ITTS20010016A1 - Polisaccaridi regioselettivamente reticolati. - Google Patents
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Description
Descrizione dell’ invenzione industriale avente per titolo:
POLISACCARIDI REGIOSELETTIVAMENTE RETICOLATI
CAMPO DELL’INVENZIONE
L'invenzione in oggetto si riferisce a polisaccaridi reticolati regioselettivi. Questi nuovi composti possiedono caratteristiche chimico-fisiche particolari e si presentano in diverse forme che vanno dalla soluzione viscosa al gel che li rendono indicati per vari scopi.
STATO DELLA TECNICA
La letteratura riporta diversi metodi per preparare polisaccaridi reticolati, che consentono l’ottenimento di materiali con caratteristiche che vengono modulate variando il tipo di legame covalente, i gruppi funzionali coinvolti, il polisaccaride. A seconda del tipo di reticolazione si possono ottenere dei network polimerici che a contatto con mezzi acquosi possono risultare insolubili oppure solubili; nel secondo caso essi danno origine a sistemi ad elevata viscosità. Per questi scopi vengono usati reagenti polifunzionali, come ad esempio diepossido, dicarbodiimmide, diidrazide, poliidrazidi, divinilsulfone, o reagenti monofunzionali come ad esempio agenti aldeidici (Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15(5), 513-555, 1998).
Tra questi prodotti, un derivato reticolato del polisaccaride ialuronano che è entrato in commercio per usi in clinica è Hylan, che comprende una classe di derivati che conservano le proprietà di biocompatibilità del polimero di partenza. Il prodotto Hylan si presenta in forma di network oppure di gel solubile. Nel primo caso la reticolazione ottenuta con divinilsulfone coinvolge esclusivamente i gruppi ossidrilici lasciando intatti i gruppi carbossilici ed i gruppi acetammidici dello ialuronano. L’ottenimento del gel solubile avviene invece mediante l’uso di formaldeide; in questo caso il tipo di reazione preclude la possibilità di ulteriori reazioni per il legame di farmaci.
Un’altra strategia di reticolazione che coinvolge i soli gruppi ossidrilici prevede l’uso di diepossidi e richiede soluzioni di partenza polimeriche molto concentrate (50-175 mg/ml) che rendono impossibile il mescolamento omogeneo dei reagenti.
Mono-carbodiimmidi, dicarbodiimmidi, idrazidi, diidrazidi, quali agenti reticolanti reagiscono invece con i gruppi carbossilici del polisaccaride. Con questa tecnica Anika ha sviluppato e messo in commercio dei reticolati di ialuronano (Inceri, Ossigel) per uso chirurgico.
La tecnica che utilizza carbodiimmide ha consentito inoltre l’ottenimento di un reticolato eteropolisaccaridico di ialuronano e carbossimetilcellulosa (Seprafilm), dove sia la natura chimica dei legami inter- e intracatena che il grado di reticolazione non sono però definiti.
Con il processo di modifica che utilizza carbodiimmidi/idrazidi vengono preparati inoltre reticolati di polisaccaride contenenti un farmaco, dove il farmaco è legato al polimero tramite il braccio funzionale idrazide. La presenza di questo braccio può in alcuni casi non essere ottimale ed interferire con i fisiologici processi di rilascio del farmaco nei distretti corporei, o rilasciare nell’organismo entità chimiche non biocompatibili o bioassorbibili.
Altri agenti reticolanti quali dimetilolurea, etilenossido, poliaziridina, poliisocianati, possono essere usati per produrre reticolati di polisaccaridi; i prodotti che si ottengono con questi agenti hanno però strutture chimica che non sono definite.
Secondo un altro approccio, il polisaccaride viene parzialmente ossidato ed i gruppi aldeidici formatisi vengono fatti reagire con gruppi amminici, ad esempio di un secondo polisaccaride, in modo tale formare un reticolo. In questo caso la struttura nativa del polisaccaride viene però persa a seguito dell’apertura dell’anello glicosidico (EP1011690).
Una strategia ulteriore di preparazione di reticolati polisaccaridici è quella descritta in US5676964. La reazione coinvolge sia i gruppi carbossilici che quelli ossidrilici dello ialuronano e non prevede l’uso di agenti reticolanti ma richiede la presenza di agenti condensanti. La reazione avviene casualmente sia sui gruppi ossidrilici del residuo N-acetil-D-glucosammina e che su quelli del residuo acido D-glucuronico; ciò conferisce incertezza alla struttura chimica del reticolato ottenuto.
In tutte le reazioni di reticolazioni descritte si prevede l’uso di agenti reticolanti o condensanti di natura chimica diversa. Considerata la natura fisica e l’elevata o elevatissima viscosità del prodotto finale polisaccaridico, questi agenti possono rimanere inglobati nel reticolo nella loro forma originale ovvero non reagita, oppure in una o più forme modificate a seguito dell’ avvenuta reazione; questi potenziali residui trattenuti nella matrice possono quindi interferire con l’uso del prodotto finale oppure conferire a questo proprietà indesiderate.
Alla luce di quanto riportato in letteratura risulta evidente la necessità di preparare reticolati polimerici ben caratterizzati dal punto di vista chimico nonché privi di gruppi chimici estranei al polisaccaride nativo o estranei al polisaccaride previamente modificato per scopi funzionali. Nel caso di applicazioni specifiche in campo medico i materiali reticolati risultano più interessanti quando hanno una struttura chimica tale da consentire la formazione di un legame diretto con molecole biologicamente attive.
DESCRIZIONE DELL’ INVENZIONE
Forma oggetto della presente invenzione una classe di polisaccaridi regioselettivamente reticolati costituiti da due polisaccaridi, dove i gruppi ossidrilici del carbonio in posizione 6 (carbonio C-6) delle unità monosaccaridiche del primo polisaccaride sono regioselettivamente esterificati con i gruppi carbossilici del secondo polisaccaride e/o con eventuali gruppi carbossilici del primo polisaccaride.
