5 ekvivalentů, s výhodou 0,5 až 2 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu. Aktivace C6-Ci8 karboxylové kyseliny probíhá po dobu 5 až 120 minut, s výhodou 30 minut, při teplotě od 20 až 60 °C, s výhodou při 25 °C. Reakce hyaluronanu a aktivované karboxylové kyseliny probíhá po dobu 1 až 24 hodin, s výhodou 2 až 3 hodiny, při teplotě od 20 do 60 °C, s výhodou při 25 °C. C6-C]8acylovaný hyaluronan se může následně izolovat z reakční směsi, promýt, sušit a lyofilizovat.
-7CZ 304654 B6
Izolace hyaluronanu z reakční směsi může být provedena srážením za použití NaCl a alkoholu. Promytí hyaluronanu lze provést například alkoholem, zejména izopropanolem nebo ethanolem.
Dále se vynález týká způsobu přípravy nanomicelární kompozice definované výše, kde se CýC18-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a biologicky aktivní látka se rozpustí v organickém rozpouštědle, oba roztoky se smíchají, poté se organické rozpouštědlo odstraní. Organickým rozpouštědlem může být těkavé chlorované rozpouštědlo jako trichlormethan, nebo alkohol jako ethanol nebo izopropanol, a jeho odstranění může proběhnout vakuovou evaporací, načež se vodná fáze usuší, rehydratuje, získaná nanomicelární útvary se zfiltrují a nakonec lyofilizují; nebo se organické rozpouštědlo odstraní dialýzou, získané nanomicelární útvary se poté zfiltrují a nakonec lyofilizují. V jednom výhodném provedení se C6-Ci8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze. V dalším výhodném provedení se Cfi-C|8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě a v níž je rozpuštěna další biologicky aktivní látka, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze.
V ještě dalším aspektu se vynález týká použití nanomicelární kompozice pro farmaceutické nebo kosmetické aplikace, s výhodou zejména pro topické aplikace.
Dále lze připravit stabilizované nanomicelární kompozice, a to tak, že se připraví Ce-Cis-acylovaný hyaluronan v nanomicelární kompozici podle obecného vzorce II.
R'=R2 nebo R’ý R2 (II), kde R je ff nebo Na+, alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1, kde R1 je lineární nebo heterocyklický řetězec C6-Ci8, který může obsahovat nenasycené vazby a alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R2, kde R2 je 3-(2-thienyl)akrylová kyselina nebo 3-(2-furyl)akrylová kyselina ajejich deriváty; které se stabilizují síťovací reakcí. Konkrétně se stabilizace provede tak, že se nejprve připraví akrylovaný hyaluronan podle obecného vzorce III.
-8CZ 304654 B6
(ΠΙ) tak, že se nejprve rozpustí HA ve vodě, pak se přidají báze (například TEA) a katalyzátor DMPA; zvlášť se připraví aktivovaná kyselina 3-(2-thienyl)akrylová nebo 3-(2-furyl)akrylová nebo jejich derivát, a to aktivací v organickém rozpouštědle (např. THF) a bázi (např. TEA) přidáním chloridu 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny, a nakonec se obě směsi smíchají za vzniku akrylovaného hyaluronanu podle vzorce III. Následně se připraví aktivovaná C6-Ci8-karboxylová kyselina, kterou se akrylovaný hyaluronan podle vzorce III acyluje podobným způsobem, jak bylo uvedeno výše v případě způsobu přípravy C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I, za vzniku acylovaného hyaluronanu podle vzorce II. Z takovéhoto acylovaného hyaluronanu lze pak analogicky připravit nanomicely, které se pak mohou síťovat radikálovými reakcemi, například pomocí peroxydisulfátu amonného. Tento zesíťovaný hyaluronan není rozpustný ve vodě.
Literatura
Boyer, I. J. (1989). Toxicity of dibutyltin, tributyltin and other organotin compounds to humans and to experimental animals. Toxicology, 55(3), 253-2989.
Eenschooten, C., Guillaumie, F., Kontogeorgis, G.M., Stenby, E.H., & Schwach-Abdellaoui, K. (2010). Preparation and structural characterisation of novel and versatile amphiphilic octenyl succinic anhydride-modified hyaluronic acid derivatives. Carbohydrate Polymers 79(2), 597605.
Gong, J., Chen, m., Zheng, Y., Wang, S., & Wang, Y. (2012). Polymeric micelles drug delivery systém in oncology. Journal of ControlledRelease, 159 (3), 312-323.
Inanaga, J., Hirata, K., Saeki, H., Katsuki, T., & Yamaguchi, M. (1979). A Rapid Esterification by Means of Mixed Anhydride and Its Application to Large-ring Lactonization. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 52(7), 1989-1993.
Kedar, U., Phutane, P., Shidhaye, S., & Kadam, V. (2010). Advances in polymeric micelles for drugs delivery and tumor targeting. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 6(6), 714-729.
Kim, T.G., Lee, H., Jang, Y., & Park, T.G. (2009). Controlled Release of Paclitaxel from Heparinized Metal Stent Fabricated by Layer-by-Layer Assembly of Polylysine and Hyaluronic Acidg-Poly(lactic-co-glycolic acid) Micelles Encapsulating Paclitaxel. Biomacromolecules, 10(6), 1532-1539.
Li,J., Huo, M., Wang, J., Zhou, J., Mohammad, J. M., Zhang, Y., Zhu, Q., Waddad, A.Y., & Zhang, Q. (2012). Redox-sensitive micelles self-assembled from amphiphilic hyaluronic acid-9CZ 304654 B6 deoxycholic acid conjugates for targeted intracellular delivery of paclitaxel. Biomaterials, 33(1), 2310-2320.
Liu, Y., Sun, J., Cao, W., Yang. J., Lián, H., Li. X., Sun, Y., Wang, Y., Wang, S., & He, Z. (2011) Duál targeting folate-conjugated hyaluronic acid polymeric micelles for paclitaxel delivery. International Journal of Pharmaceutics, 421(1), 160-169.
Mazzone, S. B., Moři, N., Burman, M., Palovich, M., Berlmonte, K. E., & Canning, B. J. (2006). Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. The Journal of Physiology, 557(1), 23-35.
Shen, Y., Li, Q., Tu, J., & Zhu, J. (2009). Synthesis and characterization of low molecular weight hyaluronic acid-based cationic micelles for efficient siRNA delivery. Carbohydrate Polymers, 77(1), 95-104.
Smejkalová, D., Hermannová, M., Šuláková, R., Průšová, A., Kučerlk. J., & Velebný, V., (2012). Structural and conformational differences of acylated hyaluronan modified in protic and aprotic solvent systém. Carbohydrate Polymers, 87(2), 1460-1466.
Tao, Y., Xu, J., Chen, M., Bai, H., & Liu X. Core cross-linked hyaluronan-styrylpyridinium micelles as a novel carrier for paclitaxel. (2012). Carbohydrate Polymers, 88(1), 118-124.
Til, H.P., Falke, Η. E., Prinsen, Μ. K., & Willems, Μ. I. (1997). Acute and subacute toxicity of tyramine, spermidine, spermine, putrescine and cadaverine in rats. Food and Chemical Toxicology, 35 (3^1), 337-348.
Wang, J., Mongayt, D., & Torchilin, V.P. (2005). Polymeric micelles for delivery of poorly soluble drugs: Preparation and anticancer activity in vitro of paclitaxel incorporated into mixed micelles based on poly(ethylene glycol)—lipid conjugate and positively charged lipids. Journal of Drug Targeting, /3(1), 73-80.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. Stanovení kritické micelámí (agregační) koncentrace cmc metodou fluorescence na acylovaném hyaluronanu (C6) a (Cl6) s enkapsulovanou nilskou červení ve vodě.
Obrázek 2. Stanovení kritické micelámí (agregační) koncentrace cmc metodou statického rozptylu světla na acylovaném hyaluronanu (C6) a (Cl6) s enkapsulovanou olejovou červení ve vodě.
Obrázek 3. Cryo-SEM snímek nanomicel hyaluronanu s enkapsulovaným vitamínem E (homí obrázek) a s enkapsulovaným paclitaxelem (spodní obrázek).
Obrázek 4: Cytotoxicita paclitaxelu a paclitaxelu enkapsulovaného v HAC6 a HAC16 v závislosti na koncentraci a době působení na buňky.
Obrázek 5: Transport doxorubicinu do buněk HCT 116 a MCF-7 po 1 h. působení.
Obrázek 6: Buněčná intemalizace 7AAD v živých buňkách z nosičů HA(C6) s enkapsulovanou 7AAD.
Obrázek 7. Profil uvolňování enkapsulované olejové červeně z nosiče HAC6 do PBS a PBS s přídavkem 1 % TWEEN 80. Koncentrace HAC6+olejová červeň 1 nebo 10 mg.mL1.
- 10CZ 304654 B6
Obrázek 8. Profil uvolňování enkapsulovaného paclitaxelu z nosiče HAC6 a HAC16 (c = 10 mgmL'1 * 3) do PBS.
Obrázek 9. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10) a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do kůže.
Obrázek 10. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10)a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do vlasů (mikroskopický snímek zachycuje průřez svazkem vlasů).
Obrázek 11. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10) a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do bukální sliznice.
Obrázek 12. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10) a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do vaginální sliznice.
Příklady provedení vynálezu
SS = stupeň substituce = 100 % * molámí množství navázaného substituentu / molámí množství všech dimerů polysacharidu
Zde používaný výraz ekvivalent (eq) se vztahuje na dimer hyaluronanu, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozího hyaluronanu (zdroj: Contipro Biotech spol., sr.o., Dolní Dobrouč, ČR) byla stanovena metodou SEC-MALLS.
