CZ2012282A3

CZ2012282A3 - Zesítovaný derivát hyaluronanu, zpusob jeho prípravy, hydrogel a mikrovlákna na jeho bázi

Info

Publication number: CZ2012282A3
Application number: CZ20120282A
Authority: CZ
Inventors: Huerta-Angeles@Gloria; Jouklová@Zuzana; Príkopová@Eva; Velebný@Vladimír
Original assignee: Contipro Biotech S.R.O.
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2013-11-06
Also published as: EP2841462B8; JP2015517016A; RU2014146888A; WO2013159757A1; EP2841462B1; KR20150005937A; EP2841462A1; US20150104643A1; ES2595653T3

Abstract

Sítovaný derivát hyaluronanu ve forme hydrogelu nebo mikrovláken a zpusob jeho prípravy, spocívající v C-C vazebné reakci. C-C vazebná reakce se provede reakcí derivátu hyaluronanu nesoucího koncovou arylhalogenidovou a/nebo arylboritanovou skupinu, a derivátu hyaluronanu nesoucího adenylovou nebo alkinylovou skupinu, ve vode, fosfátovém pufru nebo smesi organické kyseliny a alkoholu, a v prítomnosti paladnatého aktivního katalyzátoru. Paladnatým aktivním katalyzátorem muze být napríklad komplex octanu paladnatého a anorganického nebo organické báze, nebo komplex Pd(II) a 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu.

Description

Zesíťovaný derivát hyaluronanu, způsob jeho přípravy, hydrogel a mikro vlákna na jeho bázi

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu zesítění modifikované kyseliny hyaluronové (HA), který je katalyzován homogenním Pd katalyzátorem stálým ve vodě, a případně bází. Proces spočívá v syntéze derivátů, které lze použít jako vhodné prekurzory pro reakci uhlík-uhlík neboli tzv. cross-coupling reakci. Tyto prekurzory lze využít pro syntézu hydrogelů, jakož i pro síťování mikrovláken vyrobených z jejich derivátů.

Dosavadní stav techniky

Kyselina hyaluronová (HA nebo hyaluronan) patří do skupiny polymerů, které jsou známy pod názvem glykosaminoglykany. HA je lineární polysacharid s dlouhým řetězcem a je obvykle přítomna jako sodná sůl, která má molekulární vzorec (Ci4H2oNNaOn)_n a molární hmotnost se může lišit v závislosti na zdroji, postupu izolace a způsobu stanovém. Jsou však známy molární hmotnosti až do výše 14xl0⁶. Zde zmiňovaná molární hmotnost je hmotnostně střední molární hmotnost, není-li uvedeno jinak.

HA je neimunogenní, a proto má velký potenciál v lékařství. Díky svým viskoelastickým vlastnostem byla HA s vysokou molární hmotností (více než 1 milion) shledána obzvlášť užitečnou v mnoha různých klinických oblastech, včetně léčby ran, oční chirurgie a ortopedické chirurgie. HA je také zvláště užitečná v mnoha různých nelékařských oborech, například v kosmetických aplikacích.

Použití HA v některých z těchto aplikací je však omezeno tím, že po podání člověku je HA rychle degradována enzymy, například hyaluronidázami, a volnými radikály. Navíc je HA rozpustná ve vodě při laboratorní teplotě, což ji může rovněž činit méně vhodnou pro určité aplikace. Za účelem zvýšení viskozity nebo dosažení zesíťovaného derivátu se musí použít externí činidlo.

Proto byly učiněny různé snahy o přípravu stabilnějších forem HA, zejména síťováním. Například U.S. patent, č. 4,582,865 popisuje přípravu zesíťovaných gelů kyseliny hyaluronové použitím divinylsulfonu jakožto síťovacího činidla; ale zesíťovaný materiál může zapouzdřovat volný divinylsulfon, který je potencionálně toxický a pyrogenní, jak bylo později popsáno v US patentu č. 7131492. Další příklady hydrogelů na bázi HA se získaly pomocí síťovacích činidel jako je např. butandioldiglycidyléter nebo glutaraldehyd (Collins & Birkinshaw, 2007). Avšak vyskytlo se několik zpráv o alergických reakcích na tyto produkty « · · (Matarasso & Herwick, 2006). Uvedená přihláška vynálezu překonává některé nevýhody, které jsou známy u síťování, konkrétněji to, že síťování někdy selže a musí se použít druhé síťovací činidlo, které je obecně vysoce reaktivní činidlo, takže se preferuje přímá modifikace polysacharidu a síťování ve druhém kroku (Schanté, Zuber, Herlin & Vandamme; Yeom et al.).

V dosavadním stavu techniky byla popsána další síťovací činidla, která obsahují kov, přechodný kov, metaloid, zde souhrnně nazývané ”kov”. Příklady zahrnují bor, hliník, zirkon, hořčík, železo, měď, olovo nebo titan (US 20010002411). Obecně kov interaguje s alespoň dvěma gelujícími molekulami za vzniku chemické vazby mezi nimi. Mnoho z těchto známých síťovacích činidel má nevýhody spojené sjejich použitím. Například síťující činidla s obsahem boru jsou omezena na použití při pH 8 a vyžadují, aby byly v reakční směsi použity externí soli. Navíc bor reaguje shydroxyly přítomnými v makromolekule nebo s aditivy, například alkoholy nebo glykoly použitými pro dodatečnou úpravu a izolaci reakčních produktů. Titan má také nevýhody, například vysokou cenu a pomalou kinetiku síťování. I síťovací činidla na bázi zirkonu mají nevýhody; např. neschopnost síťovat xantan, který je běžným gelujícím činidlem používaným u formulací (US-20080207470).

Další způsoby síťování za účelem tvorby hydro gelů zahrnují nekovalentní vazby a použití mnohonásobně nabitých iontů, například železa, mědi, zinku, vápníku a dalších chelátotvomých iontů, jak je to uvedeno v US-7807656-B2. Začleněné kovy však mohou mít nějaké neznámé toxické účinky.

Síťování není výlučně za účelem tvorby hydrogelů, ale může být také uplatněno pro získání nerozpustných mikrovláken. Namísto toho byla nedávno popsána mikrovlákna (nebo vlákna) vyrobená z nativní kyseliny hyaluronové ve spise US 20100310631, a ta mají tu vlastnost, že jsou úplně rozpustná ve vodě. Kromě toho byly získány materiály na bázi hyaluronových vláken síťováním kyseliny hyaluronové v přítomnosti síťovacích činidel typu karbodiimidu a epoxidu (síťovací činidla, jejichž nekompletní seznam je zmíněn například v US2007066816). Tyto materiály však mají nezanedbatelnou nevýhodu, že jsou toxické pro lidi, což velice omezuje jejich použití in vivo.

Během posledních let byly činěny obrovské snahy v oblasti organických syntéz zprostředkovaných přechodným kovem. V tomto ohledu je vazebná reakce uhlík-uhlík konceptem, který zahrnuje mnoho různých reakcí, kde se vážou dva uhlovodíkové fragmenty s pomocí kovového katalyzátoru. Jsou známy dva druhy vazebných reakcí: cross-coupling (křížové vázání”), které zahrnuje reakci dvou různých partnerů, a homocoupling

(”homovázání”), kde se vážou dva stejní partneři. Přechodové kovy mají jedinečnou schopnost aktivovat různé organické sloučeniny a díky této aktivaci mohou katalyzovat tvorbu nových vazeb. Princip cross-coupling reakcí katalyzovaných paladiem spočívá v tom, že se spojí dvě molekuly na kovu prostřednictvím tvorby vazeb kov-uhlík. Tak se atomy 5 uhlíku navázané na paladium uvedou navzájem do těsné blízkosti. V dalším kroku se navážou na sebe navzájem a to vede k tvorbě nové jednoduché vazby uhlík-uhlík. To je znázorněno na

Obecný katalytický cyklus reakce cross-coupling

Schéma 1

Reakce cross-coupling katalyzovaná paladiem se uplatnila například u syntézy cukrových tyčinek (”sugar rods”) a později uhlovodanových klastrů (Roy, Das, Santoyo-González, Hemández-Mateo, Dam & Brewer, 2000). Některé příklady tohoto typu chemie byly popsány v řadě článků od autorů Vasella et al (Murty & Vasella, 2001). Tato užitečná reakce se však zřídkakdy použila v chemii uhlovodanů nebo polysacharidů. Mezinárodní přihláška vynálezu č. WO-9014353 popisuje vázání oligonukleotidů zprostředkované paladiem, pro diagnostické a terapeutické účely. Nová, paladiem zprostředkovaná vazba uhlík-uhlík byla popsána ve WO/2007/008226 pro použití při tvorbě chemie po vzoru DNA.

