Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
CZ304654B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Daniela Šmejkalová Gloria Huberta-Angeles Martin Bobek Martina Hermannová Lucie Vištejnová Jaroslav Novotný Eva Příkopová Kristina Nešporová Miroslava Němcová Klára Šlezingrová Jaromír Kulhánek Dagmar Čožíková Jana Šógorková Jan KuÄŤera Pavel Klein Vladimír Velebný
Worldwide applications
Application CZ2012-842A events
2012-11-27
2014-08-20
2014-08-20
Description
translated from
Nanomicelární kompozice na bázi Cé-Cig-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy Ce~ Cig-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy hydrofobizovaného hyaluronanu a její aplikace jako nosiče biologicky aktivních hydrofóbních látek, kde biologicky aktivní látka je enkapsulována do nanomicel hydrofobizovaného hyaluronanu. Hydrofobizace hyaluronanu je provedena esterifikační reakcí hyaluronanu s karboxylovými kyselinami s dlouhými řetězci, které jsou aktivovány halogenidovým derivátem kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové nebo jiným organickým chloridem R3-CO-CI. Ve vodě rozpustné hydrofobizované hyalurononany mohou ve vodném prostředí vytvářet nanomicely, ve kterých mohou být nekovalentně fyzikálními interakcemi navázány nepolární látky. Jádro nanomicely tvoří hydrofobní funkční skupiny acylu, zatímco obal nanomicely tvoří hyaluronan. Enkapsulaci látek do nanomicel lze provést metodou výměny rozpouštědel nebo sonikací. Hyaluronové nanomicely podporují penetraci navázaných látek při topických aplikacích a umožňují transfer navázaných látek do buněk. Dále se vynález týká i způsobu přípravy stabilizovaných nanomicelámích kompozic. Nanomicely z hydrofobizovaných hyaluronanů jsou využitelné v kosmetických i farmaceutických aplikacích.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je významným polysacharidem složeným ze dvou opakujících se jednotek |3-(l,3)-D-glukuronové kyseliny a (3-(l,4-HV-acetyl-D-glukosammu. Vyznačuje se vysokou molekulovou hmotností 5.104 až 5.106 g-mol“1, která závisí na způsobu izolace a výchozím materiálu. Hyaluronan, tedy kyselina hyaluronová, respektive její sodná sůl, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogenese. Tento značně hydrofilní polysacharid je ve vodě rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.
Nosičové systémy na bázi kyseliny hyaluronové
Kyselina hyaluronová je hydrofilní, a proto v nativní formě nemůže sloužit jako efektivní nosič hydrofóbních látek. Z tohoto důvodu je třeba na polymemí řetězec kyseliny hyaluronové navázat hydrofobní funkční skupiny. V případě dostatečného množství a délky těchto hydrofóbních skupin může docházet k jejich autoagregaci a tvorbě hydrofóbních domén ve struktuře hyaluronanu, do kterých je potom možné nekovalentně navazovat malé molekuly ve vodě nerozpustných látek. Vzniklý útvar se často v literatuře označuje jako polymemí micela, kde jádro micefy je hydrofobní a zajišťuje rozpouštění malých nepolárních molekul, zatímco obal micely je hydrofilní a zajišťuje rozpouštění polymemí micely ve vodném prostředí. Polymemí micela, která svou velikostí (průměrem) nepřekračuje 200 nm se dá nazývat nanomicelou.
Nosičové systémy jako polymemí micely na bázi modifikované kyseliny hyaluronové jsou známé z konjugátů hyaluronanu s alkylaminy (Liu et al., 2011) a kyselinou listovou. Uvedená příprava hyaluronanového derivátu je však uvedena v přítomnosti formamidu, který je vysoce toxický a teratogenní. Podobná příprava polymemích micel byla použita pro získání redox-sensitivních micel (Li et al., 2012). Je zřejmé, že z důvodu použití vysoce toxického reagentu, jsou takovéto micelámí systémy nepoužitelné pro biologické aplikace.
Konjugace kyseliny hyaluronové s jinými polymery (polymer kyseliny mléčné nebo glykolové) s vazbou přes karboxylovou skupinu na kyselině D-glukuronové a možnou inkorporaci nízkomolekulámích látek je nárokovaná v patentu US 7 767 806, kde autoři zmiňují biokompatibilitu polymeru, kterou však nepopsali ani neotestovali. V jiném případě byl nízkomolekulámí hyaluro- 1 CZ 304654 B6 nan (9^45 kDa) kovalentně modifikován v místě karboxylové skupiny kyseliny glukoronové hydrofóbními aminy s různou délkou řetězce a kladně nabitým sperminem jako kationickým segmentem (Shen, Li, Tu & Zhu, 2009). Účelem této práce bylo připravit nosič na geny. Použití sperminu pro tyto účely je však limitované kvůli jeho akutní a subakutní toxicitě (Til, Falke, Prinsen & Willems, 1997). Kritická micelámí koncentrace vzniklých polymemích micel o velikosti 125 až 555 nm byla stanovena vyšší než 0,04 mg.ml ’. Kromě toho, že hodnota kritické micelámí koncentrace je příliš vysoká a neumožní extrémní ředění micelámích systémů (např. v krevním řečišti), micely takové velikosti nejsou povařovány za vhodné kandidáty pro pasivní distribuci léčiv v těle, kdy rozměr polymemí micely udává, jestli se dostane do místa tumoru nebo infarktu přes narušenou cévní stěnu. Pro tyto případy se obecně upřednostňují polymemí micely o velikosti 20 až 100 nm (Wang, Mongayt & Torchilin, 2005).
Modifikace karboxylové skupiny kyseliny glukuronové byla využita v případě přípravy polymerních hyaluronových micel na bázi elektrostatické interakce mezi negativně nabitou kyselinou hyaluronovou a pozitivně nabitým styryl pyridinem (Tao, Xu, Chen, Bai & Liu, 2012). Použití těchto polymemích micel in vivo je však limitované z důvodu zatím ne zcela objasněné interakce styryl pyridinia s nervovými konci a dále s muskarinovými receptory, které hrají důležitou úlohu při regulaci uvolňování neurotransmiterů z neuronů (Mazzone, Moři, Burman, Palovich, Belmonte & Canning, 2006).
US patent 7 993 678 a WO 2007/033 677 si nárokuje přípravu aryl/alkyl sukcinových derivátů hyaluronanu, které jsou rovněž využitelné pro enkapsulaci aktivních nepolárních látek. V tomto případě modifikace probíhá na primárních hydroxylových skupinách hyaluronanu, zatímco karboxylová skupina zůstává zachovaná. Nevýhodou dané modifikační reakce je alkalická pH (pH 8,5 až 9,0), při kterém probíhá reakce cyklických anhydridů s hyaluronanem. Takové alkalické pH totiž může vést k hydrolýze anhydridu, a tedy ke snížení efektivnosti modifikace, zejména v průmyslových měřítkách. U připravených aryl/alkyl sukcinových derivátů hyaluronanu se stupněm substituce 44 % byla ve vodě prokázána schopnost tvořit micely (agregovat) od koncentrací vyšších než 0,003 až 0,004 mg-mf’. Velikost polymemích micel byla stanovena v rozmezí 50 až 200 nm. Nevýhodou těchto derivátů je však zvýšený celkový záporný náboj hyaluronanu díky přítomnosti další COO v alkyl/aryl sukcinové modifikující funkční skupině. Záporný náboj molekuly může výrazně negativně ovlivňovat interakci mezi buňkou a nosičovým systémem (Wang, Mongayt & Torchilin, 2005). Limitujícím faktorem pro injekční aplikace takto připravených derivátů je rovněž jejich nízká rozpustnost (Eenschooten, Guillaumie, Kontogeorgis, Stenby & Schwach-Abdellaoui, 2010). Další nevýhodou takovýchto derivátů je labilita esterových vazeb při tepelných sterilizačních procesech, jako je autoklávování. V patentech US 7 993 678 a WO 2007/033 677 je uvedený pouze způsob přímého rozpouštění nepolárních látek v roztocích alkyl/aryl sukcinových derivátů hyaluronanu včetně vzniku stabilní emulze. Hlavní nevýhodou přímého způsobu enkapsulace nepolárních látek jsou výsledné nízké vazebné kapacity polymerních micel (Kedar, Phutane, Shidhaye & Kadam, 2010). V uvedených patentech je sice nárokována struktura modifikovaného hyaluronanu pro nosičové systémy, ale kromě emulzního systému není uveden žádný další možný způsob navázání hydrofóbní látky do dané struktury hyaluronanu. Z tohoto důvodu zcela chybí uvedení i vazebné kapacity polymemího nosičového systému, což je jedna ze základních charakteristik pro reálné posouzení aplikace. Dále nejsou zmíněny parametry cytotoxicity a interakce s buňkou a nedá se tedy posoudit, jestli nárokovaná struktura skutečně může být použita na aktivní transfer hydrofóbních látek do buňky, což je ve farmaceutických aplikacích podstatné.