Příklad 1 Příprava kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kapronové.
g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) byl rozpouštěn v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 5 ml DMSO. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg,
0,05 eq.). Současně byla rozpouštěna kyselina hexanová (0,63 ml, 2 eq) v 5 ml DMSO, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (1,6 ml, 4eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu
h. při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMSO a DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 60 % (stanoveno z NMR) !H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 4H, γ, δ CH2), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
- 11 CZ 304654 B6
Příklad 2. Příprava kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kapronové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 38 kDa) byl rozpouštěn v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 5 ml izopropanolu. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a pyridin (0,4 ML, 2,0 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina hexanová (0,32 ml, 1 eq) v 5 ml izopropanolu, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, leq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,50 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění pyridinu z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 15% (stanoveno z NMR) *H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 4H, γ, δ CH2), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
Příklad 3. Příprava enanthyl esteru (C7) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny enanthové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) byla rozpouštěna v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml acetonitrilu. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,70 ml, 2 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina enanthová (0,35 ml, 1 eq) v 5 ml acetonitrilu, poté se do roztoku přidal TEA (0,70 ml, 2 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,39 ml, 1 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,75 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění acetonitrilu a DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 12 % (stanoveno z NMR) ’H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 6H, γ, δ, ε (CH2)3) (m, 4H, γ, δ (CH2), δ 0,8 (m, 3Η, CH3).
Příklad 4. Příprava kaprylyl esteru (C8) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kaprylové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml denní vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml acetonitrilu. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina oktanová (0,63 g, 4 eq) v 5 ml acetonitrilu, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,8 ml, 4 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,50 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roz-12CZ 304654 B6 tokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění acetonitrilu a DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 40 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 8H, (CH2)4), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
Příklad 5. Příprava kaprinyl esteru (CIO) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kaprinové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,025 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina dekanová (0,8 g, 2 eq) v 5ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,8 ml, 2 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění acetonitrilu a DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 15 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 12H, γ, δ, ε, ζ, η,θ CH2), δ 0,8 (m, 3Η, CH3).
Příklad 6. Příprava kaprinyl esteru (CIO) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kaprinové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina dekanová (0,8 g, 4 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,8 ml, 4 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolovaný srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění THF a DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 40 % (stanoveno z NMR) 'H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 12H, γ, δ, ε, ζ, η, θ CH2), δ 0,8 (m, 3Η, CH3).
- 13 CZ 304654 B6
Příklad 7. Příprava palmitoyl esteru (Cl6) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny palmitové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 38 kDa) byl rozpuštěn v 20 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 10 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina palmitová (0,16 g, 0,5 eq) v 10 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,098 ml, 0,5 eq.). Po aktivaci kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku ELA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
’HNMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 24H, (CH2)12), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
SS 14 % (stanoveno z NMR)
Příklad 8. Příprava stearyl esteru (Cl8) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny stearové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina stearová (0,71 lg, 2 eq) v 5ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě a následně byla reakční směs zahřívána po dobu 1 h při 50 °C. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 7 % (stanoveno z NMR) ]H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 28H, (CH2)14), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
Příklad 9. Příprava oleyl esteru (Cl8:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny olejové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,1 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,18g, 0,5 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,098 ml, 0.5 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izo- 14CZ 304654 B6 propanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 10 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-)10, δ 1,60 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
Příklad 10. Příprava oleyl esteru (08:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny olejové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 130 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 3 ml izopropanol. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,1 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,4 g, 1 eq) v 5 ml izopropanol, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,195 ml, 1 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 12 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-)10, δ 1,60 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
Příklad 11. Příprava oleyl esteru (Cl8:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu isobutyryl chloridu a kyseliny olejové
1,0 g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,787 ml, 1 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,5 ml, 3 eq.) a isobutyryl chlorid (0,26 ml, 1 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,50 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 11 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-)i0, δ 1,60 (m, 2H, -CHj-CHj-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
- 15 CZ 304654 B6
Příklad 12. Příprava oleyl esteru (Cl8:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny olejové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 130 kDa) bylo rozpuštěno v 5 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 3 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,5 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,1 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,787 ml, 2 eq) v 10 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 18 % (stanoveno z NMR)
Ή NMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-),o, δ 1,60 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
Příklad 13. Příprava linoleyl esteru (Cl8:2) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 130 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolová kyselina (0,77 ml, 2 eq) ve 3 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,2 ml, 7 eq.) a 2,4,6trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,5 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 16 % (stanoveno z NMR) ’HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 14H, -(CH2-)7), δ 1,63 (m, 2H, -CFb-CFF-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,44 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 2,83 (m, 2H, =CHCH2-CH=), δ 5,45 (m, 4H, CH=CH)
Příklad 14. Příprava linoleyl esteru (Cl8:2) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolová kyselina (0,77 ml, 2 eq) ve 3 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,2 ml, 7 eq.) a 2,4,6trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě a následně byla reakční směs zahřívána po dobu 1 h při 50 °C. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,75 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla
- 16CZ 304654 B6 nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 20 % (stanoveno z NMR) ‘HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 14H, -(CH2-)7), δ 1,63 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,44 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 2,83 (m, 2H, =CHCH2-CH=), δ 5,45 (m, 4H, CH=CH)
Příklad 15. Příprava linolenyl esteru (C18:3) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolenové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolenová kyselina (0,765 ml, 3 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2,0 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,75 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 15 % (stanoveno z NMR) ‘H NMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 8H, -(CH2-)4), δ 1,61 (m, 2H, -CH2CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,43 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 2,83 (m, 4H, =CH-CH2CH=), δ 5,45 (m, 6H, CH=CH)
Příklad 16. Příprava linolenyl esteru (Cl8:3) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolenové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolenová kyselina (0,382 ml, 1 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,195 ml, 1 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě a následně byla reakční směs zahřívána po dobu 1 h při 50 °C. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 10 % (stanoveno z NMR) ‘H NMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 8H, -(CH2-)4), δ 1,61 (m, 2H, -CfcLCH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,43 (t, 2H, -CH2-CO~), δ 2,83 (m, 4H, ^CH-ClfyCH=), δ 5,45 (m, 6H, CH=CH)
- 17CZ 304654 B6
Příklad 17. Enkapsulace tokoferolu (vitamínu E) do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok tokoferolu (10 mg ve 3 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další 3 ml CHC13. CHC13 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHC13 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného tokoferolu (HPLC stanovení): 2,3 % (hmotn.)
Příklad 18. Enkapsulace nilské červeně do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K. připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok nilské červeně (10 mg ve 3 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další 3 ml CHC13. CHC13 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHC13 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázané nilské červeně (UV-Vis stanovení): 0,4 % (hmotn.)
Příklad 19. Enkapsulace paclitaxelu do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok paclitaxelu (10 mg ve 3 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další 3 ml CHC13. CHC13 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHC13 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného paclitaxelu (HPLC stanovení): 5 % (hmotn.)
Příklad 20. Enkapsulace fosfatidylcholinu do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně po kapkách přidáván roztok fosfatidylcholinu (10 mg v 5 ml EtOH). EtOH byl z roztoku odstraněn vakuovou evaporací, zbylá vodní fáze byla vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného fosfatidylcholinu (HPLC stanovení): 3,0 % (hmotn.).
Příklad 21. Enkapsulace koenzymu Q10 do palmitoyl esteru (C16) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 7 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 30 až 40 °C postupně přidáván roztok koenzymu Q10 (20 mg v 5 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další
- 18CZ 304654 B6 ml CHC13. CHCI3 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHCI3 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydrátována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného koenzymu Q10 (UV-vis stanovení): 12,0 % (hmotn.).
Při rozpuštění produktu v 0,9% NaCl v závislosti na koncentraci rozpouštěného produktu dochází k tvorbě koacervátu nebo gelovitého roztoku.
Příklad 22. Enkapsulace tokoferolu (vitamínu E) do stearyl esteru (Cl 8) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 8 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok tokoferolu (cca 50 mg v 5 ml ethanolu). Ethanol byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění EtOH byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován. Množství navázaného tokoferolu (UV-vis stanovení): 30,0 % (hmotn.)
Příklad 23. Enkapsulace tokoferolu (vitamínu E) do stearyl esteru (C18:1) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 9 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok tokoferolu (cca 50 mg v 5 ml izopropanolu). Izopropanol byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění izopropanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného tokoferolu (UV-vis stanovení): 40,0 % (hmotn.)
Příklad 24. Enkapsulace koenzymu Q10 do palmitoyl esteru (C16) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 7 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok koenzylu Q10 (cca 30 mg v 2 ml EtOH). Po 3 hodinách míchání byla výsledná směs sonikována 30 min (100 W) a následně intenzivně dialyzována (2 dny) proti destilované vodě, zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr a zlyofilizována.
Množství navázaného koenzymu Q10 (UV-vis stanovení): 4,6 % (hmotn.)
Při rozpuštění produktu v 0,9% NaCl v závislosti na koncentraci rozpouštěného produktu dochází k tvorbě koacervátu nebo gelovitého roztoku.
Příklad 25. Enkapsulace paclitaxelu do palmitoyl esteru (Cl6) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 7 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok paclitaxelu (cca 40 mg ve 2 ml EtOH). Po 3 hodinách míchání byla výsledná směs sonikována 30 min (100 W) a následně intenzivně dialyzována (3,5 kDa cut off) proti destilované vodě, zfiltrována přes porcelánovou fritu S4 a zlyofilizována.
- 19CZ 304654 B6
Množství navázaného paclitaxelu (HPLC stanovení): 25 % (hmotn.).
Příklad 26. Enkapsulace chmelového extraktu do oleyl esteru (Cl8) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 9 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok směsi chmelového extraktu (cca 50 mg ve 5 ml izopropanolu). Izopropanol byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění izopropanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfdtrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného tokoferolu (UV-Vis stanovení): 40 % (hmotn.).
Příklad 27. Stanovení kritické micelámí (agregační) koncentrace acylovaného esteru kyseliny hyaluronové.
(a) Fluorescenční metoda
Kritická micelámí (agregační) koncentrace byla stanovena ze závislosti intenzity fluorescence na koncentraci roztoků (Obrázek 1). Emisní spektra (580 až 700 nm) vodných roztoků acylovaných hyaluronanů HAC6 (SS = 60 %) a HAC16 (SS = 14 %) s navázanou nilskou červení připravených podle postupu v příkladu 18 v rozsahu koncentrací 0,00002 až 1,5 mg.ml“1 byla proměřována na fluorometru RF-5301 (Shimadzu) při excitaci 543 nm.
