KR20150005937A

KR20150005937A - 가교된 히알루로난 유도체, 이의 제조 방법, 하이드로겔 및 이를 기재로 한 미세섬유

Info

Publication number: KR20150005937A
Application number: KR20147030381A
Authority: KR
Inventors: 앤젤레스 글로리아 후에트라; 주자나 유클로바; 에바 프리코포바; 블라디미르 벨레브니
Original assignee: 콘티프로 바이오테크 에스.알.오.
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2015-01-15
Also published as: CZ2012282A3; WO2013159757A1; ES2595653T3; RU2014146888A; JP2015517016A; EP2841462B1; EP2841462A1; EP2841462B8; US20150104643A1

Abstract

본 발명은 하이드로겔 또는 미세섬유 형태의 가교된 히알루로난 유도체, 및 C-C 커플링 반응으로 구성된 이의 제조 방법에 관한 것이다. C-C 커플링 반응은, 팔라듐 활성 촉매의 존재 하에, 물, 포스페이트 완충제, 또는 유기 산과 알코올의 혼합물에서, 말단 아릴-할라이드기 및/또는 아릴-보레이트기를 가진 히알루로난 유도체와, 알케닐기 또는 알키닐기를 가진 히알루로난 유도체의 반응을 통해 수행된다. 팔라듐 활성 촉매는 예를 들어, 팔라듐 (II) 아세테이트와 무기 염기 또는 유기 염기의 복합체, 또는 팔라듐 (II)과 2-아미노-4,6-다이하이드록시피리미딘의 복합체일 수 있다.

Description

가교된 히알루로난 유도체, 이의 제조 방법, 하이드로겔 및 이를 기재로 한 미세섬유{CROSSLINKED HYALURONAN DERIVATIVE, METHOD OF PREPARATION THEREOF, HYDROGEL AND MICROFIBERS BASED THEREON}

본 발명은, 물에 안정한 균질한 팔라듐 촉매와, 선택적으로 염기에 의해 촉매화되는 변형된 히알루론산 (HA)의 가교 방법에 관한 것이다. 본 방법은 탄소-탄소 또는 교차 커플링 반응에 적절한 전구물질로서 사용될 수 있는 유도체의 합성으로 구성된다. 이들 전구물질은 하이드로겔의 합성, 뿐만 아니라 이의 유도체로 제조되는 미세섬유의 가교에 이용될 수 있다.

히알루론산 (HA 또는 히알루로난)은 글리코스아미노글리칸으로 알려진 폴리머의 일종에 속하는 것이다. HA는 장쇄 선형 다당류로서, 통상 (C₁₄H₂₀NNaO₁₁)_n의 분자식을 가지는 나트륨 염으로서 존재하며, 분자량은 소스(source), 분리 과정 및 측정 방법에 따라 다양할 수 있다. 그러나, 14x10⁶이하의 분자량도 보고된 바 있다. 본원에서 언급되는 분자량은 달리 언급되지 않는 한, 중량 평균 분자량이다.

HA는 비-면역원성이며, 따라서 의약에서 큰 잠재성을 가진다. HA의 점탄성 특성 때문에, (1,000,000이 넘는) 고분자량의 HA는 상처 치료, 안과적 수술(ophthalmic surgery) 및 정형외과적 수술(orthopaedic surgery)을 비롯한 다양한 임상 분야에서 특히 유용한 것으로 확인되었다. HA는 또한, 미용학적 적용과 같이 다양한 비-의료 분야에서도 잠재적으로 유용하다.

그러나, 이들 적용 중 소정의 적용에서 HA의 용도는, 인간에게 투여된 후 HA는 히알루로니다제와 같은 효소 및 유리 라디칼에 의해 쉽게 분해된다는 점에서 제한적이다. 나아가, HA는 실온에서 물에 용해되는데, 이러한 사실로 인해 소정의 적용 시 HA가 부적절할 수 있다. 점도를 높이거나 또는 가교된 유도체를 수득하기 위해, 외부의 제제가 사용되어야 한다.

따라서, 보다 안정한 형태의 HA를, 특히 가교에 의해 제조하기 위한 다양한 시도들이 있어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 4,582,865는 다이비닐설폰을 가교제로 사용함으로써 히알루론산의 가교된 겔을 제조하는 방법을 기술하고 있으나; 이후 미국 특허 7131492에 기술되는 바와 같이 가교된 물질은 잠재적으로 독성이면서 발열성인 유리(free) 다이비닐-설폰을 캡슐화할 수 있다. HA계 하이드로겔의 다른 예들은 부탄다이올 다이글리시딜 에테르 또는 글루타르알데하이드와 같은 가교제에 의해 수득되었다 (Collins & Birkinshaw, 2007). 그러나, 이들 산물에 대한 알레르기 반응에 대한 보고들이 몇몇 존재한다 (Matarasso & Herwick, 2006). 이 특허 출원은 가교에서 보고된 일부 단점들을 극복하는데, 보다 구체적으로는 가교가 종종 실패하고 일반적으로 고 반응성 시약인 제2 가교제가 사용되어야 하며, 따라서 제2 단계에서 다당류의 직접적인 변형 및 가교가 바람직하다 (Schante, Zuber, Herlin & Vandamme; Yeom et al.)는 점을 해결하고 있다.

선행 기술 분야에서는, 본원에서 총괄하여 "금속"이라 지칭하는, 금속, 전이 금속, 메탈로이드(metalloid)를 포함하는 기타 가교제가 개시되어 있다. 예로는, 붕소, 알루미늄, 지르코늄, 마그네슘, 철, 구리, 납 또는 티타늄을 포함한다 (US 20010002411). 일반적으로, 금속은 2종 이상의 겔화 분자(gelling molecule)와 상호작용하여, 이들 간에 화학 결합을 형성한다. 이들 보고된 가교제들 중 다수는 이들의 용도와 관련하여 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 붕소-함유 가교제는 pH 8에서 사용되야 하는 제한이 있으며, 반응 혼합물에 포함되는 외부의 염의 사용이 요구된다. 더욱이, 붕소는 반응 산물의 추가적인 처리 및 분리에 사용되는 알코올 또는 글리콜과 같은 첨가제와 반응하거나 또는 거대분자에 존재하는 하이드록실과 반응한다. 티타늄은 또한 고 비용, 및 가교의 느린 카이네틱스 (kinetics)와 같은 단점을 가진다. 지르코늄계 가교제는 또한, 제형에 사용되는 보편적인 겔화제인 잔탄의 가교 불능 (incapability)과 같은 단점을 가진다 (US-20080207470).

하이드로겔을 형성하기 위한 가교의 다른 방법으로는 US-7807656-B2에 보고된 바와 같이 비-공유 결합을 수반하며, 철, 구리, 아연, 칼슘 및 기타 킬레이트화 이온과 같은 복수의 하전된 이온을 사용한다. 그러나, 삽입된 금속은 일부의 미공지된 독성학적 효과를 가질 수 있다.

가교는 하이드로겔의 형성에만 국한되지 않으며 불용성 미세섬유의 수득에도 적용될 수 있다. 대신, 천연 (native) 히알루론산으로 제조된 미세필라멘트 (또는 섬유)는 최근 문서 US 20100310631에 기술되었으며, 이들은 물에서 완전히 가용성인 특성을 가진다. 이 외에도, 히알루론 섬유계 물질은 카르보다이이미드 및 에폭사이드 유형의 가교제 (가교제, 예를 들어 US-2007066816에 언급된 비-배제적인 목록)의 존재 하에 히알루론산의 가교에 의해 수득되었다. 그러나, 이들 물질은 인간에게 독성인 무시하지 못할 단점을 가지며, 이는 생체 내에서 이의 모든 용도를 심각하게 제한한다.