V publikaci (Smejkalová, Hermannová, Šuláková, Průšová, Kučerík & Velebný, 2012) jsou uvedeny hydrofóbní domény hyaluronanu vznikající při agregaci acylových řetězců C6 kovalentně navázaných na hyaluronan. V těchto derivátech však nebyla kompletně odstraněna zbytková rozpouštědla a vznik polymemích micel a jejich charakterizace není náplní publikace. Navíc, symetrické anhydridy, použité v publikaci nebyly použitelné pro vazbu dlouhých alkylových řetězců. Karboxylové kyseliny s dlouhými alifatickými řetězci jsou rovněž velmi drahé a během
-2CZ 304654 B6 přípravy je navíc ztracen nejméně jeden mol kyseliny na mol reagentu. Článek rovněž nepojednává o cytotoxicitě připravených derivátů.
Příprava butyrových esterů polysacharidů včetně farmaceutické kompozice je nárokována v patentu EP 0 941 253. Nárokovaná metodika přípravy však vede pouze k velmi nízkým stupňům substitucí (max. 3%). Množství nekovalentně vázané hydrofobní látky na tyto deriváty je negativně ovlivněno tímto nízkým stupněm substituce. Butyrové estery hyaluronanu byly dále připravené v patentu WO 2005/092 929, kde jsou však vyžadovány bezvodé podmínky, a tedy transformace hyaluronanu na kvartem! ammoniovou sůl, která může být doprovázena degradací hyaluronanu. Dosažený stupeň substituce je nižší než 0,1 %, tyto esterové deriváty tedy nejsou vhodné pro přípravu nosičových systémů. Podobných výsledků bylo dosaženo i při současné esterifikací hyaluronanu anhydridem kyseliny butyrové a chloridem kyseliny retinové (WO 2004/056 877).
Kompozici polymemích micel na bázi modifikovaného hyaluronanu (HA)-[O(C=O)NH-M]p, kde M představuje modifikující jednotku, jejíž součástí je alkylová funkční skupina C2_i6 a p je násobkem 3 až 4, a farmaceuticky aktivní enkapsulované molekuly je nárokována patentem US 2010/0 316 682 a EP 1 538 166A1. Hlavní nevýhodou těchto derivátů je, že na provedení modifikace hyaluronanu s dlouhým řetězcem je použit dibutylcín laurát, potenciální imunotoxická a teratogenní látka. Tato látka se většinou používá na modifikace lepidel a je na seznamu Evropské agentury pro životní prostředí kvůli své akutní toxicitě (Boyer, 1989). Další nevýhodou nárokovaných derivátů je jejich konjugace s polymery, např. polyethylenglykolem, které nejsou tělu vlastní a mohou při intravenózních nebo topických aplikacích vést k zánětlivým reakcím, popř. ke vzniku cytotoxických degradačních produktů. Navíc, opakovaná aplikace polymemích micel, kde polyethylenglykol představuje hydrofilní segment, vedla kjejich zrychlenému odbourávání z krevního řečiště z důvodu vytvoření anti-PEG IgM protilátek (Gong, Chen, Zhang, Wang & Wang, 2012).
Paclitaxel byl úspěšně inkorporován do micel modifikovaného hyaluronanu poly(mléčnou-eoglykolovou kyselinou, PLGA) (Kim, Lee, Jang & Park, 2009). Inkorporace proběhla metodou dialýzy, kdy se modifikovaný polymer i vázaná látka rozpustily v DMSO a vzniklý roztok byl dialyzován proti H2O. Vazebná kapacita připravených polymemích micel v tomto případě dosahovala 4,5 % (hmotn.). Nevýhodou těchto nosičových systémů je přítomnost polymeru PLGA, který nepatří mezi polymery tělu vlastní a nemusí při topických a intravenózních aplikacích představovat plně biodegradabilní systém. Další nevýhodou je zbytkové DMSO ve finálních produktech.
Modifikace hyaluronanu karboxylovými kyselinami s dlouhým řetězcem
Modifikace polysacharidů karboxylovými kyselinami nej častěji vyžaduje komerčně dostupný anhydrid dané kyseliny (WO 1996/035 720, WO 2007/033 677, (Smejkalová, Hermannová, Šuláková, Průšová, Kučerík & Velebný, 2012), EP 0 893 451). Hlavní nevýhodou těchto komerčně dostupných anhydridů je jejich náchylnost k hydrolýze a možná přítomnost nečistot. Pro některé kyseliny nejsou jejich anhydridy komerčně dostupné (např. kyselina undekanová) nebo jsou dostupné a jejich cena je velmi vysoká (např. kyselina olejová, linolová, linolenová). Nedostupnost, vysoká cena a nestabilita těchto anhydridů potom znesnadňují přípravu modifikovaných polysacharidů ve velkém měřítku.
Anhydrid kyseliny může být nahrazen jiným derivátem kyseliny použitelných pro esterifikací hyaluronanu. Patent WO 2010/105 582 si nárokuje aktivaci karboxylových kyselin ethylchlorformiátem, v bezvodých podmínkách, za vzniku O-acyl-O'-alkylkarbonátů dále použitelných pro esterifikací hyaluronanu. Nevýhodou takovéto aktivace je vznik toxických a potenciálně výbušných plynů. Podobná aktivace alkylchlorformiátem je nárokovaná v patentu US 5 550 225. Aktivace alkylchlorformiátem je rovněž uvedena v patentu US 3 720 662 a CZ 20060605.
-3 CZ 304654 B6
Známá je rovněž esterifikace polysacharidů karboxylovými kyselinami v přítomnosti imidazolu (US 2012/0 172 587). Nárokovaná metoda přípravy však vyžaduje vysoké reakční teploty (90 až 200 °C), které nejsou v případě hyaluronanu aplikovatelné vzhledem k jeho degradaci i při vyšších teplotách.
Evropský patent EP 0 893 451 si nárokuje esterifikaci polysacharidů anhydridy karboxylových kyselin za použití metody superkritické extrakce. Nevýhodou tohoto postupu jsou požadavky vysokého tlaku a vysoké náklady na pořízení výrobního zařízení.
Z těchto důvodů je velmi důležité nalézt alternativní metodu aktivace karboxylových kyselin s dlouhými řetězci, která by byla aplikovatelná in sítu. Jedním z možných řešení je aktivace karboxylových kyselin za použití derivátu 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny za vzniku anhydridu. Anhydrid 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny v kombinaci s katalyzátorem DMAP byl poprvé použit v mírných reakčních podmínkách pro rychlou esterifikaci makrocylických látek (Inanaga, Hirata, Saeki, Katsuki & Yamaguchi, 1979). Tato metoda esterifikace však nebyla dosud použita na modifikaci polysacharidů, zejména kyseliny hyaluronové, z důvodu možné exotermní reakce provázané degradací polysacharidu.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je syntéza hydrofobizovaného hyaluronanu a jeho aplikace jako nanomicelámího polymerního nosiče biologicky aktivních hydrofóbních látek ve vodném prostředí, přičemž zůstává zachován nativní charakter a biologická aktivita vázaných látek.
Hydrofobizace hyaluronanu dlouhými alifatickými estery (C6-C18) je založena na přímé aktivaci karboxylových kyselin s dlouhými řetězci za vzniku anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové (Schéma 1). Tento anhydrid v dalším kroku reaguje s hyaluronanem za vzniku acylovaného hyaluronanu. Hlavní výhodou této aktivace je možné přímé využití alifatických karboxylových kyselin. Na rozdíl od podobných hydrofobizačních reakcí hyaluronanu uvedených v části stavu techniky nevyžaduje představená modifikace komerčně dostupný anhydrid. Další výhodou představené aktivace je průběh reakce při mírných podmínkách (od pokojové teploty až do 50 °C) a krátká reakční doba. Uvedená aktivace rovněž nevyžaduje nadměrné molámí množství alifatických kyselin a nevyžaduje speciální bezvodé podmínky jako v případě přihlášky vynálezu WO 2010/105 582. Aktivační reagent je stabilní a při jeho použití k hydrofobizaci polysacharidů nedochází k produkci toxických plynů nebo explozivních produktů jako v případě ethylchlorformiátu. Další výhodou aktivačního činidla je to, že nevytváří vedlejší reakční produkty a nezpůsobuje síťovací reakce.
Aktivace karboxylových kyselin derivátem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny s následnou aplikací na esterifikaci hyaluronanu je znázorněno na schématu 1 níže:
-4CZ 304654 B6
A)
Λ»
Cí
Cl R',N, organické rozpouštědlo
OK.-TCB-A
OK-TCB-A = anhydrid organické* kyseliny a kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoove
B)
R= Na+ nebo H\ R’ = H nebo -C(=O)CxHy nebo -C(=O)CH=CH-het. R4 = -H, -N(CH3)2, R'3= -CH,CH3
Schéma 1
Dále se vynález týká použití hydrofobizovaného hyaluronanu pro přípravu nanomicelámích systémů a aplikaci navázaných látek v nanomicelách hyaluronanu na kůži, vlasy a sliznice, přičemž jsou možné i jiné topické aplikace. Enkapsulované biologicky aktivní látky jsou v nanomicelách hyaluronanu vázány nekovalentně fyzikálními interakcemi s hydrofobními funkčními skupinami polymemího nosiče. Takto enkapsulované látky efektivně penetrují do vrchní části kůže (epidermis), a do celé struktury chlupů a vlasů a do epitelu sliznic. Výhodou je, že hloubka penetrace aktivních látek vázaných v nanomicelách je větší, než hloubka penetrace stejných látek rozpuštěných přímo v nepolárních rozpouštědlech.