Kritická micelámí (agregační) koncentrace HA C6: 0,001 až 0,003 mg.ml1 . HA 0 6 0,00006 až 0,0002 mg.ml1 (Obrázek 1). Stejná hodnota byla naměřena i pro PBS a 0,9% NaCl.
(b) Metoda statického rozptylu světla
Kritická micelámí (agregační) koncentrace byla stanovena ze závislosti intenzity rozptýleného světla (Igo) na koncentraci roztoků (Obrázek 2). Intenzita rozptýleného světla vodních roztoků acylovaných HAC6 (SS = 60 %) a HAC16 (SS = 14 %) s navázanou olejovou červení podle postupu v příkladu 18 v rozsahu koncentrací 0,00002 až 0,6 mg.ml“1 byla proměřována při úhlu 90° na fotometru DAWN EOS (Wyatt Technology Corporation) při vlnové délce 632 nm.
Kritická micelámí (agregační) koncentrace HA C6: 0,002 až 0,004 mg.ml1 . HA 0 6 0,00006 až 0,0001 mg.ml-1 (Obrázek 2). Stejná hodnota byla naměřena i pro PBS a 0,9% NaCl.
Příklad 28. Stanovení zeta potenciálu nanomicel hyaluronanu
Zeta potenciál byl stanoven na Zetasizeru Nano-ZS (Malvem Instruments) vybaveném He-Ne laserem (633 nm). Nezávisle na enkapsulované látce, nanomicely ve vodných roztocích vykazovaly zeta potenciál —50 mV při 5 mg.ml”1 a v rozmezí —60 až -70 mV po 10-ti násobném naředění. V 0,9% NaCl zeta potenciál klesl na -30 až -23 mV. Absolutní hodnota zeta potenciálu tedy indikuje vysokou stabilitu připravených nanomicel ve vodných roztocích a relativně vysokou stabilitu v solných roztocích.
-20CZ 304654 B6
Příklad 29. Morfologická analýza nanomicel hyaluronanu
Mikroskopické analýzy byly provedeny při -135 °C na skenovacím mikroskopu JEOL 7401F pracujícím při urychlovacím napětí 2 kV (jemný paprskový režim). Pro analýzu byly 2 až 3 pL koncentrovaného vzorku (cca 20 mg/0,4 ml) nakapány na Al destičku, ponořeny do kapalného dusíku v kryokomoře Alta 2500 (gatan) a pokoveny 2 min ve směsi Pt/Pd.
Velikost nanomicel hyaluronanu C6 s enkapsulovaným vitaminem E (příklad 17) a HAC16 s enkapsulovaným paclitaxelem (příklad 25): 20 až 50 nm (Obrázek 3).
Příklad 30. Distribuce acylovaných řetězců a nepolární látky v nanomicelách hyaluronanu
Separace nanomicel hydrofobizovaného hyaluronanu s enkapsulovaným vitamínem E byla provedena pomocí frakcionace tokem v tokovém poli (FIFFF) s použitím frit-inlet separačního kanálu. Pro analýzu bylo 10 mg lyofilizátu acylovaného hyaluronanu s navázaným vitamínem E (připraveno za použití acylovaných hyaluronanů v tabulce 1 podle postupu v příkladu 23) rozpuštěno v 1 ml mobilní fáze (50 mM NaNO3 s 0,02% NaN3), přefiltrováno přes stříkačkový skleněný filtr s velikostí pórů 1 pm a 100 μΐ bylo injektováno do FIFFF.
Separace byla provedena pomocí gradientu cross flow z 2 na 0,1 ml/min během 15 minut. Průtok mobilní fáze do detektoru byl udržován konstantní na hodnotě 1 ml/min.
Separace probíhala při laboratorní teplotě. Eluát byl monitorován pomocí detektoru rozptylu světla DAWN EOS, diferenciálního refraktometru Optilab rEX (oba od Wyatt Technology Corporation) a UV detektoru při 292 nm (Shimadzu).
Metodou lze zjistit, kolik procent navázané látky a hydrofobizovaného hyaluronanu je pevně inkorporováno uvnitř nanomicel a kolik je přítomno mimo zreagované útvary (viz tabulka 1).
Tabulka 1. Distribuce acylových řetězců a vitamínu E (tokoferolu) v agregátech (nanomicelách) hyaluronanu a mimo ně.
Nosič (stupeň substituce) Vazebná kapacita tokofero- lu (hm. %) Nezagregované acylové skupiny (%) Zagregované acylové skupiny (%) Volný Vitamín E (%) Vázaný Vitamín E (%)
HAC6 (DS=55%) 6,9 91,5 8,5 0,5 99,5
HAC8 (DS = 15%) 12,4 82,1 17,9 0,4 99,6
HAC10 (DS = 15%) 18,5 47,2 52,8 0,5 99,5
HAC18 (DS = 10%) 40 21,5 78,5 0,3 99,7
Výsledky v tabulce 1 ukazují, že distribuce acylových řetězců v nanomicelách hyaluronanu je ovlivněna především délkou acylového řetězce. Se vzrůstající délkou řetězce narůstá agregace acylových řetězců. Nezávisle na délce acylového řetězce dochází k inkorporaci nepolární látky do nanomicely. V tomto případě vždy zcela převažuje (> 99,5 %) distribuce nepolární látky v micele.
-21 CZ 304654 B6
Příklad 31. Cytotoxicita nanomicel nesoucí cytostatikum paclitaxel
Paclitaxel navázaný do acylovaných hyaluronanů C6 a C16 připravený podle postupu v příkladu 19 a 25 byl rozpuštěn v kultivačním médiu (s 10% FBS) na koncentraci 100 pg/ml neseného acylovanými hyaluronany C6 a Cl6. Účinek paclitaxelu neseného acylovanými hyaluronany C6 a 06 byl srovnáván se samotným paclitaxelem (Obrázek4). Měření buněčné viability je založeno na detekci aktivity enzymu dehydrogenázy, který je aktivní v živých buňkách, a přeměňuje žlutý substrát na fialový roztok, jehož absorbance se detekuje při 540nm a je přímo úměrná živým buňkám.
S rostoucí koncentrací nosiče, zejména v případě HAC16, docházelo ke zmírnění cytostatického účinku paclitaxelu (obrázek 4).
Samotné acylované hyaluronany nevykazovaly cytotoxické účinky.
Příklad 32. Transfer enkapsulované látky do buňky
Látky doxorubicin a 7-aminoactinomycin D (7-AAD, látka pronikající pouze do mrtvých nebo permeabilizovaných buněk) byly enkapsulovány do acylovaného hyaluronanu C6 podle postupu v příkladu 18 (nilská červeň nahrazena 7-AAD). Na buňkách lidských dermálních fibroblastů (NHDF), linii lidského prsního karcinomu (MCF-7) a linii lidského střevního karcinomu (HCT 116) bylo otestováno metodou fluorescenční mikroskopie (invertovaný mikroskop Nikon Eclipse Ti), zdaje rozdíl mezi průnikem nesené látky do buňky, pokud je samotná látka v roztoku, anebo pokud je nesena v acylovaném hyaluronanu C6. Doxorubicin byl testován v koncentracích 5,0 pg/ml (Obrázek 5) a 7-AAD (Obrázek 6) v koncentraci 15 pg/ml.
Transfer látek z nosiče do buněk byl úspěšný.
Příklad 33. Uvolňování enkapsulované olejové červeně z nanomicel do roztoku
Uvolňování olejové červeně (Oil Red O, solvent red 27) enkapsulované v HAC6 podle postupu v příkladu 18 (nilská červeň nahrazena Oil Red O) bylo studováno in vitro do roztoků PBS nebo PBS s přídavkem 1% TWEEN 80. Vodné roztoky acylovaných hyaluronanů o koncentraci 1 a 10 mg.mF1 s navázanou olejovou červení byly rozpuštěny v PBS nebo PBS s 1% TWEEN 80, kvantitativně převedeny do dialyzačního střeva (MWCO 12-14 kDa, Spectrum Laboratories) a byly dialyzovány při 37 °C proti PBS nebo PBS s přídavkem 1% TWEEN 80. 4 ml dialyzátu byly odebrány a nahrazeny čerstvým médiem v předem definovaných intervalech. Uvolněné množství olejové červeně bylo stanoveno pomocí UV—Vis (obrázek 7).
Pomalé uvolňování navázané látky ukazuje na vysokou stabilitu nosičových systémů v PBS.
Příklad 34. Uvolňování enkapsulovaného paclitaxelu látek z nanomicel do roztoku
Uvolňování paclitaxelu enkapsulované v HAC6 a HAC16 podle postupu v příkladu 19 a 25 bylo studováno in vitro do roztoků při 37 °C. Vodné roztoky acylovaných hyaluronanů obsahující celkovou koncentraci paclitaxelu 0,2 mg byly rozpuštěny v PBS, kvantitativně převedeny do dialyzačního střeva (MWCO 12 až 14 kDa, Spectrum Laboratories) a byly dialyzovány při 37 °C proti 50 ml PBS. Dialyzát byl nahrazován čerstvým médiem v předem definovaných intervalech. Uvolněné množství paclitaxelu bylo stanoveno po jeho extrakci do chloroformu, odpaření a následném rozpuštění v acetonitrilu pomocí HPLC (obrázek 8).
-22CZ 304654 B6
Pomalejší uvolňování evidováno pro HAC16 oproti HAC6. Pomalé uvolňování navázané látky ukazuje na vysokou stabilitu nosičových systémů v PBS.
Příklad 35. Příprava nanoemulzí a mikroemulzí z oleyl esteru(C18:l) kyseliny hyaluronové a kyseliny olejové mg acylovaného hyaluronanu připraveného v příkladu 11 bylo přes noc rozpouštěno ve 4 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku bylo za stálého míchání postupně přidáváno 8 mg kyseliny olejové. Po promíchání byla výsledná směs sonikována (Ultrasonic Processor, UPS 200S, output 200W) nejprve kontinuálně po dobu 25 min (amplituda 50 %) a poté s 0,8 s pulzací (amplituda 70 %) po dobu 25 min. V průběhu sonikace byla skleněná nádoba se sonikovanou směsí ponořena v ledové lázni pro zamezení přehřívání.