My zde popisujeme nový způsob síťování HA pomocí reakce cross-coupling katalyzované paladiem. Reakci lze provést bez použití speciálních aditiv, například dalších kovů, například mědi. Reakci lze provést ve vodě nebo ve fosfátovém pufru, jakož i ve směsích alkoholů a běžných organických a anorganických, ne drahých, bází a kyselin. Optimalizace podmínek ukázala, že reakce vyžaduje velmi malé množství katalyzátoru, poměrně nízké teploty a krátký reakční čas. Po zesíťování se produkty, zde nazývané hydrogely a mikrovlákna, důkladně promyly, aby se eliminovalo zbytkové paladium. Účinná eliminace katalyzátoru překvapivě zajistila potencionální využití reakce pro tvorbu nerozpustných materiálů pro aplikace ve farmacii a obecně pro humánní použití, takže reakce cross-coupling vede k opravdové inovaci v oblasti modifikační chemie bioaktivních polysacharidů.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu síťování polysacharidů, a konkrétněji kyseliny hyaluronové. Jak bylo diskutováno výše, vynález poskytuje způsob tvorby nerozpustných derivátů kyseliny hyaluronové. Konkrétněji, způsob se týká přípravy mnohonásobně zesíťovaných hydrogelů nebo mikrovláken na bázi chemicky modifikované HA. Tato metodologie popisuje účinnou přípravu hydrogelů na bázi kyseliny hyaluronové, a zároveň může být tato metodologie aplikována na síťování mikrovláken na bázi modifikované HA. Postup přípravy síťovaného derivátu hyaluronanu se provádí vazebnou reakcí C-C ve vodě, fosfátovém pufru nebo ve směsi organické kyseliny a alkoholu, a v přítomnosti aktivního katalyzátoru paladia, přičemž vazebná reakce C-C proběhne mezi derivátem hyaluronanu nesoucím koncovou arylhalogenidovou skupinu a/nebo arylboritanovou skupinu a derivátem hyaluronanu nesoucím alkenylovou nebo alkinylovou skupinu.

Vlákna podle tohoto popisu se připraví mokrým zvlákňováním nebo extruzí směsi prvního a druhého prekurzoru, kde každý má alespoň jednu funkční skupinu, o níž je známo, že je reaktivní při reakcích cross-coupling, Pro výrobu vláken lze použít známé zvlákňovací

...... i.

přístroje. Zesíťované materiály vytvořené podle tohoto popisu mohou být zhotoveny reakcí prvního prekurzoru majícího funkční skupinu s druhým prekurzorem, což má za následek, že ( tyto dva prekurzory mají mezi sebou kovalentní vazbu, za katalýzy aktivního katalyzátoru paladia. jinými slovy, způsob zahrnuje kovalentní vázání HA na další molekulu HA vázáním uhlík-uhlík. Ještě jinými slovy, na zesíťování kyseliny hyaluronové ve vodném prostředí se použila variace na Sonogashirovu reakci.

Problém, který řeší tento vynález, je získání hydrogelů a mikrovláken na bázi kyseliny hyaluronové, které jsou nerozpustné ve vodě, a to jednoduše, levně a účinně, a které by byly vhodné pro použití in vivo. Problém je vyřešen použitím paladiového katalyzátoru, který může být po zesíťování vhodných prekurzorů eliminován. Použití kyseliny hyaluronové je výhodné, protože získaný materiál je biokompatibilní a absorbovatelný. Hydrogely získané touto metodologií mají trojrozměrnou strukturu a vzájemně propojené póry. Navíc vlákna, • · · · » · • · · ·

zesíťovaná tímto způsobem, vykázala obrovské zlepšení mechanických vlastností ve srovnání s vlastnostmi nesíťovaných vláken. Vlákno se stane nerozpustným, narozdíl od stavu před zesíťovámm. Síťované materiály uváděné v této přihlášce vynálezu mohou být také začleněny do aplikací, které vyžadují viskoelastický gel. Zesíťovaná vlákna připravená podle vynálezu 5 mohou být použita v mnoha různých chirurgických aplikacích a při hojení ran, jakož i jako součásti zdravotnických prostředků. Další cíle vynálezu budou patrné na bázi následujícího popisu a nároků.

V prvním provedení se vynález týká způsobu síťování derivátů kyseliny hyaluronové, který vede k zesíťováným derivátům HA, znázorněným vzorci (A) nebo (B):

/ / ch₃co ch₃co (A) (B) kde Ri je alifatický C1-15 substituent, který může být u obou derivátů stejný nebo odlišný.

Neomezujícím příkladem Ri je methylen nebo ethylen.

Dále se vynález týká postupu přípravy derivátů pro síťovací reakci, zahrnujícího kroky:

i) příprava derivátu sekundárního aminu hyaluronanu, nesoucího koncový arylový substituent, který je rovněž nazýván první prekurzor, podle vzorce (I):

Illfw ilS es

kde X je halogen nebo boritanová funkční skupina. Neomezujícím příkladem X je -I . -Br nebo 8-(01¾. Jinými slovy, krok i) zahrnuje s výhodou kroky a) oxidace hyaluronanu v poloze C-6, a b) navázání primárního aromatického aminu nesoucího koncový substituent, kterým může být s výhodou bromid, jód nebo koncová skupina obsahující bór, za účelem získání složek typu (I). Primární aminy jsou aromatické, typu p-substituovaných anilinů, aby se získaly deriváty typu (I), které jsou substráty pro síťovací reakci popsanou v kroku iii) níže, takže použití jódu (Ia), bromu (Ib) nebo boritanů (lc) jakožto koncové skupiny v chemicky modifikované kyselině hyaluronové poskytuje složky, které mohou umožnit účinnou modulaci reakce cross-coupling. Pokud je nám známo, para-substituent aromatického kruhu ovlivňuje a může změnit krok oxidativní adice katalytického cyklu (Schéma 1 výše). Jinými slovy, první složka (I) může změnit kinetiku síťování, takže tvorba gelu se může lišit pokud jde o rychlost, čas, teplotu, výtěžek, a může zvýšit rozsah reakce cross-coupling. Tyto příznivé vlastnosti jsou obvykle přisuzovány odcházející skupině substituentu připojené v poloze para arylového substituentu -X, u níž se má za to, že řídí rychlost síťování prvního prekurzoru (I) s druhým prekurzorem typu Π nebo III.

Krokem ii) je příprava derivátu sekundárního aminu hyaluronanu, nesoucího nenasycenou sloučeninu, která obsahuje trojnou nebo dvojnou vazbu, který je rovněž nazýván druhý prekurzor, podle vzorce (II) nebo (III):

CP fí

Ϊ iů fů

O

(ΪΪ)

• · · kde Ri je specifikován výše. Chemická modifikace kyseliny hyaluronové v kroku ii) s výhodou zahrnuje kroky a) oxidace hyaluronanu v poloze C-6, a b) napojení alifatického primárního aminu na polysacharidový řetězec, nesoucí koncovou nenasycenou skupinu, kterou může být alkin (II) nebo alken (III), např. propargylamin nebo butinylamin pro (II) nebo alkenylové skupiny jako je allylamin pro (III), přičemž alkiny (II) jsou obvykle reaktivnější než alkeny (III). Rychlost síťování a konečné vlastnosti materiálu mohou být uzpůsobeny pomocí reaktivity druhých prekurzorů II nebo III.