지난 몇 년 동안, 전이 금속-매개의 유기 합성 영역에서 상당한 노력들이 이루어져 왔다. 이러한 면에서, 탄소-탄소 커플링 반응은 2개의 탄화수소 단편이 금속 촉매에 의해 커플링되는 다양한 반응을 포함하는 개념이다. 2가지 유형의 커플링 반응이 알려져 있다: 2가지 서로 다른 파트너의 반응을 수반하는 가교 반응(crosslinking), 및 2가지 동일한 파트너와 함께 커플링되는 호모커플링 (homocoupling). 전이 금속은 다양한 유기 화합물을 활성화시키는 독특한 능력을 가지며, 이러한 활성화를 통해 이들은 새로운 결합의 형성을 촉매할 수 있다. 팔라듐-촉매화된 가교의 원리는, 2개의 분자가 금속-탄소 결합의 형성을 통해 금속 상에 조립되는 것이다. 이러한 방식으로, 팔라듐에 결합된 탄소 원자들은 서로 매우 근접해진다. 다음 단계에서, 이들은 서로 커플링되며, 이로써 새로운 탄소-탄소 단일 결합이 형성된다. 이는 하기의 도식 1에 예시되어 있다:

팔라듐 촉매화된 가교 반응은 예를 들어 당 로드(sugar rod)의 합성 및 이후에 탄수화물 클러스터에 적용되었다 (Roy, Das, Santoyo-Gonzalez, Hernnandez-Mateo, Dam & Brewer, 2000). 이러한 유형의 화학반응의 일부 예는 Vasella et al (Murty & Vasella, 2001)에 의한 일련의 문헌에 기술되었다. 그러나, 이러한 유용한 반응은 탄수화물 또는 다당류 화학에는 거의 사용된 적이 없다. 국제 특허 출원 WO-9014353은 진단 및 치료 목적을 위한 올리고뉴클레오타이드의 팔라듐-매개 커플링 반응을 보고하였다. 새로운 팔라듐-매개의 탄소-탄소 결합은 DNA-주형 화학의 형성에서 이의 사용을 위해 WO/2007/008226에 개시되었다.

본원에서, 본 발명자들은 팔라듐 촉매화된 가교 반응에 의한 HA의 새로운 가교 방식을 기술한다. 이 반응은 구리와 같은 다른 금속과 같은 특수한 첨가제를 사용하지 않고도 시행될 수 있다. 이 반응은 물 또는 인산염 완충제, 뿐만 아니라 알코올과 보편적인 유기 및 무기의 저비용 염기 및 산의 혼합물에서 수행될 수 있다. 조건의 최적화는, 반응에 매우 소량의 촉매, 상대적으로 낮은 온도 및 짧은 반응 시간이 필요하다는 것을 보여준다. 가교 후, 본원에서 하이드로겔 및 미세섬유라고 하는 산물을 강하게 세정하여, 잔여 팔라듐을 제거하였다. 놀랍게도, 촉매의 효과적인 제거는 약학 분야에, 일반적으로 인간 용도로 사용하기 위한 불용성 물질을 형성하는데 반응의 잠재적인 활용을 보장하게 되었으며, 따라서 가교 반응은 생활성 다당류의 변형 화학 분야에서 실제로 혁신을 이끌었다.

Collins, M. N., & Birkinshaw, C. (2007). Comparison of the effectiveness of four different crosslinking agents with hyaluronic acid hydrogel films for tissue-culture applications. Journal of Applied Polymer Science, 104(5), 3183-3191. Matarasso, S. L., & Herwick, R. (2006). Hypersensitivity reaction to nonanimal stabilized hyaluronic acid. Journal of the American Academy of Dermatology, 55(1), 128-131. Murty, K. V. S. N., & Vasella, A. (2001). Oligosaccharide Analogues of Polysaccharides, Part 21 , Towards New Cellulose I Mimics: Synthesis of Dialkynyl C-glucosides of peri-Substituted Anthraquinone. Helvetica Chimica Acta, 84(4), 939-963. Roy, R., Das, S. K., Santoyo-Gonzalez, F., Hernanadez-Mateo, F., Dam, T. K., & Brewer, C. F. (2000). Synthesis of "Sugar-Rods" with Phytohemagglutinin Cross-Linking Properties by Using the Palladium-Catalyzed Sonogashira Reaction. Chemistry - A European Journal, 6(10), 1757-1762. Schante, C. E., Zuber, G., Herlin, C., & Vandamme, T. F. Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical applications. Carbohydrate Polymers, 85(3), 469-489. Yeom, J., Bhang, S. H., Kim, B.-S., Seo, M. S., Hwang, E. J., Cho, I. H., Park, J. K., & Hahn, S. K. Effect of Cross-Linking Reagents for Hyaluronic Acid Hydrogel Dermal Fillers on Tissue Augmentation and Regeneration. Bioconjugate Chemistry, 21(2), 240-247.

본 발명은 다당류, 보다 구체적으로 히알루론산의 가교 방법에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명은 히알루론산의 불용성 유도체의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 방법은 복수의 가교된 하이드로겔 또는 화학적으로 변형된 HA를 기재로 하는 미세섬유의 제조에 관한 것이다. 본 방법은 히알루론산계 하이드로겔의 효과적인 제조를 기술하며, 뿐만 아니라 이 방법은 변형된 HA를 기재로 하는 미세섬유의 가교에 적용될 수 있다. 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법은 물, 완충제 또는 유기산과 알코올의 혼합물에서 팔라듐 활성 촉매의 존재 하에 C-C 커플링 반응에 의해 수행되며, 여기서, C-C 커플링 반응은 말단 아릴-할라이드기 및/또는 아릴-보레이트기를 가지는 히알루로난 유도체, 및 알케닐기 또는 알키닐기를 가지는 히알루로난 유도체 간에 발생한다.

본 발명에 따른 섬유는 각각이 가교 반응에 대한 반응성을 가지는 것으로 알려진 하나 이상의 관능기를 가진 제1 전구물질 및 제2 전구물질의 혼합물을 습식-방사하거나 또는 압출함으로써 제조된다. 공지된 방사 장치는 필라멘트의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 형성되는 가교된 물질은 관능화된 제1 전구물질과 제2 전구물질 간의 반응에 의해 제조될 수 있으며, 이는 2가지 전구물질들 간에 공유 결합이 형성되게 하며, 이는 팔라듐 활성 촉매에 의해 촉매화된다. 즉, 본 방법은 탄소-탄소 커플링을 통해 HA를 HA의 또 다른 분자에 공유 결합하는 것을 포함한다. 즉, 소노가시라(Sonogashira) 반응의 변형을 수성 매질에서 히알루론산의 가교에 적용하였다.

본 발명에 의해 해결되는 과제는, 생체 내에서 사용하기에 적절한, 단순하면서도 저비용이고 효율적인 방식으로, 물에 불용성인 하이드로겔 및 히알루론산계 미세섬유를 수득하는 것이다. 이러한 과제는 적절한 전구물질을 가교시킨 후, 제거될 수 있는 팔라듐 촉매를 사용함으로써 해결된다. 히알루론산의 사용은 수득되는 물질이 생체적합성이며 흡수성이기 때문에 바람직하다. 본 방법에 의해 수득되는 하이드로겔은 3D-구조 및 상호연결된 기공을 가진다. 더욱이, 본 방법으로 가교되는 미세섬유는 비-가교 섬유의 것과 비교해 기계적 특성이 상당히 개선되어 있다. 가교 전과는 달리, 미세섬유는 물에서 불용성이다. 본 특허 출원에서 보고되는 가교된 물질은 또한, 점탄성 겔을 필요로 하는 적용에 삽입될 수도 있다. 본 출원에서 제조되는 가교된 섬유는 다양한 수술적 적용 및 상처 치유 적용, 뿐만 아니라 의료 기기 파트에도 사용될 수 있다. 추가적인 목적은 하기의 상세한 설명과 청구항을 기재로 명확해질 것이다.

제1 구현예에서, 본 발명은 히알루론산의 유도체를 가교하여, 화학식 (A) 또는 (B)로 표시되는 가교된 HA-계 유도체를 제조하는 방법을 제공한다:

상기 식에서, R₁은 지방족 C₁ _-15치환기로서, 두 유도체 모두에서 동일하거나 또는 상이할 수 있다. R₁의 비-한정적인 예는 메틸렌 또는 에틸렌이다.

나아가, 본 발명은 하기 i) 내지 iii)의 단계를 포함하는, 가교 반응용 유도체의 제조 방법에 관한 것이다:

i) 제1 전구물질로도 지칭되는, 식 (I)에 따른 말단 아릴 치환기를 가진 2차 아민 히알루로난 유도체의 제조 단계이다:

상기 식에서, X는 할로겐 또는 보레이트 관능기이다. X의 비-한정적인 예는 -I , -Br 또는 B-(OH)₃이다. 즉, 단계 i)은 바람직하게는 a) C-6 위치에서 히알루로난의 산화, 및 b) 유형 (I)의 성분들을 수득하기 위한, 바람직하게는 브로마이드, 요오드 또는 붕소-함유 말단 기일 수 있는 말단 치환기를 가진 1차 방향족 아민의 커플링을 포함한다. 1차 아민은 하기 단계 iii)에 기술된 가교 반응에 대한 기질인 유형 (I)의 유도체를 수득하기 위해 p-치환된 아닐린 유형의 방향족으로서, 화학적으로 변형된 히알루론산에서 요오드 (Ia), 브롬 (Ib), 또는 보레이트 (Ic)를 말단 기로 사용하면, 가교 반응을 효과적으로 조정할 수 있는 성분을 제공한다. 본 발명자들이 아는 한, 방향족 고리의 파라-치환기는 촉매 사이클의 산화성 첨가 단계에 영향을 미치며 변화시킬 수 있다 (상기 도식 1). 즉, 제1 성분 (I)은 가교의 카이네틱스를 변화시켜, 겔화는 속도, 시간, 온도, 수율에 대해 다양할 수 있으며, 가교 반응의 범위를 증가시킬 수 있다. 이들 선호할만한 특징은 전형적으로 아릴 치환기 -X의 파라 위치에 부착되는 치환기의 이탈기 능력으로 인한 것으로, 제1 전구물질 (I)을 II형 또는 III형의 제2 전구물질과 가교시키는 속도를 조절하는 것으로 여겨진다.