Velikost částic (zetasizer): 200 až 300 nm. Velikost je závislá na množství olejové fáze ve směsi.
Příklad 36. Příprava nanoemulzí a mikroemulzí z oleyl esteru(C18:l) kyseliny hyaluronové, kyseliny olejové a koenzymu Q10 mg acylovaného hyaluronanu připraveného v příkladu 11 bylo přes noc rozpouštěno ve 4 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku bylo za stálého míchání postupně přidáváno 8 mg kyseliny olejové sjiž rozpuštěným koenzymem Q10 (cca 0,5 mg). Po promíchání byla výsledná směs sonikována (Ultrasonic Processor, UPS 200S, output 200W) nejprve kontinuálně po dobu 25 min (amplituda 50 %) a poté s 0,8 s pulzací (amplituda 70 %) po dobu 25 min. V průběhu sonikace byla skleněná nádoba se sonikovanou směsí ponořena v ledové lázni pro zamezení přehřívání.
Velikost částic (zetasizer): 200 až 300 nm. Velikost je závislá na množství olejové fáze ve směsi.
Příklad 37. Stabilizace nanomicel kovalentním síťováním g hyaluronanu sodného (25 mmol, 38 kDa) bylo rozpouštěno v 200 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (6,97 ml, 2 eq. vzhledem k dimeru HA) a DMAP (153 mg, 0.05 eq.). Aktivace: 3,5 g kyseliny 3-(2-furyl)akrylové (25 mmol) bylo rozpuštěno v 50 ml tetrahydrofuranu a 19,2 ml TEA (2 eq.), následovalo chlazení v ledové lázni a přídavek trichlorbenzoyl chloridu (1,2 ml), reakce se nechala probíhat 15 minut. Poté byla aktivovaná kyselina přidána k roztoku hyaluronanu, reakce probíhala po dobu 24 h při 25 °C. Potom se reakční směs naředila vodou. Akrylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanol. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C. Získaný akrylovaný hyaluronan byl acylován, viz příklad 1, následně rozpuštěn ve vodě a lyofilizován za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
Nosičový systém připravený z olejové červeně (Oil red O) a akrylovaného hyaluronanu podle postupu v příkladu 18 (nilská červeň nahrazena olejovou červení) byl rozpuštěn jako 1% vodný roztok, a zesíťován v tomto vodném roztoku za použití iniciátoru peroxydisulfátu amonného (10% eq.).
SS 20 % aktivní skupiny pro foto cross-link (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 7,83, 6,87 (d, J=3,5), 6,87, 6,61 (bs), 7,83, 7,59 (J,ra™= 16,01), 6,39 (Jfraws-15, 85).
-23CZ 304654 B6
Příklad 38. Topická aplikace nanomicel hyaluronanu - penetrace do kůže, vlas a sliznic
Prasečí kůže, kravská vaginální a kravská bukální sliznice byly darovány od MasoEko, s.r.o. Kunčice 243, Letohrad. Vzorky byly ihned po odebrání vystaveny pasivnímu působení roztoku acylovaného hyaluronanu C6 a CIO (10 mg.mE1) s enkapsulovanou nilskou červení (připraveno podle postupu v příkladu 18) a penetrace do vzorku byla porovnána měřením fluorescence na invertovaném mikroskopu Nikon Eclipse Ti, objevit Pian Fluor 4x. Vzorky kůže byly inkubovány při 37 °C po dobu 20 hodin (obrázek 9), vzorky vlasů po dobu 15 minut (obrázek 10) a vzorky sliznic po dobu 4 hodin (obrázekl 1 a 12).
Nosiče zajistily efektivnější penetrace látek do kůže, vlasů a sliznic oproti olejovému a vodnému rozpouštědlu.

Claims (15)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Nanomicelámí kompozice na bázi C6-Ci8-acylováného hyaluronanu, vyznačující se t í m , že obsahuje C6-Ci8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I (I), kde R je I-f nebo Na+, a kde R1 je H nebo -C(=O)CxHy, kde x je celé číslo v rozmezí 5 až 17 a y je celé číslo v rozmezí 11 až 35 a CxHy je lineární nebo rozvětvený, nasycený nebo nenasycený řetězec C5-Ci7 a, přičemž alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1 -C(=O)CxHy, kde n je v rozmezí 12 až 4000, přičemž nanomicely představují hydrofobní jádro tvořené CóAfyg-acylovými skupinami navázanými na hyaluronan a hydrofilní obal tvořený hydrofilními funkčními skupinami hyaluronanu, a jednu nebo více biologicky aktivních látek fyzikálně vázaných v nanomicele.
2. Nanomicelámí kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje C6Cig-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I, kde R je H' nebo Na+ a R1 je -C(=O)(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3.
3. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoliv z nároků la2, vyznačující se tím, že obsahuje 0,3 až 50 % hmotnostních biologicky aktivní látky vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, přičemž biologicky aktivní látka je vybrána ze skupiny zahrnující farmaceuticky a kosmeticky aktivní látky, zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fytokomplexy nebo fytoaktivní látky, minerální nebo rostlinné oleje, nebo jejich směs.
4. Nanomicelámí kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že biologicky aktivní látkou je tokoferol, paclitaxel, fosfatidylcholin nebo koenzym Q10.
-24CZ 304654 B6
5. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž 4, vyznačující se tím, že obsahuje vyšší koncentraci C6-C|8-acylovaného hyaluronanu než je jeho kritická agregační koncentrace.
6. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž5, vyznačující se tím, že koncentrace C6-Ci8-acylované hyaluronanu v kompozici ve vodném roztoku je v rozmezí 0,0001 až 30 mg.ml'1, s výhodou 1 až 20 mg.ml'1.
7. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž 6, vyznačující se tím, že biologicky aktivní látkou je minerální nebo rostlinný olej v množství 0,05 až 40 % hmotn. vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, s výhodou 1 až 20 % hmotn.
8. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje biologicky aktivní látku, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, v níž je rozpouštěna další biologicky aktivní látka.
9. Nanomicelámí kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, je minerální nebo rostlinný olej, a další biologicky aktivní látkou je farmaceuticky nebo kosmeticky aktivní látka, zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fytokomplexy nebo fytoaktivní látky nebo jejich směs.
10. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž9, vyznačující se tím, žeje ve formě roztoku, nanoemulze, mikroemulze, koacervátu nebo gelu.
11. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoliv z nároků lažlO, vyznačující se tím, že v alespoň jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1 -C(=O)CxHy a jeden nebo více -C(=O)CH=CH-het, kde het je heterocyklický nebo heteroaromatický zbytek s volitelným obsahem N, S nebo O atomů.
12. Způsob přípravy C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I obsaženého v nanomicelámí kompozici definované v kterémkoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že hyaluronan reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru s C6-Ci8 karboxylovou kyselinou aktivovanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3-CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený Ci-C30 alkyl, heteroaromatická nebo aromatická funkční skupina.
13. Způsob přípravy podle nároku 12, vyznačující se tím, že hyaluronan je ve formě volné kyseliny nebo stabilní farmaceuticky přijatelné soli a má molekulovou hmotnost od 5x103 do l,6xl06 g/mol, s výhodou od 15xl03 do 250xl03g/mol, nejlépe 15xl03 až 50xl03 g/mol.
14. Způsob přípravy podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, že se rozpustí hyaluronan ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, kterým je polární organické rozpouštědlo, přičemž obsah vody je v rozmezí od 10 do 99 % objemových, s výhodou 50 % objemových.
15. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že aprotickým rozpouštědlem mísitelným s vodou se rozumí dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, aceton, acetonitril nebo izopropanol.
16. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12ažl5, vyznačující se tím, že v reakční směsi je přítomna báze R'3N, kde R' je lineární nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec CnHm, kde n je celé číslo v rozmezí 1 až 4 a m je celé číslo v rozmezí 3 až 9, jako např. triethylamin, v množství 0,01 až 20 ekvivalentů, s výhodou 6 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu, a katalyzátor vybraný ze skupiny zahrnující substituované pyridiny, jako dimethylaminopyri-25CZ 304654 B6 din a jeho deriváty, v množství 0,01 až 1 ekvivalent, s výhodou 0,05 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu.
17. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 16, vyznačující se tím, že se nejprve provede aktivace Cf)-Cis karboxylové kyseliny v polárním organickém rozpouštědle, v přítomnosti báze a kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové nebo jejích derivátů, nebo v přítomnosti báze a organického chloridu, následně se směs obsahující aktivovanou C6-Ci8 karboxylovou kyselinu přidá k hyaluronanu rozpuštěného ve směsi vody, organického rozpouštědla, báze a katalyzátoru a nechá se proběhnout reakce za vzniku C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I.
18. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 17, vyznačující se tím, že C6Cig karboxylová kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu kapronovou, enanthovou, kaprylovou, kaprinovou, palmitovou, stearovou, olejovou, linolovou a linolenovou.
19. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 18, vyznačující se tím, že množství aktivované C6-Ci8 karboxylové kyseliny je v rozmezí 0,01 až 5 ekvivalentů, s výhodou 0,5 až 2 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu.
20. Způsob přípravy podle nároků 12 až 19, vyznačující se tím, že aktivace C6-C18 karboxylové kyseliny probíhá po dobu 5 až 120 minut, s výhodou 30 minut, při teplotě od 20 až 60 °C, s výhodou při 25 °C.
21. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 20, vyznačující se tím, že reakce hyaluronanu s aktivovanou C6-Ci8 karboxylovou kyselinou probíhá po dobu 1 až 24 hodin, s výhodou 2 až 3 hodiny, při teplotě od 20 do 60 °C, s výhodou při 25 °C.
22. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 21, vyznačující se tím, že se C6-C)8-acylovaný hyaluronan následně izoluje z reakční směsi, promyje, suší a lyofilizuje.
