KR20240008551A - 주사 가능한 pH-반응성 하이드로겔 - Google Patents

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정선호
김요한
정재필
호예라
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Abstract

본 발명은 pH 반응성 약물 전달을 위해 산화된 숙시노글리칸/키토산을 사용하는 주사 가능한 자가 치유/접착성 하이드로겔에 관한 것으로, 본 발명의 알데하이드를 포함한 산화된 숙시노글리칸과 양이온성 다당류인 키토산의 정전기적 이온결합 및 쉬프-염기(Schiff-base) 결합/형성을 통해 제작된 OSG/CS 하이드로겔은 쉬프-염기에 기반한 향상된 자가치유성, 주사성, 접착성 및 항균성을 나타내며, 특히, pH에 따라 가역적으로 형성되는 쉬프 염기에 의한 하이드로겔의 팽윤도 차이를 통해 약물 방출을 제어할 수 있는 효과가 있다.

Description

주사 가능한 pH-반응성 하이드로겔{Injectable pH-responsive hydrogel}
본 발명은 pH 반응성 약물 전달을 위해 산화된 숙시노글리칸/키토산을 사용하는 주사 가능한 자가 치유/접착성 하이드로겔에 관한 것이다.
하이드로겔은 구조 내에 많은 양의 수분을 흡수할 수 있는 친수성 고분자 시스템으로, 화학적 또는 물리적으로 가교 결합된 네트워크이다. 하이드로겔은 다량의 물 또는 그 밖의 생물학적 유체를 함유할 수 있는 3차원적 네트워크 구조를 가지며(Kim et al. 2015), 이들의 특성은 구성 중합체에 의해 결정된다. 이들 하이드로겔은 다양한 생물의학, 약학, 생물공학적 분야에 적용되어 왔다. 특히, 주사 주입형 하이드로겔은 의료분야에서 많은 관심을 받고 있으며, 의료용 충진제부터 약물(생체 전달 물질 포함) 전달체, 삼차원 구조를 이용한 기관/조직재생에 이르기까지 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 주사 주입형 하이드로겔은 외과적인 수술과정 없이 주사기 등을 사용하여 간단하게 생체 내에 주입될 수 있다는 장점을 가지고 있다. 일반적으로 주사 주입형 하이드로겔의 경우 체외에서는 유체와 같은 특성을 가지고 있어 주사기를 사용하여 이식이 가능하고, 체내에 주입 후에는 겔화가 일어나게 된다. 즉, 이식 후에는 약물(생체 활성 물질)의 지속적인 방출을 위한 약물전달체 또는 세포의 성장을 유지할 수 있는 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 또한 다양한 가교 방법을 도입하여 하이드로겔의 젤화 시간, 팽윤 정도, 분해 및 기계적 물성과 같은 물리화학적 특성을 조절할 수 있으며, 이러한 물리화학적 특성의 조절 가능성은 용도에 따라 하이드로겔을 약물전달 시스템이나 조직공학에 이용하는 데 큰 이점이 된다. 따라서 적당한 가교의 정도를 조절하여 원하는 물리화학적 특성을 가지는 하이드로겔을 제조하는 것이 중요하다.
최근 하이드로겔은 높은 수분 함량, 다공성 구조, 세포외 기질과의 유사성으로 인하여 높은 생체적합성을 가지면서 용해되지 않고, 많은 양의 물을 흡수할 수 있으므로, 특히 약물 전달 시스템이나 조직공학 등과 같은 바이오메디컬 분야에서 광범위하게 연구되고 있다. 약물전달체로서 하이드로겔은 주변 조직에 특정 약물 농도를 장시간 동안 지속적으로 유지시켜 줌으로써 최소한의 투여로 치료효과를 극대화시킬 수 있다. 약물 전달에 사용되는 하이드로겔은 일반적으로 체외에서 형성되며 체내로 주입하기 전에 약물과 혼합하나, 겔의 특성상 주사를 통한 주입이 어렵고, 겔을 외부에서 형성하여 체내로 이식하여야 하며, 이식된 하이드로겔의 완전한 생분해를 유도하는 것 또한 어려운 문제가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 주사 주입이 용이하고, 체내에 주입 후에도 약물 방출을 조절할 수 있는 제형 개발에 많은 연구가 진행되고 있으나, 아직은 미비한 실정이다.
한편, 키토산(alginate)은 생체 적합성(biocompatibility), 생분해성(biodegradability) 및 저 가격성으로 인해 우수한 천연 하이드로겔 원료 물질 중의 하나이다. 키토산은 β-(1→4) 연결 D-글루코사민(탈 아세틸화 단위)과 N-아세틸-D-글루코사민(아세틸화 단위)으로 구성된 선형 다당류이며, 새우를 비롯한 갑각류의 키틴 껍데기를 수산화나트륨과 같은 알칼리성 물질로 처리하여 만든다. 키토산은 의료용으로 출혈을 줄이는 용도, 항균제 용도 및 피부를 통해 약물을 전달하는 용도로도 사용되어 왔다. 이러한 키토산 하이드로겔의 합성은 이온성 가교 결합제(ionic cross-linker)로서 작용하는 2가 양이온의 존재 하에서 일어나나, 자연적인 이온 방출에 의해 기계적 강도를 쉽게 잃는 문제가 있고, 기계적 성질이 장기간 유지될 수 있는, 공유 결합(covalent bond)으로 가교된 하이드로겔의 제작은 키토산 자체의 낮은 용해도로 인해 키토산의 유도체화 또는 산성 용매를 직접 사용하는 방법으로만 이루어져 왔다.
본 발명의 목적은 pH 감응성 항균 하이드로겔을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 하이드로겔을 포함하는 약물전달체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상처 드레싱 제재를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 조직 공학용 지지체를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 pH 감응성 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 산화된 숙시노글리칸 및 키토산이 가교 결합된 하이드로겔을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 및 약물을 포함하는 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 또는 약물전달체를 포함하는 항균 조성물, 조직 지지체 조성물, 필러 조성물, 유착 방지용 조성물, 약물 전달용 담체, 조직 공학용 지지체, 상처 드레싱 제재, 3D 프린팅 조성물 또는 바이오잉크를 제공한다.
아울러, 본 발명은 pH 감응성 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 Sinorhizobium meliloti 1021에서 분리한 숙시노글리칸을 산화시켜 알데하이드를 포함한 산화된 숙시노글리칸을 합성한 후, 양이온성 다당류인 키토산과 정전기적 이온결합 및 쉬프-염기(Schiff-base) 결합/형성을 통해 하이드로겔을 합성하였으며, 이렇게 제작된 OSG/CS 하이드로겔은 쉬프-염기에 기반한 향상된 자가치유성, 주사성, 접착성 및 항균성을 나타내며, 특히, pH에 따라 가역적으로 형성되는 쉬프 염기에 의한 하이드로겔의 팽윤도 차이를 통해 약물 방출을 제어할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 OSG/CS 하이드로겔의 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 OSG/CS 하이드로겔의 SG 및 OSG 몰비에 따른 특성을 확인한 도이다:
a: SG 및 OSG의 FTIR 스펙트럼(spectra) 특성;
b: 다양한 SG/OSG 몰비의 OSG/CS 하이드로겔 및 CS의 FTIR 스펙트럼 특성;
c: 다양한 SG/OSG 몰비의 OSG/CS 하이드로겔 및 CS의 DSC 스펙트럼 특성; 및
d: 다양한 SG/OSG 몰비의 OSG/CS 하이드로겔 및 CS의 TGA 스펙트럼 특성.