I gruppi carbossilici dei polisaccaridi regioselettivamente reticolati non coivolti nel legame estereo sono in forma acida o di sale, quando sono in forma di sale i gruppi sono salificati con cationi di metalli alcalini, alcalino terrosi, e cationi contenenti azoto. Tra i cationi contenenti azoto sono compresi quelli contenenti azoto organico, ad esempio sali di tetralchilammonio, dove alchile ha 1-6 atomi di carbonio. Altri esempi sono lutidinio, collidinio, imidazolio.
II primo polisaccaride deve contenere gruppi ossidrilici sul carbonio in posizione 6 (carbonio C-6) delle unità monosaccaridiche, che consentano l’esterificazione regioselettiva, può contenere anche gruppi carbossilici.
Allo scopo dell’invenzione il primo polisaccaride viene preferibilmente scelto tra quelli che contengono anche gruppi carbossilici. Quando il polisaccaride contiene gruppi carbossilici questi sono in forma di acido o di sale; in quest’ultimo essi sono salificati preferibilmente con cationi di metalli alcalini, alcalino-terrosi, con cationi organici o inorganici contenenti azoto. Polisaccaridi (primo polisaccaride) che contengono gruppi ossidrilici sul carbonio C-6 delle unità monosaccaridiche e contengono anche gruppi carbossilici sono: glicosamminoglicani, xantano, derivati carbossilati di cellulosa, di chitina, di amilosio, di destrano con grado di sostituzione inferiore a 100%, gomme vegetali. Esempi specifici sono: ialuronano, condrotina 4-solfato, dermatan solfato, eparina; carbossimetilcellulosa, carbossimetilchitina, carbossimetilamilosio, carbossimetilguar, carbossimetildestrano; gomma arabica, gomma tragacante, gomma ghatti. Polisaccaridi (primo polisaccaride) che contengono gruppi ossidrilici sul carbonio C-6 delle unità monosaccaridiche e non contengono anche gruppi carbossilici sono: β-glucani, pullulano, curdlano, gellano, succinoglicano, galattomannani, glucomannani.
Allo scopo della presente invenzione il primo polisaccaride viene preferibilmente scelto nel gruppo che consiste di ialuronano, xantano, carbossimetilcellulosa con grado di sostituzione inferiore a 100%, preferibilmente compreso tra 0-50%, carbossimetilchitina con grado di sostituzione inferiore a 100%, preferibilmente compreso tra 0-50%, carbossimetilamilosio con grado di sostituzione inferiore a 100%, preferibilmente compreso tra 0-50%, carbossimetilguar con grado di sostituzione inferiore a 100%, scleroglucano, laminarano.
Il secondo polisaccaride è un polisaccaride carbossilato: esso deve contenere gruppi carbossilici sulle unità monosaccaridiche che lo costituiscono. Detto polisaccaride è presente in forma di acido o di sale; in quest’ultimo caso i gruppi carbossilici sono salificati con cationi di metalli alcalini, alcalino-terrosi, o cationi contenenti azoto. Polisaccaridi che contengono gruppi carbossilici sulle unità monosaccaridiche (secondo polisaccaride) sono: glicosamminoglicani, xantano, derivati carbossilati di cellulosa, di chitina, di amilosio, di destrano, alginati, gomme vegetali, pectine con grado di esterificazione inferiore a 100%. Esempi di polisaccaridi che ricadono in questi gruppi sono: ialuronano, condrotina 4-solfato, condroitina 6-solfato, dermatan solfato, eparina; carbossimetilcellulosa, carbossimetilchitina, carbossimetilamilosio, carbossimetilguar, carbossimetildestrano; gomma arabica, gomma tragacante, gomma ghatti. Allo scopo della presente invenzione il secondo polisaccaride viene preferibilmente scelto nel gruppo che consiste di ialuronano, xantano, alginato, carbossimetilcellulosa, carbossimetilchitina, carbossimetilamilosio, carbossilmetilguar.
Il primo ed il secondo polisaccaride hanno peso molecolare medio pesato (MW, determinazione mediante HPSEC e/o accoppiata con un rivelatore di dimensione, ad esempio diffusione della luce) compreso preferibilmente tra 500 e 3000000 o più preferibilmente tra 800 e 1500000. Il peso molecolare medio pesato dei due polisaccaridi può essere diverso oppure uguale. Quando questo è diverso, solitamente il peso molecolare medio pesato del primo polisaccaride è minore di quello del secondo polisaccaride.
Il primo ed il secondo polisaccaride che costituiscono il polisaccaride reticolato secondo la presente invenzione possono essere identici. In questo caso il polisaccaride preferito è lo ialuronano. Il primo ed il secondo polisaccaride, entrambi ialuronano, hanno peso molecolare medio pesato uguale o diverso. Quando i due polisaccaridi sono diversi allora il primo è preferibilmente un β-glucano, scelto tra laminarano o scleroglucano, il secondo è preferibilmente ialuronano.
Sia il primo che il secondo polisaccaride che costituiscono il derivato reticolato possono essere ulteriormente sostituiti sulle posizioni libere, ovvero sui gruppi ossidrilici, sui gruppi carbossilici, sui gruppi amminici, ove presenti. La sostituzione può avvenire mediante introduzione di gruppi chimici strutturalmente diversi che conferiscono proprietà funzionali importanti per gli utilizzi del prodotto reticolato dell’invenzione. Ad esempio questi polisaccaridi possono essere sostituiti con farmaci o sostanze biologicamente attive, come ad esempio farmaci o sostanze ad attività antitumorale, antiinfiammatoria, cicatrizzante.