단계 ii)는 제2 전구물질이라고도 하는, 식 ( II ) 또는 ( III )의 삼중 결합 또는 이중 결합을 포함하는 불포화 화합물을 가진 2차 아민 히알루로난 유도체의 제조이다:

상기 식에서, R₁은 상기에 명시되어 있다. 단계 ii)에서 히알루론산의 화학적 변형은 바람직하게는, a) C-6 위치에서 히알루로난의 산화 단계, 및 b) 알카인 (II) 또는 알켄 (III)일 수 있는 말단 불포화 기를 가지는 지방족 1차 아민, 예를 들어, (II)의 경우 프로파길 아민 또는 부티닐 아민 또는 (III)의 경우 알릴 아민과 같은 알케닐기의 다당류 백본에의 부착 단계로서, 한편 알카인 (II)는 통상 알켄 (III)보다 반응성이다. 물질의 가교 속도 및 최종 특성은 제2 전구물질 II 또는 III의 반응성에 의해 맞춰질 수 있다.

추가 단계인 단계 iii)은, 말단 알카인 (II) 또는 알켄 (III)을 (I)의 유도체의 아릴, 비닐 할라이드 또는 보란에 "팔라듐 활성 촉매" 촉매화된 커플링을 수행하여, 탄소-탄소 결합의 형성을 통해 가교시키는 것을 포함한다. 이 반응을 또한 가교 반응이라 칭할 수 있다. 따라서, 단계 iii)은 식 (I)의 유도체를 식 II (또는 III)의 유도체, 그리고 팔라듐 활성 촉매와 혼합하여, 히알루론산의 가교를 수행하는 단계로 구성된다. 가교된 산물은 상기 도식 A 또는 B에 도시된 식으로 특징지어진다. 가교는 도식 2에 나타낸 방정식에 의해 다소 임의적으로 정의되며, 여기서, R₁ 및 R₂는 아릴기 또는 비닐기를 가진 HA 유도체이며, X는 할로겐 원자 또는 관련된 헤테로원자 이탈기이다. 금속 (M)은 H, C, 및 15족 내지 18족 원소를 제외한 모든 원소로서 정의된다.

이 경우, 가교와 호모-커플링을 구별해야 한다. R₁R₂, R₁R₁, 및 R₂R₂의 주로 통계학적인 혼합물 또는 랜덤 혼합물을 제공하는 반응은 가교로부터 가능한 한 배제되어야 한다.

전술한 바와 같이, 반응은 촉매량의 Cu (I) 염의 사용을 수반하거나 또는 수반하지 않을 수 있으며, 통상 가교 반응으로서 간주된다. 도식 2에서 기술되고 도식 1에서 기술된 촉매 사이클에 의해 특징지어지는 가교 반응은 가교된 물질의 수득을 위해 단계 iii)에 적용된다. 가교는 팔라듐 활성 촉매에 의해 촉매화되는, 말단 할라이드 및/또는 아릴-보레이트와 알케닐 또는 알키닐 유도체와 같은 불포화 기 간의 반응을 포함하며, 상기 팔라듐 활성 촉매는 바람직하게는 팔라듐 (II) 아세테이트와 무기 염기 또는 유기 염기의 복합체, 또는 팔라듐 (II)와 2-아미노-4,6-다이하이드록시피리미딘의 복합체일 수 있으며, 반응 혼합물 내의 팔라듐 활성 촉매의 농도는 1x10^-5 M 내지 1x10^-3 M 범위일 수 있다. 가교된 HA 유도체를 하이드로겔 형태로 제조하는 경우, 팔라듐 (II) 아세테이트와, 무기 염기 또는 유기 염기, 예컨대 DABCO, TEMED, TEA, K₂HPO₄와 같은 2차 포스페이트, CsCO₃와 같은 카르보네이트, 보다 바람직하게는 TEMED 또는 DABCO의 복합체를 팔라듐 활성 촉매로서 사용하며, 한편 반응 혼합물 내의 이러한 팔라듐 활성 촉매의 바람직한 농도는 1x10^-4 M 내지 1x10^-3 M, 바람직하게는 5x10^-4 M 범위인 것이 바람직한 것으로 확인되었다.

미세섬유 형태의 가교된 HA 유도체의 제조를 위해, 식 (I)의 유도체는 식 (II) 또는 (III)의 유도체와 혼합되며, 혼합물은 응고조(coagulation bath)로 압출된 다음, 미세섬유가 팔라듐 활성 촉매를 포함하는 가교조로 수송된다. 미세섬유의 가교에 바람직한 팔라듐 활성 촉매는 팔라듐 (II)와 2-아미노-4,6-다이하이드록시피리미딘의 복합체이며, 가교조에서 이의 바람직한 농도는 1x10^-5 M 내지 1x10^-4 M, 바람직하게는 5x10^-5M인 것으로 확인되었다. 응고조는 알코올과 유기 산의 혼합물로 구성될 수 있으며, 그러나 한편, HA-계 미세섬유의 제조에 적절한 임의의 응고조가 사용될 수 있으며, 가교조는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 알코올과 락트산 및 팔라듐 활성 촉매의 혼합물로 구성된다. 가교조에 바람직한 조성물은 1:1 내지 1:5, 바람직하게는 1:4 비율의 락트산 및 이소프로판올이다.

가교 반응을 수행하기 위해, 폴리머는 거대분자 당 하나 이상의 이탈기 (할로게나이드, 붕소-함유 기) 및 하나의 불포화 (알켄 또는 알카인) 모이어티를 가져야 한다.

가교 반응은 알카인의 경우 도식 3에, 알켄의 경우 도식 4에 그래프로 표시되어 있다.

도 1은 실시예 2에 기술된 바와 같은 산물 Ib의 ¹H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 2는 실시예 5에 기술된 바와 같은 산물 IIb의 ¹H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 (TEMED를 사용하여) 실시예 8에 기술된 가교된 물질의 SEM 미세구조를 도시한 것이다.
도 4(a)는 (25℃)에서 측정한 겔화점(gelation point)을 도시한 것이며, 도 4(b)는 실시예 8에서 기술된 Ia 및 IIa의 가교를 위해 60℃에서 측정한 겔화점을 도시한 것이며, 여기서, TEMED는 염기로서 사용된다.
도 5는 실시예 12에 기술된 가교된 물질의 SEM 미세구조를 도시한 것으로, 반응은 K₂HPO₄ 완충제를 사용해 수행하였다.
도 6은 실시예 10에 기술된 가교된 물질의 SEM 미세구조를 도시한 것으로, 여기서, DABCO는 염기로서 사용된다.
도 7은 실시예 2 및 실시예 4에서 기술된 유도체로 제조된 미세섬유의 미세구조를 도시한 것으로서, 여기서, 두 유도체의 농도는 12%이다. 도 7a는 가교 반응 전의 섬유의 미세구조를 도시한 것이며, 도 7b는 가교 후의 미세구조를 도시한 것이다.
도 8은 실시예 2 및 실시예 4에서 기술된 유도체로 제조된 미세섬유의 미세구조를 도시한 것으로서, 여기서, 두 유도체의 농도는 14%이다. 도 8a는 가교 반응 전의 섬유의 미세구조를 도시한 것이며, 도 8b는 가교 후의 미세구조를 도시한 것이다.
도 9는 실시예 2 및 실시예 4에서 기술된 유도체로 제조된 미세섬유의 미세구조를 도시한 것으로서, 여기서, 두 유도체의 농도는 15%이다. 도 9a는 가교 반응 전의 섬유의 미세구조를 도시한 것이며, 도 9b는 가교 후의 미세구조를 도시한 것이다.
도 10은 PBS에 침지한 후의 실시예 16, 17 및 18에서 제조된 섬유의 시간에 대한 팽창도를 도시한 것이다. 평균 직경은 광학 현미경으로 측정 시 시간의 함수로서 측정하였다.
도 11은 실시예 17에서 제조된 미세섬유의 생체적합성 시험을 나타내는 그래프이다.
도 12는 실시예 18에서 제조된 미세섬유의 인장 강도를 도시한 것이다.