도 3은 SG/CS 하이드로겔의 유변학적 특성을 확인한 도이다:
a: 0.5% 변형률에서 각 주파수(angular frequency)(0.1 내지 100 rad/s)에 대한 저장 계수(storage modulus) (G') 및 손실 계수(loss modulus) (G")의 변화;
b: 일정한 각 주파수 (1 Hz)에서 변형 진폭(strain amplitude) (R = 0.1% 내지 400%)에 대한 저장 계수 (G') 및 손실 계수 (G")의 변화;
c: 압축 응력-변형률(Compressive stress-strain) 곡선; 및
d: 다양한 SG/OSG 몰비의 OSG/CS 하이드로겔의 압축 계수.
도 4는 OSG/CS 하이드로겔의 자가-치유 및 인장 특성을 확인한 도이다:
a: 5 mm/min의 인장 속도에서 자르지 않은 OSG/CS 하이드로겔에서 발생한 신장(Stretching);
b: 5 mm/min의 인장 속도에서 자르고 12 h 동안 치유된 OSG/CS 하이드로겔에서 발생한 신장;
c: 1 Hz 주파수에서 100초 동안 0.5% 내지 50초 동안 500%로 변형률이 3회 전환된 주기적 연속 단계 변형률(cyclic continuous step strain)에서 OSG/CS 하이드로겔;
d: 1 내지 100 s-1의 전단 속도(shear rate)에 대한 OSG/CS 하이드로겔의 점도; 및
e: OSG/CS 하이드로겔의 주사성.
도 5는 1 Hz 주파수에서 100초 동안 0.5% 내지 50초 동안 500%로 변형률이 3회 전환된 OSG/CS 하이드로겔의 주기적 연속 단계 변형률 (cyclic continuous step strain)을 확인한 도이다.
도 6은 OSG/CS 하이드로겔의 접착 특성을 확인한 도이다:
a: 손가락 끝 및 관절에서 OSG/CS 하이드로겔의 접착력;
b: OSG/CS 하이드로겔의 몰비 (OSG:CS_1:3, OSG:CS_1:2, OSG:CS_1:1, OSG:CS_2:1 및 OSG:CS_3:1)에 따른 접착력; 및
c: OSG/CS 하이드로겔의 접착 메커니즘.
도 7은 OSG/CS 하이드로겔의 항균 특성을 확인한 도이다:
a: 중량 10 mg, 20 mg 또는 40 mg의 OSG/CS 하이드로겔 (OSG:CS_1:3의 몰비)의 대장균 및 황색포도상구균에 대한 항균 효과;
b: 중량 10 mg, 20 mg 또는 40 mg의 OSG/CS 하이드로겔 (OSG:CS_1:1의 몰비)의 대장균 및 황색포도상구균에 대한 항균 효과;
c: 중량 10 mg, 20 mg 또는 40 mg의 OSG/CS 하이드로겔 (OSG:CS_3:1의 몰비)의 대장균 및 황색포도상구균에 대한 항균 효과; 및
d: 총 중량 (10 mg, 20 mg 또는 40 mg)에 따른 OSG/CS 하이드로겔 (OSG:CS_1:3, OSG:CS_1:1 및 OSG:CS_3:1의 몰비)의 항균능 (%).
도 8은 OSG/CS 하이드로겔의 형태학적 특성을 FE-SEM로 확인한 도이다:
a: OSG:CS_1:3 몰비의 OSG/CS 하이드로겔의 단면 표면 이미지;
b: OSG:CS_1:2 몰비의 OSG/CS 하이드로겔의 단면 표면 이미지;
c: OSG:CS_1:1 몰비의 OSG/CS 하이드로겔의 단면 표면 이미지;
d: OSG:CS_2:1 몰비의 OSG/CS 하이드로겔의 단면 표면 이미지; 및
e: OSG:CS_3:1 몰비의 OSG/CS 하이드로겔의 단면 표면 이미지.
도 9는 OSG/CS 하이드로겔의 팽윤능 및 약물 방출능을 확인한 도이다:
a: pH 7.4에서 OSG/CS 하이드로겔의 팽윤능;
b: pH 2.0에서 OSG/CS 하이드로겔의 팽윤능;
c: pH 7.4 또는 2.0에서 방출된 5-FU(5-fluorouracil)의 누적량 (%); 및
d: 6 h 후 pH 변화 (pH 7.4에서 2.0로)에 의한 5-FU의 제어 방출 (%).
도 10은 OSG/CS 하이드로겔의 분해능을 확인한 도이다.
도 11은 OSG/CS 하이드로겔의 용해 후 용해 간섭을 확인한 도이다.
도 12는 OSG/CS 하이드로겔의 세포 독성 (a) 및 세포 증식율 (b)을 확인한 도이다.
도 13은 약물 탑재 하이드로겔의 약물 방출 효과를 확인한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
일 측면에서, 본 발명은 산화된 숙시노글리칸 (oxidized succinoglycan, OSG) 및 키토산 (chitosan, CS)이 가교 결합(Cross-link)된 하이드로겔 (OSG/CS)에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔 (OSG/CS)은 OSG 및 CS 간에 쉬프 염기가 형성(Schiff base formation)되어 가교 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 망상 구조를 이뤄 다공성일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 산화된 숙시노글리칸 및 키토산이 1:4 내지 4:1의 몰비로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 주사제형 하이드로겔일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 pH 감응형 약물 담지 하이드로겔일 수 있으며, pH 1 내지 3에서 선택적인 약물 방출이 가능할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 키토산 하이드로겔에 비해 열 안정성이 증가될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 자가-치유 특성을 가질 수 있으며, 하기 수학식 1로 표시되는 자가-치유 능력이 90 % 이상일 수 있다:
[수학식 1]
f = ε / ε0
(ε: 자가-치유된 시료의 파괴 변형률(fracture strain); 및 ε0: 초기 하이드로겔의 파괴 변형률).
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 접착성 및 신축성을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 5 내지 1000μ m의 기공 크기를 가질 수 있으며, 하이드로겔 제작시 OSG의 농도를 조절하여 기공 크기를 조절할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔은 산화된 숙시노글리칸 및 키토산의 몰비에 따라 하기 표 1의 물리적 특성 (도 3b에 따른 저장 계수, 도 3c에 따른 압축 강도, 도 3d에 따른 압축 계수, 도 4a에 따른 인장 강도, 도 4b에 따른 자가-치유 효율, 도 4c 및 도 5에 따른 자가-치유 능력, 도 5b에 따른 접착성 및 도 8a에 따른 팽윤도)을 가질 수 있다.