23. Způsob přípravy podle nároku 22, vyznačující se tím, že se C6-Ci8-acylovaný hyaluronan izoluje z reakční směsi srážením za použití NaCl a alkoholu.
24. Způsob přípravy podle nároku 22 nebo 23, vyznačující se tím, že se C6-C]8acylovaný hyaluronan promyje alkoholem, zejména izopropanolem nebo ethanolem.
25. Způsob přípravy nanomicelámí kompozice definované v kterémkoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se Cé-Cig-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a biologicky aktivní látka se rozpustí v organickém rozpouštědle, oba roztoky se smíchají, poté se organické rozpouštědlo odstraní.
26. Způsob přípravy podle nároku 25, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo se odstraní vakuovou evaporací, následně se vodná fáze usuší, rehydratuje, získané nanomicelámí útvary se zfiltrují a nakonec lyofilizují.
27. Způsob přípravy podle nároku 25, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo se odstraní dialýzou, získané nanomicelámí útvary se poté zfiltrují a nakonec lyofilizují.
28. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem je těkavé chlorované rozpouštědlo jako trichlormethan, nebo alkohol jako ethanol nebo izopropanol.
29. Způsob přípravy nanomicelámí kompozice definované v kterémkoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se C6-C18-acyl ováný hyaluronan podle obecného vzorce 1 roz-26CZ 304654 B6 pustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze.
30. Způsob přípravy nanomicelámí kompozice definované v nároku 29, vyznačující se 5 t í m , že se C6-C]8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě a v níž je rozpuštěna další biologicky aktivní látka, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze.
ío
31. Použití nanomicelámí kompozice definované v kterémkoli z nároků 1 až 11 pro farmaceutické nebo kosmetické aplikace, s výhodou zejména pro topické aplikace.
32. Způsob přípravy stabilní nanomicelámí kompozice, vyznačující se tím, že se připraví C6-C18-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce II kde R je I-Γ nebo Na+, alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1 představován C6-Ci8 lineárním řetězcem, který může obsahovat nenasycené vazby, a alespoň v jedné opakující
20 se jednotce je jeden nebo více R1 představován 3-(2-thienyl)akrylovou kyselinou nebo 3-(2furyl)akrylovou kyselinou nebo jejich deriváty; načež se z C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce II připraví nanomicelámí kompozice, která se stabilizuje síťovací reakcí.
33. Způsob přípravy podle nároku 32, vyznačující se tím, že nejprve hyaluronan
25 reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru, s 3-(2-thienyl)akrylovou kyselinou nebo 3-(2-furyl)akrylovou kyselinou nebo jejich derivátem, aktivovanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3-CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený Ci-C30 alkyl, případně obsahující heteroaromatické nebo aromatické funkční skupiny, za vzniku akrylovaného hyaluronanu pod30 le vzorce III
-27CZ 304654 B6 0 OR OR
To
OH /
NH
CH3CO
R=H+ nebo Na+, R1 =
H z = o o
(III), poté akrylovaný hyaluronan podle vzorce III reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru, s C6-Cl8 karboxylovou kyselinou aktivo5 vanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený C]-C3o alkyl, příležitostně obsahující heteroaromatické nebo aromatické funkční skupiny, za vzniku C6-C!8-acylovaného hyaluronanu podle vzorce II, následně se z hyaluronanu podle vzorce II připraví nanomicelární kompozice způsobem definovaným v kterémkoli z nároků 25 až 30, která se poté podrobí síťovací reakci pomocí radikálo10 vých reakcí.
34. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 32 a 33, vyznačující se tím, že radikálová reakce je katalyzovaná síťovacím činidlem.
15 35. Způsob přípravy podle nároku 34, vyznačující se tím, že síťovacím činidlem je peroxydisulfát amonný.
CZ2012-842A 2012-11-27 2012-11-27 Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití CZ304654B6 (cs)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2012-842A CZ304654B6 (cs) 2012-11-27 2012-11-27 Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
EP13829034.1A EP2934592B1 (en) 2012-11-27 2013-11-26 C6-c18-acylated derivative of hyaluronic acid, method of preparation thereof, nanomicellar composition on its basis, method of preparation thereof and method of preparation stabilized nanomicellar composition, and use thereof
HUE13829034A HUE038664T2 (hu) 2012-11-27 2013-11-26 Hialuronsav C6-C18-acilezett származéka, eljárás annak elõállítására, erre épülõ nanomicelláris kompozíció, eljárás annak elõállítására és eljárás stabilizált nanomicelláris kompozíció elõállítására, valamint annak alkalmazása
US14/647,626 US9999678B2 (en) 2012-11-27 2013-11-26 C6-C18-acylated derivative of hyaluronic acid and method of preparation thereof
DK13829034.1T DK2934592T3 (en) 2012-11-27 2013-11-26 C6-C18 acylated hyaluronic acid derivative, method of preparation thereof, on the basis of nanomicellar composition, method of preparation thereof, and method of preparation of a stabilized nanomicellar composition and use thereof
PL13829034T PL2934592T3 (pl) 2012-11-27 2013-11-26 C6-c18-acylowana pochodna kwasu hialuronowego, sposób jej wytwarzania, mieszanina nanomicelarna na jej bazie, sposób jej wytwarzania oraz sposób wytwarzania stabilizowanej mieszanki nanomicelarnej i jej zastosowanie
JP2015543316A JP2016500130A (ja) 2012-11-27 2013-11-26 ヒアルロン酸のｃ６‐ｃ１８‐アシル化誘導体とその調製方法，それをベースとするナノミセル組成物及びその調製方法，並びに安定化されたナノミセル組成物の調製方法及びその使用
PCT/CZ2013/000156 WO2014082609A1 (en) 2012-11-27 2013-11-26 C6-c18-acylated derivative of hyaluronic acid, method of preparation thereof, nanomicellar composition on its basis, method of preparation thereof and method of preparation stabilized nanomicellar composition, and use thereof
ES13829034.1T ES2683993T3 (es) 2012-11-27 2013-11-26 Derivado acilado de C6-C18 de ácido hialurónico, su método de preparación, composición nanomicelar basada en él, su método y preparación y método de preparación de la composición nanomicelar estabilizada, y su uso
KR1020157016788A KR102191353B1 (ko) 2012-11-27 2013-11-26 히알루론산의 c6-c18-아실화된 유도체, 이의 제조 방법, 이를 기재로 하는 나노미쉘형 조성물, 이의 제조 방법, 및 안정화된 나노미쉘형 조성물의 제조 방법, 및 이의 용도
BR112015012191A BR112015012191A8 (pt) 2012-11-27 2013-11-26 derivado c6-c18 acilado de ácido hialurônico, método de preparação de um derivado de ácido hialurônico, composição nanomicelar com base em um derivado c6-c18 acilado de ácido hialurônico, método de preparação da composição nanomicelar, uso de composição nanomicelar, método de preparação de composição nanomicelar estabilizada
RU2015125076A RU2640287C2 (ru) 2012-11-27 2013-11-26 С6-с18-ацилированное производное гиалуроновой кислоты, способ его получения, наномицеллярная композиция на его основе, способ ее получения и способ получения стабилизированной наномицеллярной композиции и ее применение

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2012-842A CZ304654B6 (cs) 2012-11-27 2012-11-27 Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2012842A3 CZ2012842A3 (cs) 2014-08-20
CZ304654B6 true CZ304654B6 (cs) 2014-08-20

Family

ID=50097520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2012-842A CZ304654B6 (cs) 2012-11-27 2012-11-27 Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9999678B2 (cs)
EP (1) EP2934592B1 (cs)
JP (1) JP2016500130A (cs)
KR (1) KR102191353B1 (cs)
BR (1) BR112015012191A8 (cs)
CZ (1) CZ304654B6 (cs)
DK (1) DK2934592T3 (cs)
ES (1) ES2683993T3 (cs)
HU (1) HUE038664T2 (cs)
PL (1) PL2934592T3 (cs)
RU (1) RU2640287C2 (cs)
WO (1) WO2014082609A1 (cs)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ304654B6 (cs) 2012-11-27 2014-08-20 Contipro Biotech S.R.O. Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
CZ305153B6 (cs) 2014-03-11 2015-05-20 Contipro Biotech S.R.O. Konjugáty oligomeru kyseliny hyaluronové nebo její soli, způsob jejich přípravy a použití
CZ2014451A3 (cs) * 2014-06-30 2016-01-13 Contipro Pharma A.S. Protinádorová kompozice na bázi kyseliny hyaluronové a anorganických nanočástic, způsob její přípravy a použití
CZ309295B6 (cs) * 2015-03-09 2022-08-10 Contipro A.S. Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití
WO2016194869A1 (ja) * 2015-05-29 2016-12-08 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン誘導体とケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物
CZ2015398A3 (cs) 2015-06-15 2017-02-08 Contipro A.S. Způsob síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránicích skupin
CZ306662B6 (cs) 2015-06-26 2017-04-26 Contipro A.S. Deriváty sulfatovaných polysacharidů, způsob jejich přípravy, způsob jejich modifikace a použití
CZ307511B6 (cs) 2015-12-23 2018-10-31 Contipro A.S. Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl, hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a použití
CZ308106B6 (cs) 2016-06-27 2020-01-08 Contipro A.S. Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití
CZ2016826A3 (cs) 2016-12-22 2018-07-04 Contipro A.S. Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití
CZ307158B6 (cs) * 2016-12-23 2018-02-07 Contipro A.S. Oftalmologický prostředek
EP3813895A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Fatty acid-grafted hyaluronic acid, dermal filler formulations comprising same, process for preparation and use thereof
FR3105922B1 (fr) 2020-01-08 2022-12-02 Le Rouge Francais Composition cosmétique pour le traitement des lèvres sous forme de solide compact contenant au moins un agent probiotique et au moins un composé choisi parmi l'acide hyaluronique et ses dérivés.