정의

본 명세서에서, 특정한 표현은 특징 또는 구현예의 중요한 기술적인 측면에 관한 것인 한, 보다 빈번하게 사용된다. 이들 표현들 중 일부의 경우, 하기의 정의는, 이들이 사용되는 특정한 문맥에서 서로 다른 해석을 필요로 하지 않는 한, 사용되어야 한다.

본원에서, 히알루론산은 폴리카르복실산, 및 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 염 형태의 다당류를 지칭하며, 중량 평균 분자량의 범위는 50,000 Da 내지 3,000,000 Da일 수 있다.

본원에서, 다당류 백본의 경우, 치환율(degree of substitution)은 100개의 당류 다이머(saccharide dimer) (이 경우, 다당류는 히알루론산임) 당 반응성 모이어티로서 정의되는데, 즉, 화학적으로 변형된 다이머의 수를 표시한다.

본원에서, 가교된 물질은 하나 이상의 친수성 폴리머의 화학적 가교에 의해 만들어진 3-차원 폴리머 네트워크이다. 이러한 유도체는 팽창될 수는 있지만 물과 접촉 시 용해되지 않는다.

본원에서, 미세섬유 또는 섬유는 명확한 종축 또는 축방향 기하 구조(axial geometry)를 가진 성분으로, 부가적으로는 약 1,000 ㎛ (즉, 1 mm) 미만, 선택적으로 약 100 ㎛ (즉, 100,000 nm) 이하인 공간 차원(spatial dimension)을 하나 이상 가진다. 본원에서, "마이크로-크기의(micro-sized)" 또는 "마이크로미터-크기의(micrometer-sized)"라는 용어는 일반적으로 당해 기술분야의 당업자에게는 약 500 ㎛ (즉, 0.5 mm) 미만을 의미하는 것으로 이해된다.

전술한 바와 같이, 팔라듐 활성 촉매는 팔라듐 (II)과 염기의 복합체, 또는 팔라듐 (II)과 2-아미노-4, 6-다이하이드록시피리미딘의 복합체로서, 가교 반응을 촉매화하는 데 사용되며 팔라듐 용액의 보관을 가능하게 한다. 상기 반응은 불활성 분위기 하에 수행될 필요가 있을 수 있거나 또는 없을 수 있다.

가교 반응에 사용될 수 있는 염기로는, 유기 염기 또는 무기 염기, 예를 들어, DABCO (1, 4-다이아자바이사이클로 [2.2.2] 옥탄), TEMED 또는 TMEDA (N, N, N', N'-테트라메틸-에탄-1,2-다이아민), TEA (트리에틸아민), K₂HPO₄와 같은 2차 포스페이트, CsCO₃와 같은 카르보네이트를 포함한다.

전술한 바와 같이, 히알루론산의 화학적 변형은 "산화 및 환원성 아민화"에 의해 수행되어, 유형 I, II 또는 III의 유도체가 수득되었다. 나아가, 화학적 변형은 반응 조건에 따라 8% 내지 15%로 다양할 수 있다. 예를 들어, 도 1은 유형 Ib의 화학적으로 변형된 HA의 ¹H NMR 스펙트럼을 도시한 것으로, DS가 6%인 것을 특징으로 한다. 도 2는 유형 II의 화학적으로 변형된 HA의 ¹H NMR 스펙트럼을 도시한 것으로, DS가 12%인 것을 특징으로 한다. 가교 반응성 모이어티는 안정한 2차 아민 결합을 포함하는 링커에 의해 폴리머 백본에 연결되며; 본원에서, 2차 아민은 식 -C-NH-R로 표시되며, 여기서, R은 임의의 탄소 사슬을 의미한다. 겔화는 가교 반응 동안 수집되는 동적 점탄성 데이터의 측정으로 모니터링하였다. 시스템이 점탄성 고체로 진전되는 것은 명백히 확인되었으며, 도 4에서 각각 25℃에서의 가교의 경우 A로 60℃에서의 가교의 경우 B로 도시하였다. 먼저, 폴리머 성분을 바이얼에서 혼합하였다. 팔라듐 (II) 촉매 및 염기를 폴리머 용액에 첨가하고, 와동(vortex)하였다. 용액을 신속하게 유량계(rheometer)로 옮기고 겔화를 인 시추(in situ ) 측정하였다. 유량계 측정(rheometric measurement)을 수행하여, 반응 카이네틱스 (가교 / 겔화에 필요한 시간)를 평가하고, 가교 / 겔화의 발생을 입증하였다. 가교 반응 동안, 진동 스윕 운동(oscillatory sweep movement)을 5 Hz의 진동수로 적용하였다. 전형적인 실험 결과를 도 4a 및 4b에 도시한다. 유량계 측정의 목적은 HA-계 겔의 팔라듐-촉매화된 가교 방법의 과정을 "겔화점", 즉, G^*=G^**에서의 시간에 관해 특징화하는 것이었으며, 여기서, G^*는 저장 탄성률(storage modulus) 또는 탄성률(elastic modulus)로 정의되며, G^**는 손실 탄성률(loss modulus)로 정의된다. 시간의 함수로서 G^* 및 G^**의 곡선이 교차하는 경우 (즉, G^*=G^**), 물질이 겔화를 수행함을 의미한다. 2가지 겔의 경우 그 결과는, 가교 과정이, 겔화를 60℃에서 수행한 경우 상대적으로 단시간인 660초에 의해 특징지어지며 (도 4b), 겔화를 25℃에서 수행한 경우 4000초로 길어짐을 의미한다 (도 4a).

도 3, 5 및 6은 가교된 물질 (건조된 스캐폴드(scaffold))의 미세구조를 도시한 것이다. 화학적으로 1,4-다이아자바이사이클로 [2.2.2] 옥탄으로 규정된 DABCO는 소노가시라 반응에 대한 효과적인 리간드인 것으로 확인되었다. 따라서, 1,4-다이아자바이사이클로 [2.2.2] 옥탄 (도 6)은 테트라메틸에틸렌다이아민 (TMEDA 또는 TEMED)과 비교 시 일정한 다공성을 형성하며 기공 크기가 보다 작았다 (도 3). K₂HPO₄를 염기로서 사용하여 가교된 샘플의 구조 또한 연구하였으며 (도 5), 여기서, K₂HPO₄를 사용하면 염기의 무독성으로 인해 바람직하다. SEM 현미경 사진에 따르면, HA의 가교 동안 염기가 중요한 역할을 하는 것이 명백하다. 반응 조건은 하이드로겔 미세구조에 상당한 영향을 미친다. 스캐폴드의 다공성은 300 ㎛ 내지 900 ㎛로서 측정되었다.