Další krok, krok iii) zahrnuje vázání koncových alkinů (II) nebo alkenů (III) s arylem, vinylhalogenidy nebo boritany derivátu (I), katalyzované ”paladnatým aktivním katalyzátorem” za účelem zesíťování prostřednictvím tvorby vazeb uhlík-uhlík. Tuto reakci lze rovněž nazvat cross-coupling. Krok iii) tedy spočívá ve smíchání derivátu podle vzorce (I) s derivátem podle vzorce II (nebo III), a paladnatého aktivního katalyzátoru, aby proběhlo cross-coupling kyseliny hyaluronové. Zesíťovaný produkt je charakterizován vzorci znázorněnými na schématech A a B výše. Cross-coupling je náhodně definováno rovnicí znázorněnou na schématu 2, kde Ri a R₂ jsou deriváty HA sarylovými nebo vinylovými skupinami a X je atom halogenu nebo příbuzná heteroatomová odstupující skupina. Kovy (M) jsou definovány jako všechny prvky kromě H, C prvků skupin 15-18.

Ri-M + R₂-X -+R1-R2 +M-X

Schéma 2

V tomto případě by se mělo rozlišovat mezi vázáním cross-coupling a homo-vázáním. Reakce, které dávají zejména statistické nebo náhodné směsi R1R2, R1R1 a R2R2, by pravděpodobně měly být z cross-coupling vyloučeny.

Jak je zde popsáno, reakce může, ale nemusí zahrnovat použití katalytického množství měďných solí a obvykle se zde považuje za cross-coupling. Reakce cross-coupling, jak je znázorněna na Schématu 2 a charakterizována katalytickým cyklem popsaným na Schématu 1, se aplikuje v kroku iii) za účelem získání síťovaných materiálů. Cross-coupling zahrnuje reakci mezi koncovým halogenidem a/nebo aryl-boritanem a nenasycenou skupinou, například alkenylovým nebo alkinylovým derivátem, katalyzovanou paladnatým aktivním katalyzátorem, kterým může být s výhodou komplex octanu paladnatého a anorganické nebo organické báze, nebo komplex 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu paladnatého, přičemž koncentrace paladnatého aktivního katalyzátoru v reakční směsi může být v rozsahu od lxl0‘⁵do lxlO³ M. Bylo zjištěno, že pro přípravu síťovaného derivátu HA ve formě hydrogelu je výhodné použít jakožto paladnatý aktivní katalyzátor komplex octanu paladnatého a anorganické nebo organické báze jako je DABCO, TEMED, TEA, sekundární fosforečnany, • · · • · například K2HPO4, uhličitany, například CsCCh, výhodněji TEMED nebo DABCO, přičemž výhodná koncentrace takového paladnatého aktivního katalyzátoru v reakční směsi je v rozsahu od lxl O'⁴ do lxlO’³ M, s výhodou 5x10⁴.

Pro přípravu síťovaného derivátu HA ve formě mikrovláken se smíchá derivát podle vzorce (I) s derivátem podle vzorce (II) nebo (III) a směs se extruduje do koagulační lázně, a pak se mikrovlákna přenesou do síťovací lázně obsahující paladnatý aktivní katalyzátor. Bylo zjištěno, že výhodným paladnatým aktivním katalyzátorem pro síťování mikrovláken je komplexpaladia (II) a 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu (neboli 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu paladnatého) a jeho výhodná koncentrace v síťovací lázni je v rozmezí od lxlO'⁵do lxlO'⁴ M, s výhodou 5xl0’⁵. Koagulační lázeň může sestávat ze směsi alkoholu a organické kyseliny, přičemž však lze použít jakoukoli koagulační lázeň vhodnou pro výrobu mikrovláken na bázi HA, a síťovací lázeň sestává ze směsi alkoholu, například methanolu, ethanolu nebo isopropanolu, a kyseliny mléčné a paladnatého aktivního katalyzátoru. Výhodné složení síťovací lázně je kyselina mléčná a isopropanol v poměru 1:1 až 1:5, s výhodou 1:4.

Aby proběhla reakce 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu, musí mít polymer alespoň jednu odstupující skupinu (halogenid, skupinu obsahující bór) a jeden nenasycený (alkenový nebo alkynový) zbytek na makromolekulu.

Reakce 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu je ilustrována na Schématu 3 pro případ alkinů, a

Schéma 3 • ·

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje Ή NMR spektrum produktu Ib, jak je popsán v Příkladu 2.

Obrázek 2 znázorňuje ^!H NMR spektrum produktu lib, jak je popsán v Příkladu 5.

Obrázek 3 znázorňuje SEM mikrostrukturu síťovaného materiálu popsaného v Příkladu 8 (za použití TEMED).

Obrázek 4(a) znázorňuje bod gelace stanovený při (25 °C) a Obrázek 4(b) znázorňuje bod gelace stanovený při 60 °C pro síťování derivátů la a Ila, jak je popsáno v Příkladu 8, přičemž TEMED je použit jako báze.

Obrázek 5 znázorňuje SEM mikrostrukturu síťovaného materiálu popsaného v Příkladu 12, přičemž reakce se prováděla za použití pufru K2HPO4.

Obrázek 6 znázorňuje SEM mikrostrukturu síťovaného materiálu popsaného v Příkladu 10, přičemž DABCO je použit jako báze.

Obrázek 7 znázorňuje mikrostrukturu mikrovláken připravených z derivátů popsaných v příkladech 2 a 4, přičemž koncentrace obou derivátů je 12%. Obrázek 7a znázorňuje mikrostrukturu vlákna před reakcí cross-coupling a Obrázek 7b znázorňuje mikrostrukturu po cross-coupling.

Obrázek 8 znázorňuje mikrostrukturu mikrovláken připravených z derivátů popsaných v příkladech 2 a 4, přičemž koncentrace obou derivátů je 14%. Obrázek 8a znázorňuje • · mikrostrukturu vlákna před reakcí cross-coupling a Obrázek 8b znázorňuje mikrostrukturu po cross-coupling.

Obrázek 9 znázorňuje mikrostrukturu mikrovláken připravených z derivátů popsaných v příkladech 2 a 4, přičemž koncentrace obou derivátů je 15%. Obrázek 9a znázorňuje mikrostrukturu vlákna před reakcí cross-coupling a Obrázek 9b znázorňuje mikrostrukturu po cross-coupling.

Obrázek 10 znázorňuje stupeň bobtnání v závislosti na čase u vláken připravených v příkladech 16, 17 a 18 po ponoření do PBS. Průměrný průměr byl měřen jako funkce času, stanoveno pomocí optické mikroskopie.

Obrázek 11 je grafické znázornění testované biokompatibility mikrovláken připravených v příkladu 17.

Obrázek 12 znázorňuj e pevnost v tahu mikrovláken připravených v příkladu 18. (

DEFINICE

V tomto popisu jsou některé výrazy užívány poměrně často, jelikož se týkají důležitých technických aspektů znaků nebo provedení. Pro některé z těchto výrazů by měly být použity následující definice, pokud konkrétní kontext, v němž jsou použity, nevyžaduje jinou interpretaci.

Kyselina hyaluronová, jak je zde uváděna, se vztahuje jak kpolysacharidů ve formě polykarboxylové kyseliny, tak k jejím solím, např. sodné, draselné, hořečnaté a vápenaté soli, a může mít hmotnostně průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí od 50 000 do 3 000 000 Da.

Stupeň substituce, jak je zde uváděn v případě polysacharidového řetězce, je definován jako ¹ reaktivní zbytky na 100 sacharidových dimerů (v případě, že polysacharidovým řetězcem je kyselina hyaluronová), tj. představuje počet dimerů, které byly chemicky modifikovány.

Síťovaný materiál, jak je zde uváděn, je trojrozměrná polymerní síť vyrobená chemickým síťováním jednoho nebo více hydrofilních polymerů. Tento derivát je schopen bobtnat, ale nerozpouští se při styku s vodou.

Mikrovlákno nebo vlákno, jak je zde uváděno, je složka, která má zjevnou podélnou osu nebo axiální geometrii a dále má alespoň jeden prostorový rozměr, který je menší než asi 1 000 pm (tj. 1 mm), případně menší než nebo rovný asi 100 pm (tj. 100 000 nm). Výrazem mikrovelikost nebo mikrometrové velikosti, jak je zde uváděn, odborník v oboru obecně rozumí velikost menší než asi 500 pm (tj. 0,5 mm).

Paladnatý aktivní katalyzátor, jak je zde uváděn, je komplex paladnatého iontu a báze nebo komplex paladnatého iontu a 2-amino-4, 6-dihydroxypyrimidinu, a použije se pro katalýzu reakce cross-coupling a umožňuje skladování roztoku paladia. Reakce může, ale nemusí vyžadovat, aby byla provedena v inertní atmosféře.