JP7397103B2 (ja) * 2020-02-05 2023-12-12 旭化成株式会社 ヒアルロン酸誘導体組成物、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物
CN114945600A (zh) * 2020-02-07 2022-08-26 旭化成株式会社 透明质酸衍生物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体
KR102547183B1 (ko) * 2020-10-19 2023-06-26 주식회사 메피온 필러 및 필러 제조 방법
CN112159527B (zh) * 2020-10-29 2023-06-06 绍兴文理学院 一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯ha-pg及其合成方法和其在制备药物制剂中的应用
CN113476426B (zh) * 2021-06-29 2023-11-24 大连工业大学 一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备及其在炎症性肠病中的应用
CN114561827B (zh) * 2022-02-25 2023-04-21 华南理工大学 一种全生物质基蜡乳液防水涂料及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090252810A1 (en) * 2005-09-26 2009-10-08 Novozymes Biopolymer A/S Aryl/alkyl Succinic Anhydride-Hyaluronan Derivatives
CZ301899B6 (cs) * 2009-03-17 2010-07-21 Contipro C, A.S. Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové pomocí O-acyl-O´-alkylkarbonátu v prítomnosti substituovaného pyridinu
CZ302856B6 (cs) * 2006-09-27 2011-12-14 Cpn Spol. S R. O. Zpusob prípravy derivátu polysacharidu

Family Cites Families (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3720662A (en) 1971-09-13 1973-03-13 Nat Starch Chem Corp Preparation of starch esters
US3728223A (en) 1971-10-08 1973-04-17 Amano Pharma Co Ltd Production of hyaluronidase from a strain of streptomyces
GB1527592A (en) 1974-08-05 1978-10-04 Ici Ltd Wound dressing
CH628088A5 (en) 1975-09-17 1982-02-15 Dresden Arzneimittel Process for obtaining streptococcal metabolic products
US4205025A (en) 1975-12-22 1980-05-27 Champion International Corporation Synthetic polymeric fibrids, fibrid products and process for their production
JPS6033474B2 (ja) 1978-05-11 1985-08-02 藤沢薬品工業株式会社 新規なヒアルロニダ−ゼｂｍｐ−８２３１およびその製造法
US4716224A (en) 1984-05-04 1987-12-29 Seikagaku Kogyo Co. Ltd. Crosslinked hyaluronic acid and its use
US4713448A (en) 1985-03-12 1987-12-15 Biomatrix, Inc. Chemically modified hyaluronic acid preparation and method of recovery thereof from animal tissues
US4851521A (en) 1985-07-08 1989-07-25 Fidia, S.P.A. Esters of hyaluronic acid
GB8519416D0 (en) 1985-08-01 1985-09-04 Unilever Plc Oligosaccharides
JPS62104579A (ja) 1985-10-30 1987-05-15 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒアルロニダ−ゼの製造法
JPH0751064B2 (ja) 1986-08-13 1995-06-05 生化学工業株式会社 新規なヒアルロニダ−ゼｓｄ−６７８およびその製造法
IT1219587B (it) 1988-05-13 1990-05-18 Fidia Farmaceutici Polisaccaridi carbossiilici autoreticolati
JPH0214019A (ja) 1988-06-30 1990-01-18 Tonen Corp 繊維状成形物及びその製造方法
JPH0755961B2 (ja) * 1989-04-18 1995-06-14 工業技術院長 新規なヒアルロン酸誘導体及びその製造方法
US5522879A (en) 1991-11-12 1996-06-04 Ethicon, Inc. Piezoelectric biomedical device
US5824335A (en) 1991-12-18 1998-10-20 Dorigatti; Franco Non-woven fabric material comprising auto-crosslinked hyaluronic acid derivatives
IT1254704B (it) 1991-12-18 1995-10-09 Mini Ricerca Scient Tecnolog Tessuto non tessuto essenzialmente costituito da derivati dell'acido ialuronico
JP2855307B2 (ja) 1992-02-05 1999-02-10 生化学工業株式会社 光反応性グリコサミノグリカン、架橋グリコサミノグリカン及びそれらの製造方法
FR2689131B1 (fr) 1992-03-30 1994-05-20 Oreal Procede de preparation de monoesters majoritairement en position 6' du d-maltose et leur utilisation dans les domaines cosmetique, bucco-dentaire, pharmaceutique et alimentaire.
JPH0625306A (ja) * 1992-04-21 1994-02-01 Shiseido Co Ltd 溶媒不溶化ヒアルロン酸及びその製造方法
IT1263316B (it) 1993-02-12 1996-08-05 Fidia Advanced Biopolymers Srl Tessuto non tessuto multistrato in cui uno degli strati e' costituito essenzialmente da esteri dell'acido ialuronico
NL9700003A (nl) 1993-09-28 1997-07-01 House Foods Corp Werkwijze voor het inoculeren van Fistulina hepatica.
US5616568A (en) 1993-11-30 1997-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Functionalized derivatives of hyaluronic acid
JP3662253B2 (ja) 1994-03-14 2005-06-22 生化学工業株式会社 眼部装着材
US5455349A (en) 1994-05-13 1995-10-03 Polaroid Corporation Vinylbenzyl thymine monomers
AU687093B2 (en) 1994-09-27 1998-02-19 Nycomed Imaging As Contrast agent
JP3308742B2 (ja) 1994-11-17 2002-07-29 生化学工業株式会社 光架橋性ヒアルロン酸誘導体とその架橋体およびそれらの製造方法
US6025444A (en) 1994-11-17 2000-02-15 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Cinnamic acid derivative
US5690961A (en) 1994-12-22 1997-11-25 Hercules Incorporated Acidic polysaccharides crosslinked with polycarboxylic acids and their uses
US6011149A (en) 1995-03-07 2000-01-04 Novartis Ag Photochemically cross-linked polysaccharide derivatives as supports for the chromatographic separation of enantiomers
IT1281877B1 (it) 1995-05-10 1998-03-03 Fidia Advanced Biopolymers Srl Sali di metalli pesanti di succinil derivati dell'acido ialuronico e loro impiego come potenziali agenti terapeutici
AU718484B2 (en) 1995-08-29 2000-04-13 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. Biomaterials for preventing post-surgical adhesions comprised of hyaluronic acid derivatives
DE69625658T2 (de) 1995-09-13 2003-07-17 Seikagaku Kogyo K K Seikagaku Kontaktlinse auf Basis photogehärteter Hyaluronsäure
DE19604706A1 (de) 1996-02-09 1997-08-14 Merck Patent Gmbh Vernetzungsprodukte von Aminogruppen-haltigen Biopolymeren
DE19616010C2 (de) 1996-04-23 1998-07-09 Seitz Filter Werke Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Fibrets (Fibriden) aus Zellulosederivaten
IT1287698B1 (it) 1996-08-29 1998-08-18 Fidia Advanced Biopolymers Srl Fili da sutura essenzialmente costituiti da derivati esterei dello acido ialuronico
US6632802B2 (en) 1996-08-29 2003-10-14 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. Hyaluronic acid esters, threads and biomaterials containing them, and their use in surgery
IT1286510B1 (it) 1996-11-29 1998-07-15 Cooperativa Centro Ricerche Po Esteri butirrici ad attivita' antiproliferativa e composizioni farmaceutiche che li contengono
CN1161127C (zh) 1997-07-03 2004-08-11 奥奎斯特公司 交联的多糖药物载体
US5977348A (en) 1997-07-25 1999-11-02 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Polysaccharide modification in densified fluid
US6613897B1 (en) 1998-04-30 2003-09-02 Maruha Corporation Compounds having glucuronic acid derivatives and glucosamine derivative in the structure, process for producing the same and utilization thereof
KR20010071212A (ko) 1998-05-07 2001-07-28 추후보정 일차 알콜의 선택적 산화 반응
US6630457B1 (en) 1998-09-18 2003-10-07 Orthogene Llc Functionalized derivatives of hyaluronic acid, formation of hydrogels in situ using same, and methods for making and using same
IT1302534B1 (it) 1998-12-21 2000-09-05 Fidia Advanced Biopolymers Srl Composizioni iniettabili, biocompatibili e biodegradabili comprendentialmeno un derivato dell'acido ialuronico, cellule condrogeniche, per
US6719986B1 (en) 1998-12-23 2004-04-13 Esparma Gmbh Hyaluronate lyase used for promoting penetration in topical agents
DE19917614C2 (de) 1999-04-19 2001-07-05 Thueringisches Inst Textil Verfahren zur Herstellung von cellulosischen Formkörpern mit hohem Adsorptionsvermögen
US6288043B1 (en) 1999-06-18 2001-09-11 Orquest, Inc. Injectable hyaluronate-sulfated polysaccharide conjugates
US6592794B1 (en) 1999-09-28 2003-07-15 Organogenesis Inc. Process of making bioengineered collagen fibrils
CO5231217A1 (es) 1999-11-08 2002-12-27 Sca Hygiene Prod Zeist Bv Procedimiento de oxidacion de alcoholes primarios
DE10003397A1 (de) 2000-01-27 2001-08-09 Hartmann Paul Ag Polyelektrolyt-Feststoffsystem, Verfahren zur Herstellung desselben sowie Wundverband
DE10009996B4 (de) * 2000-03-02 2005-10-13 Cognis Ip Management Gmbh Feststoffgranulate mit monodisperser Korngrößenverteilung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
IT1317358B1 (it) 2000-08-31 2003-06-16 Fidia Advanced Biopolymers Srl Derivati cross-linkati dell'acido ialuronico.