Oproti podobným polymemím systémům (US patent US 7 993 678, WO 2007/033 677), hyaluronové nanomicelámí konjugáty vykázaly nečekaně 3 až 10 násobně nízkou kritickou micelámí koncentraci a současně relevantně vysokou stabilitu v solném a ve vodném prostředí. Velmi nízká hodnota kritické micelámí koncentrace je výhodná pro možné intravenózní aplikace hyaluronových nanomicel. Vysokou stabilitu hyaluronových nanomicel lze oproti podobným systémům na bázi většiny jiných polymerů popsaných v části stavu techniky s výhodou použít na lyofilizaci materiálu, kdy není potřeba pro zachování enkapsulace do roztoku před vlastním vymražením přidávat lyoprotektant.
Výhodou nárokových hydrofobizovaných hyaluronanů je absence syntetických polymerů (PLGA, PEG atd.) a kopolymerů, které jsou často nutné pro vytvoření nanomicel a které můžou vyvolat při opakovaném podání vznik protilátek (Gong, Chen, Zheng, Wang & Wang).
Na rozdíl od podobných polymerních micelámích systémů, tvorba nanomicel není založena na modifikovaném hyaluronanu se zvýšeným celkovým záporným nábojem, a tedy není z tohoto důvodu negativně ovlivněna interakce nosičového systému s buňkami.
-5CZ 304654 B6
Některé z nanomicelámích útvarů, zejména ty obsahující delší acelové řetězce na hyaluronanu, mohou tvořit v solném prostředí gelovou fázi, kterou lze s výhodou použít pro určité aplikace vyžadující vyšší viskozitu nosičového systému.
Rozměr připravených nanomicelámích systémů se nejčastěji pohybuje v rozmezí 20 až 100 nm, což je optimální velikost pro farmaceutické aplikace, ve kterých se využívá zvýšený permeabilní a retenční efekt (EPR efekt). Tato velikost nemusí být vždy dosažitelná polymemích micel popsaných v části stav techniky.
Další výhodou hyaluronových nanomicel je přenos navázaných látek z hydrofobních domén nanomicely do buňky.
Inovovaný způsob enkapsulace je založen na přípravě směsi modifikovaného hyaluronanu rozpuštěného ve vodě a biologicky aktivní rozpuštěné v organickém rozpouštědle, energetickém narušení hydratační obálky hyaluronanu a následným odstraněním organického rozpouštědla z roztoku. Tento způsob na rozdíl od běžných enkapsulačních postupů není založen na rozpustnosti polymeru v organickém rozpouštědle a z tohoto důvodu nevyžaduje ztrátu nativního charakteru hyaluronanu a výraznou modifikaci polymemího řetězce zejména v místě karboxylových skupin, které jsou důležité pro rozpoznání hyaluronanu buněčnými receptory. Preferované organické rozpouštědlo je takové, které má nižší teplotu varu než voda. Vazebnou kapacitu hyaluronových nanomicel výrazně zvyšuje kompletní evaporace zbylé vodné fáze s následnou rehydratací nanomicel. Nenavázanou biologicky aktivní látku lze odstranit filtrací a výsledné nanomicely lze přímo lyofilizovat a skladovat v suchém stavu do doby následné rehydratace.
Vynález se tedy týká nanomicelámí kompozice na bázi C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I,
(I), kde Rje tf nebo Na+, a kde R1 je H nebo -C(=O)CxHy nebo -C(=O)CH=CH-het, kde x je celé číslo v rozmezí 5 až 17 a y celé číslo v rozmezí 11 až 35 a CxHy je lineární nebo rozvětvený nasycený, nenasycený řetězec C5-C17 a het je heterocyklický nebo heteroaromatický zbytek s volitelným obsahem N, S nebo O atomů, přičemž alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1-C(=O)CxHy nebo -C(=O)CH=CH-het, a kde n je v rozmezí 12 až 4000, přičemž nanomicely obsahují hydrofobní jádro tvořené C6-Ci8-acylovými skupinami navázanými na hyaluronan a hydrofilní obal tvořený hydrofilními funkčními skupinami hyaluronanu, a jednu nebo více biologicky aktivních látek fyzikálně vázaných v nanomicele. Ve výhodném provedení vynálezu je C6-Ci8-acylovaná HA, oleyl HA, tzn. ve vzorci I je R H nebo Na+ a R1 je -C(=O)(CH2)7-CH=CH-(CH2)7CH3. Kompozice dále obsahuje vodu, může obsahovat i soli (např. 0,9 % NaCl). Ve výhodném provedení nanomicelámí kompozice obsahuje 0,3 až 50 % hmotnostních biologicky aktivní látky vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, přičemž biologicky aktivní látka je vybrána ze skupiny zahrnující farmaceuticky a kosmeticky aktivní látky zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fýtokomplexy nebo íytoaktivní látky, minerální nebo rostlinné oleje, nebo jejich směs. Příklady biologicky použitelných aktivních látek zahrnují například tokoferol, paclitaxel, fosfotidylcholin nebo koenzym Q10. V jednom výhodném provedení obsahuje kompozice vyšší koncentraci C6Ci8-acylovaného hyaluronanu než je jeho kritická agregační koncentrace. Koncentrace C6-Ci8acylované hyaluronanu v kompozici ve vodném roztoku je v rozmezí 0,0001 mg.ml'1 až
-6CZ 304654 B6 mg.ml'1, s výhodou 1 až 20mg.ml'1. V dalším výhodném provedení je biologicky aktivní látkou minerální nebo rostlinný olej v množství 0,05 až 40 % hmotn. vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, s výhodou 1 až 20 % hmotn. V ještě dalším výhodném provedení obsahuje kompozice biologicky aktivní látku, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, a v níž je rozpouštěna další biologicky aktivní látka. Touto biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, může být například minerální nebo rostlinný olej, a uvedenou další biologicky aktivní látkou může být například farmaceuticky nebo kosmeticky aktivní látka, zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fytokomplexy nebo íytoaktivní látky nebo jejich směs. Nanomicelámí kompozice podle vynálezu může být ve formě roztoku nanoemulze, mikroemulze, koacervátu nebo gelu.
Dále se vynález týká způsobu přípravy výše uvedeného C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, obsaženého v nanomicelámí kompozici podle vynálezu, kde hyaluronan reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru s C6-Ci8 karboxylovou kyselinou aktivovanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3-CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený Ci-C3o alkyl, případně obsahující heteroaromatické nebo aromatické funkční skupiny. Příkladem heteroaromatické skupiny je pyridin nebo jeho deriváty (například podle vzorce i), příkladem aromatické skupiny je benzen ajeho halogenové deriváty (například podle vzorce ii):
(i) (ϋ)
Hyaluronan může být ve formě volné kyseliny nebo stabilní farmaceuticky přijatelné soli, například Na, K, Ca, Mg, Zn, nebo li soli, a má molekulovou hmotnost, od 5x103 g/mol do l,6xl06 g/mol, s výhodou od 15xl03 g/mol do 250xl03 g/mol, nejlépe 15xl03 až 50xl03 g/mol. Způsob přípravy podle vynálezu se provádí tak, že se rozpustí hyaluronan ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, kterým je polární organické rozpouštědlo, přičemž obsah vody je v rozmezí od 10 do 99 % objemových, s výhodou 50 % objemových. Aprotickým rozpouštědlem mísitelným s vodou může být například dimethylsulfoxid (DMSO), tetrahydrofurane(THF), aceton, acetonitril nebo izopropanol (IPA). V reakční směsi je přítomna báze R'3N, kde R' je lineární nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec CnHm, kde n je celé číslo v rozmezí 1 až 4 a m je celé číslo v rozmezí 3 až 9, jako např. triethylamin, v množství 0,01 až 20 ekvivalentů, s výhodou 6 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu, a katalyzátor vybraný ze skupiny zahrnující substituované pyridiny, jako dimethylaminopyridin ajeho deriváty, v množství 0,01 až 1 ekvivalent, s výhodou 0,05 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu. Ve způsobu podle vynálezu se nejprve provede aktivace C6-Ci8 karboxylové kyseliny v polárním organickém rozpouštědle, v přítomnosti báze a kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové nebo jejích derivátů, nebo v přítomnosti báze a organického chloridu, následně se směs obsahující aktivovanou C6-Ci8 karboxylovou kyselinu přidá k hyaluronanu rozpuštěného ve směsi vody, organického rozpouštědla, báze a katalyzátoru a nechá se proběhnout reakce za vzniku acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I. C6-Ci8 karboxylová kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu kapronovou, enanthovou, kaprylovou, pelargonovou, kaprinovou, palmitovou, stearovou, olejovou, linolovou a linolenovou. Množství aktivované C6-C18 karboxylové kyseliny je v rozmezí 0,01 až 5 ekvivalentů, s výhodou 0,5 až 2 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu. Aktivace C6-Ci8 karboxylové kyseliny probíhá po dobu 5 až 120 minut, s výhodou 30 minut, při teplotě od 20 až 60 °C, s výhodou při 25 °C. Reakce hyaluronanu a aktivované karboxylové kyseliny probíhá po dobu 1 až 24 hodin, s výhodou 2 až 3 hodiny, při teplotě od 20 do 60 °C, s výhodou při 25 °C. C6-C]8acylovaný hyaluronan se může následně izolovat z reakční směsi, promýt, sušit a lyofilizovat.
-7CZ 304654 B6
Izolace hyaluronanu z reakční směsi může být provedena srážením za použití NaCl a alkoholu. Promytí hyaluronanu lze provést například alkoholem, zejména izopropanolem nebo ethanolem.