Báze, které lze použít pro reakci cross-coupling, zahrnují organické nebo anorganické báze, např. DABCO (l,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan), TEMED nebo TMEDA (Ν,Ν,Ν’,Ν’tetramethylethan-l,2-diamin), TEA (triethylamin), sekundární fosforečnany, např. K2HPO4, uhličitany, např. CsCC>3, atd.

Jak bylo popsáno výše, chemická modifikace kyseliny hyaluronové se provedla oxidační a 10 reduktivní aminací” pro získání derivátů typů I, II nebo III. Dále se chemická modifikace může lišit od 8 do 15%, v závislosti na reakčmch podmínkách. Například Obrázek 1 znázorňuje NMR spektrum chemicky modifikované HA typu Ib charakterizované stupněm substituce DS 6 %. Obrázek 2 znázorňuje NMR spektrum chemicky modifikované HA typu II a DS 12 %. Reaktivní zbytky pro cross-coupling jsou připojeny na polymerní řetězec 15 linkerem, který obsahuje stabilní sekundární aminovou vazbu; sekundární amin, jak je zde uváděn, je představován vzorcem -C-NH-R, kde R znamená jakýkoli uhlíkový řetězec. Gelace se sledovala měřením dynamických visko-elastických údajů, které se sbíraly v průběhu síťovací reakce. Vývoj systému do viskoelastické pevné látky byl jasně vidět, jak je to znázorněno na Obrázku 4 A u síťování při 25 °C, respektive 4 B při 60 °C. Polymerní 20 složky s nejprve smíchaly ve viále. K polymemímu roztoku se přidal paladnatý katalyzátor a báze a vortexovaly se. Roztok se rychle přenesl do reometru a stanovila se gelace in šitu. Reometrická měření se prováděla za účelem testování reakční kinetiky (doba nezbytná pro síťování / gelaci) a prokázání, že k síťování / gelaci dochází. Během síťovací reakce se aplikovalo oscilační zatěžování při frekvenci 5 Hz. Typické výsledky pro tento experiment 25 jsou znázorněny na obrázcích 4A a B. Cílem reometrických měření bylo charakterizovat průběh síťovacího procesu gelů na bázi HA, katalyzovaného paladiem pokud jde o ”body gelu”, tj. doby, kdy G*=G**, přičemž G* je definován jako paměťový modul nebo elastický modul a G** je definován jako ztrátový modul. Když se křivky G* a G** jako funkce času protnou (tj. G*=G**), znamená to, že materiál podstupuje gelovatění. Výsledky udávají, že 30 pro ty dva gely je síťovací proces charakterizován poměrně krátkou dobou 660 s, je-li gelace prováděna při 60 °C (Obrázek 4B), která se prodlouží na 4000 s, kdy se gelace prováděla při 25 °C (Obrázek 4A).

Obrázky 3, 5 a 6 znázorňují mikr o strukturu zesíťo váného materiálu (usušený skafold). Pro Sonogashirovu reakci byl shledán účinným ligandem DABCO, identifikovaný chemicky jako

1,4-diazabicyklo [2,2,2] oktan. l,4-diazabicyklo[2,2,2]oktan (Obrázek 6) tak vytvořil jednotnou poréznost a menší velikost pórů ve srovnání s tetramethylethylendiaminem (TMEDA nebo TEMED) (Obrázek 3). Struktura zesíťovaných vzorků za použití K2HPO4 jakožto báze se také zkoumala (Obrázek 5), přičemž použití K2HPO4 je výhodné díky netoxičnosti báze. Podle SEM mikrografu je zjevné, že báze hraje zásadní roli během síťování HA. Reakční podmínky mají silný účinek na mikrostrukturu hydrogelu. Poréznost skafoldů byla stanovena jako 300 až 900pm.

Síťovací reakce, jak je popsána v kroku iii), může být aplikována i na tvorbu mikrovláken, která jsou nerozpustná ve vodě. Mikrovlákna složená z derivátů (I) a (III) nebo (II) se vyznačují průměrem 100-250 μΜ a kruhovým průřezem a byla vyrobena mokrým zvlákňováním; poté se tato mikrovlákna podrobila síťování katalyzovanému octanem paladnatým nebo paladnatým aktivním katalyzátorem. Postup přípravy mikrovláken a síťování zahrnuje následující kroky: a) Derivát typu (II) nebo (III) se smíchá s derivátem typu (I), rozpuštěným ve vodě nebo ve fosfátovém pufru, za tvorby pouze fyzikální směsi. Polymerní roztoky sestávající ze složek (I+III) nebo (II + III) se připravily z 1 až 15%hmotn. pevné modifikované HA, v závislosti na konečném použití reakce, přičemž pro hydrogely jsou výhodné 1 až 5% kompozice (Příklady 7 až 15) a pro mikrovlákna jsou výhodné 12-15% kompozice (Příklady 16-18). Konkrétní koncentrace složek použitých, jak je to zde popsáno, pro síťování mikrovláken, vedly k vláknům o vyšší pevnosti v tahu, b) Fyzikální směsi derivátů v koncentracích, jak jsou popsány v příkladech 16-18, za účelem získání síťovaných mikrovláken, se připravily alespoň 24 hodin před zvlákňováním. c) Vlákna se připravila procesem mokrého zvlákňování; d) poté se vlákno usušilo a e) přeneslo do druhé lázně (síťovací lázeň), kde se vlákno síťovalo reakcí cross-coupling po dobu 2 hodin, za použití vysoké teploty v rozmezí 40-80 °C, s výhodou 60 °C. f) Z vláken se vymyly složky, za použití směsí isopropanolu a vody, a vlákna se opět sušila po dobu 24 hodin. Obrázky 7, 8 a 9 znázorňují mikrografy získané skenovací elektronovou mikroskopií (SEM) mikrovláken o různém složení. Části A a B obrázků 7, 8 a 9 (horní část) vždy znázorňují část získaného vlákna, aby se ilustrovala homogenita získaná po zvlákňovacím procesu; např. Obrázek 7(A) znázorňuje průřez vláknem (část) před síťováním, (B) po zesíťování. Dole je znázorněn podélný pohled na strukturu vlákna před (C) a po zesítění (D). Mikrovlákna se připravila za použití kompozice přibližně 12, 14 a 15 %hmotn. Průměrný průměr vláken se stanovil pro každou zvlákňovací rychlost skenovacím elektronovým mikroskopem z alespoň čtyř měření provedených v různých místech po celé délce téhož vlákna. Bylo zjištěno, že složení mělo vliv na průměr vláken. Obrázek 7(C) znázorňuje průměr mikrovlákna získaného z 12%hmotn.

• · · » kompozice vykazovalo průměrný průměr 147,3 pm před síťováním a 128 pm po síťování (D). Obrázek 8(C) ukázal, že vlákno získané ze 14%hmotn. kompozice vykazovalo průměr 223,4 pm před síťováním a po síťování se průměr opět snížil na 151,6 pm (Obrázek 8(D). Obrázek 9(C) ukazuje, že průměr mikrovlákna získaného použitím 15%hmotn. se snížil 5 z 217,1 na 153,2 pm. Tato kompozice však vykazuje konstantní bobtnací poměr po 300 s (Obrázek 10). Vlákna jsou schopna bobtnat ve styku s vodou a fyziologickým prostředím, aniž by se rozpustila. Pro stanovení nárůstu průměru materiálu po styku s PBS se použila optická mikroskopie. Obrázek 10 znázorňuje stupeň bobtnání vláken připravených v Příkladech 16-18. Navíc se zjišťovala biokompatibilita mikrovláken před a po zesítění.