단계 iii)에 기술된 가교 반응은 물에서 불용성인 미세섬유의 형성에도 적용될 수 있다. 유도체 (I) 및 (III) 또는 (II)으로 구성된 미세섬유는 직경이 100-250 μM(㎛)이며 둥근 단면을 가지는 것을 특징으로 하며, 습식-방사에 의해 제조되며; 이후 이들 미세섬유는 팔라듐 (II) 아세테이트 또는 팔라듐 활성 촉매에 의해 촉매화되는 가교를 수행한다. 미세섬유 및 가교의 형성 방법은 하기 a) 내지 f)의 단계를 포함한다: a) 유형 (II) 또는 (III)의 유도체를 유형 (I)의 유도체와 혼합하고, 물 또는 포스페이트 완충제에 용해시켜, 단순한 물리적 혼합물을 형성한다. 성분 (I + III) 또는 (II + III)으로 구성된 폴리머 용액을 반응의 최종 용도에 따라 변형된 HA 고체 1 중량% 내지 15 중량%로부터 제조하였으며, 여기서, 1% 내지 5%의 조성물이 하이드로겔에 바람직하며 (실시예 7 내지 15), 12% 내지 15%는 미세섬유에 바람직하다 (실시예 16 내지 18). 전술한 바와 같이 미세섬유의 가교에 사용되는 성분의 특정 농도로써, 인장 강도가 보다 높은 섬유를 제조하였다. b) 가교된 미세섬유를 수득하기 위해 실시예 16 내지 18에 기술된 바와 같은 농도로 유도체를 혼합한 물리적 혼합물은 방사 전 적어도 24시간에 제조하였다. c) 섬유를 습식-방사 공정으로 제조하였다; d) 이후, 섬유를 건조하고, e) 제2 조 (bath) (가교조)에 옮긴 다음, 섬유를 40℃ 내지 80℃, 바람직하게는 60℃ 범위의 고온을 이용해 2시간 동안 가교에 의해 가교시켰다. f) 이소프로판올-물 혼합물을 사용해 섬유에서 성분들을 세정해 내고, 다시 24시간 동안 건조하였다. 도 7, 8 및 9는 조성이 다양한 섬유를 주사 전자 현미경 (SEM)으로 촬영하여 수득한 현미경 사진을 도시한 것이다. 도 7, 8 및 9의 파트 a 및 b (상부 파트)는 항상, 방사 공정 후에 수득되는 균질성을 예시하기 위해 수득된 섬유의 균열(fracture)을 도시하는데; 예를 들어, 도 7(a)는 가교 전의 섬유의 단면도 (균열)를 도시하며, (b)는 가교 후의 섬유의 단면을 도시한 것이다. 하면에는, 가교 전 섬유 표면의 장축도(longitudinal view)(c)와, 가교 후 섬유 표면의 장축도(d)가 도시되어 있다. 미세섬유는 약 12 중량%, 14 중량% 및 15 중량%의 조성물을 사용해 제조하였다. 필라멘트의 평균 직경은 동일한 섬유의 길이에 대해 다양한 위치에서 적어도 4회의 측정을 주사 전자 현미경을 이용해 각각의 방사 속도에서 측정하여 결정하였다. 조성물은 섬유의 직경에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 도 7(c)는, 12 중량%로부터 수득한 미세섬유의 직경은 가교 전 평균 직경이 147.3 ㎛이며 가교 후 평균 직경이 128 ㎛ (d)임을 보여준다. 도 8(c)에서, 14 중량%로부터 수득한 섬유는 가교 전 직경이 223.4 ㎛이며, 가교 후 직경이 151.6 ㎛로 다시 감소한 것으로 나타났다 (도 8(d)). 도 9(C)에서는, 15 중량%를 사용하여 수득한 미세섬유의 직경이 217.1 ㎛에서 153.2 ㎛로 감소한 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 조성물은 300초 후에 일정한 팽창률(swelling ratio)을 나타낸다 (도 10). 섬유는 물 및 생리학적 매질과 접촉 시 용해되지 않으면서 팽창할 수 있다. 광학 현미경을 사용해 PBS와 접촉한 후의 물질의 직경 증가를 측정하였다. 도 10은 실시예 16 내지 18에서 제조한 섬유의 팽창도를 도시한 것이다. 더욱이, 미세섬유의 생체적합성은 가교 전과 가교 후에 특징지어진다. 미세섬유는 멸균시킨 다음 1.8 μ/ml 내지 3.6 μ/ml의 농도로 12-웰 플레이트에 두어, 세포와 섬유가 직접 접촉했을 때의 적합성을 시험하였다. 시험은 가교 반응 전과 반응 후에 삼중으로 수행하였다. 도 11은, 미세섬유가 NIH-3T3 섬유모세포와 함께 시험된 후 세포적합성(cytocompatible)임을 보여준다. 나아가, 세정 후 미세섬유에는 팔라듐이 남아 있지 않았으며, 따라서 생체 내에서 사용하기에 적절하게 된다. 도 12는, 최고 인장 강도를 보고한 조성물 (15 중량%)의 인장 강도를 도시한 것이다. 장력(tension)은 Universal 인장 응력 기계 (Instron)에서 측정하였다. 인장 강도는 가교 전과 가교 후에 수득하였다. 즉, 인장 강도는 섬유가 부서질 때까지 연신(stretching)에 필요한 응력의 측정값이다. 먼저, 1 mm/ min의 초기 속도를 이용해 0005 N의 힘 (하중)을 섬유에 적용하여 늘린 다음, 섬유가 부서질 때까지 10 mm/min의 속도로 인장 응력을 가한다. 각각의 유형의 샘플에 대해, 최소 4회의 시험을 수행하고, 데이터를 통계학적으로 분석하였다. 실험 데이터로부터, 최상의 조성물은 성분의 물리적 혼합물을 15 중량%로 수득하였을 때 확인되었다. 이들 섬유의 인장 강도 값을 측정하였으며, 표 1 및 2에 나타낸다. 측정은 가교 전과 가교 후에 수행하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 섬유는 51.05±3.5 MPa의 인장 강도 값을 나타낸 반면, 가교 후 동일한 조성물은 2배가 넘는 인장 강도, 이 경우 114.63±4.23 MPa의 인장 강도를 나타내었다 (표 2).

실시예

이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 할 뿐 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 실시예에서 언급되는 모든 부(part), 백분율(%), 비율 등은 다르게 명시되지 않는 한 중량에 의한 것이다.

실시예 1. 말단 기로서 요오드를 포함하는 성분 ( Ia )의 제조

HA의 모노머 단위 0.025 mmol에 상응하는 평균 분자량이 498 kDa인 히알루로난 10 g을 실온에서 증류수 1000 mL에 용해시켰다. NaBr 2.57 g 및 Na₂HPO₄.12H₂O 38.84 g을 혼합물에 첨가하였다. 반응물의 pH는 NaOH 0.1 M을 첨가하여 pH 9.0으로 조정하였다. 반응물을 5℃로 냉각시키고 비워 낸 후 질소로 재충전하였다. 4-아세타미도-TEMPO 53.3 mg을 첨가하고, 소듐 하이포클로라이트 3 mL을 첨가하였다. 산화 반응을 15분 동안 수행하였다. 반응 혼합물의 pH를 아세트산을 첨가하여 pH 7.0으로 조정하였다. 그런 다음, p-요오도-아닐린 1.159 g을 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 5시간 동안 방치하였다. 마지막으로, 피콜린 보란 0.566 g을 반응물에 첨가하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 용액을 물 1000 ml로 희석하고, 분자량 컷오프(molecular cut-off)가 10 kDa인 센트라메이트 카세트(centramate cassette) (Paal Co)를 사용해 초여과하였다. 생성물을 IPA로 침전시키고 IPA: 물 (100:0, 80:20, 및 60:40)로 3회 세정한 다음, 60℃에서 오븐에서 건조하였다. 반응 산물을 분석 방법(analytical methodologies)에 의해 완전히 특정하였다. 반응 수율: 90%. SEC-MALLS로 측정한 분자량은 556 kDa였으며 다분산성(polydispersity)은 1.59였다. 치환율 (DS) =6% NMR ¹H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2.02 (s, 3H,-NH-CO-CH₃), 3.35-3.84 (m, 14H), 4.46 (d, 2H), 6.68 (d, 2H, J=8.35), 7.56 (d, 2H, J=8.35).

DS= (n+m) =100%; n=4-8%

실시예 2. 말단 기로서 브롬을 포함하는 성분 ( Ib )의 제조

평균 분자량이 498 kDa (0.025 mmol)인 히알루로난 10 g을 실온에서 증류수 1000 mL에 용해시켰다. NaBr 2.57 g 및 Na₂HPO₄.12H₂O 38.84 g을 혼합물에 첨가하였다. 반응물의 pH는 NaOH 0.1 M을 첨가하여 pH 9.0으로 조정하였다. 반응물을 5℃로 냉각시키고 비워 낸 후 질소로 재충전하였다. 4-아세타미도-TEMPO 53.3 mg을 첨가하고, 소듐 하이포클로라이트 3 mL을 첨가하였다. 산화 반응을 15분 동안 수행하였다. 반응 혼합물의 pH를 아세트산을 첨가하여 pH 7.0으로 조정하였다. 그런 다음, p-브로모-아닐린 (0.2 당량) 0.910 g을 혼합물에 첨가하였다. 반응을 실온에서 5시간 동안 수행하였다. 마지막으로, 피콜린 보란 (0.2 당량) 0.566 g을 반응물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 물 1000 ml로 희석하고, 분자량 컷오프가 10 kDa인 센트라메이트 카세트를 사용해 초여과하였다. 생성물을 IPA로 침전시키고 IPA: 물 (100:0, 80:20, 및 60:40)로 3회 세정하였다. 침전물을 60℃에서 오븐에서 건조하였다. 그런 다음, 반응 산물을 분석 방법에 의해 완전히 특정하였다. 반응 수율 10.5 g. SEC-MALLS로 측정한 분자량은 853 kDa였으며 다분산성은 2.01이었다. 치환율 (DS) =6%.