Dále se vynález týká způsobu přípravy nanomicelární kompozice definované výše, kde se CýC18-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a biologicky aktivní látka se rozpustí v organickém rozpouštědle, oba roztoky se smíchají, poté se organické rozpouštědlo odstraní. Organickým rozpouštědlem může být těkavé chlorované rozpouštědlo jako trichlormethan, nebo alkohol jako ethanol nebo izopropanol, a jeho odstranění může proběhnout vakuovou evaporací, načež se vodná fáze usuší, rehydratuje, získaná nanomicelární útvary se zfiltrují a nakonec lyofilizují; nebo se organické rozpouštědlo odstraní dialýzou, získané nanomicelární útvary se poté zfiltrují a nakonec lyofilizují. V jednom výhodném provedení se C6-Ci8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze. V dalším výhodném provedení se Cfi-C|8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě a v níž je rozpuštěna další biologicky aktivní látka, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze.
V ještě dalším aspektu se vynález týká použití nanomicelární kompozice pro farmaceutické nebo kosmetické aplikace, s výhodou zejména pro topické aplikace.
Dále lze připravit stabilizované nanomicelární kompozice, a to tak, že se připraví Ce-Cis-acylovaný hyaluronan v nanomicelární kompozici podle obecného vzorce II.
R'=R2 nebo R’ý R2 (II), kde R je ff nebo Na+, alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1, kde R1 je lineární nebo heterocyklický řetězec C6-Ci8, který může obsahovat nenasycené vazby a alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R2, kde R2 je 3-(2-thienyl)akrylová kyselina nebo 3-(2-furyl)akrylová kyselina ajejich deriváty; které se stabilizují síťovací reakcí. Konkrétně se stabilizace provede tak, že se nejprve připraví akrylovaný hyaluronan podle obecného vzorce III.
-8CZ 304654 B6
(ΠΙ) tak, že se nejprve rozpustí HA ve vodě, pak se přidají báze (například TEA) a katalyzátor DMPA; zvlášť se připraví aktivovaná kyselina 3-(2-thienyl)akrylová nebo 3-(2-furyl)akrylová nebo jejich derivát, a to aktivací v organickém rozpouštědle (např. THF) a bázi (např. TEA) přidáním chloridu 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny, a nakonec se obě směsi smíchají za vzniku akrylovaného hyaluronanu podle vzorce III. Následně se připraví aktivovaná C6-Ci8-karboxylová kyselina, kterou se akrylovaný hyaluronan podle vzorce III acyluje podobným způsobem, jak bylo uvedeno výše v případě způsobu přípravy C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I, za vzniku acylovaného hyaluronanu podle vzorce II. Z takovéhoto acylovaného hyaluronanu lze pak analogicky připravit nanomicely, které se pak mohou síťovat radikálovými reakcemi, například pomocí peroxydisulfátu amonného. Tento zesíťovaný hyaluronan není rozpustný ve vodě.
Literatura
Boyer, I. J. (1989). Toxicity of dibutyltin, tributyltin and other organotin compounds to humans and to experimental animals. Toxicology, 55(3), 253-2989.
Eenschooten, C., Guillaumie, F., Kontogeorgis, G.M., Stenby, E.H., & Schwach-Abdellaoui, K. (2010). Preparation and structural characterisation of novel and versatile amphiphilic octenyl succinic anhydride-modified hyaluronic acid derivatives. Carbohydrate Polymers 79(2), 597605.
Gong, J., Chen, m., Zheng, Y., Wang, S., & Wang, Y. (2012). Polymeric micelles drug delivery systém in oncology. Journal of ControlledRelease, 159 (3), 312-323.
Inanaga, J., Hirata, K., Saeki, H., Katsuki, T., & Yamaguchi, M. (1979). A Rapid Esterification by Means of Mixed Anhydride and Its Application to Large-ring Lactonization. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 52(7), 1989-1993.
Kedar, U., Phutane, P., Shidhaye, S., & Kadam, V. (2010). Advances in polymeric micelles for drugs delivery and tumor targeting. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 6(6), 714-729.
Kim, T.G., Lee, H., Jang, Y., & Park, T.G. (2009). Controlled Release of Paclitaxel from Heparinized Metal Stent Fabricated by Layer-by-Layer Assembly of Polylysine and Hyaluronic Acidg-Poly(lactic-co-glycolic acid) Micelles Encapsulating Paclitaxel. Biomacromolecules, 10(6), 1532-1539.
Li,J., Huo, M., Wang, J., Zhou, J., Mohammad, J. M., Zhang, Y., Zhu, Q., Waddad, A.Y., & Zhang, Q. (2012). Redox-sensitive micelles self-assembled from amphiphilic hyaluronic acid-9CZ 304654 B6 deoxycholic acid conjugates for targeted intracellular delivery of paclitaxel. Biomaterials, 33(1), 2310-2320.
Liu, Y., Sun, J., Cao, W., Yang. J., Lián, H., Li. X., Sun, Y., Wang, Y., Wang, S., & He, Z. (2011) Duál targeting folate-conjugated hyaluronic acid polymeric micelles for paclitaxel delivery. International Journal of Pharmaceutics, 421(1), 160-169.
Mazzone, S. B., Moři, N., Burman, M., Palovich, M., Berlmonte, K. E., & Canning, B. J. (2006). Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. The Journal of Physiology, 557(1), 23-35.
Shen, Y., Li, Q., Tu, J., & Zhu, J. (2009). Synthesis and characterization of low molecular weight hyaluronic acid-based cationic micelles for efficient siRNA delivery. Carbohydrate Polymers, 77(1), 95-104.
Smejkalová, D., Hermannová, M., Šuláková, R., Průšová, A., Kučerlk. J., & Velebný, V., (2012). Structural and conformational differences of acylated hyaluronan modified in protic and aprotic solvent systém. Carbohydrate Polymers, 87(2), 1460-1466.
Tao, Y., Xu, J., Chen, M., Bai, H., & Liu X. Core cross-linked hyaluronan-styrylpyridinium micelles as a novel carrier for paclitaxel. (2012). Carbohydrate Polymers, 88(1), 118-124.
Til, H.P., Falke, Η. E., Prinsen, Μ. K., & Willems, Μ. I. (1997). Acute and subacute toxicity of tyramine, spermidine, spermine, putrescine and cadaverine in rats. Food and Chemical Toxicology, 35 (3^1), 337-348.
Wang, J., Mongayt, D., & Torchilin, V.P. (2005). Polymeric micelles for delivery of poorly soluble drugs: Preparation and anticancer activity in vitro of paclitaxel incorporated into mixed micelles based on poly(ethylene glycol)—lipid conjugate and positively charged lipids. Journal of Drug Targeting, /3(1), 73-80.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. Stanovení kritické micelámí (agregační) koncentrace cmc metodou fluorescence na acylovaném hyaluronanu (C6) a (Cl6) s enkapsulovanou nilskou červení ve vodě.
Obrázek 2. Stanovení kritické micelámí (agregační) koncentrace cmc metodou statického rozptylu světla na acylovaném hyaluronanu (C6) a (Cl6) s enkapsulovanou olejovou červení ve vodě.
Obrázek 3. Cryo-SEM snímek nanomicel hyaluronanu s enkapsulovaným vitamínem E (homí obrázek) a s enkapsulovaným paclitaxelem (spodní obrázek).
Obrázek 4: Cytotoxicita paclitaxelu a paclitaxelu enkapsulovaného v HAC6 a HAC16 v závislosti na koncentraci a době působení na buňky.
Obrázek 5: Transport doxorubicinu do buněk HCT 116 a MCF-7 po 1 h. působení.
Obrázek 6: Buněčná intemalizace 7AAD v živých buňkách z nosičů HA(C6) s enkapsulovanou 7AAD.
Obrázek 7. Profil uvolňování enkapsulované olejové červeně z nosiče HAC6 do PBS a PBS s přídavkem 1 % TWEEN 80. Koncentrace HAC6+olejová červeň 1 nebo 10 mg.mL1.
- 10CZ 304654 B6
Obrázek 8. Profil uvolňování enkapsulovaného paclitaxelu z nosiče HAC6 a HAC16 (c = 10 mgmL'1 * 3) do PBS.
Obrázek 9. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10) a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do kůže.
Obrázek 10. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10)a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do vlasů (mikroskopický snímek zachycuje průřez svazkem vlasů).
Obrázek 11. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10) a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do bukální sliznice.
Obrázek 12. Penetrace enkapsulované nilské červeně (NR) z polymemích nanomicel hyaluronanu HA(C6) a HA(C10) a dále stejné koncentrace nilské červeně rozpuštěné v oleji a dispergované ve vodě do vaginální sliznice.
Příklady provedení vynálezu
SS = stupeň substituce = 100 % * molámí množství navázaného substituentu / molámí množství všech dimerů polysacharidu
Zde používaný výraz ekvivalent (eq) se vztahuje na dimer hyaluronanu, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozího hyaluronanu (zdroj: Contipro Biotech spol., sr.o., Dolní Dobrouč, ČR) byla stanovena metodou SEC-MALLS.