Mikrovlákna se sterilizovala a umístila do 12-jamkové destičky v koncentraci 1,8 a 3,6p/ml, aby se testovala kompatibilita přímým stykem buněk s vlákny. Test se provedl třikrát před a po síťovací reakci. Obrázek 11 ukazuje, že mikrovlákna jsou cytokompatibilní po testování NIH-3T3 fibroblasty. Navíc mikrovlákna po promytí neobsahují paladium, což je činí vhodnými pro použití in vivo. Obrázek 12 ukazuje pevnost v tahu kompozice, která udávala nejvyšší pevnost tahu (15%hmotn.). Tah se stanovil v univerzálním stroji pro měření pevnosti v tahu (Instron). Pevnost v tahu se získala před a po síťování. Jinými slovy, pevnost v tahu je měřítkem napětí, které je nezbytné pro natažení vlákna, až praskne. Nejprve se vlákno natahuje použitím síly (zátěže) 0,05 N za použití počáteční rychlosti 1 mm/ min, a pak je podrobeno napětí v tahu při rychlosti 10 mm/min, dokud nepraskne. Pro každý typ vzorku 20 se provedly minimálně čtyři testy a údaje byly statisticky analyzovány. Z experimentálních údajů bylo zjištěno, že nejlepší složení se získalo fyzikální směsí složek v koncentraci 15%hmotn. Stanovila se hodnota napětí v tahu těchto vláken a je uvedena v Tabulkách 1 a 2. Měření se provedlo před síťováním a po síťování. Jak je znázorněno v Tabulce 1, vlákno vykazovalo hodnotu pevnost v tahu 51,05 ± 3,.5 MPa, zatímco tatáž kompozice po zesíťování 25 vykazovala dvakrát tak velkou pevnost v tahu, v tomto případě 114,63 ± 4,23 MPa (Tabulka 2).

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Tyto příklady jsou pouze pro ilustrativní účely a nemají omezovat rozsah nároků. Všechny díly, procenta, poměry atd. v příkladech jsou hmotnostní, není-li uvedeno jinak.

Příklad 1. Příprava složky obsahující jód jakožto koncovou skupinu (Ia) g hyaluronanu s průměrnou molekulovou hmotností 498 kDa, což odpovídá 0,025 mmol monomemí jednotky HA, se rozpustilo v 1000 ml destilované vody při laboratorní teplotě. Ke směsi se přidalo 2,57 g NaBr a 38,84 g Na2HPO4.12 H2O. pH reakce se upravilo

Jf> · · · · · . · * * • »· _ř · » * « · · « - * - · * • »·« — *· * ·” ··· .....

na 9,0 přidáním NaOH O,1M. Reakce se ochladila na 5 °C a evakuovala a znovu naplnila dusíkem. Přidalo se 53,3 mg 4-acetamido-TEMPO, následně se přidaly 3 ml chlornanu sodného. Oxidační reakce se prováděla 15 minut. pH reakční směsi se upravilo na 7,0 přidáním kyseliny octové. Pak se ke směsi přidalo 1,159 g j>-jódanilinu, Reakce se ponechala po dobu 5 hodin při laboratorní teplotě. Nakonec se k reakci přidalo 0,566 g pikolinboranu a reakce se míchala přes noc. Roztok se naředil 1000 ml vody a ultrafiltroval se za použití kazety Centramate (Paal Co) s diferenciací molekulových hmotností (”molecular weight cutoff’) 10 kDa. Produkt se vysrážel pomocí IP A a promyl třikrát směsí IPAivody (100:0, 80:20 a 60:40) a usušil v sušárně při 60 °C. Reakční produkt se zcela charakterizoval analytickými metodami. Výtěžek reakce: 90 %. Molekulová hmotnost měřená pomocí SEC-MALLS udává hodnotu 556 kDa a polydispersita je 1,59. Stupeň substituce (DS) = 6 % NMR ²H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,02 (s, 3H,-NH-CO-CH₃), 3,35-3,84 (m, 14H), 4,46 (d, 2H), 6,68 (d, 2H, J=8,35), 7,56 (d, 2H, J=8,35).

DS- (n+m) -100%; n-4-8%

Příklad 2. Příprava složky obsahující brom jakožto koncovou skupinu (Ib) g hyaluronanu s průměrnou molekulovou hmotností 498 kDa (0,025 mmol) se rozpustilo v 1000 ml destilované vody při laboratorní teplotě. Ke směsi se přidalo 2,57 g NaBr a 38,84 g Na2HPO4.12 H2O. pH reakce se nastavilo na 9,0 přidáním 0,lM NaOH. Reakce se ochladila na 5 °C a evakuovala a znovu naplnila dusíkem. Přidalo se 53,3 mg 4-acetamidoTEMPO, následně se přidaly 3 ml chlornanu sodného. Oxidační reakce se prováděla 15 minut. pH reakční směsi se upravilo na 7,0 přidáním kyseliny octové. Poté se k reakci přidalo 0,910 g /2-bromanilinu (0,2 ekvivalenty). Reakce se prováděla 5 hodin při laboratorní teplotě. Nakonec se ke směsi přidalo 0,566 g pikolinboranu (0,2 ekvivalenty). Reakce se míchala přes noc při laboratorní teplotě. Pak se roztok naředil 1000 ml vody a ultrafiltroval za použití kazety Centramate s diferenciací molekulových hmotností lOkDa. Produkt se vysrážel pomocí IPA a promyl třikrát směsí IPA:voda (100:0, 80:20, 60:40). Sraženina se usušila v sušárně při 60 °C. Pak se produkt reakce charakterizoval analytickými metodami. Výtěžek • · ·> * reakce 10,5 g. Molekulová hmotnost měřená pomocí SEC-MALLS má průměrnou hodnotu 853 kDa apolydispersitaje 2,01. Stupeň substituce (DS) = 6 %.

NMR (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,02 (s, 3H,-NH-CO-CH₃), 3,35-3,84 (m, 14H), 4,46 (d, 2H), 6,80 (d, 2H, J=8,35), 7,39 (d, 2H, >8,35).

Příklad 3. Příprava složky obsahující boritan jakožto koncovou skupinu (lc)

1,0 g oxidovaného hyaluronanu o průměrné molekulové hmotnosti 251,2 kDa se rozpustilo ve 100 ml fosfátového pufru o pH 8. K tomuto roztoku se přidalo 0,086 g hydrochloridu kyseliny aminofenylborité. Reakce se míchala při laboratorní teplotě po dobu 5 hodin. Přidalo se 0,084 g pikolinboranu (0,03 ekvivalenty vzhledem k HA-dimeru). Reakce se míchala přes noc. Reakční produkt se vyčistil extenzivní dialýzou proti roztoku 0,5%(hmotn./obj.) NaHCO₃/NaCl a poté extenzivně proti vodě. Výtěžek reakce byl 1,04 g. Molekulová hmotnost produktu byla 121,8 kDa a polydispersita 1,46. Stupeň substituce stanovený NMR je 8 %. NMR ^!Η (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H), 7,34 (m, 5H)

Příklad 4. Příprava složky obsahující trojnou vazbu (propargyl) Ila

10,0 g zoxidováného hyaluronanu o průměrné molekulové hmotnosti 798 kDa se rozpustilo v 960 ml vody. K reakční směsi se přidal hydrochlorid ípropargylaminu. (0,3 ekvivalenty vzhledem k dimeru HA). pH reakce se upravilo přidáním 1 ml kyseliny octové, dokud pH směsi nedosáhne 5,5. Po 5 hodinách míchání při laboratorní teplotě se přidalo 0,424 g pikolinboranu (odpovídající 0,3 ekvivalentům opakujících se dimerů kyseliny hyaluronové). Reakce probíhala přes noc. Produkt se vyčistil ultrafiltrací. Produkt propargylem modifikované HA se zcela charakterizoval běžnými analytickými metodami. Signály použité pro kvantitativní vyhodnocení propargylaminových zbytků navázaných na HA jsou methyly patřící HA ve srovnám s methyleny patřící modifikovanému polysacharidu. Molekulová hmotnost naměřená SEC-MALLS má průměrnou hodnotu 604,4 kDa a polydisperzita je 2,15. Stupeň substituce (DS) = 12 % FT-IR (KBr, cm'¹): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ, C=C), 1614,1407,1078, 613. NMR ^!H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).