Per quanto concerne Γ esterificazione regioselettiva dei gruppi ossidrilici questa può coinvolgere tutti i gruppi ossidrilici (esterificazione 100%) o solo una parte di essi. Sono preferiti quei polisaccaridi regioselettivamente reticolati dove il numero dei gruppi ossidrilici esterificati è compresa tra 0.01% e 70%.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è il processo per la preparazione del polisaccaride reticolato. Il procedimento è caratterizzato dai seguenti passaggi: a) ottenimento del primo polisaccaride regioselettivamente alogenato mediante attivazione dei gruppi ossidrilici del carbonio C-6 delle unità monosaccaridiche del polisaccaride; b) formazione del legame estereo tra il gruppo carbossilico del secondo polisaccaride ed il primo polisaccaride regioselettivamente alogenato ottenuto in a) mediante sostituzione degli atomi di alogeno.
Nel passaggio a) il primo polisaccaride viene sospeso in opportuno solvente organico e tenuto sotto agitazione per 1-5 ore a 25-100°C; quindi dei gruppi ossidrilici del carbonio C-6 vengono fatti reagire con un agente alogenante in solvente organico alla temperatura compresa tra -20°C e 70°C sotto agitazione per 1-18 ore. Il pH della miscela di rezione può essere portato a valori compresi tra 9-11. Al termine della reazione di alogenazione regioselettiva la miscela viene neutralizzata ed il prodotto viene recuperato e purificato secondo i metodi noti. L’agente alogenante è scelto nel gruppo che consiste in: metansolfonilbromuro, metansolfonilcloruro, ptoluensolfonilbromuro, p-toluensolfonil cloruro, tionilcloruro, tionilbromuro; in alternativa si può usare ad esempio l’ossalil bormuro, ossalil cloruro, fosgene, bis-triclorometilcarbonato anche in opportuna miscela secondo l’arte. I solventi che possono essere usati sono i solventi aprotici quali dialchilsolfossido, dialchilcarbossammidi, in particolare Cl-C6-dialchilsolfossidi, come ad esempio dimetilsolfossido, e C1-C6 dialchilammidi di acidi C1-C6 abiatici, come ad esempio N,N-dimetilformammide, Ν,Ν-dietilformammide, Ν,Ν-dimetilacetammide, N,N-dietilacetammide. I solventi preferiti sono N,N-dimetilformammide, dimetilsolfossido, N-metilpirrolidone.
Quando il primo polisaccaride che viene alogenato contiene gruppi carbossilici questi sono in forma di acido o di sale, preferibilmente in forma di sale, ancora più preferiti sono i sali con cationi contenenti azoto organico, ad esempio i sali tetralichilammonici.
Ulteriori dettagli per l’alogenazione regioselettiva di polisaccaridi che contengono anche un gruppo carbossilico sono descritte in W099/18133. Nel passaggio b) il primo polisaccaride regioselettivamente alogenato ottenuto in a), viene sospeso, preferibilmente nella sua forma acida, in un solvente organico o in una miscela di solventi organici e quindi mescolato con il secondo polisaccaride sospeso nello stesso solvente, in presenza di un agente basico. La reazione viene condotta alla temperatura compresa tra 25 e 90°C per 1-100 ore. Il prodotto viene recuperato secondo le tecniche classiche, quali ad esempio la precipitazione, la filtrazione, l’essiccazione, la liofilizzazione. La reazione può prevedere anche l’aggiunta di catalizzatori. I solventi idonei sono i solventi aprotici quali dialchilsolfossido, dialchilcarbossammidi, in particolare C1-C6-dialchilsolfossidi, come ad esempio dimetilsolfossido, e C1-C6 dialchilammidi di acidi C1-C6 alifatici, come ad esempio N,N-dimetilformammide, Ν,Ν-dietilformammide, Ν,Ν-dimetilacetammide, N,N-dietilacetammide. Il solvente è preferibilmente scelto tra N,N-dimetilformammide, dimetilsolfossido, N-metilpirrolidone. L’agente basico è scelto tra basi inorganiche o basi organiche. Ad esempio sono adatti i carbonati di metalli alcalini, piridine anche sostituite come ad esempio dimetilamminopiridina, morfoline, ossazoline, triazoli, tetrazoli, chinoline anche sostituite ad esempio con gruppi amminci, metilici. Si possono anche usare anche precursori di una base.
Altre reazioni diverse da quelle descritte che consentono comunque lo svolgimento dei passaggi a) e b) possono essere applicate.
Nei prodotti reticolati ottenuti applicando i passaggi a) e b) del processo di preparazione, i gruppi carbossilici liberi, non coinvolti nel legame estereo possono essere eventualmente salificati secondo una delle procedure note. Per quanto concerne i polisaccaridi di partenza, il primo (quando contiene gruppi carbossilici) e il secondo hanno preferibilmente i gruppi carbossilici salificati con cationi contententi azoto organico; è ancora più preferibile utilizzare il sale di tetraalchilammonio, con gruppi alchilici da 1 a 6 atomi di carbonio. Nella maggior parte dei casi viene utilizzato il polisaccaride carbossilato di tetrabutilammonio. E' possibile preparare questi sali facendo reagire un sale sodico del polisaccaride o la sua forma acida in soluzione acquosa con una resina sulfonica salificata con una base di ammonio quaternario appropriato.
Variazioni nelle condizioni di reazione, come la concentrazione delle soluzioni polisaccaridiche di partenza, i rapporti tra il primo ed il secondo polisaccaride, i rapporti tra i reagenti ed i singoli polisaccaridi , la temperatura di reazione, la durata di reazione, consentono di modulare il grado di reticolazione.