OSG:CS 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1
저장 계수 (Pa) 155 434 925 550 487
압축 강도 (kPa) 45.8 86.7 173.2 117.4 107.7
압축 계수 (kPa) 361 695 1444 974 899
인장강도 (kPa) 2.67 3.93 5.89 5.18 4.56
자가 -치유 효율 (%) 95.31 96.07 98.82 93.11 93.01
자가 -치유 능력 (%) 51.26 36.52 99.89 64.01 56.63
접착성 (Pa) 2131±292 2334±288 2621±270 2763±274 2444±290
팽윤도 (%) 1662.16 1488.43 887.03 1080.46 1285.74
본 발명의 하이드로겔은 이의 주사성, 자가치유성 및 접착성을 기반으로 하는 다양한 타입의 제형으로 이용될 수 있으며, 일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 의 제형은 경구, 주사, 시트, 상처 드레싱, 세포 배양 지지체, 조직 지지체, 연조직 대체물, 의료용 충진제 또는 체내 주입형 지지체 제형일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 항균성일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "가교 결합(cross-link)"은 물리적 가교방식과 화학적 가교방식을 지칭할 수 있다. 같은 고분자를 사용하더라도 가교방식에 따라 전혀 다른 특성의 하이드로겔이 얻어질 수 있다. 물리적 가교방식은 이온결합, 수소결합, 반데르 발스 힘, 소수성 상호작용, 고분자의 결정에 의한 가역적 가교방식을 말한다. 화학적 가교방식은 공유결합에 의한 비가역적 가교방식을 말하고, 물리적 가교방식보다 안정적인 가교 구조를 형성한다. 일 실시예에 따르면, 상기 가교는 쉬프 염기의 형성으로 인한 화학적 결합(공유결합)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "하이드로겔"은 수화겔 또는 수화젤이라고도 하고, 3 차원적 가교를 형성하고 있는 친수성 고분자 망상구조로서, 높은 수분함량을 가져 천연 조직과 거의 유사한 탄성을 나타낸다. 또한, 수상 환경에서 용해되지 않고, 다양한 고분자로부터 만들어질 수 있기 때문에 여러 가지 화학적 조성과 물성을 갖는다. 또한 가공이 용이하여, 응용에 따라 다양한 형태로 변형할 수 있다. 하이드로겔은 높은 함수율(water content)과 세포 외 기질(extracellular matrix)과의 물리화학적 유사성으로 인하여 높은 생체적합성을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "저장 계수 (storage modulus (G'))"와 손실 계수 (loss moduli (G")는 유변학적(rheological) 반복 전단 측정을 통해 측정되며 하이드로겔의 탄성 성분과 점성 성분을 각각 나타내는 것으로, 이를 통해 겔 형성 과정에서 가교 반응 속도 (G'와 G "가 만나는 시점) 및 가교 비율(전체 고분자 용액에서 겔로 가교된 부분의 비율 (G' 대 G")을 측정할 수 있다. 또한, 저장 계수가 클수록 반복 전단 조건 하에서 탄력적이고 부러지기 어려움을 나타낸다.
본 발명의 하이드로겔은 생체에 무해한 탄수화물소재인 숙시노글리칸 및 키토산을 주성분으로 이용하여 합성한 소재이며, 세포독성이 없고 주사성, 자가치유성, 접착성 및 항균성을 가지기 때문에 상처치료제, 약물전달 (특히, 주사성 약물전달), 약물제제, 조직공학 분야에 응용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔을 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항균 조성물을 포함하는 항균 제품에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 항균 제품은 층 (layer), 필름, 매트 (mat), 상처 드레싱제 또는 조직 스캐폴드를 포함하는 군으로부터 선택되는 형태일 수 있으며, 항균 부직포, 항균 습윤밴드, 드레싱, 연골조직 또는 콘텍트렌즈로 사용될 수 있고, 상처 치유 장치 또는 외용 (external use) 또는 내용 (internal use) 패치에 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔 및 약물을 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 약물이 상기 하이드로겔에 담지될 수 있으며, pH 1 내지 4의 조건에서 선택적인 약물 방출이 가능한 pH 감응성/반응성 약물전달체일 수 있다.
일 구현예에서, 약물은 조영제, 나노입자, 항체, 항체 단편, DNA, RNA 또는 SiRNA를 포함하는 핵산, 펩타이드, 유전자, 단백질, 세포 및 화합물 (chemical compound)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 단백질은 인슐린, 성장인자, 항체일 수 있으며, 상기 화합물은 항암제, 항생제, 소염제, 진통제, 상피재생 촉진제, 마취제, 지혈제, 항균제, 항세균제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, 항산화제, 방부제, 항히스타민제, 진양제, 해열제, 면역자극제, 피부과용 제제일 수 있고, 상기 세포는 줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 약물은 전세포사멸성(pro-apoptotic) 펩타이드, 면역원성 세포사멸 유도제 또는 항암제일 수 있으며, 전세포사멸성 펩타이드는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, Brevenin-2R, 부포린 IIb(Buforin IIb), 세크로핀 A-마가이닌 2(cecropin A-Magainin 2, CA-MA-2), 세크로핀 A(Cecropin A), 세크로핀 B(Cecropin B), 크리소피신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(Gomesin), 락토페리신 B(Lactoferricin B), LLL27, LTX-315, 마가이닌 2(Magainin 2), 마가이닌 II-봄패신 결합체(Magainin II-bombesin conjugate, MG2B), 파르닥신(Pardaxin) 또는 이들의 조합일 수 있고, 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 또는 이들의 조합일 수 있으며, 항암제는 세포독성 항암제일 수 있으며, 5-FU(5-fluorouracil), 독소루비신(doxorubisin), 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신 (erythromycin), 빈블라스틴 (vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신 (idarubicin), 미톡산트론 (mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 엔티노스테트(Entinostat), 크라드리빈(Cladribine), 프랄라트렉세이트(Pralatrexate), 로라티닙(Lorlatinib), 메이탄시네 DM1(Maytansine DM1), 메이탄시네 DM3(Maytansine DM3), 메이탄시네 DM4(Maytansine DM4) 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, 약물은 인슐린, 프레드니솔론 21-아세테이트(prednisolone 21-acetate), 레티노익 산(retinoic acid), 시스플라틴(cis-platin), 캄토세신(camptothecin), 도세탁셀(Docetaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(anasterozole), 토포테칸(topotecan), 글리벡(gleevec), 빈크리스틴(vincristine), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 덱사메타손(dexamethasone), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone), 코르티코스테로이드(corticosteroid), α-리포산(α-lipoic acid), α-토코페롤(α-Tocopherol), 레티노이트(Retinoids) 또는 글루타치온(Glutathione)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "약물"은 약학분야에서의 약물전달목적 또는 조직공학분야에서의 인공조직 이식을 위한 조직재생 목적에 사용되는 것일 수 있다. 또한 친수성 약물에 한정되지 않고 소수성 내부 공동(cavity)를 갖는 분자구조를 도입하여 소수성 약물을 탑재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "약물 전달(drug delivery)"은 원하는 약리효과를 발생시킬 목적으로 약리적 활성성분의 약제학적 유효량을 생체 내로 전달하는 것을 의미한다.