Příklad 1 Příprava kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kapronové.
g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) byl rozpouštěn v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 5 ml DMSO. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg,
0,05 eq.). Současně byla rozpouštěna kyselina hexanová (0,63 ml, 2 eq) v 5 ml DMSO, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (1,6 ml, 4eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu
h. při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMSO a DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 60 % (stanoveno z NMR) !H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 4H, γ, δ CH2), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
- 11 CZ 304654 B6
Příklad 2. Příprava kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kapronové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 38 kDa) byl rozpouštěn v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 5 ml izopropanolu. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a pyridin (0,4 ML, 2,0 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina hexanová (0,32 ml, 1 eq) v 5 ml izopropanolu, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, leq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,50 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění pyridinu z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 15% (stanoveno z NMR) *H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 4H, γ, δ CH2), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
Příklad 3. Příprava enanthyl esteru (C7) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny enanthové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) byla rozpouštěna v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml acetonitrilu. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,70 ml, 2 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina enanthová (0,35 ml, 1 eq) v 5 ml acetonitrilu, poté se do roztoku přidal TEA (0,70 ml, 2 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,39 ml, 1 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,75 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění acetonitrilu a DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 12 % (stanoveno z NMR) ’H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 6H, γ, δ, ε (CH2)3) (m, 4H, γ, δ (CH2), δ 0,8 (m, 3Η, CH3).
Příklad 4. Příprava kaprylyl esteru (C8) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kaprylové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml denní vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml acetonitrilu. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina oktanová (0,63 g, 4 eq) v 5 ml acetonitrilu, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,8 ml, 4 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,50 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roz-12CZ 304654 B6 tokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění acetonitrilu a DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 40 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 8H, (CH2)4), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
Příklad 5. Příprava kaprinyl esteru (CIO) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kaprinové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,025 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina dekanová (0,8 g, 2 eq) v 5ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,8 ml, 2 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění acetonitrilu a DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 15 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 12H, γ, δ, ε, ζ, η,θ CH2), δ 0,8 (m, 3Η, CH3).
Příklad 6. Příprava kaprinyl esteru (CIO) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny kaprinové g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina dekanová (0,8 g, 4 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,05 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,8 ml, 4 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolovaný srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění THF a DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 40 % (stanoveno z NMR) 'H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 12H, γ, δ, ε, ζ, η, θ CH2), δ 0,8 (m, 3Η, CH3).
- 13 CZ 304654 B6
Příklad 7. Příprava palmitoyl esteru (Cl6) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny palmitové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 38 kDa) byl rozpuštěn v 20 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 10 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina palmitová (0,16 g, 0,5 eq) v 10 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,098 ml, 0,5 eq.). Po aktivaci kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku ELA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
’HNMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 24H, (CH2)12), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
SS 14 % (stanoveno z NMR)
Příklad 8. Příprava stearyl esteru (Cl8) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny stearové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina stearová (0,71 lg, 2 eq) v 5ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě a následně byla reakční směs zahřívána po dobu 1 h při 50 °C. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 7 % (stanoveno z NMR) ]H NMR (D2O) signály acylu: δ 2,4 ppm (m, 2H, a CH2), δ 1,6 ppm (m, 2H, β CH2), δ 1,3 ppm (m, 28H, (CH2)14), δ 0,8 (m, 3H, CH3).
Příklad 9. Příprava oleyl esteru (Cl8:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny olejové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,1 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,18g, 0,5 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,098 ml, 0.5 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izo- 14CZ 304654 B6 propanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 10 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-)10, δ 1,60 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
Příklad 10. Příprava oleyl esteru (08:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny olejové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 130 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 3 ml izopropanol. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,1 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,4 g, 1 eq) v 5 ml izopropanol, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,195 ml, 1 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 12 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-)10, δ 1,60 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
Příklad 11. Příprava oleyl esteru (Cl8:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu isobutyryl chloridu a kyseliny olejové
1,0 g hyaluronanu sodného (2,5 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté bylo postupně přidáno 5 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,05 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,05 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,787 ml, 1 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,5 ml, 3 eq.) a isobutyryl chlorid (0,26 ml, 1 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,50 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 11 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-)i0, δ 1,60 (m, 2H, -CHj-CHj-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
- 15 CZ 304654 B6
Příklad 12. Příprava oleyl esteru (Cl8:1) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny olejové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 130 kDa) bylo rozpuštěno v 5 ml demi vody. Poté byly postupně přidány 3 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (1,5 ml, 3 eq.) a DMAP (15,0 mg, 0,1 eq.). Současně byla rozpuštěna olejová kyselina (0,787 ml, 2 eq) v 10 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci byla kyseliny sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 18 % (stanoveno z NMR)
Ή NMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 20H, -(CH2-),o, δ 1,60 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,41 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 5,41 (d, 2H, CH=CH)
Příklad 13. Příprava linoleyl esteru (Cl8:2) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 130 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolová kyselina (0,77 ml, 2 eq) ve 3 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,2 ml, 7 eq.) a 2,4,6trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,5 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 16 % (stanoveno z NMR) ’HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 14H, -(CH2-)7), δ 1,63 (m, 2H, -CFb-CFF-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,44 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 2,83 (m, 2H, =CHCH2-CH=), δ 5,45 (m, 4H, CH=CH)
Příklad 14. Příprava linoleyl esteru (Cl8:2) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolová kyselina (0,77 ml, 2 eq) ve 3 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (1,2 ml, 7 eq.) a 2,4,6trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě a následně byla reakční směs zahřívána po dobu 1 h při 50 °C. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,75 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla
- 16CZ 304654 B6 nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu, a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 20 % (stanoveno z NMR) ‘HNMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 14H, -(CH2-)7), δ 1,63 (m, 2H, -CH2-CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,44 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 2,83 (m, 2H, =CHCH2-CH=), δ 5,45 (m, 4H, CH=CH)
Příklad 15. Příprava linolenyl esteru (C18:3) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolenové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolenová kyselina (0,765 ml, 3 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,391 ml, 2,0 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,75 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 15 % (stanoveno z NMR) ‘H NMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 8H, -(CH2-)4), δ 1,61 (m, 2H, -CH2CH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,43 (t, 2H, -CH2-CO-), δ 2,83 (m, 4H, =CH-CH2CH=), δ 5,45 (m, 6H, CH=CH)
Příklad 16. Příprava linolenyl esteru (Cl8:3) kyseliny hyaluronové pomocí směsného anhydridu kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové a kyseliny linolenové
0,5 g hyaluronanu sodného (1,25 mmol, 15 kDa) bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (0,52 ml, 3 eq.) a DMAP (8 mg, 0.05 eq.). Současně byla rozpuštěna linolenová kyselina (0,382 ml, 1 eq) v 5 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (0,52 ml, 3 eq.) a 2,4,6-trichlorobenzoyl chlorid (0,195 ml, 1 eq.). Po aktivaci kyseliny byla sraženina zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 3 h při pokojové teplotě a následně byla reakční směs zahřívána po dobu 1 h při 50 °C. Poté se reakční směs naředila 5 ml demi vody s přídavkem 0,25 g NaCl. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanolu. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) z důvodu odstranění DMAP z produktu a potom absolutním izopropanolem z důvodu odstranění vody z produktu. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C a následně lyofilizována za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
SS 10 % (stanoveno z NMR) ‘H NMR (D2O): δ 0,88 (t, 3H, -CH2-CH3), δ 1,22-1,35 (m, 8H, -(CH2-)4), δ 1,61 (m, 2H, -CfcLCH2-CO-), δ 2,0 ppm (m, 4H, (CH2)2), δ 2,43 (t, 2H, -CH2-CO~), δ 2,83 (m, 4H, ^CH-ClfyCH=), δ 5,45 (m, 6H, CH=CH)
- 17CZ 304654 B6
Příklad 17. Enkapsulace tokoferolu (vitamínu E) do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok tokoferolu (10 mg ve 3 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další 3 ml CHC13. CHC13 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHC13 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného tokoferolu (HPLC stanovení): 2,3 % (hmotn.)
Příklad 18. Enkapsulace nilské červeně do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K. připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok nilské červeně (10 mg ve 3 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další 3 ml CHC13. CHC13 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHC13 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázané nilské červeně (UV-Vis stanovení): 0,4 % (hmotn.)
Příklad 19. Enkapsulace paclitaxelu do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok paclitaxelu (10 mg ve 3 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další 3 ml CHC13. CHC13 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHC13 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného paclitaxelu (HPLC stanovení): 5 % (hmotn.)
Příklad 20. Enkapsulace fosfatidylcholinu do kapronyl esteru (C6) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 1 bylo rozpouštěno 3 hodiny v 5 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně po kapkách přidáván roztok fosfatidylcholinu (10 mg v 5 ml EtOH). EtOH byl z roztoku odstraněn vakuovou evaporací, zbylá vodní fáze byla vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného fosfatidylcholinu (HPLC stanovení): 3,0 % (hmotn.).
Příklad 21. Enkapsulace koenzymu Q10 do palmitoyl esteru (C16) kyseliny hyaluronové
100 g acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 7 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 30 až 40 °C postupně přidáván roztok koenzymu Q10 (20 mg v 5 ml CHC13) a dále byly postupně přidány další
- 18CZ 304654 B6 ml CHC13. CHCI3 byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění CHCI3 byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydrátována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného koenzymu Q10 (UV-vis stanovení): 12,0 % (hmotn.).
Při rozpuštění produktu v 0,9% NaCl v závislosti na koncentraci rozpouštěného produktu dochází k tvorbě koacervátu nebo gelovitého roztoku.