Il processo di preparazione dei polisaccaridi reticolati presenta la caratteristica essenziale di consentire una reazione regioselettiva. Infatti, la reazione avviene solamente sui gruppi ossidrilici presenti sul C-6 del residuo monosaccaridico del primo polisaccaride che vengono opportunamente attivati in modo da essere gli unici gruppi ossidrilici delle unità monosaccaridiche in grado di reagire con il gruppo carbossilico per formare il legame estereo. Con questo processo si ottiene quindi un prodotto polisaccaridico regioselttivamente reticolato che è chimicamente ben definito.
Un ulteriore vantaggio del processo della presente invenzione consiste nel fatto che detta procedura permette di produrre dei polisaccaridi regioselettivamente reticolati in assenza di ulteriori agenti, come ad esempio gli agenti reticolanti e/o agenti condensanti comunemente usati nei processi dello stato dell’ arte per la preparazione di polisaccaridi reticolati. Questo consente di disporre di polisaccaridi regioselettivamente reticolati puri, ovvero privi di contaminanti provenienti da agenti usati per svolgere la reazione. Questi contaminanti potrebbero interferire con l’utilizzo finale del reticolato; in particolare nel caso di uso in campo medico essi potrebbero costituire dei componenti tossici o nocivi o dare effetti collaterali, ad esempio attività infiammatoria.
Al variare del tipo di polisaccaride e del grado di esterificazione dei gruppi ossidrilici sul carbonio C6 il polisaccaride reticolato dell’invenzione assume le proprietà di un polisaccaride ad elevato peso molecolare, dove per elevato peso molecolare si intende un peso molecolare di valore superiore al peso molecolare medio pesato (MW) dei polisaccaridi nativi. Il polimero reticolato regioselettivo dell’invenzione quando viene messo a contatto con acqua o soluzioni acquose rigonfia in modo evidente e, dopo eventuale agitazione meccanica, fornisce soluzioni molto viscose trasparenti, in alcuni casi lievemente opalescenti con proprietà reologiche di notevole complessità. In altri casi l’aggiunta di acqua o soluzioni acquose al polisaccaride reticolato produce gel acquosi con buone caratteristiche meccaniche. Il polisaccaride reticolato si presenta quindi in tutte le possibili forme che vanno dalla soluzione molto viscosa al gel ad elevatissimo modulo di rigidità. Quando il polisaccaride reticolato presenta delle sostituzioni con gruppi funzionali queste possono consentire la preparazione di sistemi ad elevata viscosità in solventi non acquosi oppure solventi misti. Queste caratteristiche sono alla base dell’utilizzo industriale dei polisaccaridi regioselettivamente reticolati dell’invenzione.
I polisaccaridi regioselettivamente reticolati rivendicati nella presente invenzione possono essere usati in campo farmaceutico, sanitario, chirurgico, cosmetico.
I prodotti che presentano la caratteristica di essere biocompatibili e bioassorbibili possono essere vantaggiosamente usati quali biomateriali. Costituiscono quindi ulteriore oggetto dell’invenzione articoli sanitari o ausili chirurgici comprendenti detti prodotti. Questi possono quindi essere usati nella viscosupplementazione, ovvero in tutte quelle pratiche chirurgiche adiuvanti, e quindi nel settore oculistico, ortopedico, neurologico. Inoltre, possono trovare impiego nel settore chirurgico per ostacolare il fenomeno della formazioni di aderenze, frequente a seguito di interventi chirurgici, ad esempio toracici, addominali, pelvici, ortopedici, ecc. Possono inoltre essere interessanti quali compositi per la riparazione tissutale, quali sistemi di rilascio controllato o quali veicoli di sostanze attive. In questi casi quindi possono trovare impiego in quelle patologie che richiedono trattamenti farmacologici continuati ed eventualmente anche di lunga durata con farmaci che per effetti collaterali o problemi di farmacocinetica non possono essere somministrati con i modi usuali. Costituiscono quindi oggetto dell’invenzione anche i medicamenti comprendenti il polisaccaride reticolato.
Articoli cosmetici comprendente il polisaccaride reticolato, utili soprattutto per applicazioni topiche, come ad esempio idratanti, sono ulteriore oggetto del’invenzione.
I prodotti reticolati di questa invenzione possono essere ulteriormente utilizzati in altri settori industriali come nella preparazione di materiali plastici, materiali compositi, materiali per imballaggio, materiali per alta tecnologia, adesivi, vernici, additivi per industria, agenti compatibilizzanti, modificatori reologici.
Altri utilizzi dei composti dell'invenzione vengono individuati nella preparazione di fasi stazionarie cromatografiche, tra cui anche le fasi stazionarie chirali. Al fine della preparazione di fasi stazionarie cromatografiche, questi reticolati vengono utilizzati come tali oppure dopo essere stati macinati o modellati in beads e dopo essere stati eventualmente selezionati sulla base delle dimensioni delle particelle. Costituiscono quindi un ulteriore oggetto della presente invenzione le fasi stazionarie cromatografiche che comprendono i polisaccaridi regioselettivamente reticolati dell’invenzione. Queste fasi stazionarie sono preparate secondo i processi noti ai tecnici del settore e possono essere usate nella cromatografia a strato sottile, nella cromatografia liquida, ad esempio HPLC, la cromatografia batch, la cromatografia mediante processo di "simulating moving bed" (SBM), la cromatografia con fluidi supercritici (SFC).