일 실시예에 따르면, 하이드로겔 내 약물방출 거동(drug release behavior)은 pH 변화에 따라 쉬프 염기의 가교가 변화하고, 이에 따라 약물 방출 속도가 제어(조절)될 수 있었다. 따라서, 상기 pH를 조절함으로써, 약물 방출 거동을 세부적으로 조절할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔 또는 약물전달체를 포함하는 조직 지지체 조성물 또는 조직 공학용 지지체에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔 또는 약물전달체를 포함하는 필러 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔 또는 약물전달체를 포함하는 유착 방지용 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔 또는 약물전달체를 포함하는 약물 전달용 담체에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔 또는 약물전달체를 포함하는 3D 프린팅 조성물 또는 바이오잉크에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔 또는 약물전달체를 포함하는 상처 드레싱 제재에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 숙시노글리칸(succinoglycan, SG)을 산화시켜 산화된 숙시노글리칸을 제작하는 단계; b) 산화된 숙시노글리칸에 키토산을 첨가하는 단계; 및 c) 산성 증기에 노출시키는 단계를 포함하는 pH 감응성 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 산성 증기는 아세트산 증기(acetic acid atmosphere)일 수 있으며, 이를 통해 종래의 산성 용매를 직접 사용하여 키토산을 녹이는 방법에서 낮은 pH로 인해 쉬프 염기가 형성되지 않는 한계점을 극복할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 방법은 키토산을 이용한 하이드로겔 중에서 최초로 산성 용매의 직접 사용 또는 화학적 유도체화를 거치지 않고 산성 증기에 노출시킴으로써 쉬프-염기를 형성할 수 있는 방법이다.
일 구현예에서, pH 감응성 하이드로겔은 겔 형태이면서도 주사 가능한 주사제형일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. OSG/CS 하이드로겔 제작
1-1. OSG 제작
S. meliloti Rm1021을 GMS 배지 (pH 7)에서 30 ℃로 7일 동안 180 rpm로 교반 배양한 후, 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 엑소폴리사카라이드인 SG(succinoglycan)를 수집한 뒤, 48시간 동안 투석 (MWCO: 12-14 kDa)하였다. 침전된 SG (1.0 g, 0.66 mmol)를 60 ℃에서 증류수 90 ml에 완전히 녹이고 과요오드산나트륨(sodium periodate) (0.72 g, 3.3 mmol) 용액 10 ml을 SG 용액에 첨가하고 암조건으로 2 h 동안 교반하였다. 그 후, 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol) 0.2 ml을 첨가하여 반응을 종료시키고, 증류수를 반복적으로 교체하면서 36 h 동안 반응 혼합물을 투석 (MWCO 12-14 kDa)하여 OSG(Oxidized succinoglycan dialdehyde)를 제작하였다. OSG의 산화도는 요오드 적정법(iodometric titration method) (Gomez, Rinaudo, & Villar, 2007)을 이용하여 확인하였다.
1-2. OSG/CS 하이드로겔 합성
OSG 및 CS(Chitosan)의 혼합 질량비에 따른 하이드로겔 특성을 확인하기 위해, 하기 표 2의 다양한 질량비로 일련의 OSG/CS를 준비하고, 탈이온수 (0.5 ml)에 OSG 10 mg을 녹여 제조한 OSG 용액 (2%, w/v)에 순수한 CS 용액 (2% w/v)을 첨가하여 상온에서 6 h 동안 교반함으로써 슬러리 용액을 형성하였다. 그 후, 슬러리 용액을 5 ml 바이알에 붓고 500 ml 비이커에 위치시켰다 (도 1). 그 후 슬러리 용액이 하이드로겔로 완전히 전환될 때까지 (3 h) 아세트산 증기 상태(acetic acid atmosphere)에 노출시켰다. 이 후, 합성된 OSG/CS 하이드로겔을 탈이온수로 완전히 세척하여 아세트산 잔기들을 제거하고 -76 ℃에서 6 h 동안 동결한 뒤 동결건조하였다.
OSG/CS OSG:CS_1:3 OSG:CS_1:2 OSG:CS_1:1 OSG:CS_1:2 OSG:CS_3:1
2% OSG 0.25 ml 0.33 ml 0.5 ml 0.67 ml 0.75 ml
2% CS 0.75 ml 0.67 ml 0.5 ml 0.33 ml 0.25 ml
실시예 2. OSG/CS 하이드로겔의 몰비에 따른 특성 확인
상기 실시예 1에서 합성한 OSG/CS 하이드로겔의 합성을 검증하고 특성을 확인하기 위해, 500 MHz Bruker Avance spectrometer (Bruker, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 NMR(Nuclear magnetic resonance) 스펙트라(spectra)를 확인하였으며, DSC 7020 (SEICO INST.)를 이용하여 DSC(Differential scanning calorimetry) 분석을 25-200 ℃에서 10 ℃/min의 스캐닝 속도로 수행하였고, 2000-600 cm-1의 파장수에서 FTIR spectrometer ATR mode (0.1 cm-1 resolution, Spectrum Two, Perkin Elmer, USA)로 FTIR(Fourier transform infrared) 스펙트럼을 얻었으며, 건조된 시료의 중량 손실을 질소하에 20 내지 600 ℃에서 10 ℃/min의 속도로 Q20 (TA-Instruments, USA)로 모니터링하여 TGA(Thermal gravimetric analysis)를 측정하였다.