NMR ¹H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2.02 (s, 3H,-NH-CO-CH₃), 3.35-3.84 (m, 14H), 4.46 (d, 2H), 6. 80 (d, 2H, J=8.35), 7.39 (d, 2H, J=8.35).

실시예 3. 말단 기로서 보레이트를 포함하는 성분 ( Ic )의 제조

평균 분자량이 251.2 kDa인 산화된 히알루로난 1.0 g을 pH 8 포스페이트 완충제 100 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, 아미노페닐보론산 하이드로클로라이드 0.086 g을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 피콜린 보란 0.084 g을 첨가하였다 (HA-다이머에 대해 0.03 당량). 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 산물을 0.5 %(w/v)의 NaHCO₃ /NaCl 용액에 대해 광범위 투석(extensive dialysis)으로 정제하고, 그런 다음 물에 대해 광범위하게 정제하였다. 반응 수율은 1.04 g이었다. 산물의 분자량은 121.8 kDa이고 다분산성은 1.46이었다. NMR로 측정한 치환율은 8%이다. NMR ¹H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H), 7.34 (m, 5H)

실시예 4. 삼중 결합 (프로파길)을 포함하는 성분 IIa 의 제조

평균 분자량이 798 kDa인 산화된 히알루로난 10.0 g을 물 960 ml에 용해시켰다. 프로파길 아민 하이드로클로라이드 (HA-다이머에 대해 0.3 당량)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응물의 pH는 혼합물의 pH가 pH 5.5에 도달할 때까지 아세트산 1 mL을 첨가하여 조정하였다. 실온에서 5시간 동안 교반한 후, 피콜린 보란 0.424 g을 첨가하였다 (히알루론산 반복 다이머 0.3 당량에 상응함). 반응은 밤새 진행시켰다. 산물을 초여과로 정제하였다. 프로파길-변형된 HA 산물은 보편적인 분석 기술로 완전히 특정화하였다. HA에 결합된 프로파길 아민 모이어티의 정량적 평가에 사용되는 신호는, 변형된 다당류의 경우 메틸렌이지만 HA의 경우 메틸이다. SEC-MALLS로 측정한 분자량은 평균 값이 604.4 kDa이며 다분산성은 2.15이다. 치환율 (DS) = 12% FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ, C≡C), 1614, 1407, 1078, 613. NMR ¹H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).

DS= n=8-15%

실시예 5. 삼중 결합 ( 부티닐 )을 포함하는 성분 IIb 의 제조

일반적으로, 평균 분자량이 130 kDa인 소듐 히알루로네이트 10.0 g을 물 960 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, 소듐 브로마이드 2.57 g을 첨가하였다 (2,5 mmol). 소듐 포스페이트 38.8 g을 반응 혼합물에 첨가하여, pH=9.0가 되게 하였다. 하기의 반응물을 순서대로 첨가하였다: 미리 물 (1 ml)에 용해시킨 4-아세타미도-TEMPO 53.3 mg, 및 소듐 하이포클로라이트 3.0 ml. 혼합물을 교반 하에 5시간 동안 방치하였다. 반응물이 실온에 도달할 때까지 방치하였다. 이 문서에서, pH는 아세트산을 첨가하여 전위차적으로 (potentiometrically) 조정하여, pH=5.5가 되게 하였다. 이 혼합물에, n-부티닐-아민 (0.3 mmol)을 첨가하였다. 환원성 아민화를 5시간 동안 수행하였다. 이후, 피콜린 보란 0.424 g을 첨가하였다 (히알루론산 반복 다이머 0.3 당량에 상응함). 반응물이 실온에서 밤새 진행되도록 방치하였다. 산물은 초여과로 정제하였다. 프로파길-변형된 HA 산물은 보편적인 분석 기술로 완전히 특정화하였다. HA에 결합된 프로파길 아민 모이어티의 정량적 평가에 사용되는 신호는, 변형된 다당류의 경우 메틸렌이지만 HA의 경우 메틸이다. SEC-MALLS로 측정한 분자량은 평균 값이 440.1 kDa이며 다분산성은 1.57이다. 치환율 (DS)= 12% NMR ¹H (500 MHz, δ ppm): 2.03 (3H, -N-CO-CH ₃ ), 2.64 (2H, t J=6.6, -NH-CH₂- CH ₂ -), 2.70 (1H, t; J=6.6), 3.18 (2H t; J=6.5, -NH- CH ₂ -CH₂-), 3.30-3.90(10H, sceletal), 4,46 (2H, 1a,1b). FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ,C≡C), 1614, 1407, 1078, 613.

실시예 6. 이중 결합 (알릴)을 포함하는 성분 III 의 제조

일반적으로, 평균 분자량이 130 kDa이고 다분산성이 1.9 (2.5 mmol)인 산화된 소듐 히알루로네이트 1.0 g을 물 100 ml에 용해시켰다. 알릴 아민, (0.285 g, 0.5 mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 피콜린 보란 0.0535 g을 첨가하였다 (0.5 mmol). 반응은 실온에서 밤새 진행시켰다. 반응물은 10 kDa 컷-오프인 튜브를 사용해 투석으로 정제하였다. 반응 수율은 0.6932 g이었다. SEC MALLS 데이터에서, 분자량은 203.05 kDa이며 다분산성은 1.574인 것으로 확인되었다. 아세타미도 모이어티의 병합(integration)에 의해, 알케닐 신호와 비교해서 측정되는 치환율은 8%인 것으로 확인된다.

실시예 7. 25℃에서 TEMED 및 팔라듐 활성 촉매를 사용하여 수행되는 가교 반응

Pd-피리미딘 "활성 촉매"의 제조는 본원에 기술되어 있다: 10 mL 메스 플라스크(volumetric flask)에, 2-아미노-4,6-다이하이드록시피리미딘 (13 mg, 0.10 mmol) 및 0.10 M NaOH 스탁 용액 2 mL를 첨가하였다. 피리미딘 리간드는 65℃로 예열한 수조에서 2분 동안 교반함으로써 완전히 용해시켰다. 생성 용액에, Pd (OAc)₂ (22.4 mg, 0.1 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 65℃에서 30분 동안 (개방형 공기에서) 격렬히 교반하여, 균질한 황색-오렌지색 용액을 수득하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 교반 막대기 (stir bar)를 제거하고, 증류수를 이용해 용액을 5.00 mL로 희석시켜, Pd (II) 중의 0.01 M 촉매 용액을 수득하였다. 가교 반응을 위한 일반적인 절차는 본원에 기술되어 있다: 성분 Ia 10 mg (0.025 mmol) 및 성분 IIa 10 mg (0.025 mmol)을 증류수 2 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, TEMED (테트라메틸에틸렌다이아민 (TMEDA 또는 TEMED) 10 ㎕ (0.0006 mmol), 및 팔라듐 활성 촉매 용액 10 ㎕를 연속해서 첨가하였다. 촉매를 첨가한 후 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 25℃에서 6시간 동안 수행하였다. 제조된 하이드로겔을 PBS (3x100ml) 및 증류수 (3x100ml)로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다. 잔여 팔라듐을 215±25 ng/g의 건조 질량 (dry mass)으로서 정량화하였다.

실시예 8. 25℃ 및 60℃에서 TEMED 및 팔라듐 ( II ) 아세테이트를 사용한 가교

성분 Ia (0.5 mmol) 20 mg 및 성분 IIa (0.5mmol) 20 mg을 증류수 1 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, TEMED (테트라메틸에틸렌다이아민) 10 ㎕ (0.0006 mmol) 및 팔라듐 (II 아세테이트 (0.013 mmol) 3 mg을 첨가하였다. 촉매를 첨가한 후 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 60℃에서 6시간 이하 동안 가온하였다. 하이드로겔을 PBS (3x100ml) 및 증류수 (3x100ml)로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다. 건조된 물질의 구조는 건조 후 SEM으로 연구하였다 (도 3). 가교 반응의 과정을 유동학(rheology)으로 확인하였다. 유량계 측정은 실온에서 콘(cone) 및 플레이트를 구비한 TA 유량계에서 수행하였다. 측정 변수는 τ = 10000 Pa 및 f = 1 s^-1이었다. 성분 Ia 및 IIa의 용액은 2% (w/v)의 농도로 제조하였다. 따라서, 팔라듐 (II) 아세테이트 2 mg을 와동에 의해 폴리머 혼합물에 혼입하고, 이어서 TEMED 10 ㎕를 혼입하였다. 혼합물을 양호하게 균질화한 후, 제조된 용액 (500 ㎕)을 각각 25℃ 또는 60℃의 일정한 온도로 유지시킨 유량계의 실린더형 셀 (cylindrical cell)에 옮겼다 (도 4a 및 4b).