Gli esempi seguenti illustrano l'invenzione, senza funzione di limitazione. PARTE SPERIMENTALE ESEMPIO 1 Metodo di determinazione del peso molecolare medio pesato (MW) di ialuronano
H peso molecolare medio pesato viene determinato mediante HP-SEC (High Performance Size Exclusion Chromatography). Le condizioni di analisi sono: Cromatografo: HPLC Jasco PU-880 con iniettore Rheodyne 9125. Colonne: TSK PWxl G6000+G5000+G3000 (TosoHaas) 300 mm x 7.8 mm ID, 13, 10, 6 pm particle size; Temperatura 40°C. Fase mobile: NaCl 0.15 M. Flusso: 0.8 ml/min. Detector: LALLS CMX-100 (TSP Chromatix), Po = 300-400 mV; Indice di rifrazione differenziale 410 (Waters), Sensibilità 128x; Temperatura 32°C. Volume iniettato: 100 μΐ .1 prodotti vengono solubilizzati in 0.15 M NaCl alla concentrazione di ca. 1.0 mg/ml e vengono tenuti in agitazione per 12 ore. Le soluzioni vengono filtrate su un filtro a porosità di 0.45 pm (Millipore) e quindi inettate nel cromatografo. L’analisi consente la determinazione del MW (peso molecolare medio pesato), Mn (peso molecolare medio numerico), PI (polidispersità). Le concentrazioni delle soluzioni polisaccaridiche vengono verificate mediante l’integrale dell’indice di rifrazione. Lo ialuronano tetrabutilammonico (campioni usati negli esempi 3-6, 8-14) viene analizzato dopo scambio ionico tra tetrabutilammonio e sodio, la determinazione del suo MW viene quindi fatto sul corrispondente sale di sodio.
ESEMPIO 2 Metodo di determinazione del peso molecolare medio pesato (MW) di laminar ano
Il peso molecolare medio pesato viene determinato mediante HP-SEC (High Performance Size Exclusion Chromatography). Le condizioni di analisi sono: Cromatografo: HPLC Jasco PU-880 con iniettore Rheodyne 9125. Colonne: TSK PWxl G3000+G2500 (TosoHaas) 300 mm x 7.8 mm ID, 13, 10, 6 μm particle size; Temperatura 40°C. Fase mobile: NaCl 0.15 M. Flusso: 0.5 ml/min. Detector: indice di rifrazione differenziale 410 (Waters), Sensibilità 128x; Temperatura 32°C. Volume iniettato: 100 μΐ. I prodotti vengono solubilizzati in 0.1 M NaCl alla concentrazione di ca. 1.0 mg/ml e vengono tenuti in agitazione per 12 ore. Le soluzioni vengono filtrate su un filtro a porosità di 0.45 μm (Millipore) e quindi inettate nel cromatografo. L’analisi consente, previa calibrazione con standard di pullulano (PolymerLab UK), la determinazione del MW (peso molecolare medio pesato), Mn (peso molecolare medio numerico), PI (polidispersità). Le concentrazioni delle soluzioni polisaccaridiche vengono verificate mediante l’integrale dell’indice di rifrazione.
ESEMPIO 3 Preparazione di C6-bromo ialuronano
250 mg di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 10 mL di Ν,Ν-dimetilformammide in un pallone a 3 colli provvisto di refrigerante a ricadere, alla temperatura di 80°C, sotto flusso di azoto e sotto agitazione magnetica. Si porta a temperatura ambiente e si addizionano ulteriori 5 mL di N,N-dimetilformammide. Si porta la miscela a 0°C e si aggiungono 312 pL di tionil bromuro. Si lascia il sistema sotto agitazione per 30 minuti e si alza quindi la temperatura a 80°C lasciando poi reagire per 16 ore. La soluzione viene raffreddata a temperatura ambiente, addizionata di 10 mL di acqua Milli-Q e neutralizzata con idrossido di sodio. Il solvente viene eliminato a pressione ridotta ed il solido ottenuto viene lavato con acetone e recuperato mediante filtrazione. Si solubilizza quindi il prodotto in 10 mL di acqua Milli-Q e si dializza contro acqua distillata. Il prodotto viene poi recuperato mediante liofilizzazione. Si sono ottenuti 30 mg di prodotto.
Il prodotto è stato caratterizzato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del protone e del carbonio (<1>H NMR, <13>C NMR) usando come solvente acqua deuterata alla temperatura di 40°C. Nello spettro del <13>C, dal confronto tra l'area del segnale del C6 bromurato (33 ppm) e quella del C6 non bromurato (61 ppm) è stato definito che il grado di bromurazione è del 90%.
ESEMPIO 4 Preparazione di C6-bromo ialuronano
2 g di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 100 mL di Ν,Ν-dimetilformammide in un pallone a 3 colli provvisto di refrigerante a ricadere, alla temperatura di 60°C, sotto flusso di azoto e sotto agitazione meccanica. A solubilizzazione completa si raffredda a temperatura ambiente e quindi a 0°C con un bagno a ghiaccio. Si aggiungono alla soluzione 101 μL di acido metansolfonico e, in 2 aliquote, 1.5 mL di ossalil bromuro e si lascia il sistema sotto agitazione per 30 minuti. Si alza quindi la temperatura a 60°C e si lascia reagire per 16 ore. Si ottiene un sistema eterogeneo al quale si addizionano 10 mL di acqua Milli-Q, neutralizzando poi con idrossido di sodio. Il sistema viene concentrato a pressione ridotta a circa 1/5 del suo volume e precipitato in metanolo. Il prodotto viene filtrato e disperso in acqua. Si basilica con idrossido di sodio e si lascia il sistema sotto agitazione magnetica fino a completa solubilizzazione del prodotto. La soluzione viene quindi neutralizzata con acido cloridrico e dializzata contro acqua distillata. Il prodotto viene recuperato mediante liofilizzazione. Si sono ottenuti 610 mg di prodotto. Il prodotto è stato caratterizzato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del protone e del carbonio (<1>H NMR, <13>C NMR) usando come solvente acqua deuterata alla temperatura di 40°C. Nello spettro del <13>C, dal confronto tra l'area del segnale del C6 bromurato (33 ppm) e quella del C6 non bromurato (61 ppm) è stato definito che il grado di bromurazione è del 50%.