OSG/CS 하이드로겔은 아민 또는 알데하이드기를 가진 두 개의 다당류를 이용하여 쉬프 염기(Schiff base) 및 정전기 상호작용을 통해 제작되었으며 (도 1), 특히, SG에서 5개의 단당류가 산화되어 OSG에서 10개의 알데하이드기를 생성할 수 있었다. 요오드 적정법으로 측정된 OGS (1543.41 g/mol)의 산화도는 90.7%로 나타났으며, 이는 5.87 mmol/g의 OSG 알데하이드 함량으로 계산될 수 있다. CS (340.15 g/mol)는 반복 단위의 두 개의 아민을 가지며, 이는 CS 아민 함량 (5.87 mmol/g)으로 전환될 수 있다. 1H NMR 분석을 통해 OSG의 구조를 확인하였으며, SG는 반복되는 팔당류(octasaccharide) 단위에 숙시닐기(succinyl groups), 아세틸기 및 피루베이트기를 포함하였다. 이러한 특징적인 작용기의 양성자 피크(proton peak)가 1H NMR 스펙트럼에서 나타나, OSG가 과요오드산염 산화(periodate oxidation)에 의해 알데하이드-함유 다당류(polysaccharide)로서 성공적으로 합성되었음을 검증하였다. 또한, FTIR 분석을 통해 OSG로 알데하이드기가 도입되었음을 확인하였다 (도 2a). OSG의 FTIR 스펙트럼은 헤미아세탈 결합 형성으로 인해 894.5 cm-1에서 피크로 나타났으며, 과요오드산염 산화 후 아세틸기의 카보닐 에스터의 C = O 신축 영역에서 1724 cm-1에서 1728 cm-1로의 피크 이동이 관찰되었다. 또한, OSG와 OSG/CS 하이드로겔의 FTIR 스펙트라를 비교한 결과, 흡수 피크가 1626 및 1375 cm-1에서 1629 및 1372 cm-1로 이동하였으며, 이와 같은 피크 이동이 900-1100 cm-1 영역에서도 관찰되어, OSG의 카르복실기와 CS 양이온 사이에 상호작용이 발생했고, OSG/CS 하이드로겔 네트워크에서 아민기, 카르복실 및 하이드록실기의 분자 상호작용에 의해 피크 이동이 유도되고 쉬프 염기 형성으로 인해 피크 강도의 차이가 발생하는 것을 알 수 있었다 (도 2b). OSG/CS의 쉬프 염기 (이민 결합, C = N)가 1643 및 1456 cm-1에서 관찰되었고, OSG/CS에 존재하는 숙시네이트 및 아세테이트의 비대칭 -COO- (1629 cm-1) 신축 진동과 겹쳐, OSG/CS에서 C = N의 숄더 피크가 FTIR 스펙트럼에서 거의 관찰되지 않았다. 대신, 다른 CN 피크가 1456 cm-1에서 관찰되었으나, 피크의 강도(intensity)가 OSG/CS 몰비(molar ratio)에 따라 다르게 나타났다. 특히, 5개의 피크들 (inset) 중 1:1의 OSG:CS에서 가장 높은 값이 나타나, OSG/CS의 1:1 몰비가 pH-반응성을 결정하는 쉬프 염기 형성에 최적화된 조건임을 확인하였다. 또한, DSC 분석을 통해, 하이드로겔 네트워크가 증가된 열 안정성을 가지는 것을 확인하였으며 (도 2c), OSG/CS의 하이드로겔 네트워크의 열 안정성에 대한 OSG의 이러한 기여가 정전기 인력(electrostatic attractions), 수소 결합 및 반데르발스 결합(van der Waals interaction)과 같은 강력한 분자 상호작용에 의한 것임을 확인하였다. 또한, OSG/CS의 용융 온도 (Tm)를 TGA로 확인하고 CS의 값과 비교한 결과, 용융 온도 및 열 안정성을 나타내는 2차 질량 감소값은 OSG/CS는 287.68 내지 410.14 ℃에서 82.5%로 나타났으나, CS는 181.25-438.02 ℃에서 76.14%로 나타나, OSG/CS가 CS보다 더 나은 열 안정성을 가지는 것을 확인하였다 (도 2d). 따라서, 하이드로겔 네트워크에 OSG를 적용하면 OSG/CS의 열 안정성을 효율적으로 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 유변학적 분석을 통한 기계적 특성 확인
3-1. 점탄성 및 유연성
상기 실시예 1에서 합성한 OSG/CS 하이드로겔의 OSG:CS의 몰비에 따른 유변학적 특성을 확인하기 위해, OSG/CS의 점탄성 특성을 DHR-2 rheometer (TA-Instruments, USA)로 확인하였다. 각 주파수(angular frequency)는 0.1 내지 100 rad/s의 범위에서 0.5%의 변형률(strain)으로 스위프(sweep)되었으며, 진폭 스위프 변형률은 1 Hz의 각 주파수에서 0.1% 내지 1000%의 범위에서 측정되었다. OSG/CS의 유변학적 회복(rheological recovery)도 각 주파수 1 Hz에서 대체 스위프 변형 시험(alternate sweep strain test)으로 측정되었다. 변형 진폭(strain amplitude)은 100초 동안 0.5%의 고정된 변형률 및 50초 동안 1000%의 고정된 변형률 사이에서 반복적으로 변경되었다.
OSG:CS의 몰비에 따른 OSG/CS 유변학적 특성을 확인한 결과, 대부분의 주파수 및 변형률에 대해 모든 OSG/CS의 G' 값이 G" 값보다 높게 나타나, 하이드로겔 네트워크가 잘 구조화된 것을 확인하였다 (도 3a). 또한, OSG:CS_1:1가 하이드로겔 합성 과정에 대부분의 쉬프 염기 결합이 1:1 몰비 (알데하이드:아민)로 형성되어 G' 값이 가장 높았다. 또한, 유변학적 측정에서 G' 및 G"의 교차점(crossover points)을 비교하여 하이드로겔 네트워트의 유연성을 확인한 결과, G' 및 G"의 교차가 변동률 27.35% (OSG:CS_1:2), 47.55% (OSG:CS_1:1) 및 80.94% (OSG:CS_1:3)에서 관찰되었다 (도 3b). OSG:CS_1:1의 교차점 (변동률)은 OSG:CS_1:2 및 OSG:CS_1:3 사이의 중간값으로 나타나, OSG:CS_1:1가 적절한 물리적 강도를 유지하면서 유연성이 있는 CS-기반 하이드로겔의 조건으로 적합한 것을 확인하였다.
3-2. 기계적 강도
OSG/CS의 향상된 기계적 특성을 확인하기 위해, Micro-fatigue Tester E3000LT (Instron Inc., USA)를 이용하여 압축 시험을 수행하였다. 구체적으로, OSG/CS 하이드로겔을 높이 10 mm 및 직경 20 mm로 준비하고 10 mm/min의 속도에서 60%의 변형률로 압축 시험을 수행하였다. 또한, 50 내지 60% 변형률 범위에서 선형 회귀의 기울기로부터 압축 계수(compressive modulus)를 결정하였다 (도 3c).
그 결과, OSG:CS의 다양한 몰비에 따라 압축 응력(compressive stresses)이 다양하게 나타났으며, OSG:CS_1:1인 하이드로겔에서 가장 강한 압축 응력이 나타났고 (60% 변형률에서 173 kPa), OSG:CS_2:1, OSG:CS_3:1, OSG:CS_1:2 및 OSG:CS_1:3가 그 뒤를 이었다 (도 3a). 또한, 가장 높은 압축 계수를 나타낸 OSG/CS 하이드로겔은 OSG:CS_1:1이며 392 kPa에서 1444 kPa로 약 4배에 가깝게 나타났다 (도 3d).
따라서, OSG:CS가 1:1의 몰비를 가지는 하이드로겔이 기계적 특성 향상에 최적인 조건임을 확인하였다.