DS = n = 8-15%

Příklad 5. Příprava složky obsahující trojnou vazbu (butinyl) lib

Obecně se rozpustí 10,0 g hyaluronátu sodného o průměrné molekulové hmotnosti 130 kDa v 960 ml vody. K tomuto roztoku se přidalo 2,57 g bromidu sodného (2,5 mmol). K reakční směsi se přidalo 38,8 g fosforečnanu sodného, aby se dosáhlo pH = 9,0. Postupně se přidávaly následující reaktanty: 53,3 mg of 4-acetamido-TEMPO, předem rozpuštěného ve vodě (1 ml), a následně 3,0 ml chlornanu sodného. Směs se nechala za stálého míchání po dobu 5 hodin. Reakce se nechala dosáhnout laboratorní teploty. V tuto chvíli se potenciometricky upravilo pH přidáním kyseliny octové, aby se dosáhlo pH = 5,5. Ktéto směsi se přidal n-butinylamin (0,3 mmol). Reduktivní aminace se prováděla 5 hodin. Poté se přidalo 0,424 g pikolinboranu (odpovídající 0,3 ekvivalentům opakujících se dimerů kyseliny hyaluronové). Reakce se nechala probíhat při laboratorní teplotě přes noc. Produkt se přečistil ultrafiltrací. Produkt HA modifikované propargylem se zcela charakterizoval běžnými analytickými postupy. Signály použité pro kvantitativní vyhodnocení propargylaminových zbytků navázaných na HA jsou methyly patřící HA ve srovnání s methyleny patřící modifikovanému polysacharidů. Molekulová hmotnost naměřená SEC-MALLS má průměrnou hodnotu 440,1 kDa apolydisperzitaje 1,57. Stupeň substituce (DS) = 12 % NMR 4-1 (500 MHz, δ ppm): 2.03 (3H, -N-CO-C7Ú), 2,64 (2H, t J=6,6, -NH-CH?-CffA 2,70 (1H, t; J=6,6), 3,18 (2H t; J=6,5, -NH-CflyCH?-). 3,30-3,90(10H, skeletální), 4,46 (2H, la,lb). FT-IR (KBr, cm'¹): 3379 (υ , -O-H), 2894, 2131 (υ ,C=C), 1614,1407,1078, 613.

Příklad 6. Příprava složky obsahující dvojnou vazbu (allyl) III

Obecně se ve 100 ml vody rozpustí 1,0 g zoxidovaného hyaluronátu sodného o průměrné molekulové hmotnosti 130 kDa a polydisperzitě 1,9 (2,5 mmol). Kpředchozímu roztoku se přidal allylamin (0,285 g, 0,5 mmol). Reakce se míchala po dobu 5 hodin při laboratorní teplotě. Pak se přidalo 0,0535 g pikolinboranu (0,5 mmol). Reakce probíhala při laboratorní teplotě přes noc. Reakce se pročistila dialýzou za použití zkumavky s lOkDa diferenciací molekulových hmotností. Výtěžek reakce byl 0,6932 g. Údaje SEC MALLS • · ukázaly molekulovou hmotnost 203,05 kDa a polydisperzitu 1,574. Integrace acetamidových zbytků ukazuje stupeň substituce - stanovený porovnáním se signálem alkenylu - 8 %.

Příklad 7. Síťovací reakce prováděná pomocí TEMED a paladnatého aktivního katalyzátoru při 25 °C

Příprava Pd-pyrimidinového ”aktivního katalyzátoru” je popsána zde: Do lOml odměmé baňky se přidal 2-amino-4, 6-dihydroxypyrimidin (13 mg, 0,10 mmol) a 2 ml zásobního roztoku 0,10M NaOH. Pyrimidinový ligand se úplně rozpustil mícháním po dobu 2 minut ve vodní lázni předehřáté na 65 °C. K výslednému roztoku se přidal Pd(OAc)2 (22,4 mg, 0,1 mmol). Směs se intenzivně promíchávala při 65 °C po dobu 30 minut (na vzduchu), aby vznikl homogenní žlutooranžový roztok. Po ochlazení na laboratorní teplotu se odstranila míchací tyčinka a roztok se naředil na 5,00 ml destilovanou vodou za účelem získání roztoku katalyzátoru 0,01 M v Pd (II). Obecný postup síťovací reakce je popsán zde: 10 mg složky la (0,025 mmol) a 10 mg složky Ha (0,025 mmol) se rozpustily ve 2 ml destilované vody. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 μΐ (0,0006 mmol) TEMED (tetramethylethylendiamid (TMEDA nebo TEMED)) a 10 μΐ roztoku paladnatého aktivního katalyzátoru. Po přidání katalyzátoru se použilo vortexování, aby se zajistila dobrá homogenizace. Reakce se naplnila dusíkem a prováděla se po dobu 6 hodin při 25 °C. Připravený hydrogel se důkladně promyl PBS (3 x 100 ml) a destilovanou vodou (3 x 100 ml), aby se odstranil katalyzátor. Zbývající paladium se kvantifikovalo jako 215 ±25 ng/g sušiny.

Příklad 8. Síťování za použití TEMED a octanu paladnatého při 25 a 60 °C mg složky la (0,5 mmol) a 20 mg složky Ila (0,5 mmol) se rozpustilo v 1 ml destilované vody. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 μΐ (0,0006 mmol) TEMED (tetramethylethylendiamin) a 3 mg octanu paladnatého (0,013 mmol). Po přidání katalyzátoru se použilo vortexování, aby se zajistila dobrá homogenizace. Reakce se naplnila dusíkem a zahřívala po dobu 6 hodin na 60 °C. Hydrogel se důkladně promyl PBS (3 x 100 ml) a destilovanou vodou (3 x 100 ml), aby se odstranil katalyzátor. Po usušení se studovala pomocí SEM struktura usušeného materiálu (Obrázek 3). Průběh síťovací reakce se sledoval pomocí reologie. Reologická měření se provedla na TA reometru s kuželovou a rovinnou geometrií při laboratorní teplotě. Parametry měření byly τ = 10000 Pa a f = 1 s^_1. Roztoky složek la a Ila se připravily v koncentracích 2 % (hmotn./obj.). Do polymerní směsi se pak začlenily 2 mg octanu paladnatého vortexovámm a následně 10 μΐ TEMED. Po dobré homogenizaci směsi se • · ♦ · připravený roztok (500 μΐ) přenesl do válcové komory reometru udržované na konstantní teplotě 25, respektive 60 °C (Obrázky 4A a 4B).

Příklad 9. Síťování pomocí CsCO3 a paladnatého aktivního katalyzátoru při 60 °C mg složky la (0,5 mmol) a 20 mg složky Ila (0,5 mmol) se rozpustilo v 1 ml destilované vody. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 mg (0,028 mmol) uhličitanu česného a 10 μΐ roztoku (0,01M) paladnatého aktivního katalyzátoru, připraveného tak, jak je uvedeno v příkladu 6. Pro zajištění dobré homogenizace se použilo vortexování. Reakce se naplnila dusíkem a míchala se po dobu 24 hodin při 60 °C. Hydrogel se důkladně promyl PBS a destilovanou vodou, aby se odstranil katalyzátor.

Příklad 10. Síťování pomocí octanu paladnatého a DABCO při 37 °C mg složky la (0,5 mmol) a 20 mg složky Ila (0,5 mmol) se rozpustilo v 1 ml destilované vody. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 mg (0,09 mmol) DABCO (neboli l,4-diazabicyklo[2,2,2]oktanu) a 1 mg (0,004 mmol) octanu paladnatého předem rozpuštěného ve vodě. Po přidám katalyzátoru se použilo vortexování, aby se zajistila dobrá homogenizace. Reakce se naplnila dusíkem míchala po dobu 24 hodin při 37 °C. Připravený hydrogel se důkladně promyl PBS a destilovanou vodou, aby se odstranil katalyzátor. Struktura hydro gelu je znázorněna na Obrázku 6.

Příklad 11. Síťování pomocí octanu paladnatého a TEA při 37 °C mg složky la (0,5 mmol) a 20 mg složky Ila (0,5 mmol) se rozpustilo v 1 ml destilované vody. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 μΐ (0,010 mmol) TEA a 10 μΐ roztoku octanu paladnatiho (3%hmotn./obj.) ve vodp. Po přidání každé složky se použilo vortexování, aby se zajistila dobrá homogenizace. Reakce se naplnila dusíkem a míchala se po dobu 24 hodin při 37 °C. Připravený hydrogel se důkladně promyl PBS a destilovanou vodou, aby se odstranil katalyzátor.