ESEMPIO 5 Preparazione di C6-bromo ialuronano
1 g di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 100 mL di Ν,Ν-dimetilformammide in un pallone a 3 colli provvisto di refrigerante a ricadere, alla temperatura di 60°C, sotto flusso di azoto e sotto agitazione meccanica. A solubilizzazione completa si raffredda a temperatura ambiente e quindi a 0°C con un bagno a ghiaccio. Si aggiungono alla soluzione 50 pL di acido metansolfonico e 754 pL di ossalil bromuro e si lascia il sistema sotto agitazione per 30 minuti. Si alza quindi la temperatura a 80°C e si lascia reagire per 16 ore. Si ottiene un sistema eterogeneo al quale si addizionano 10 mL di acqua Milli-Q, neutralizzando poi con idrossido di sodio. Il sistema viene concentrato a pressione ridotta a circa 1/5 del suo volume e precipitato in acetone. Il prodotto viene filtrato e disperso in 100 mL di acqua Milli-Q. Si basilica con idrossido di sodio e si lascia il sistema sotto agitazione magnetica fino a completa solubilizzazione del prodotto. La soluzione viene quindi neutralizzata con acido cloridrico e dializzata contro acqua distillata. H prodotto viene recuperato mediante liofilizzazione. Si sono ottenuti 440 mg di prodotto. Il prodotto è stato caratterizzato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del protone e del carbonio (<1>H NMR, <13>C NMR) usando come solvente acqua deuterata alla temperatura di 40°C. Nello spettro del <13>C, dal confronto tra l'area del segnale del C6 bromurato (33 ppm) e quella del C6 non bromurato (61 ppm) è stato definito che il grado di bromurazione è del 70%.
ESEMPIO 6 Preparazione di C6-bromo ialuronano
4 g di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 200 mL di N,N-dimetilformammide in un pallone a 3 colli provvisto di refrigerante a ricadere, alla temperatura di 60°C, sotto flusso di azoto e sotto agitazione meccanica. A solubilizzazione completa si raffredda a temperatura ambiente e quindi a 0°C con un bagno a ghiaccio. Si aggiungono alla soluzione 202 μL di acido metansolfonico e, in 3 aliquote, 3.0 mL di ossalil bromuro e si lascia il sistema sotto agitazione per 30 minuti. Si alza quindi la temperatura a 60°C e si lascia reagire per 16 ore. Al sistema si addizionano 20 mL di acqua Milli-Q, neutralizzando poi con idrossido di tetrabutilammonio al 40%. Il sistema viene concentrato a pressione ridotta a circa 1/5 del suo volume e precipitato in acetone. Il prodotto viene filtrato e disperso in 150 mL di acqua Milli-Q. Si basifica con idrossido di tetrabutilammonio al 40% e si lascia il sistema sotto agitazione magnetica fino a completa solubilizzazione del prodotto. La soluzione viene quindi neutralizzata con acido cloridrico e dializzata contro acqua distillata. Il prodotto viene recuperato mediante liofilizzazione. Si sono ottenuti 2.31 g di prodotto. Il prodotto è stato caratterizzato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del protone e del carbonio (<1>H NMR, <13>C NMR) usando come solvente acqua deuterata alla temperatura di 40°C. Nello spettro del <13>C, dal confronto tra l'area del segnale del C6 bromurato (33 ppm) e quella del C6 non bromurato (61 ppm) è stato definito che il grado di bromurazione è del 50%.
ESEMPIO 7 Preparazione di di C6-bromo laminarano
0.5 g di laminarano (“hot extraction” da Laminaria sp; MW: 10000, secondo l’esempio 2) vengono dispersi in 5 mL di N,N-dimetilformammide, si raffredda il sistema a -40°C in un bagno di etanolo. Si aggiungono alla soluzione 4 mL di acido metansolfonilbromuro mediante imbuto gocciolatore durante un periodo di tempo superiore a 1 ora. Si porta quindi a temperatura ambiente e si lascia reagire per 2 ore e mezza. Si porta la temperatura a 70°C e si lascia reagire per 16 ore. Si neutralizza con una soluzione di carbonato e si dializza contro acqua distillata. D precipitato che si ottiene viene recuperato solubilizzato in un piccolo volume di Ν,Ν-dimetilformammide e quindi dializzato contro acqua distillata. Il precipitato viene raccolto e quindi essiccato. Il prodotto è stato caratterizzato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del carbonio (<13>C NMR). Nello spettro del <13>C, si osserva il segnale del C6 bromurato (33.77 ppm) mentre è assente il segnale del C6 non bromurato (60.8 ppm), è stato quindi definito che il grado di bromurazione è del 100%.
ESEMPIO 8 Preparazione di polisaccaride reticolato
50 mg di acido ialuronico (MW: 100000) vengono sciolti in 10 mL di dimetilsolfossido in un pallone a tre colli da 50 mL sotto flusso di azoto e sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente. In un altro pallone a tre colli da 50 mL sotto flusso di azoto e sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente, vengono sciolti 100 mg di 6-bromo ialuronano in forma acida, preparato all’esempio 3 in 10 mL di dimetilsolfossido. Si mescolano le due soluzioni e si lascia reagire a temperatura ambiente e sotto flusso di azoto per 45 ore in presenza di un agente basico. La soluzione viene precipitata in metanolo ed il prodotto viene recuperato mediante filtrazione a pressione ridotta. Aggiungendo al solido 100 mL di acqua Milli-Q si ottiene un sistema eterogeneo a pH acido. Si neutralizza quindi con bicarbonato di sodio ottenendo cosi un sistema omogeneo che viene liofilizzato. Il prodotto ottenuto rigonfia in soluzione acquosa ad alte concentrazioni.