IT1317359B1 (it) 2000-08-31 2003-06-16 Fidia Advanced Biopolymers Srl Polisaccaridi percarbossilati, quali l'acido ialuronico, processo perla loro preparazione e loro impiego in campo farmaceutico e
US6498269B1 (en) 2000-10-17 2002-12-24 The University Of Connecticut Method for the oxidation of aldehydes, hemiacetals and primary alcohols
AU2002219718A1 (en) 2000-12-13 2002-06-24 Sca Hygiene Products Zeist B.V. Process for oxidising primary alcohols
DE60117502T2 (de) 2000-12-19 2006-08-24 Seikagaku Corp. Photohärtbare Derivate von Hyaluronsäure, Verfahren zu deren Herstellung, vernetztes und photogehärtetes Derivat der Hyaluronsäure und diese enthaltendes medizinisches Material
FR2819808B1 (fr) 2001-01-19 2003-04-18 Simafex Compositions stabilisees d'acide o-iodoxybenzoique et leur procede de preparation
JP4135502B2 (ja) 2001-01-31 2008-08-20 生化学工業株式会社 架橋多糖スポンジ
US6902548B1 (en) 2001-03-19 2005-06-07 Ed Schuler Use of Streptomyces hyalurolyticus enzyme in ophthalmic treatments
US6673919B2 (en) 2001-03-30 2004-01-06 Chisso Cororation Chemically modified hyaluronic acid or salts thereof, and a process for producing thereof
US6946284B2 (en) 2001-11-16 2005-09-20 University Of Massachusetts Solubilizing cross-linked polymers with photolyase
US20060189516A1 (en) 2002-02-19 2006-08-24 Industrial Technology Research Institute Method for producing cross-linked hyaluronic acid-protein bio-composites
ITPD20020064A1 (it) 2002-03-12 2003-09-12 Fidia Advanced Biopolymers Srl Derivati esterei dell'acido ialuronico per la preparazione di idrogelda utilizzare in campo biomedico, sanitario e chirurgico e come sistem
JP3975267B2 (ja) 2002-06-03 2007-09-12 独立行政法人産業技術総合研究所 多糖物質のアシル化方法
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
JP4323148B2 (ja) * 2002-09-30 2009-09-02 チッソ株式会社 ｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩およびその製造法
US7550136B2 (en) 2002-12-20 2009-06-23 University Of Massachusetts Photo-reactive polymers and devices for use in hair treatments
ITMI20022745A1 (it) 2002-12-23 2004-06-24 Coimex Scrl United Companies Esteri misti dell'acido ialuronico ad attivita' citostatica e prodifferenziante e procedimento per la loro produzione.
US7465766B2 (en) 2004-01-08 2008-12-16 The Cleveland Clinic Foundation Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof
US6982298B2 (en) 2003-01-10 2006-01-03 The Cleveland Clinic Foundation Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof
US20050126338A1 (en) * 2003-02-24 2005-06-16 Nanoproducts Corporation Zinc comprising nanoparticles and related nanotechnology
FR2852012B1 (fr) 2003-03-04 2006-06-23 Oreal Procede de preparation de derives o-acyles du glucose
JP4813179B2 (ja) 2003-03-11 2011-11-09 生化学工業株式会社 光架橋多糖組成物およびその製造方法
ES2226567B1 (es) * 2003-06-20 2006-07-01 Universidad De Santiago De Compostela Nanoparticulas de acido hialuronico.
DE10331342B4 (de) 2003-07-11 2009-03-12 Thüringisches Institut für Textil- und Kunststoff-Forschung e.V. Thermostabile Form- oder Spinnmasse
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
TW200524959A (en) 2003-09-08 2005-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Hyaluronic acid modification product and drug carrier therefrom
US7235295B2 (en) 2003-09-10 2007-06-26 Laurencin Cato T Polymeric nanofibers for tissue engineering and drug delivery
CA2538793C (en) 2003-09-19 2011-01-11 Colorado State University Research Foundation (Csurf) Hyaluronan (ha) esterification via acylation technique for moldable devices
GB2408741B (en) 2003-12-04 2008-06-18 Ind Tech Res Inst Hyaluronic acid derivative with urethane linkage
US20100330143A1 (en) 2003-12-04 2010-12-30 University Of Utah Research Foundation Modified macromolecules and methods of making and using thereof
US8313765B2 (en) 2003-12-04 2012-11-20 Industrial Technology Research Institute Biodegradable hyaluronic acid derivative, biodegradable polymeric micelle composition and pharmaceutical or bioactive composition
ITMI20040605A1 (it) 2004-03-29 2004-06-29 Coimex S C R L United Companie Esteri butirrici dell'acido ialuronico a basso grado di sostituzione procedimento per la loro preparazione ed uso
JP2008505716A (ja) 2004-07-09 2008-02-28 ザ クリーヴランド クリニック ファウンデーション ヒドロキシフェニル架橋高分子ネットワーク及びその用途
US7323425B2 (en) 2004-08-27 2008-01-29 Stony Brook Technology And Applied Research Crosslinking of hyaluronan solutions and nanofiberous membranes made therefrom
US8481080B2 (en) * 2004-11-24 2013-07-09 Novozymes Biopolymer A/S Method of cross-linking hyaluronic acid with divinulsulfone
US7214759B2 (en) 2004-11-24 2007-05-08 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Biologically absorbable coatings for implantable devices based on polyesters and methods for fabricating the same
US7680038B1 (en) 2005-04-25 2010-03-16 Electronic Arts, Inc. Dynamic bandwidth detection and response for online games
GB0513552D0 (en) 2005-07-01 2005-08-10 Bristol Myers Squibb Co Bandage
RU2429018C2 (ru) 2005-07-06 2011-09-20 Сейкагаку Корпорейшн Гель, полученный из фотосшитой гиалуроновой кислоты с введенным лекарственным средством
ITPD20050206A1 (it) 2005-07-07 2007-01-08 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali in forma di fibra da impiegarsi come dispositivi medici nel trattamento delle ferite e loro processi di produzione
ITMI20051415A1 (it) 2005-07-22 2007-01-23 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali a base di corbossimetilcellulosa salificata con zinco associata a derivati dell'acido ialuronico da impiegarsi come dispositivi medici con attivita' antimicrobica ed antifungina e loro processo di produzione
CN101282985B (zh) 2005-09-21 2013-07-10 科德生物工程有限公司 用透明质酸低聚衍生物覆盖的细胞表面
WO2007070617A1 (en) 2005-12-14 2007-06-21 Anika Therapeutics, Inc. Bioabsorbable implant of hyaluronic acid derivative for treatment of osteochondral and chondral defects
EP1826274A1 (en) 2006-02-24 2007-08-29 Kikkoman Corporation Enzyme composition, low molecular weight hyaluronan and process for preparing the same
CN101432311A (zh) 2006-02-28 2009-05-13 诺维信生物聚合物公司 透明质酸衍生物
JP5399716B2 (ja) * 2006-03-02 2014-01-29 ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ アリール／アルキルビニルスルホンヒアルロン酸誘導体
JP4892679B2 (ja) 2006-03-27 2012-03-07 国立大学法人弘前大学 ゲル紡糸によるヒアルロン酸繊維およびその製造方法
KR20070118730A (ko) 2006-06-13 2007-12-18 주식회사 코오롱 보습성이 우수한 창상피복재 및 그의 제조방법
US20080124395A1 (en) 2006-06-22 2008-05-29 Weiliam Chen Formulations and devices for treatment or prevention of neural ischemic damage
CA2657823A1 (en) 2006-08-04 2008-02-07 Novozymes Biopolymer A/S Branched hyaluronic acid and method of manufacture
US20080063617A1 (en) 2006-09-07 2008-03-13 Abrahams John M Cosmetics formulations
ITMI20061726A1 (it) 2006-09-11 2008-03-12 Fidia Farmaceutici Derivati crosslinkati a base di acido ialuronico reticolato via click chemistry
BRPI0722061B8 (pt) 2006-12-22 2021-06-22 Croma Pharma Ges M B H uso de um polímero contendo grupo tiol e implante
KR20080062092A (ko) 2006-12-29 2008-07-03 주식회사 핸슨바이오텍 세포전달체로서의 히알루론산 유도체 및 이의 제조 방법
EP1942117A1 (en) 2006-12-29 2008-07-09 Sigea S.R.L. Derivatives of acid polysaccharides
JP5329767B2 (ja) 2007-02-26 2013-10-30 帝人株式会社 芳香族コポリアミド繊維の製造装置
WO2008115799A1 (en) 2007-03-21 2008-09-25 William Marsh Rice University Novel gene delivery vectors for human mesenchymal stem cells
CZ2007299A3 (cs) 2007-04-24 2009-02-04 Cpn Spol. S R. O. Príprava nanovláken z polysacharidu a jejich smesí s polyvinylalkoholem
JP5165281B2 (ja) 2007-06-01 2013-03-21 株式会社バイオベルデ ２反応剤型の医療用含水ゲル形成剤、及び、これより得られるヒアルロン酸ゲル
US8288142B2 (en) 2007-06-19 2012-10-16 Uvarkina Tamara P Hyaluronidase and method of use thereof
US8709809B2 (en) 2007-06-22 2014-04-29 Innovative Surface Technologies, Inc. Nanofibers containing latent reactive groups
US8268638B2 (en) 2007-07-18 2012-09-18 Advantageous Systems, Llc Methods and apparatuses for detecting analytes in biological fluid of an animal
FR2921675B1 (fr) 2007-09-28 2010-03-19 Univ Claude Bernard Lyon Filament a base d'acide hyaluronique et son procede d'obtention.
US7976825B2 (en) 2007-12-06 2011-07-12 Janos Borbely Cancer cell diagnosis by targeting delivery of nanodevices
EP2242794B1 (de) 2008-02-11 2014-04-30 Basf Se Verfahren zur herstellung poröser strukturen aus synthetischen polymeren
WO2009108100A1 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Ipr-Systems Sweden Ab Composition for the formation of gels
JP5563563B2 (ja) 2008-06-05 2014-07-30 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ ペルオキシダーゼおよび低濃度の過酸化水素の存在下でのヒドロゲルの形成方法
JP2010014784A (ja) 2008-07-01 2010-01-21 Fuji Xerox Co Ltd 光書込型表示装置、書込装置、及び光書き込み方法
FR2934999B1 (fr) 2008-08-13 2011-07-29 Adocia Polysaccharides fonctionnalises par des derives du tryptophane
ES2658609T3 (es) 2008-09-02 2018-03-12 Tautona Group Lp Hilos de ácido hialurónico y/o derivados de los mismos, métodos para fabricar los mismos, y usos de los mismos
CZ2008705A3 (cs) 2008-11-06 2010-04-14 Cpn S. R. O. Zpusob prípravy DTPA sítovaných derivátu kyseliny hyaluronové a jejich modifikace
ITRM20080636A1 (it) 2008-11-28 2010-05-29 Univ Palermo Procedimento per la produzione di derivati funzionalizzati dell acido ialuronico e relativi idrogeli.