Příklad 12. Síťování pomocí octanu paladnatého a K2HPO4 při 60 °C mg složky Ib (0,5 mmol) a 20 mg složky lib (0,5 mmol) se rozpustilo v 1 ml destilované vody. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 mg (0,057 mmol) K2HPO4 a 10 μΐ roztoku octanu paladnatiho (3%hmotn./obj.) ve vodp. Po přidání katalyzátoru se použilo vortexování, aby se zajistila dobrá homogenizace. Reakce se naplnila dusíkem a míchala se po dobu 24 hodin při 60 °C. Připravený hydrogel se důkladně promyl PBS a destilovanou vodou, aby se odstranil katalyzátor. Strukturní charakterizace pomocí SEM mikrografu je znázorněna na Obrázku 5.

Příklad 13. Síťování pomocí paladnatého aktivního katalyzátoru a K2HPO4 při 60 °C mg složky Ib (0,5 mmol) a 20 mg složky líc (0,5 mmol) se rozpustilo v 1 ml destilované vody. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 mg (0,057 mmol) K2HPO4 a 10 μΐ roztoku paladnatiho aktivního katalyzátoru (0,01M) připraveného podle příkladu 6. Aby se zajistila dobrá homogenizace, použilo se po přidání každé složky vortexování. Reakce se prováděla po dobu 5 hodin při 60 °C.

Příklad 14. Síťování pomocí octanu paladnatého ve fosfátovém pufru (pH 6,0) mg složky la (0,5 mmol) a 20 mg složky Ila (0,5 mmol) se rozpustilo ve 2 ml fosfátového pufru, pH 6,0. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 mg (0,028 mmol) TEMED a 10 mg (0,04 mmol) octanu paladnatého. Aby se zajistila dobrá homogenizace, použilo se po přidání katalyzátoru a báze vortexování. Reakce se naplnila dusíkem a míchala se po dobu 24 hodin při 60 °C. Připravený hydrogel se důkladně promyl PBS a destilovanou vodou, aby se odstranil katalyzátor.

Příklad 15. Síťování pomocí octanu paladnatého ve fosfátovém pufru (pH 6,0) mg složky Ib (0,5 mmol) a 20 mg složky Ila (0,5 mmol) se rozpustilo ve 2 ml fosfátového pufru, pH 8,0. K tomuto roztoku se postupně přidalo 10 mg (0,028 mmol) TEMED a 10 mg (0,04 mmol) octanu paladnatého. Pro zajištění dobré homogenizace se po přidání katalyzátoru a báze použilo vortexování. Reakce se naplnila dusíkem a míchala se po dobu 24 hodin při 60 °C. Připravený hydrogel se důkladně promyl PBS a destilovanou vodou, aby se odstranil katalyzátor.

Příklad 16. Síťování mikrovláken za použití 12% (hmotn./obj.) koncentrace derivátů a paladnatého aktivního katalyzátoru při 60 °C

Tvorba mikrovláken: Fyzikální směs derivátů označených jako Ib a Ila se rozpustila ve vodě za tvorby vodného roztoku o koncentraci 12%hmotn. Směs se před procesem zvlákňování intenzivně míchala v důsledku vysoké viskozity suspenze (minimálně po dobu 24 h), aby se dosáhlo dokonalé homogenity. Směs se přenesla do injekční stříkačky, která se ponechala otevřená, aby z ní unikl zachycený vzduch. Základní experimentální podmínky použité pro tvorbu vláken zahrnují injekční stříkačku obsahující polymerní roztok, která je uchycena • · ♦ *

..........

pomocí držáku. Injekční stříkačka se umístila do lineárního stříkačkového čerpadla (Nexus 5000, Chemyx). Injekční stříkačka se připevnila ke vstřikovacím trubičkám, přičemž polymerní směs se přímo vstřikovala do koagulační lázně, takže se získala mikrovlákna pomocí procesu mokrého zvlákňování. Experimenty se prováděly při laboratorní teplotě s průměrnou rychlostí extruze 260 μΙ/min. Koagulační lázeň může sestávat například z alkoholu, např. metanolu nebo ethanolu, a organické kyseliny, např. kyseliny mravenčí nebo octové, ve vodě. Složení koagulační lázně však není míněno jako omezující rozsah vynálezu, jelikož předmětem vynálezu je síťování vytvořených vláken. Existují samozřejmě také další způsoby použitelné pro výrobu hyaluronanových vláken, jak bylo již dříve popsáno v oboru. Výsledné vlákno je odebráno a dlouženo by válcováním mezi dvěma kotouči. Výsledné vlákno se pak dehydratuje při laboratorní teplotě. Proces sušení umožňuje postupné odpařování těkavých složek, které se použily pro srážení mikrovlákna.

Nastavení reakčních podmínek pro síťování mikrovláken: Mikrovlákno se přeneslo do lázně, zde dále nazývané síťovací lázeň, obsahující směs isopropanolu a kyseliny mléčné v poměru (8:2). Složení síťovací lázně se však může lišit a může zahrnovat jiné alkoholy a organické kyseliny, aniž by se ovlivnila síťovací reakce. Mikrovlákna se nechala reagovat v síťovací lázni při různých množstvích roztoku ”paladnatého aktivního katalyzátoru” od 50 do 100 μΐ, připraveného jak bylo popsáno dříve v příkladu 7. Konečná koncentrace paladnatého aktivního katalyzátoru použitá v síťovací lázni se může lišit např. od 5x10'⁵ do lxlO’⁴ M. Síťovací reakce se zkusila při třech různých teplotách: při laboratorní teplotě, 37 °C a 60 °C. Experimentálně bylo pozorováno, že vlákno prošlo síťováním při teplotě 60 °C. Pro sledování doby síťování se kousek. vlákna vyňal z reakční směsi a testovala se jeho rozpustnost ve vodě. Reakce se nechala probíhat po dobu 2 hodin, což se ukázalo jako nejlepší doba. Poté se mikrovlákno důkladně promylo směsí isopropanokvoda a opět usušilo. Charakterizace mikrovlákna se provedla skenovací elektronovou mikroskopií (SEM): Mikrovlákenné skafoldy se zvlákňují na hliníkovém substrátu, s naneseným popraškem zlata, a jejich povrchová morfologie se zkoumá skenovacím elektronovým mikroskopem. Morfologické a strukturní charakterizace mikrovláken před a po síťování se získaly pomocí SEM a jsou znázorněny na Obrázku 7. Testy pevnosti v tahu se naměřily na přístroji pro testování pevnosti v tahu Instron 3343 a analyzovaly pomocí softwaru Bluehill 2.

Příklad 17. Síťování mikrovláken za použití 14% (hmotn./obj.) koncentrace derivátů a paladnatého aktivního katalyzátoru při 60 °C • · e «

Vlákna se připravila za použití podobného postupu jako bylo popsáno v příkladu 16, pouze se zvýšením koncentrace složek na 14%hmotn. Vlákna se získala procesem mokrého zvlákňování za použití rychlosti extruze 280 μΐ/min.

Příklad 18. Síťování mikrovláken za použití 15% (hmotn./obj.) koncentrace derivátů a paladnatého aktivního katalyzátoru při 60 °C

Vlákna se připravila podobným postupem, jako je popsáno v přikladu 16, pouze se zvýšením koncentrace složek na 15%hmotn. Vlákna se získala procesem mokrého zvlákňování za použití rychlosti extruze 300 μΐ/min.

Tabulka 1 mze představuje mechanické vlastnosti mikrovláken, jak je popsáno v Příkladu 18 (před síťováním). Tabulka 2 představuje mechanické vlastnosti mikrovláken popsaných v Příklad 18 (po síťování).

Tabulka 1.

Označení vzorku	Zátěž při přetrhu (kurzor)	Tahová deformace při přetrhu (kurzor)	Houževnatost při přetrhu (kurzor)	Modul (Tangent 0,5 %)	Napětí v tahu při přetrhu (kurzor)
	(N)	(mm/mm)	(cN/tex)	(MPa)	(MPa)
1	2,70	0,19	2,70383	> 1334,425	55,08204
2	2,36	0,15	2,36366	> 1462,406	48,15201
3	2,58	0,17	2,58496	> 1538,254	52,66032
4	2,59	0,17	2,58656	> 1429,957	52,69302
5	2,29	0,14	2,29136	> 1480,453	46,67916
Průměr	2,51	0,17	2,50607	1449,099	51,05331
Standardní odchylka	0,17190	0,01776	0,17190	75,209	3,50188
Medián	2,58	0,17	2,58496	1462,406	52,66032
Koeficient variace	6,85926	10,74236	6,85926	5,190	6,85925

Tabulka 2.