Příklad 22. Enkapsulace tokoferolu (vitamínu E) do stearyl esteru (Cl 8) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 8 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok tokoferolu (cca 50 mg v 5 ml ethanolu). Ethanol byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění EtOH byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován. Množství navázaného tokoferolu (UV-vis stanovení): 30,0 % (hmotn.)
Příklad 23. Enkapsulace tokoferolu (vitamínu E) do stearyl esteru (C18:1) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 9 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání při teplotě 25 až 40 °C postupně přidáván roztok tokoferolu (cca 50 mg v 5 ml izopropanolu). Izopropanol byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění izopropanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes lpm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného tokoferolu (UV-vis stanovení): 40,0 % (hmotn.)
Příklad 24. Enkapsulace koenzymu Q10 do palmitoyl esteru (C16) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 7 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok koenzylu Q10 (cca 30 mg v 2 ml EtOH). Po 3 hodinách míchání byla výsledná směs sonikována 30 min (100 W) a následně intenzivně dialyzována (2 dny) proti destilované vodě, zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr a zlyofilizována.
Množství navázaného koenzymu Q10 (UV-vis stanovení): 4,6 % (hmotn.)
Při rozpuštění produktu v 0,9% NaCl v závislosti na koncentraci rozpouštěného produktu dochází k tvorbě koacervátu nebo gelovitého roztoku.
Příklad 25. Enkapsulace paclitaxelu do palmitoyl esteru (Cl6) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 7 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok paclitaxelu (cca 40 mg ve 2 ml EtOH). Po 3 hodinách míchání byla výsledná směs sonikována 30 min (100 W) a následně intenzivně dialyzována (3,5 kDa cut off) proti destilované vodě, zfiltrována přes porcelánovou fritu S4 a zlyofilizována.
- 19CZ 304654 B6
Množství navázaného paclitaxelu (HPLC stanovení): 25 % (hmotn.).
Příklad 26. Enkapsulace chmelového extraktu do oleyl esteru (Cl8) kyseliny hyaluronové
100 mg acylového hyaluronanu připraveného v příkladu 9 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok směsi chmelového extraktu (cca 50 mg ve 5 ml izopropanolu). Izopropanol byl z roztoku kontinuálně odstraňován vakuovou evaporací. Po odstranění izopropanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfdtrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.
Množství navázaného tokoferolu (UV-Vis stanovení): 40 % (hmotn.).
Příklad 27. Stanovení kritické micelámí (agregační) koncentrace acylovaného esteru kyseliny hyaluronové.
(a) Fluorescenční metoda
Kritická micelámí (agregační) koncentrace byla stanovena ze závislosti intenzity fluorescence na koncentraci roztoků (Obrázek 1). Emisní spektra (580 až 700 nm) vodných roztoků acylovaných hyaluronanů HAC6 (SS = 60 %) a HAC16 (SS = 14 %) s navázanou nilskou červení připravených podle postupu v příkladu 18 v rozsahu koncentrací 0,00002 až 1,5 mg.ml“1 byla proměřována na fluorometru RF-5301 (Shimadzu) při excitaci 543 nm.
Kritická micelámí (agregační) koncentrace HA C6: 0,001 až 0,003 mg.ml1 . HA 0 6 0,00006 až 0,0002 mg.ml1 (Obrázek 1). Stejná hodnota byla naměřena i pro PBS a 0,9% NaCl.
(b) Metoda statického rozptylu světla
Kritická micelámí (agregační) koncentrace byla stanovena ze závislosti intenzity rozptýleného světla (Igo) na koncentraci roztoků (Obrázek 2). Intenzita rozptýleného světla vodních roztoků acylovaných HAC6 (SS = 60 %) a HAC16 (SS = 14 %) s navázanou olejovou červení podle postupu v příkladu 18 v rozsahu koncentrací 0,00002 až 0,6 mg.ml“1 byla proměřována při úhlu 90° na fotometru DAWN EOS (Wyatt Technology Corporation) při vlnové délce 632 nm.
Kritická micelámí (agregační) koncentrace HA C6: 0,002 až 0,004 mg.ml1 . HA 0 6 0,00006 až 0,0001 mg.ml-1 (Obrázek 2). Stejná hodnota byla naměřena i pro PBS a 0,9% NaCl.
Příklad 28. Stanovení zeta potenciálu nanomicel hyaluronanu
Zeta potenciál byl stanoven na Zetasizeru Nano-ZS (Malvem Instruments) vybaveném He-Ne laserem (633 nm). Nezávisle na enkapsulované látce, nanomicely ve vodných roztocích vykazovaly zeta potenciál —50 mV při 5 mg.ml”1 a v rozmezí —60 až -70 mV po 10-ti násobném naředění. V 0,9% NaCl zeta potenciál klesl na -30 až -23 mV. Absolutní hodnota zeta potenciálu tedy indikuje vysokou stabilitu připravených nanomicel ve vodných roztocích a relativně vysokou stabilitu v solných roztocích.
-20CZ 304654 B6
Příklad 29. Morfologická analýza nanomicel hyaluronanu
Mikroskopické analýzy byly provedeny při -135 °C na skenovacím mikroskopu JEOL 7401F pracujícím při urychlovacím napětí 2 kV (jemný paprskový režim). Pro analýzu byly 2 až 3 pL koncentrovaného vzorku (cca 20 mg/0,4 ml) nakapány na Al destičku, ponořeny do kapalného dusíku v kryokomoře Alta 2500 (gatan) a pokoveny 2 min ve směsi Pt/Pd.
Velikost nanomicel hyaluronanu C6 s enkapsulovaným vitaminem E (příklad 17) a HAC16 s enkapsulovaným paclitaxelem (příklad 25): 20 až 50 nm (Obrázek 3).
Příklad 30. Distribuce acylovaných řetězců a nepolární látky v nanomicelách hyaluronanu
Separace nanomicel hydrofobizovaného hyaluronanu s enkapsulovaným vitamínem E byla provedena pomocí frakcionace tokem v tokovém poli (FIFFF) s použitím frit-inlet separačního kanálu. Pro analýzu bylo 10 mg lyofilizátu acylovaného hyaluronanu s navázaným vitamínem E (připraveno za použití acylovaných hyaluronanů v tabulce 1 podle postupu v příkladu 23) rozpuštěno v 1 ml mobilní fáze (50 mM NaNO3 s 0,02% NaN3), přefiltrováno přes stříkačkový skleněný filtr s velikostí pórů 1 pm a 100 μΐ bylo injektováno do FIFFF.
Separace byla provedena pomocí gradientu cross flow z 2 na 0,1 ml/min během 15 minut. Průtok mobilní fáze do detektoru byl udržován konstantní na hodnotě 1 ml/min.
Separace probíhala při laboratorní teplotě. Eluát byl monitorován pomocí detektoru rozptylu světla DAWN EOS, diferenciálního refraktometru Optilab rEX (oba od Wyatt Technology Corporation) a UV detektoru při 292 nm (Shimadzu).
Metodou lze zjistit, kolik procent navázané látky a hydrofobizovaného hyaluronanu je pevně inkorporováno uvnitř nanomicel a kolik je přítomno mimo zreagované útvary (viz tabulka 1).
Tabulka 1. Distribuce acylových řetězců a vitamínu E (tokoferolu) v agregátech (nanomicelách) hyaluronanu a mimo ně.
| Nosič (stupeň substituce) | Vazebná kapacita tokofero- lu (hm. %) | Nezagregované acylové skupiny (%) | Zagregované acylové skupiny (%) | Volný Vitamín E (%) | Vázaný Vitamín E (%) |
| HAC6 (DS=55%) | 6,9 | 91,5 | 8,5 | 0,5 | 99,5 |
| HAC8 (DS = 15%) | 12,4 | 82,1 | 17,9 | 0,4 | 99,6 |
| HAC10 (DS = 15%) | 18,5 | 47,2 | 52,8 | 0,5 | 99,5 |
| HAC18 (DS = 10%) | 40 | 21,5 | 78,5 | 0,3 | 99,7 |
Výsledky v tabulce 1 ukazují, že distribuce acylových řetězců v nanomicelách hyaluronanu je ovlivněna především délkou acylového řetězce. Se vzrůstající délkou řetězce narůstá agregace acylových řetězců. Nezávisle na délce acylového řetězce dochází k inkorporaci nepolární látky do nanomicely. V tomto případě vždy zcela převažuje (> 99,5 %) distribuce nepolární látky v micele.
-21 CZ 304654 B6
Příklad 31. Cytotoxicita nanomicel nesoucí cytostatikum paclitaxel
Paclitaxel navázaný do acylovaných hyaluronanů C6 a C16 připravený podle postupu v příkladu 19 a 25 byl rozpuštěn v kultivačním médiu (s 10% FBS) na koncentraci 100 pg/ml neseného acylovanými hyaluronany C6 a Cl6. Účinek paclitaxelu neseného acylovanými hyaluronany C6 a 06 byl srovnáván se samotným paclitaxelem (Obrázek4). Měření buněčné viability je založeno na detekci aktivity enzymu dehydrogenázy, který je aktivní v živých buňkách, a přeměňuje žlutý substrát na fialový roztok, jehož absorbance se detekuje při 540nm a je přímo úměrná živým buňkám.
S rostoucí koncentrací nosiče, zejména v případě HAC16, docházelo ke zmírnění cytostatického účinku paclitaxelu (obrázek 4).