실시예 9. 60℃에서 CsCO ₃ 및 팔라듐 활성 촉매를 사용한 가교

성분 Ia 20 mg (0.5 mmol) 및 성분 IIa 20 mg (0.5 mmol)을 증류수 1 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, 세슘 카르보네이트 10 mg (0.028 mmol) 및 실시예 6에 기술한 바와 같이 제조한 팔라듐 활성 촉매 용액 10 ㎕ (0.01 M)을 첨가하였다. 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 하이드로겔을 PBS 및 증류수로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다.

실시예 10. 37℃에서 팔라듐 ( II ) 아세테이트 및 DABCO 를 사용한 가교

성분 Ia 20 mg (0.5 mmol) 및 성분 IIa 20 mg (0.5 mmol)을 증류수 1 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, DABCO (또는 1, 4-다이아자바이사이클로 [2.2.2] 옥탄) 10 mg (0.09 mmol) 및 물에 용해시킨 팔라듐 (II) 아세테이트 1 mg (0.004 mmol)을 연속해서 첨가하였다. 촉매를 첨가한 후, 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 37℃에서 24시간 동안 교반하였다. 제조된 하이드로겔을 PBS 및 증류수로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다. 하이드로겔의 구조는 도 6에 도시되어 있다.

실시예 11. 37℃에서 팔라듐 ( II ) 아세테이트 및 TEA 를 사용한 가교

성분 Ia 20 mg (0.5 mmol) 및 성분 IIa 20 mg (0.5 mmol)을 증류수 1 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, TEA 10 ㎕ (0.010 mmol) 및 물에 용해시킨 팔라듐 (II) 아세테이트 용액 10 ㎕ (3% w/v)를 연속해서 첨가하였다. 각각의 성분을 첨가한 후, 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 37℃에서 24시간 동안 교반하였다. 제조된 하이드로겔을 PBS 및 증류수로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다.

실시예 12. 60℃에서 팔라듐 ( II ) 아세테이트 및 K ₂ HPO ₄ 를 사용한 가교

성분 Ib 20 mg (0.5 mmol) 및 성분 IIb 20 mg (0.5 mmol)을 증류수 1 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, K₂HPO₄ 10 mg (0.057 mmol) 및 물에 용해시킨 팔라듐 (II) 아세테이트 용액 10 ㎕ (3% w/v)를 연속해서 첨가하였다. 촉매를 첨가한 후, 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 제조된 하이드로겔을 PBS 및 증류수로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다. SEM 현미경에 의한 구조적 특정화는 도 5에 도시되어 있다.

실시예 13. 60℃에서 팔라듐 활성 촉매 및 K ₂ HPO ₄ 를 사용한 가교

성분 Ib 20 mg (0.5 mmol) 및 성분 IIc 20 mg (0.5 mmol)을 증류수 1 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, K₂HPO₄ 10 mg (0.057 mmol) 및 실시예 6에 기술한 바와 같이 제조한 팔라듐 활성 촉매 용액 (0.01 M) 10 ㎕를 연속해서 첨가하였다. 각각의 성분을 첨가한 후, 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응은 60℃에서 5시간 동안 수행하였다.

실시예 14. 포스페이트 완충제 ( pH 6.0) 중의 팔라듐 ( II ) 아세테이트를 사용한 가교

성분 Ia 20 mg (0.5 mmol) 및 성분 IIa 20 mg (0.5 mmol)을 포스페이트 완충제 pH; 6.0, pH 2 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, TEMED 10 mg (0.028 mmol) 및 팔라듐 (II) 아세테이트 10 mg (0.04 mmol)을 연속해서 첨가하였다. 촉매 및 염기를 첨가한 후, 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 제조된 하이드로겔을 PBS 및 증류수로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다.

실시예 15. 포스페이트 완충제 ( pH 6.0) 중의 팔라듐 ( II ) 아세테이트를 사용한 가교

성분 Ib 20 mg (0.5 mmol) 및 성분 IIb 20 mg (0.5 mmol)을 포스페이트 완충제 pH; 8.0, pH 2 ml에 용해시켰다. 상기 용액에, TEMED 10 mg (0.028 mmol) 및 팔라듐 (II) 아세테이트 10 mg (0.04 mmol)을 연속해서 첨가하였다. 촉매 및 염기를 첨가한 후, 와동을 이용하여 양호하게 균질시켰다. 반응물을 질소로 충전시키고 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 제조된 하이드로겔을 PBS 및 증류수로 광범위하게 세정하여 촉매를 제거하였다.

실시예 16. 60℃에서 12% (w/v) 농도의 유도체 및 팔라듐 활성 촉매를 사용한 미세섬유의 가교

미세섬유의 형성: Ib 및 IIa로서 기술되는 유도체의 물리적 혼합물을 물에 용해시켜, 12 중량%의 수용액을 제조하였다. 상기 혼합물을 방사 공정 전 현탁액의 고 점도로 인해 격렬히 (최소한 24시간 동안) 교반하여, 완전히 균질화하였다. 혼합물을 주사기로 옮기고, 주사기는 열어 둔 채 두어 포획된 공기가 나갈 수 있게 하였다. 섬유 형성에 사용되는 기본적인 실험 설정은, 홀더 (holder)를 사용해 고정되는, 폴리머 용액을 포함하는 주사기를 포함한다. 상기 주사기를 선형 주사기 펌프 (Nexus 5000, Chemyx)에 넣는다. 주사기를 주입 튜빙 (injection tubing)에 부착하고, 여기서, 폴리머 혼합물을 응고조에 직접 주입하여, 습식-방사 공정을 이용해 미세섬유를 수득하였다. 실험은 실온에서 평균 압출 속도 260 ㎕/min로 수행하였다. 응고조는 예를 들어 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올, 및 포름산 또는 아세트산과 같은 유기산으로 구성될 수 있다. 그러나, 본 발명의 주제가 형성된 섬유의 가교이기 때문에, 응고조의 조성물은 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 물론, 당해 기술분야에 이미 기술된 바와 같이 히알루로난의 제조에 유용한 다른 방법들도 존재한다. 생성되는 섬유는 조 밖으로 나가게 힘을 가하며 2개의 코일들 간에 롤링함으로써 연장시킨다. 그런 다음, 최종 섬유는 실온에서 탈수시킨다. 건조 공정에 의해, 미세섬유의 침강에 사용한 휘발성 성분을 서서히 증발시킬 수 있다.

미세섬유의 가교를 위한 반응 조건의 설정: 미세섬유를, 이하 이소프로판올 및 락트산의 (8:2) 비율의 혼합물을 포함하는 가교조라 지칭되는, 조(bath)로 옮겼다. 그러나, 가교조의 조성은 다양할 수 있으며, 가교 반응에 영향을 주지 않으면서 다른 알코올 및 유기산을 포함할 수 있다. 실시예 7에 이미 기술한 바와 같이 제조한 "팔라듐 활성 촉매" 용액의 양을 50 ㎕ 내지 100 ㎕로 다양하게 하여, 미세섬유가 가교조로 반응하게 하였다. 가교조에서 사용되는 팔라듐 활성 촉매의 최종 농도는 예를 들어, 5x10^-5 M 내지 1x10^-4 M일 수 있다. 가교 반응은 3가지 상이한 온도: 실온, 37℃ 및 60℃에서 시도하였다. 실험적으로, 섬유는 60℃에서 가교를 수행한 것으로 관찰되었다. 가교 시간을 모니터링하기 위해, 섬유 조각을 반응물로부터 추출하고, 물에서의 섬유의 용해도를 시험하였다. 따라서, 반응을 최상의 시간인 것으로 확인된 2시간 동안 진행시켰다. 이후, 미세섬유를 이소프로판올 : 물의 혼합물로 광범위하게 세정하고 다시 건조하였다. 미세섬유의 특정화는 주사 전자 현미경 (SEM)으로 수행하였으며: 미세섬유 스캐폴드는 알루미늄 기판의 상부에 방사하고, 금으로 스퍼터-코팅 (sputter-coated)하고, 이들의 표면 형태구조를 주사 전자 현미경으로 조사한다. 가교 전과 가교 후의 미세섬유의 형태적 특정화 및 구조적 특정화는 SEM으로 수득하였으며 도 7에 도시한다. 인장 시험은 인장 시험 기계인 Instron 3343로 측정하였으며, Bluehill 2 소프트웨어로 분석하였다.