실시예 4. 신축성 및 자가치유능 확인
4-1. 신축성 확인
OSG/CS 하이드로겔의 신축성(stretchability) 특성을 평가하기 위해 Micro-fatigue Tester E3000LT (Instron Inc., USA)를 이용하여 인장 시험(tensile testing)을 수행하였다. 다양한 몰비로 제작된 OSG/CS를 실린더 형태로 성형 (길이 8cm, 직경 0.4 cm 및 10 min-1의 신장율)하고 인장 강도를 확인하였다.
신축성을 확인한 결과, OSG:CS_1:1는 210.81%까지 늘어나며 5.89 kPa의 가장 높은 인장 강도를 나타냈다 (도 4a).
4-2. 자가-치유능 확인
OSG/CS 하이드로겔의 자가-치유(self-healing) 특성을 평가하기 위해 Micro-fatigue Tester E3000LT (Instron Inc., USA)를 이용하여 인장 시험(tensile testing)을 수행하였다. 다양한 몰비로 제작된 OSG/CS를 두 개의 조각으로 절단하고 24시간 동안 다시 결합시켜 자가-치유능을 확인하였다. 또한, 자가-치유 특성을 정량 분석하기 위해, 자가-치유 효율 (f)를 하기 수학식 1로 계산하였다. 아울러, OSG/CS의 자가-치유능을 변형률 진폭 스위프 시험(strain amplitude sweep test)으로 평가하였다.
ε: 자가-치유된 시료의 파괴 변형률(fracture strain); 및
ε0: 초기 하이드로겔의 파괴 변형률.
자가-치유능을 확인한 결과, OSG:CS_1:1의 경우 대부분 치유되어 208.33%의 변형률을 나타냈다. 또한, 자가-치유 특성을 정량 분석한 결과, 절단 24시간 후 OSG:CS_1:3, OSG:CS_1:2, OSG:CS_1:1, OSG:CS_2:1 및 OSG:CS_3:1의 각 f 값은 95.31%, 96.07%, 98.82%, 93.11% 및 93.01%로 나타났다 (도 4b). 아울러, 변형률 진폭 스위프 시험으로 OSG/CS를 1 Hz 주파수에서 100초 동안 0.5%에서 50초 동안 500%로 변형률을 3회 전환하는 주기적 연속 단계 변형률을 측정한 결과, 50초 동안 500% 변형률을 적용한 후, 100초 동안 0.5% 변형률을 적용했을 때 OSG/CS가 네트워크를 복원하는 것으로 나타났다 (도 5). G' 값 및 G" 값은 500% 변형률에서 역전되어 겔에서 졸 상태 전이가 발생했음을 나타냈다. 또한, OSG/CS의 G' 및 G"의 패턴이 회복되었고, 낮은 변형률에서는 하이드로겔을 문지르면 폴리머 체인들이 얽히기 때문에 쉬프 염기의 재구성이 발생할 수 있다 (도 4c). 이러한 3 주기까지의 반복적인 복구 특성은 99.89%의 자가-치유 능력을 시사한다. 이와 이전 데이터 (도 3) 및 주기적 연속 단계 변형률 결과를 통합하면, OSG/CS의 몰비를 조절하여 OSG/CS의 기계적 강도 및 자가-치유능을 조절할 수 있음을 알 수 있다.
4-3. 주사성 확인
주사 가능한 하이드로겔은 가해진 변형(deformation)이 제거되면 겔 상태로 빠르게 자가-치유되므로, 일반적으로 주사 가능성을 확인하기 위해 겔-졸 전환의 변형점(strain point)이 유변학적 측정에 의해 선행된다. 변형률이 약 100%일 때, OSG/CS의 모든 G' 및 G" 커브의 교차점이 관찰되어, 하이드로겔 네트워크의 붕괴로 인해 OSG/CS가 졸 상태로 전이되었음을 알 수 있다 (도 3b). 겔에서 졸로의 전이가 달성되기 위해서는 상대적으로 낮은 변형률이 필요하였으며, 이는 OSG/CS가 쉽게 주사될 수 있음을 나타낸다. 또한, 유변학적 데이터로 하이드로겔의 주사성을 평가하기 위한 중요한 인자는 하이드로겔의 전단박하(shear-thinning) 여부이므로, OSG/CS의 전단박하 및 주사성을 확인하기 위해 1 내지 100 s-1의 전단 속도(shear rate)에 대한 점도를 측정한 결과, 전단력(shear force)이 적용되었을 때 전단박하되는 하이드로겔에서 점도가 감소하는 것으로 나타났다. 일반적으로 주사 가능한 하이드로겔의 점도는 전단 속도 1-100 s-1에서 100 Pa·s이하로 떨어지는 경향이 있고, OSG/CS의 점도는 전단 속도가 100 s-1로 증가함에 따라 크게 감소하는 것으로 나타났다 (도 4d). 주사 가능한 하이드로겔의 필수적인 요건은 주사 바늘을 통과하여 전단박하되는 특성(거동)이며 본 발명의 OSG/CS가 이와 같은 특성을 가지는 것을 확인하였다 (도 4e). 이를 통해, 하이드로겔의 자가-치유 특성이 하이드로겔의 주사성에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 접착성 및 항균 효과 확인
5-1. 접착능 확인
조직에 부착되어 감염으로부터 상처를 보호하여 상처 치유 및 봉합(closure)에 중요한 특성인 접착능을 확인하기 위해, 본 발명의 OSG/CS 하이드로겔을 두 개의 원반 모양으로 성형하여 손가락 끝 및 관절에 각각 부착한 뒤 이의 접착성을 확인하였다. 또한, 접착 특성을 정량화하기 위해, 랩-전단(lap-shear) 시험으로 접착 강도를 평가하였다. 구체적으로, 시판되는 신선한 돼지 가죽을 세척하고 4 × 4 cm의 크기로 잘라 2개 준비한 뒤, 2 × 2 × 0.5 cm 크기의 OSG/CS 하이드로겔을 2 장의 돼지 가죽 사이에 끼우고 상온에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 이 때, 돼지 가죽과 OSG/CS 하이드로겔의 접촉 면적은 2 × 2 cm였다. 랩-전단 시험은 5 mm/min의 속도로 수행되었으며, 접착 강도는 최대 하중을 접촉 면적으로 나눠 계산하였다.
본 발명의 OSG/CS 하이드로겔은 손가락 끝 및 관절에 부착시 우수한 접착력을 나타냈으며, 손가락 관절을 90°로 접었을 때도 단단하게 부착되어 있었다 (도 6a). 또한, 접착 강도를 정량한 결과, OSG/CS 하이드로겔의 접착 강도는 2131 ± 292 Pa에서 2763 ± 274 Pa로 다양하게 나타나, OSG/CS 하이드로겔이 상처 봉합 및 치유에 충분한 접착 특성을 가지는 것을 확인하였다 (도 6b). 아울러, OSG:CS_2:1가 OSG:CS_1:1보다 접착 강도가 높은 것으로 나타났다 (도 6b). 이러한 접착 특성의 메커니즘은 OSC/CS의 잔류 카르복실기 및 자유 알데하이드기가 피부 표면의 아민기 및 티올기와 더 많은 수소결합 및 이민 결합을 형성하는 것에 의한 것이다 (도 6c).