ESEMPIO 9 Preparazione di polisaccaride reticolato
In un pallone a fondo sferico da 20 mL sotto agitazione magnetica alla temperatura di 80°C, vengono sciolti 50 mg di C6-bromo ialuronano, preparato all’esempio 6, in 10 mL di N,N-dimetilformammide.A solubilizzazione completa si raffredda il sistema a temperatura ambiente. In un altro pallone a tre colli da 50 mL sotto agitazione magnetica e sotto flusso di azoto alla temperatura di 30°C, 50 mg di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 3 mL di Ν,Ν-dimetilformammide. Alla soluzione si aggiungono quindi il C6-bromo ialuronano sciolto in N,N-dimetilformammide, 25 μL di trietilammina ed una quantità catalitica di tetrabutilammonio ioduro e si lascia reagire a 30°C sotto agitazione magnetica e sotto flusso di azoto per 22 ore. Il sistema viene concentrato a pressione ridotta a 1/3 del suo volume e precipitato in acetone. Il prodotto viene recuperato mediante filtrazione e quindi disperso in 50 mL di acqua Milli-Q. Si ottiene un sistema eterogeneo a pH basico che viene neutralizzato con acido cloridrico e messo a dializzare contro acqua distillata. Il prodotto viene recuperato mediante liofilizzazione. Il prodotto ottenuto rigonfia in soluzione acquosa ad alte concentrazioni con ottenimento di un sistema molto viscoso.
ESEMPIO 10 Preparazione di polisaccaride reticolato
50 mg di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 2 mL di dimetilsolfossido in un pallone a fondo sferico da 20 mL sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente. A solubilizzazione completa, si aggiungono 30 mg di dimetilamminopiridina ed una quantità catalitica di tetrabutilammonio ioduro. In un altro pallone a fondo sferico da 10 mL sotto agitazione magnetica alla temperatura di 50°C, vengono sciolti 50 mg di C6-bromo ialuronano, preparato all’esempio 6, in 2 mL di dimetilsolfossido. Il sistema viene raffreddato a temperatura ambiente ed addizionato alla soluzione di ialuronano tetrabutilammonico. Si lascia reagire a temperatura ambiente sotto blanda agitazione per 2 ore. Al sistema ottenuto si aggiungono 20 mL di acqua Milli-Q, si neutralizza con acido cloridrico e si dializza contro acqua distillata. E prodotto viene recuperato per liofilizzazione. Il prodotto disperso in soluzione acquosa rigonfia.
ESEMPIO 11 Preparazione di polisaccaride reticolato
90 mg di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 5 mL di dimetilsolfossido in un pallone a fondo sferico da 50 mL sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente, A solubilizzazione completa si aggiungono 39 mg di dimetilammino piridina ed una quantità catalitica di tetrabutilammonio ioduro. In un altro pallone a fondo sferico da 10 mL sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente, vengono sciolti 10 mg di C6-bromo ialuronano, preparato all’esempio 4, in forma acida, in 2 mL di dimetilsolfossido. Alla soluzione si aggiungono 4 mg di dimetilamminopiridina e si addiziona il tutto allo ialuronano tetrabutilammonico. Si lascia reagire a temperatura ambiente sotto blanda agitazione magnetica per 16 ore. Al sistema ottenuto si aggiungono 20 mL di acqua Milli-Q, si neutralizza con acido cloridrico e si dializza contro acqua distillata. Il prodotto viene recuperato per liofilizzazione. Il prodotto rigonfia in soluzione aquosa.
ESEMPIO 12 Preparazione di polisaccaride reticolato
90 mg di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 5 mL di dimetilsolfossido in un pallone a fondo sferico da 50 mL sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente. A solubilizzazione completa si aggiungono 39 mg di dimetilammino piridina ed una quantità catalitica di tetrabutilammonio ioduro. In un altro pallone a fondo sferico da 10 mL sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente, vengono sciolti 10 mg di C6-bromo-ialuronano, preparato all’esempio 3, in forma acida, in 2 mL di dimetilsolfossido. Alla soluzione si aggiungono 4 mg di dimetilamminopiridina e si addiziona il tutto allo ialuronano tetrabutilammonico. Si lascia reagire a temperatura ambiente sotto blanda agitazione magnetica per 16 ore. Al sistema ottenuto si aggiungono 20 mL di acqua Milli-Q, si neutralizza con acido cloridrico e si dializza contro acqua distillata. Il prodotto viene recuperato per liofilizzazione. Il prodotto ottenuto viene disperso in soluzione acquosa e rigonfia.
ESEMPIO 13 Preparazione di polisaccaride reticolato
40 mg di ialuronano tetrabutilammonico (21%) -sodico (79%) (il cui sale di sodio ha MW: 1200000) vengono sciolti in 2 mL di dimetilsolfossido in un pallone a fondo sferico sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente. A solubilizzazione completa, si aggiungono 33 mg di dimetilamminopiridina ed una quantità catalitica di tetrabutilammonio ioduro. In un altro pallone a fondo sferico da 10 mL sotto agitazione magnetica alla temperatura di 50°C, 30 mg di C6-bromo ialuronano, preparato all’esempio 6, vengono sciolti in 2 mL di dimetilsolfossido. Il sistema viene raffreddato a temperatura ambiente ed addizionato alla soluzione di ialuronano tetrabutilammonico-sodico. Si lascia reagire a temperatura ambiente sotto blanda agitazione per 16 ore. Al sistema ottenuto si aggiungono 20 mL di acqua Milli-Q, si neutralizza con acido cloridrico e si dializza contro acqua distillata. Il prodotto rigonfia in soluzione acquosa e forma un sistema ad alta viscosità.