Samotné acylované hyaluronany nevykazovaly cytotoxické účinky.
Příklad 32. Transfer enkapsulované látky do buňky
Látky doxorubicin a 7-aminoactinomycin D (7-AAD, látka pronikající pouze do mrtvých nebo permeabilizovaných buněk) byly enkapsulovány do acylovaného hyaluronanu C6 podle postupu v příkladu 18 (nilská červeň nahrazena 7-AAD). Na buňkách lidských dermálních fibroblastů (NHDF), linii lidského prsního karcinomu (MCF-7) a linii lidského střevního karcinomu (HCT 116) bylo otestováno metodou fluorescenční mikroskopie (invertovaný mikroskop Nikon Eclipse Ti), zdaje rozdíl mezi průnikem nesené látky do buňky, pokud je samotná látka v roztoku, anebo pokud je nesena v acylovaném hyaluronanu C6. Doxorubicin byl testován v koncentracích 5,0 pg/ml (Obrázek 5) a 7-AAD (Obrázek 6) v koncentraci 15 pg/ml.
Transfer látek z nosiče do buněk byl úspěšný.
Příklad 33. Uvolňování enkapsulované olejové červeně z nanomicel do roztoku
Uvolňování olejové červeně (Oil Red O, solvent red 27) enkapsulované v HAC6 podle postupu v příkladu 18 (nilská červeň nahrazena Oil Red O) bylo studováno in vitro do roztoků PBS nebo PBS s přídavkem 1% TWEEN 80. Vodné roztoky acylovaných hyaluronanů o koncentraci 1 a 10 mg.mF1 s navázanou olejovou červení byly rozpuštěny v PBS nebo PBS s 1% TWEEN 80, kvantitativně převedeny do dialyzačního střeva (MWCO 12-14 kDa, Spectrum Laboratories) a byly dialyzovány při 37 °C proti PBS nebo PBS s přídavkem 1% TWEEN 80. 4 ml dialyzátu byly odebrány a nahrazeny čerstvým médiem v předem definovaných intervalech. Uvolněné množství olejové červeně bylo stanoveno pomocí UV—Vis (obrázek 7).
Pomalé uvolňování navázané látky ukazuje na vysokou stabilitu nosičových systémů v PBS.
Příklad 34. Uvolňování enkapsulovaného paclitaxelu látek z nanomicel do roztoku
Uvolňování paclitaxelu enkapsulované v HAC6 a HAC16 podle postupu v příkladu 19 a 25 bylo studováno in vitro do roztoků při 37 °C. Vodné roztoky acylovaných hyaluronanů obsahující celkovou koncentraci paclitaxelu 0,2 mg byly rozpuštěny v PBS, kvantitativně převedeny do dialyzačního střeva (MWCO 12 až 14 kDa, Spectrum Laboratories) a byly dialyzovány při 37 °C proti 50 ml PBS. Dialyzát byl nahrazován čerstvým médiem v předem definovaných intervalech. Uvolněné množství paclitaxelu bylo stanoveno po jeho extrakci do chloroformu, odpaření a následném rozpuštění v acetonitrilu pomocí HPLC (obrázek 8).
-22CZ 304654 B6
Pomalejší uvolňování evidováno pro HAC16 oproti HAC6. Pomalé uvolňování navázané látky ukazuje na vysokou stabilitu nosičových systémů v PBS.
Příklad 35. Příprava nanoemulzí a mikroemulzí z oleyl esteru(C18:l) kyseliny hyaluronové a kyseliny olejové mg acylovaného hyaluronanu připraveného v příkladu 11 bylo přes noc rozpouštěno ve 4 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku bylo za stálého míchání postupně přidáváno 8 mg kyseliny olejové. Po promíchání byla výsledná směs sonikována (Ultrasonic Processor, UPS 200S, output 200W) nejprve kontinuálně po dobu 25 min (amplituda 50 %) a poté s 0,8 s pulzací (amplituda 70 %) po dobu 25 min. V průběhu sonikace byla skleněná nádoba se sonikovanou směsí ponořena v ledové lázni pro zamezení přehřívání.
Velikost částic (zetasizer): 200 až 300 nm. Velikost je závislá na množství olejové fáze ve směsi.
Příklad 36. Příprava nanoemulzí a mikroemulzí z oleyl esteru(C18:l) kyseliny hyaluronové, kyseliny olejové a koenzymu Q10 mg acylovaného hyaluronanu připraveného v příkladu 11 bylo přes noc rozpouštěno ve 4 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku bylo za stálého míchání postupně přidáváno 8 mg kyseliny olejové sjiž rozpuštěným koenzymem Q10 (cca 0,5 mg). Po promíchání byla výsledná směs sonikována (Ultrasonic Processor, UPS 200S, output 200W) nejprve kontinuálně po dobu 25 min (amplituda 50 %) a poté s 0,8 s pulzací (amplituda 70 %) po dobu 25 min. V průběhu sonikace byla skleněná nádoba se sonikovanou směsí ponořena v ledové lázni pro zamezení přehřívání.
Velikost částic (zetasizer): 200 až 300 nm. Velikost je závislá na množství olejové fáze ve směsi.
Příklad 37. Stabilizace nanomicel kovalentním síťováním g hyaluronanu sodného (25 mmol, 38 kDa) bylo rozpouštěno v 200 ml demi vody. Poté se do roztoku přidaly TEA (6,97 ml, 2 eq. vzhledem k dimeru HA) a DMAP (153 mg, 0.05 eq.). Aktivace: 3,5 g kyseliny 3-(2-furyl)akrylové (25 mmol) bylo rozpuštěno v 50 ml tetrahydrofuranu a 19,2 ml TEA (2 eq.), následovalo chlazení v ledové lázni a přídavek trichlorbenzoyl chloridu (1,2 ml), reakce se nechala probíhat 15 minut. Poté byla aktivovaná kyselina přidána k roztoku hyaluronanu, reakce probíhala po dobu 24 h při 25 °C. Potom se reakční směs naředila vodou. Akrylovaný hyaluronan byl z reakční směsi vyizolován srážením za použití 4-násobku absolutního izopropanol. Po dekantaci se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem izopropanolu (85 % obj.) Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C. Získaný akrylovaný hyaluronan byl acylován, viz příklad 1, následně rozpuštěn ve vodě a lyofilizován za účelem odstranění zbytkových rozpouštědel.
Nosičový systém připravený z olejové červeně (Oil red O) a akrylovaného hyaluronanu podle postupu v příkladu 18 (nilská červeň nahrazena olejovou červení) byl rozpuštěn jako 1% vodný roztok, a zesíťován v tomto vodném roztoku za použití iniciátoru peroxydisulfátu amonného (10% eq.).
SS 20 % aktivní skupiny pro foto cross-link (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O): δ 7,83, 6,87 (d, J=3,5), 6,87, 6,61 (bs), 7,83, 7,59 (J,ra™= 16,01), 6,39 (Jfraws-15, 85).
-23CZ 304654 B6
Příklad 38. Topická aplikace nanomicel hyaluronanu - penetrace do kůže, vlas a sliznic
Prasečí kůže, kravská vaginální a kravská bukální sliznice byly darovány od MasoEko, s.r.o. Kunčice 243, Letohrad. Vzorky byly ihned po odebrání vystaveny pasivnímu působení roztoku acylovaného hyaluronanu C6 a CIO (10 mg.mE1) s enkapsulovanou nilskou červení (připraveno podle postupu v příkladu 18) a penetrace do vzorku byla porovnána měřením fluorescence na invertovaném mikroskopu Nikon Eclipse Ti, objevit Pian Fluor 4x. Vzorky kůže byly inkubovány při 37 °C po dobu 20 hodin (obrázek 9), vzorky vlasů po dobu 15 minut (obrázek 10) a vzorky sliznic po dobu 4 hodin (obrázekl 1 a 12).
Nosiče zajistily efektivnější penetrace látek do kůže, vlasů a sliznic oproti olejovému a vodnému rozpouštědlu.
Claims (15)
Hide Dependent
translated from
Claims (15)
Hide Dependent
translated from
1. Nanomicelámí kompozice na bázi C6-Ci8-acylováného hyaluronanu, vyznačující se t í m , že obsahuje C6-Ci8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I (I), kde R je I-f nebo Na+, a kde R1 je H nebo -C(=O)CxHy, kde x je celé číslo v rozmezí 5 až 17 a y je celé číslo v rozmezí 11 až 35 a CxHy je lineární nebo rozvětvený, nasycený nebo nenasycený řetězec C5-Ci7 a, přičemž alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1 -C(=O)CxHy, kde n je v rozmezí 12 až 4000, přičemž nanomicely představují hydrofobní jádro tvořené CóAfyg-acylovými skupinami navázanými na hyaluronan a hydrofilní obal tvořený hydrofilními funkčními skupinami hyaluronanu, a jednu nebo více biologicky aktivních látek fyzikálně vázaných v nanomicele.
2. Nanomicelámí kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje C6Cig-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I, kde R je H' nebo Na+ a R1 je -C(=O)(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3.
3. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoliv z nároků la2, vyznačující se tím, že obsahuje 0,3 až 50 % hmotnostních biologicky aktivní látky vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, přičemž biologicky aktivní látka je vybrána ze skupiny zahrnující farmaceuticky a kosmeticky aktivní látky, zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fytokomplexy nebo fytoaktivní látky, minerální nebo rostlinné oleje, nebo jejich směs.