JP2010138276A (ja) 2008-12-11 2010-06-24 Nipro Corp ヒアルロン酸単糸の製造方法
US8648144B2 (en) 2009-02-21 2014-02-11 Sofradim Production Crosslinked fibers and method of making same by extrusion
EP2398850B1 (en) 2009-02-21 2018-08-22 Sofradim Production Medical devices with an activated coating
AU2010215199B2 (en) 2009-02-21 2015-01-15 Sofradim Production Compounds and medical devices activated with solvophobic linkers
US8551378B2 (en) 2009-03-24 2013-10-08 North Carolina State University Nanospinning of polymer fibers from sheared solutions
US20120219554A2 (en) 2009-05-14 2012-08-30 Fidia Farmaceutici S.P.A. Extracellular yaluronidase from streptomyces koganeiensis
DE102009022805B4 (de) 2009-05-27 2013-04-25 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharidestern oder Polysaccharidmischestern
WO2010138074A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Hilborn Joens Hyaluronic acid based delivery systems
CN102458370A (zh) * 2009-06-09 2012-05-16 卢克斯生物科技公司 用于眼科用途的表面药物递送系统
EP2459239A1 (en) 2009-07-30 2012-06-06 Carbylan Biosurgery, Inc. Modified hyaluronic acid polymer compositions and related methods
KR101103423B1 (ko) 2009-09-04 2012-01-06 아주대학교산학협력단 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도
EP3067069B1 (en) 2009-11-11 2023-07-26 Hy2Care B.V. Hydrogels based on polymers of dextran tyramine and tyramine conjugates of natural polymers
WO2011059325A2 (en) 2009-11-11 2011-05-19 University Of Twente, Institute For Biomedical Technology And Technical Medicine (Mira) Dextran-hyaluronic acid based hydrogels
US20110111012A1 (en) 2009-11-12 2011-05-12 Hemcon Medical Technologies, Inc. Nanomaterial wound dressing assembly
CZ302504B6 (cs) 2009-12-11 2011-06-22 Contipro C A.S. Derivát kyseliny hyaluronové oxidovaný v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd, zpusob jeho prípravy a zpusob jeho modifikace
CZ302503B6 (cs) 2009-12-11 2011-06-22 Contipro C A.S. Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové oxidovaného v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd a zpusob jeho modifikace
US8197849B2 (en) 2010-02-12 2012-06-12 National Health Research Institutes Cross-linked oxidated hyaluronic acid for use as a vitreous substitute
CN101897976A (zh) * 2010-07-16 2010-12-01 沈阳药科大学 一种药物增溶载体及其制备方法和应用
CZ302994B6 (cs) 2010-12-31 2012-02-08 Cpn S.R.O. Hyaluronová vlákna, zpusob jejich prípravy a použití
CZ304072B6 (cs) 2011-04-26 2013-09-25 Contipro Biotech S.R.O. Amfoterní materiál na bázi sítované kyseliny hyaluronové, zpusob jeho prípravy, materiály obsahující aktivní cinidla uzavrené v síti hyaluronanu, zpusob jejich prípravy a jejich pouzití
CN102154738B (zh) 2011-05-10 2012-08-01 青岛大学 一种红藻琼胶纤维的制备方法
ITTO20110428A1 (it) 2011-05-13 2012-11-14 Rottapharm Spa Esteri dell'acido ialuronico, loro preparazione ed uso in dermatologia
EP2748359B1 (en) 2011-10-18 2018-01-03 HeiQ Pty Ltd Fibre-forming process and fibres produced by the process
CZ2012282A3 (cs) 2012-04-25 2013-11-06 Contipro Biotech S.R.O. Zesítovaný derivát hyaluronanu, zpusob jeho prípravy, hydrogel a mikrovlákna na jeho bázi
CZ304512B6 (cs) 2012-08-08 2014-06-11 Contipro Biotech S.R.O. Derivát kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy, způsob jeho modifikace a použití
CZ304267B6 (cs) 2012-11-27 2014-02-05 Contipro Biotech S.R.O. Fotoreaktivní derivát kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy, 3D síťovaný derivát kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití
CZ2012841A3 (cs) 2012-11-27 2014-02-19 Contipro Biotech S.R.O. Vlákna založená na hydrofobizovaném hyaluronanu, způsob jejich přípravy a použití, textilie na jejich bázi a použití
CZ304654B6 (cs) 2012-11-27 2014-08-20 Contipro Biotech S.R.O. Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
CN103505736A (zh) 2013-09-23 2014-01-15 天津大学 基于改性透明质酸的高分子脂质体及其制备方法
CZ305153B6 (cs) 2014-03-11 2015-05-20 Contipro Biotech S.R.O. Konjugáty oligomeru kyseliny hyaluronové nebo její soli, způsob jejich přípravy a použití

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090252810A1 (en) * 2005-09-26 2009-10-08 Novozymes Biopolymer A/S Aryl/alkyl Succinic Anhydride-Hyaluronan Derivatives
CZ302856B6 (cs) * 2006-09-27 2011-12-14 Cpn Spol. S R. O. Zpusob prípravy derivátu polysacharidu
CZ301899B6 (cs) * 2009-03-17 2010-07-21 Contipro C, A.S. Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové pomocí O-acyl-O´-alkylkarbonátu v prítomnosti substituovaného pyridinu

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Daniela Smejkalová a kol.: Structural and conformational differences of acylated hyaluronan modified in protic and aprotic solvent system, Carbohydrate Polymers 87, 15.1.2012, str. 1460-1466 *
Kang Moo Huh a kol.: Hydrotropic polymer micelle system for delivery of paclitaxel, Journal of Controlled Release 101 (2005), str. 59-68 *
Klára Slezingrová a kol.: Syntéza a charakterizace palmitoyl hyaluronanu, Chemické Listy 106, cerven 2012, str. 554-567 *
Yoshihiro Kawaguchi a kol.: The relation between the adsorption behavior at the interface and the conformational changes in hyaluronates partially modified with various acyl chains, Carbohydrate Polymers 26 (1995), str. 149-154 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014082609A1 (en) 2014-06-05
KR20150088848A (ko) 2015-08-03
CZ2012842A3 (cs) 2014-08-20
HUE038664T2 (hu) 2018-11-28
DK2934592T3 (en) 2018-07-02
EP2934592B1 (en) 2018-05-16
KR102191353B1 (ko) 2020-12-16
RU2640287C2 (ru) 2017-12-27
US20150320873A1 (en) 2015-11-12
BR112015012191A8 (pt) 2018-01-23
JP2016500130A (ja) 2016-01-07
US9999678B2 (en) 2018-06-19
ES2683993T3 (es) 2018-10-01
BR112015012191A2 (pt) 2017-07-11
PL2934592T3 (pl) 2018-12-31
EP2934592A1 (en) 2015-10-28
RU2015125076A (ru) 2017-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ304654B6 (cs) Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
Lee et al. Inflammation-responsive drug-conjugated dextran nanoparticles enhance anti-inflammatory drug efficacy
Na et al. Self-assembled nanoparticles of hydrophobically-modified polysaccharide bearing vitamin H as a targeted anti-cancer drug delivery system
Choi et al. Self-assembled hyaluronic acid nanoparticles as a potential drug carrier for cancer therapy: synthesis, characterization, and in vivo biodistribution
Wu et al. Bioreducible heparin-based nanogel drug delivery system
Liu et al. Novel pH-sensitive chitosan-derived micelles loaded with paclitaxel
Li et al. Redox-sensitive micelles self-assembled from amphiphilic hyaluronic acid-deoxycholic acid conjugates for targeted intracellular delivery of paclitaxel
Liang et al. α-Tocopherol succinate-modified chitosan as a micellar delivery system for paclitaxel: Preparation, characterization and in vitro/in vivo evaluations
Liu et al. Dextran-based redox-responsive doxorubicin prodrug micelles for overcoming multidrug resistance
Li et al. Self-assembled nanoparticles of cholesterol-conjugated carboxymethyl curdlan as a novel carrier of epirubicin
Tian et al. The effect of the molecular weight of hyaluronic acid on the physicochemical characterization of hyaluronic acid-curcumin conjugates and in vitro evaluation in glioma cells
Hu et al. Targeting and anti-tumor effect of folic acid-labeled polymer–doxorubicin conjugates with pH-sensitive hydrazone linker
Ji et al. Inclusion complex from cyclodextrin-grafted hyaluronic acid and pseudo protein as biodegradable nano-delivery vehicle for gambogic acid
CN103611165B (zh) 透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体及其制备方法和应用
Hu et al. Core cross-linked polyphosphoester micelles with folate-targeted and acid-cleavable features for pH-triggered drug delivery
Yang et al. Effect of molecular weight of PGG–paclitaxel conjugates on in vitro and in vivo efficacy
Zhang et al. pH-sensitive prodrug conjugated polydopamine for NIR-triggered synergistic chemo-photothermal therapy
JP6887381B2 (ja) 両親媒性ポリマー系
Yao et al. Intercellular pH-responsive histidine modified dextran-g-cholesterol micelle for anticancer drug delivery
Han et al. Redox-sensitive micelles for targeted intracellular delivery and combination chemotherapy of paclitaxel and all-trans-retinoid acid
CN101775082A (zh) 基于两性离子的电荷反转型壳聚糖衍生物及其在药剂中的应用
Li et al. Multifunctional micelles self-assembled from hyaluronic acid conjugate for enhancing anti-tumor effect of paclitaxel
Tahvilian et al. Preparation and characterization of pH-sensitive camptothecin-cis-aconityl grafted chitosan oligosaccharide nanomicelles
Shirani et al. Redox responsive polymeric micelles of gellan gum/abietic acid for targeted delivery of ribociclib
Huerta-Ángeles et al. Grafting of steroids to hyaluronan towards the design of delivery systems for antioxidants: The role of hydrophobic core