Označení vzorku	Zátěž při přetrhu (kurzor)	Tahová deformace při přetrhu (kurzor)	Houževnatost při přetrhu (kurzor)	Modul (Tangent 0,5 %)	Napětí v tahu při přetrhu (kurzor)
	(N)	(mm/mm)	(cN/tex)	(MPa)	(MPa)
1	2,39	0,10	2,39025	> 4872,143	118,88104
2	2,33	0,11	2,33154	> 4722,472	115,96108
3	2,19	0,09	2,18782	> 4720,472	108,81340
4	2,31	0,09	2,30931	> 4516,462	114,85558
Průměr	2,30	0,10	2,30473	4707,887	114,62778

• ·

Standardní odchylka	0,08509	0,00775	0,08509	146,053	4,23190
Medián	2,32	0,10	2,32042	4721,472	115,40833
Koeficient variace	3,69186	7,81418	3,69186	3,102	3,69186

Příklad 19. Měření viability buněk před a po síťovací reakci

Vlákna připravená jako v příkladu 16 se sterilizovala v autoklávu (120°C/20 minut) a následně se přenesla do kultivačního média sestávajícího z Dulbeccova modifikovaného Eagle média s 10% fetálním bovinním sérem, 5 g/l D-glukózou, 20uM L-glutaminem, lOOU/ml penicilinem a 100pg/ml streptomycinem. Roztok vláken se připravil v koncentraci 3,6 mg vzorku na ml kultivačního média. Vlákna se suspendovala přes noc. Tato suspenze se testovala za použití dvou různých koncentrací: 1,8 a 3,6 mg/ml. Buněčné linie a viabilita se testovaly u buněčné linie NIH-3T3. Buňky se osely do 12-jamkové kultivační destičky a kultivovaly se po dobu 24 hodin, než se použila hustota 3000 buněk na jamku. Po předchozí inkubaci se buňky přenesly do kultivačního média, aby měly přímý kontakt s vláknem a rozpuštěnými produkty. Inkubace se uskutečnila po dobu 24, 48, resp. 72 hodin. Po každé inkubační době se použil test MTT (za použití 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu), za účelem prozkoumání buněčné viability. Test se připravil, jak je uvedeno: MTT se rozpustil v koncentraci 5mg/ml v kultivačním médiu. 20 μΐ roztoku MTT se přeneslo do jamky a inkubovalo se po dobu 2,5 hodin. Měření absorbance mikrodestičky se přečetlo pomocí VersaMax na dvou hodnotách absorbance, v tomto případě 570 a 690 nm. Grafický důkaz biokompatibility je znázorněn na obrázku 11.

Odkazy

Collins, Μ. N., & Birkinshaw, C. (2007). Comparison of the effectiveness of four different crosslinking agents with hyaluronic acid hydrogel films for tissue-culture applications.

Journal of AppliedPolymer Science, 104(5), 3183-3191.

Matarasso, S. L., & Herwick, R. (2006). Hypersensitivity reactionto nonanimal stabilized hyaluronic acid. Journal of the Američan Academy of Dermatology, 55(1), 128-131.

Murty, K. V. S. N., & Vasella, A. (2001). Oligosaccharide Analogues of Polysaccharides, Part 21, Towards New Cellulose I Mimics: Synthesis of Dialkynyl C-glucosides of periSubstituted Anthraquinone. Helvetica ChimicaActa, 84(4), 939-963.

Roy, R., Das, S. K., Santoyo-González, F., Hemández-Mateo, F., Dam, Τ. K., & Brewer, C.

F. (2000). Synthesis of ”Sugar-Rods” with Phytohemagglutinin Cross-Linking Properties by Using the Palladium-Catalyzed Sonogashira Reaction. Chemistry-A European Journal, 6(10), 1757-1762.

..........

Schanté, C. E.. Zuber, G., Herlin, C., & Vandamme, T. F. Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical applications. Carbohydrate Polymers, 85(3), 469-489.

Yeom, J., Bhang, S. H., Kim, B.-S., Seo, M. S., Hwang, E. J., Cho, I. H., Park, J. K., & Hahn, 5 S. K. Effect of Cross-Linking Reagents for Hyaluronic Acid Hydrogel Dermal Fillers on

Tissue Augmentation and Regeneration. Bioconjugate Chemistry, 21(2), 240-247.

Claims

1. Způsob přípravy síťovaného derivátu hyaluronanu, vyznačující se tím, že se provede C-C vazebnou reakcí ve vodě, fosfátovém pufru nebo směsi organické kyseliny a alkoholu, a v přítomnosti paladnatého aktivního katalyzátoru, kde C-C vazebná reakce se uskuteční mezi derivátem hyaluronanu nesoucím koncovou aryl-halogenidovou a/nebo arylboritanovou skupinu, a derivátem hyaluronanu nesoucím alkenvlovou nebo alkinylovou skupinu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nejprve připraví derivát hyaluronanu sekundární amin, nesoucí koncový arylovy substituent, podle vzorce (I):

(I) kde X= halogen nebo boritanová funkční skupina, pak se připraví derivát hyaluronanu sekundární amin, nesoucí nenasycenou sloučeninu, která obsahuje trojnou nebo dvojnou vazbu, podle vzorce (II) nebo (ΠΙ):

kde Ri je alifatická Cj-is skupina, a pak se derivát podle vzorce (I) smíchá s derivátem podle vzorce (Π) nebo (ΠΓ), pak se přidá paladnatý aktivní katalyzátor stabilní ve vodě, aby se získal síťovaný derivát hyaluronanu.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že X je I, Br nebo B-(OH)3, a Ri je methylen nebo ethylen.

4. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že paladnatý aktivní katalyzátor se vybere ze skupiny obsahující komplex octanu paladnatého a anorganické nebo organické báze, a komplex Pd(II) a 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu, přičemž koncentrace paladnatého aktivního katalyzátoru v reakční směsi je v rozmezí od lxlO'⁵ do lxl O’³ M.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že paladnatým aktivním katalyzátorem je komplex octanu paladnatého a anorganické nebo organické báze, koncentrace paladnatého aktivního katalyzátoru v reakční směsi je v rozmezí od lxlO’⁴ do lxlO'³M, s výhodou 5x10‘⁴, přičemž výsledný zesíťovaný derivát hyaluronanu je ve formě hydrogelu.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že báze je vybrána ze skupiny obsahující DABCO, TEMED, TEA, sekundám fosforečnany, například K2HPO4, uhličitany, například CsCCh.

7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že bází je TEMED nebo DABCO.

8. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že derivát podle vzorce (I) se smíchá s derivátem podle vzorce (II) nebo (III) a směs se vytlačuje do koagulační lázně, aby se získala mikrovlákna na bázi derivátu hyaluronanu, a pak se mikrovlákna přenesou do síťovací lázně obsahující paladnatý aktivní katalyzátor, aby se získala zesíťovaná mikrovlákna na bázi derivátu hyaluronanu.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že paladnatým aktivním katalyzátorem je komplex Pd(II) a 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu a koncentrace paladnatého aktivního katalyzátoru v síťovací lázni je v rozmezí od lxlO’⁵ do lxlO'⁴ M, s výhodou 5x10’⁵.

10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že koagulační lázeň sestává ze směsi alkoholu a organické kyseliny a síťovací lázeň sestává ze směsi alkoholu a kyseliny mléčné a paladnatého aktivního katalyzátoru.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že alkohol v síťovací lázni je vybrán z methanolu, ethanolu a isopropanolu.

12. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že síťování se provede při teplotách mezi 25 a 100 ⁰ C, s výhodou 60 °C.

13. Hydro gel podle vzorce A nebo B *S « /

ch₃co (A) (B) kde Ri je alifatický C145 substituent.

14. Hydrogel podle nároku 13, vyznačující se tím, že Ri methylen nebo ethylen.

15. Mikrovlákno na bázi derivátu hyaluronanu podle vzorce A nebo B (A) (B)

10 kde Ri je alifatický C145 substituent.

16. Mikrovlákno podle nároku 15, vyznačující se tím, že má průměr 100 až 300 pm.