4. Nanomicelámí kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že biologicky aktivní látkou je tokoferol, paclitaxel, fosfatidylcholin nebo koenzym Q10.
-24CZ 304654 B6
5. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž 4, vyznačující se tím, že obsahuje vyšší koncentraci C6-C|8-acylovaného hyaluronanu než je jeho kritická agregační koncentrace.
6. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž5, vyznačující se tím, že koncentrace C6-Ci8-acylované hyaluronanu v kompozici ve vodném roztoku je v rozmezí 0,0001 až 30 mg.ml'1, s výhodou 1 až 20 mg.ml'1.
7. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž 6, vyznačující se tím, že biologicky aktivní látkou je minerální nebo rostlinný olej v množství 0,05 až 40 % hmotn. vzhledem k hmotnostnímu obsahu C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu, s výhodou 1 až 20 % hmotn.
8. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje biologicky aktivní látku, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, v níž je rozpouštěna další biologicky aktivní látka.
9. Nanomicelámí kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, je minerální nebo rostlinný olej, a další biologicky aktivní látkou je farmaceuticky nebo kosmeticky aktivní látka, zejména vitamíny, léčiva, cytostatika, steroidy, fytoextrakty, fytokomplexy nebo fytoaktivní látky nebo jejich směs.
10. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků laž9, vyznačující se tím, žeje ve formě roztoku, nanoemulze, mikroemulze, koacervátu nebo gelu.
11. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoliv z nároků lažlO, vyznačující se tím, že v alespoň jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1 -C(=O)CxHy a jeden nebo více -C(=O)CH=CH-het, kde het je heterocyklický nebo heteroaromatický zbytek s volitelným obsahem N, S nebo O atomů.
12. Způsob přípravy C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I obsaženého v nanomicelámí kompozici definované v kterémkoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že hyaluronan reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru s C6-Ci8 karboxylovou kyselinou aktivovanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3-CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený Ci-C30 alkyl, heteroaromatická nebo aromatická funkční skupina.
13. Způsob přípravy podle nároku 12, vyznačující se tím, že hyaluronan je ve formě volné kyseliny nebo stabilní farmaceuticky přijatelné soli a má molekulovou hmotnost od 5x103 do l,6xl06 g/mol, s výhodou od 15xl03 do 250xl03g/mol, nejlépe 15xl03 až 50xl03 g/mol.
14. Způsob přípravy podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, že se rozpustí hyaluronan ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, kterým je polární organické rozpouštědlo, přičemž obsah vody je v rozmezí od 10 do 99 % objemových, s výhodou 50 % objemových.
15. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že aprotickým rozpouštědlem mísitelným s vodou se rozumí dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, aceton, acetonitril nebo izopropanol.
16. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12ažl5, vyznačující se tím, že v reakční směsi je přítomna báze R'3N, kde R' je lineární nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec CnHm, kde n je celé číslo v rozmezí 1 až 4 a m je celé číslo v rozmezí 3 až 9, jako např. triethylamin, v množství 0,01 až 20 ekvivalentů, s výhodou 6 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu, a katalyzátor vybraný ze skupiny zahrnující substituované pyridiny, jako dimethylaminopyri-25CZ 304654 B6 din a jeho deriváty, v množství 0,01 až 1 ekvivalent, s výhodou 0,05 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu.
17. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 16, vyznačující se tím, že se nejprve provede aktivace Cf)-Cis karboxylové kyseliny v polárním organickém rozpouštědle, v přítomnosti báze a kyseliny 2,4,6-trichlorbenzoové nebo jejích derivátů, nebo v přítomnosti báze a organického chloridu, následně se směs obsahující aktivovanou C6-Ci8 karboxylovou kyselinu přidá k hyaluronanu rozpuštěného ve směsi vody, organického rozpouštědla, báze a katalyzátoru a nechá se proběhnout reakce za vzniku C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce I.
18. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 17, vyznačující se tím, že C6Cig karboxylová kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu kapronovou, enanthovou, kaprylovou, kaprinovou, palmitovou, stearovou, olejovou, linolovou a linolenovou.
19. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 18, vyznačující se tím, že množství aktivované C6-Ci8 karboxylové kyseliny je v rozmezí 0,01 až 5 ekvivalentů, s výhodou 0,5 až 2 ekvivalentů vzhledem k dimeru hyaluronanu.
20. Způsob přípravy podle nároků 12 až 19, vyznačující se tím, že aktivace C6-C18 karboxylové kyseliny probíhá po dobu 5 až 120 minut, s výhodou 30 minut, při teplotě od 20 až 60 °C, s výhodou při 25 °C.
21. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 20, vyznačující se tím, že reakce hyaluronanu s aktivovanou C6-Ci8 karboxylovou kyselinou probíhá po dobu 1 až 24 hodin, s výhodou 2 až 3 hodiny, při teplotě od 20 do 60 °C, s výhodou při 25 °C.
22. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 12 až 21, vyznačující se tím, že se C6-C)8-acylovaný hyaluronan následně izoluje z reakční směsi, promyje, suší a lyofilizuje.
23. Způsob přípravy podle nároku 22, vyznačující se tím, že se C6-Ci8-acylovaný hyaluronan izoluje z reakční směsi srážením za použití NaCl a alkoholu.
24. Způsob přípravy podle nároku 22 nebo 23, vyznačující se tím, že se C6-C]8acylovaný hyaluronan promyje alkoholem, zejména izopropanolem nebo ethanolem.
25. Způsob přípravy nanomicelámí kompozice definované v kterémkoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se Cé-Cig-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a biologicky aktivní látka se rozpustí v organickém rozpouštědle, oba roztoky se smíchají, poté se organické rozpouštědlo odstraní.
26. Způsob přípravy podle nároku 25, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo se odstraní vakuovou evaporací, následně se vodná fáze usuší, rehydratuje, získané nanomicelámí útvary se zfiltrují a nakonec lyofilizují.
27. Způsob přípravy podle nároku 25, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo se odstraní dialýzou, získané nanomicelámí útvary se poté zfiltrují a nakonec lyofilizují.
28. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem je těkavé chlorované rozpouštědlo jako trichlormethan, nebo alkohol jako ethanol nebo izopropanol.
29. Způsob přípravy nanomicelámí kompozice definované v kterémkoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se C6-C18-acyl ováný hyaluronan podle obecného vzorce 1 roz-26CZ 304654 B6 pustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze.
30. Způsob přípravy nanomicelámí kompozice definované v nároku 29, vyznačující se 5 t í m , že se C6-C]8-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce I rozpustí ve vodě a následně se smíchá s biologicky aktivní látkou, která je kapalná a nerozpustná ve vodě a v níž je rozpuštěna další biologicky aktivní látka, načež se směs homogenizuje sonikaci za tvorby mikroemulze nebo nanoemulze.
ío
31. Použití nanomicelámí kompozice definované v kterémkoli z nároků 1 až 11 pro farmaceutické nebo kosmetické aplikace, s výhodou zejména pro topické aplikace.
32. Způsob přípravy stabilní nanomicelámí kompozice, vyznačující se tím, že se připraví C6-C18-acylovaný hyaluronan podle obecného vzorce II kde R je I-Γ nebo Na+, alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více R1 představován C6-Ci8 lineárním řetězcem, který může obsahovat nenasycené vazby, a alespoň v jedné opakující
20 se jednotce je jeden nebo více R1 představován 3-(2-thienyl)akrylovou kyselinou nebo 3-(2furyl)akrylovou kyselinou nebo jejich deriváty; načež se z C6-Ci8-acylovaného hyaluronanu podle obecného vzorce II připraví nanomicelámí kompozice, která se stabilizuje síťovací reakcí.
33. Způsob přípravy podle nároku 32, vyznačující se tím, že nejprve hyaluronan
25 reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru, s 3-(2-thienyl)akrylovou kyselinou nebo 3-(2-furyl)akrylovou kyselinou nebo jejich derivátem, aktivovanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3-CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený Ci-C30 alkyl, případně obsahující heteroaromatické nebo aromatické funkční skupiny, za vzniku akrylovaného hyaluronanu pod30 le vzorce III
-27CZ 304654 B6 0 OR OR
To
OH /
NH
CH3CO
R=H+ nebo Na+, R1 =
H z = o o
(III), poté akrylovaný hyaluronan podle vzorce III reaguje ve směsi vody a aprotického rozpouštědla mísitelného s vodou, v přítomnosti báze a katalyzátoru, s C6-Cl8 karboxylovou kyselinou aktivo5 vanou chloridem 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny nebo aktivovanou organickým chloridem R3CO-C1, kde R3 je alifatický nebo rozvětvený C]-C3o alkyl, příležitostně obsahující heteroaromatické nebo aromatické funkční skupiny, za vzniku C6-C!8-acylovaného hyaluronanu podle vzorce II, následně se z hyaluronanu podle vzorce II připraví nanomicelární kompozice způsobem definovaným v kterémkoli z nároků 25 až 30, která se poté podrobí síťovací reakci pomocí radikálo10 vých reakcí.
34. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 32 a 33, vyznačující se tím, že radikálová reakce je katalyzovaná síťovacím činidlem.
15 35. Způsob přípravy podle nároku 34, vyznačující se tím, že síťovacím činidlem je peroxydisulfát amonný.