5-2. 항균능 확인
본 발명의 OSG/CS 하이드로겔의 항균 특성을 확인하기 위해, 그람 (-) 박테리아로서 대장균(E. coli) 및 그람 (+) 박테리아로서 황색포도상구균(S. aureus)을 이용하였다. 구체적으로, 높이 10mm 및 직경 20mm의 OSG/CS 하이드로겔을 박테리아 액체 (105 CFU/ml)를 포함하는 LB 아가 플레이트의 중앙에 위치시키고 37 ℃에서 24 h 동안 인큐베이션하여 하이드로겔 주변의 박테리아 사멸 정도를 육안으로 확인하였다. 또한, OSG/CS 하이드로겔의 항균능을 광학 밀도로 측정하기 위해, OSG/CS 하이드로겔을 5ml의 박테리아 현탁액 (3 × 104 CFU/ml)에 침지하고 37 ℃에서 24 h 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 200 μL의 박테리아 현탁액을 꺼내 UV-Vis 분광광도계 (UV2450, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)로 600 nm에서 측정하고 하기 수학식 2를 통해 항균능을 계산하였다.
I1: 대조군의 OD 값; 및
I2: 실험군의 OD 값.
LB 아가 플레이트에서 OSG/CS 하이드로겔의 항균성을 확인한 결과, OSG/CS 하이드로겔이 아가 플레이트 상에서 대장균 및 황색포도상구균의 성장을 억제하거나 이를 사멸시키는 항균능이 있는 것으로 나타났다 (도 7a 내지 c). OSG/CS_1:2의 하이드로겔의 경우 대장균 및 황색포도상구균에 대해 각각 직경 3.3 ± 0.2 mm 및 3.5 ± 0.1 mm의 억제대(inhibition zone)를 나타냈다. 또한, OSG:CS_1:3, OSG:CS_1:2, OSG:CS_1:1, OSG:CS_2:1 및 OSG:CS_3:1의 대장균 억제대는 각각 2.8 ± 0.3, 3.2 ± 0.2, 2.8 ± 0.2, 2.7 ± 0.2 및 2.8 ± 0.3 mm로 나타났으며, 황색포도상구균 억제대는 각각 2.1 ± 0.2, 3.5 ± 0.1, 3.1 ± 0.2, 2.1 ± 0.2 및 1.9 ± 0.1로 나타났다. 또한, OSG/CS 하이드로겔의 항균능을 광학 밀도로 확인한 결과, OSG/CS 하이드로겔이 대장균 및 황색포도상구균을 모두 사멸시키는 것으로 나타났으며, OSG/CS_1:2, OSG/CS_1:1 및 OSG/CS_2:1에서 96% 이상의 황색포도상구균이 94% 이상의 대장균이 사멸되었다 (도 7d). 이를 통해 OSG/CS 하이드로겔이 박테리아 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한, OSG/CS_1:3 및 OSG/CS_3:1의 하이드로겔들이 91% 이상의 황색포도상구균을 88% 이상의 대장균을 사멸시키는 것으로 나타나 상처를 보호하기에 충분한 항균성을 가지는 것을 확인하였다 (도 7d). 즉, 각 OSG/CS 하이드로겔에서 항균 효과를 가지는 CS의 몰비는 다르지만, OSG/CS 표면에서 일정한 항균 효과를 나타내, OSG/CS 하이드로겔이 항균 드레싱 재료로서 이용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 형태학적 분석
FE-SEM을 이용하여 OSG/CS 하이드로겔의 형태학적 특성을 분석하였다. 구체적으로, 다양한 몰비의 OSG/CS 하이드로겔을 -76 ℃로 12 h 동안 급속 냉동한 뒤 동결건조시켰다. 그 후 시료들을 황동 스터브에 양면 탄소 테이프로 고정하고, 동결건조된 하이드로겔의 표면을 진공 상태에서 금박층으로 코팅하여 전기 전도성을 부여하였다. 시료의 표면을 FE-SEM (JSM-7800F Prime, JEOL Ltd. Japan)로 3 kV의 여기 전압 및 200배(200×) 배율로 촬영하였다.
그 결과, OSG/CS 하이드로겔의 단면은 14.1 ± 10.2 내지 302.14 ± 21.4 μ m의 기공 직경을 가지는 다공성 구조를 보였으며, OSG/CS의 기공 크기는 OSG 농도를 조정하여 조절될 수 있었다. 평균 기공 직경은 하이드로겔에서 OSG:CS의 몰비가 1:1가 될 때까지 OSG의 농도를 높이면 감소되어, 1:1의 몰비에서 다른 몰비에서보다 더 밀집된 OSG/CS 네트워크를 형성하였다 (도 8). 이러한 결과는 OSG의 알데하이드기와 CS의 아미노기 간의 쉬프 염기의 형성에 의한 것으로 설명될 수 있고, 진폭 변형률(oscillation strain) 및 각 주파수 스위프 시험을 포함하는 상기의 유변학적 분석 결과와 일치하며, 하이드로겔의 팽윤 특성과 관련이 있을 수 있다. 이를 통해, OSG/CS 하이드로겔의 기공 크기를 조절할 수 있어 생물 의약 응용 분야에 적용이 가능함을 알 수 있다.
실시예 7. 팽윤능 확인
하이드로겔의 팽윤능(swelling ability)은 약물 방출 제어에 큰 영향을 미치므로, 본 발명의 OSG/CS 하이드로겔의 팽윤능을 확인하였다. 구체적으로, 건조된 각 몰비의 OSG/CS 하이드로겔들을 37 ℃에서 pH 7.4 및 pH 2.0의 PBS에 각각 침지하여 평형화시킨 뒤, 팽윤된 하이드로겔을 여러번 칭량하여 하기 수학식 3을 통해 팽윤도(swelling ratio)를 계산하고 시간 의존적 팽윤 곡선을 구하였다.
Ws: 팽윤된 하이드로겔의 무게; 및
Wd: 건조된 하이드로겔의 무게.