ESEMPIO 14 Preparazione di polisaccaride reticolato
50 mg di ialuronano tetrabutilammonico (il cui sale di sodio ha MW: 100000) vengono sciolti in 2 mL di dimetilsolfossido in un pallone a tre colli sotto flusso di azoto e sotto agitazione magnetica temperatura ambiente. A solubilizzazione completa, si aggiungono 12 mg di dimetilamminopiridina ed una quantità catalitica di tetrabutilammonio ioduro. In un altro pallone a fondo sferico da 10 mL sotto agitazione magnetica alla temperatura di 50°C, vengono sciolti 50 mg di C6-bromo laminarano preparato all’esempio 7, in 2 mL di dimetilsolfossido. Al sistema si aggiungono 11 mg di dimetilamminopiridina e si addiziona il tutto alla soluzione di ialuronano tetrabutilammonico. Si lascia reagire a temperatura ambiente sotto blanda agitazione per 2 ore e 30 minuti. Si addizionano quindi altri 11 mg di dimetilamminopiridina e si lascia sotto agitazione per un'altra ora. Al sistema ottenuto si aggiungono 20 mL di acqua Milli-Q, si neutralizza con acido cloridrico e si dializza contro acqua distillata. Il prodotto viene recuperato mediante liofilizzazione. Il prodotto rigonfia in soluzione acquosa dando un sistema molto viscoso.
Claims (28)
- RIVENDICAZIONI 1. Polisaccaride regioselettivamente reticolato costituito da due polisaccaridi, dove i gruppi ossidrilici del carbonio C-6 delle unità monosaccaridiche del primo polisaccaride sono regioselettivamente esterificati con i gruppi carbossilici del secondo polisaccaride e/o con eventuali gruppi carbossilici del primo polisaccaride.
- 2. Polisaccaride secondo la rivendicazione 1 costituito da due polisaccaridi, dove i gruppi ossidrilici del carbonio C-6 delle unità monosaccaridiche del primo polisaccaride sono totalmente o parzialmente esterificati.
- 3. Polisaccaride secondo la rivendicazione 2, dove il numero dei gruppi ossidrilici esterificati è compresa tra 0.01% e 70%.
- 4. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove il primo polisaccaride è scelto nel gruppo che consiste di ialuronano, xantano, carbossimetilcellulosa con grado di sostituzione inferiore a 100%, carbossimetilchitina con grado di sostituzione inferiore a 100%, carbossimetilamilosio con grado di sostituzione inferiore a 100%, carbossimetilguar con grado di sostituzione inferiore a 100%, scleroglucano, laminarano.
- 5. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove il secondo polisaccaride è scelto nel gruppo che consiste di ialuronano, alginato, xantano, carbossimetilcellulosa, carbossimetilchitina, carbossimetilamilosio, carbossilmetilguar.
- 6. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, dove il primo polisaccaride e/o il secondo polisaccaride sono ulteriormente sostituiti.
- 7. Polisaccaride secondo la rivendicazione 6, dove il primo polisaccaride e/o il secondo polisaccaride sono ulteriormente sostituiti con farmaci o sostanze biologicamente attive.
- 8. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, dove i gruppi carbossilici non coivolti nel legame estereo sono in forma acida o di sale.
- 9. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, dove il primo polisaccaride è identico al secondo polisaccaride.
- 10. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, dove il primo polisaccaride ha peso molecolare medio pesato diverso dal secondo polisaccaride.
- 1 1. Polisaccaride secondo la rivendicazione 9-10, dove il primo polisaccaride ed il secondo polisaccaride sono ialuronano.
- 12. Polisaccaride secondo la rivendicazione 11, dove il primo polisaccaride ed il secondo polisaccaride sono ialuronano, ed il peso molecolare medio pesato del primo polisaccaride è minore di quello del secondo polisaccaride.
- 13. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12 in forma di soluzione ad alta viscosità.
- 14. Polisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12 in forma di gel.
- 15. Polisaccaride secondo la rivendicazione 14 in forma di microsfere,, fili, film.
- 16. Processo per la preparazione del polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12, che comprende i seguenti passaggi: a) ottenimento del primo polisaccaride regioselettivamente alogenato mediante attivazione dei gruppi ossidrilici del carbonio C-6 delle unità monosaccaridiche del polisaccaride; b) formazione del legame estereo tra il gruppo carbossilico del secondo polisaccaride ed il primo polisaccaride regioselettivamente alogenato ottenuto in a) mediante sostituzione degli atomi di alogeno.
- 17. Processo secondo la rivendicazione 16, dove Γ attivazione nel passaggio a) viene eseguita mediante alogenazione in solvente organico in presenza di un agente alogenante.
- 18. Processo secondo la rivendicazione 17, dove l’agente alogenante è scelto nel gruppo che consiste in: tionilbromuro, tionilcloruro, metansolfonilcloruro, metansolfonilbromuro, p-toluensolfonilcloruro, ptoluensolfonilbromuro, bis-triclorometilcarbonato, fosgene, ossalilbromuro o cloruro, eventualmente in miscela.
- 19. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16-18, dove nel passaggio b) il primo polisaccaride regioselettivamente alogenato ottenuto in a) viene sospeso in un solvente organico e messo a contatto con il secondo polisaccaride sospeso nello stesso solvente, in presenza di un agente basico.
- 20. Processo secondo la rivendicazione 19 dove il solvente organico è scelto nel gruppo che consiste in: N,N-dimetilformammide, dimetilsolfossido, N-metilpirrolidone.
- 21. Processo secondo la rivendicazione 19-20, dove l’agente basico è scelto tra basi organiche o basi inorganiche.
- 22. Medicamento comprendente il polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15.
- 23. Articolo sanitario o chirurgico comprendente il polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15.
- 24. Articolo cosmetico comprendente il polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15.
- 25. Uso del polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15 in campo farmaceutico, cosmetico, sanitario, chirurgico.
- 26. Uso del polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15 nella preparazione di fasi stazionarie per cromatografia.
- 27. Uso del polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15 nella preparazione di materiali plastici, materiali compositi, materiali per imballaggio, adesivi, vernici, additivi per industria, modificatori reologici.
- 28. Fasi stazionarie cromatografiche comprendenti il polisaccaride reticolato descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15.
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