실시예 17. 60℃에서 14% (w/v) 농도의 유도체 및 팔라듐 활성 촉매를 사용한 미세섬유의 가교

성분의 농도를 14 중량%로 증가시킨 것을 제외하고는, 섬유를 실시예 16에 기술된 것과 유사한 절차를 이용해 제조하였다. 280 ㎕/min의 압출 속도로 습식-방사 공정에 의해 섬유를 수득하였다.

실시예 18. 60℃에서 15% (w/v) 농도의 유도체 및 팔라듐 활성 촉매를 사용한 미세섬유의 가교

성분의 농도를 15 중량%로 증가시킨 것을 제외하고는, 섬유를 실시예 16에 기술된 것과 유사한 절차를 이용해 제조하였다. 300 ㎕/min의 압출 속도로 습식-방사 공정에 의해 섬유를 수득하였다.

하기의 표 1은 (가교 전의) 실시예 18에 기술된 미세섬유의 기계적 특성을 나타낸다. 표 2는 (가교 후의) 실시예 18에 기술된 미세섬유의 기계적 특성을 나타낸다.

표본 라벨	파단 시 하중 (Cursor)	파단 시 인장 변형률 (Cursor)	파단 시 인성 (tenacity at Break)(Cursor)	계수 (Tangent 0.5 %)	파단 시 인장 응력 (Cursor)
	(N)	(mm/mm)	(cN/tex)	(MPa)	(MPa)
1	2,70	0.19	2.70383	> 1334.425	55.08204
2	2,36	0.15	2.36366	> 1462.406	48.15201
3	2,58	0.17	2.58496	> 1538.254	52.66032
4	2,59	0.17	2.58656	> 1429.957	52.69302
5	2,29	0.14	2.29136	> 1480.453	46.67916
평균	2,51	0.17	2.50607	1449.099	51.05331
표준 편차	0.17190	0.01776	0.17190	75.209	3.50188
중앙값	2,58	0.17	2.58496	1462.406	52.66032
변동 계수	6.85926	10.74236	6.85926	5.190	6.85925

표본 라벨	파단 시 하중 (Cursor)	파단 시 인장 변형률 (Cursor)	파단 시 인성 (Cursor)	계수 (Tangent 0.5 %)	파단 시 인장 응력 (Cursor)
	(N)	(mm/mm)	(cN/tex)	(MPa)	(MPa)
1	2,39	0.10	2.39025	> 4872.143	118.88104
2	2,33	0.11	2.33154	> 4722.472	115.96108
3	2,19	0.09	2.18782	> 4720.472	108.81340
4	2,31	0.09	2.30931	> 4516.462	114.85558
평균	2,30	0.10	2.30473	4707.887	114.62778
표준 편차	0.08509	0.00775	0.08509	146.053	4.23190
중앙값	2,32	0.10	2.32042	4721.472	115.40833
변동 계수	3.69186	7.81418	3.69186	3.102	3.69186

실시예 19. 가교 반응 전과 가교 반응 후의 세포의 생존율 측정

실시예 16에 기술한 바와 같이 제조한 섬유를 오토클레이브 (120℃/20분)에서 멸균시키고, 이어서 Dulbecco's Modified Eagle Medium과 10% 태아 소 혈청, 5 g/l D-글루코스, 20 uM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 구성된 배양 배지로 옮겼다. 섬유 용액은 배양 배지 mL 당 샘플 3.6 mg의 농도로 제조하였다. 섬유를 밤새 현탁시켰다. 이 현탁액을 2가지 상이한 농도: 1.8 mg/ml 및 3.6 mg/ml에서 시험하였다. 세포주 및 생존율은 NIH-3T3 세포주에서 시험하였다. 세포를 12-웰 배양 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양한 후, 웰 당 3000 c의 밀도로 사용하였다. 상기 인큐베이션 후, 세포를 배양 배지로 옮겨, 섬유 및 용해된 산물과 직접 접촉시켰다. 인큐베이션은 각각 24시간, 48시간 및 72시간 동안 수행하였다. 각각의 인큐베이션 기간 후, (3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐 테트라졸륨 브로마이드 사용하는) 시험 MTT에 의해 세포의 생존율을 조사하였다. 시험물은 지시한 바와 같이 제조하였는데; MTT를 배양 배지에서 5 mg/ml의 농도로 용해시켰다. MTT 용액 20 ㎕를 웰에 옮기고 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광 마이크로플레이트의 측정은 2가지 상이한 흡광 값, 이 경우 570 nm 및 690 nm에서 VersaMax를 사용해 판독하였다. 생체적합성의 그래프 증거는 도 11에 도시되어 있다.

Claims

가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법으로서,
팔라듐 활성 촉매의 존재 하에, 물, 포스페이트 완충제, 또는 유기산과 알코올의 혼합물 중에서의 C-C 커플링 반응에 의해 수행되며,
상기 C-C 커플링 반응은 말단 아릴-할라이드기 및/또는 아릴-보레이트기를 가진 히알루로난 유도체와 알케닐기 또는 알키닐기를 가진 히알루로난 유도체 사이에 발생하는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제1항에 있어서,
식 (I)에 따른, 말단 아릴 치환기를 가진 제1의 2차 아민 히알루로난 유도체를 제조하는 단계:

상기 식에서, X는 할로겐 또는 보레이트 관능기임;
식 (II) 또는 (III)에 따른, 삼중 결합 또는 이중 결합을 포함하는 불포화 화합물을 가진 2차 아민 히알루로난 유도체를 제조하는 단계:

상기 식에서, R₁은 지방족 C₁ _-15 기임; 및
상기 식 (I)의 유도체를 상기 식 (II) 또는 (III)의 유도체와 혼합한 다음, 물에서 안정적인 팔라듐 활성 촉매를 첨가하여, 가교된 히알루로난 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제2항에 있어서,
X가 I, Br 또는 B-(OH)₃이고,
R₁은 메틸렌 또는 에틸렌인 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 팔라듐 활성 촉매가, 팔라듐 (II) 아세테이트와 무기 염기 또는 유기 염기의 복합체, 및 팔라듐 (II)과 2-아미노-4,6-다이하이드록시피리미딘의 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되며,
반응 혼합물에서 상기 팔라듐 활성 촉매의 농도가 1x10^-5 M 내지 1x10^-3 M 범위인 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 팔라듐 활성 촉매가 팔라듐 (II) 아세테이트와 무기 염기 또는 유기 염기의 복합체이며,
반응 혼합물에서 상기 팔라듐 활성 촉매의 농도가 1x10^-4 M 내지 1x10^-3 M, 바람직하게는 5x10^-4 M이며,
생성되는 가교된 히알루로난 유도체가 하이드로겔 형태인 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제5항에 있어서,
상기 염기가 DABCO, TEMED, TEA, K₂HPO₄와 같은 2차 포스페이트, CsCO₃와 같은 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제5항에 있어서,
상기 염기가 TEMED 또는 DABCO인 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 식 (I)의 유도체를 상기 식 (II) 또는 (III)의 유도체와 혼합하는 단계,
상기 혼합물을 응고조 (coagulation bath)로 압출시켜 히알루로난 유도체 미세섬유를 수득하는 단계, 및
상기 미세섬유를, 팔라듐 활성 촉매를 포함하는 가교조 (crosslinking bath)로 옮겨 가교된 히알루로난-유도체 미세섬유를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제8항에 있어서,
상기 팔라듐 활성 촉매가 팔라듐 (II)과 2-아미노-4,6-다이하이드록시피리미딘의 복합체이며,
상기 가교조에서의 상기 팔라듐 활성 촉매의 농도가 1x10^-5 M 내지 1x10^-4 M, 바람직하게는 5x10^-5M 범위인 것을특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 응고조가 알코올과 유기 산의 혼합물로 구성되며,
상기 가교조가 알코올과 락트산의 혼합물 및 팔라듐 활성 촉매로 구성되는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제10항에 있어서,
상기 가교조의 알코올이 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가교가 25℃ 내지 100℃, 바람직하게는 60℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루로난 유도체의 제조 방법.
하기의 식 A 또는 B에 따른 하이드로겔:

상기 식에서, R₁은 지방족 C₁ _-15치환기임.
제13항에 있어서,
R₁이 메틸렌 또는 에틸렌인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔.
하기의 식 A 또는 B에 따른 히알루로난 유도체를 기재로 하는 미세섬유 (microfiber):

상기 식에서, R₁은 지방족 C₁ _-15치환기임.
제15항에 있어서,
100 ㎛ 내지 300 ㎛의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는, 미세섬유.