그 결과, OSG/CS 하이드로겔은 pH 7.4 PBS 버퍼에서 시간 의존적으로 팽윤도가 크게 증가하고 48시간 후에 평형을 이루었으며, 이와 같은 팽윤도는 OSG의 농도에 의존적인 것으로 관찰되었다 (도 9a). 이러한 현상은 쉬프 염기의 가교(cross-linking) 정도와 일치하였다. OSG:CS의 몰비가 1:1일 때, OSG 및 CS 사이에 최적의 쉬프 염기 가교가 발생하여 밀집된 OSG/CS 네트워크 구조를 생성하였다. 또한, OSG:CS_1:3의 몰비로 제작된 하이드로겔의 팽윤도 (1662%)는 OSG:CS_1:1의 몰비로 제작된 하이드로겔의 팽윤도 (887%)보다 현저히 높게 나타났다. 그러나, 모든 OSG/CS 하이드로겔의 팽윤도는 pH 2.0의 PBS 버퍼에서 48시간 후에 평형에 도달하였으며, 최대 팽윤도는 2066%로 나타났다 (도 9b). 이와 같은 결과는 OSG/CS 하이드로겔에서 형성된 쉬프 염기가 pH 2.0에서 분해된다는 사실에 기인한다. 이를 통해, OSG/CS 하이드로겔의 pH에 민감한 특성을 약물 방출 제어에 자극-반응성 물질로서 적용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8. 약물 방출능 확인
상기에서 확인한 pH에 따른 OSG/CS 하이드로겔의 팽윤능 결과는 OSG/CS 하이드로겔의 pH-반응성 약물 방출능을 시사하므로, OSG/CS 하이드로겔의 체외 약물 방출 실험을 위한 모델 약물로 5-FU를 선택하여 확인하였다. 구체적으로, 37 ℃의 PBS 버퍼 (pH 7.4 또는 2.0)에서 하이드로겔로부터 5-FU의 방출 패턴을 평가하였다. 방출 용액의 부피의 0.5%를 PBS에서 주기적으로 빼내고 (추출 시료), 새로운 PBS를 지속적으로 첨가하여 총 용액 부피를 유지하였다. UV 분광광도계 UV2450 (Shimadzu Corporation, Japan)로 266 nm에서 5-FU 농도 (0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 mM)에 따라 측정한 세기를 이용하여 검량선을 작성하였다. 5-FU 누적량은 266 nm에서 UV 분광광도계로 측정한 값을 하기 수학식 4에 적용하여 계산하였다 (Kim, Jeong, Kim, Kim, & Jung, 2019).
Cn: 방출 매질(release medium)에서의 5-FU의 농도;
Ci: 추출 시료(extraction sample)에서의 5-FU의 농도;
V: 방출 매질 부피; 및
Vi: 시료 부피.
OSG/CS 하이드로겔의 약물 방출 패턴을 확인한 결과, 48시간 이내에 pH 7.4에서 OSG/CS 하이드로겔이 5-FU를 약 60% 방출한 반면, pH 2.0에서는 5-FU의 거의 90%가 방출되었으며 (도 9c), 이는 산성 pH에서 OSG/CS 하이드로겔의 쉬프-염기의 네트워크 구조가 붕괴되었기 때문이다. 쉬프-염기 하이드로겔의 내부 네트워크 공간이 약물 방출의 가능 용량을 결정하기 때문에, OSG/CS 하이드로겔에서의 5-FU의 방출 패턴을 쉬프 염기를 파괴함으로써 조절할 수 있다. 따라서, pH 환경의 변화가 약물 방출 제어에 적용될 수 있다. pH에 따른 이러한 방출 차이를 입증하기 위해, 6 h차에 pH를 7.4에서 2.0로 변화시키고 OSG/CS 하이드로겔에서의 5-FU 방출 프로파일 (Controlled release)을 확인한 결과, pH 7.4 (~6 h)에서는 모든 OSG/CS 하이드로겔에서 5-FU의 방출율이 유사한 것으로 나타났으나, pH 2.0 (6 h~)에서는 5-FU의 방출율이 48시간 이내에 약 90%로 급격히 증가하였다 (도 9d). 쉬프-염기의 안정성은 외부 pH에 의존적이기 때문에, OSG/CS 하이드로겔에서 쉬프-염기의 파괴로 이어지는 pH 변화에 의해 약물의 방출 패턴이 조절(제어)될 수 있다.
실시예 9. 분해능 확인
OSG/CS 하이드로겔의 분해능을 확인하기 위해, 약물을 탑재하지 않은 OSG:CS_1:1 하이드로겔을 37 ℃에서 pH 7.4, 4.7 및 2.0의 PBS에 각각 침지한 후, 0, 3, 6, 9, 12 h, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10일차에 꺼내 칭량하여 하기 수학식 5를 통해 남아있는 하이드로겔의 무게를 계산하였다.
W0: 분해 전 하이드로겔 무게; 및
Wt: 분해 후 하이드로겔 무게.
12시간 후 남아있는 OSG/CS 하이드로겔의 무게는 pH 7.4, pH 4.7 및 pH 2.0에서 각각 89.26%, 85.10% 및 73.76%로 나타났다 (도 10). 그 후, pH 2.0에서 OSG/CS는 4일차부터 빠르게 분해된 반면, 다른 pH 조건에서는 6일차부터 천천히 분해되는 것으로 나타났다. 10일차에 남아있는 OSG/CS 하이드로겔의 무게는 pH 7.4, pH 4.7 및 pH 2.0에서 각각 68.94%, 58.68% 및 13.78%로 나타났다. 이를 통해, 산성 조건에 의한 쉬프 염기의 파괴가 OSC/CS 하이드로겔의 분해를 더 빠르게 촉진하는 것을 알 수 있었다. 또한, OSG/CS가 pH 2.0에서 점차 분해되어 용액에 용해되지만 용해 간섭은 없는 것으로 나타났다 (도 11).
실시예 10. 세포 독성 및 세포 증식능 확인
본 발명의 하이드로겔을 생체에 적용 가능 여부를 확인하기 위해 WST-8 분석 (Hettiarachchi et al., 2010)을 이용하여 세포 독성과 세포 증식능을 분석하였다. 구체적으로, 인간배아 신장 세포 239 (HEK-293, Korean Cell Line Bank)를 3 × 104 cell/ml로 OSG/CS 하이드로겔 또는 조직 배양 폴리스티렌 24웰 플레이트 (Costar, Cambridge, USA)에 분주한 뒤, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 MEM(minimum essential medium) (WELGENE, South Korea)을 첨가한 뒤, 37 ℃의 5% CO2 조건으로 인큐베이션하였다. 그 후, SpectraMax Microplate Reader (Sunnyvale, USA)를 이용하여 450 nm에서 12, 48 및 84 h 간격으로 흡광도를 측정하여 세포 증식을 확인하였다. 세포 생존율은 하기 수학식 6을 이용하여 계산하였다.
그 결과, OSG:CS_3:1, OSG:CS_1:3, OSG:CS_1:2, OSG:CS_1:1 및 OSG:CS_2:1 하이드로겔을 처리한 세포의 세포생존율은 각각 대조군 대비 97.30%, 90.94%, 93.03%, 95.35% 및 91.70%로 나타나, OSG/CS 하이드로겔은 세포 독성이 없는 것으로 나타났다 (도 12a). 또한, OSG/CS 하이드로겔 및 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 모두에서 지속적인 세포 증식이 나타났으며, 배양 7일 후 OSG:CS_3:1 하이드로겔에서 OD 값은 98.84%로 나타났다 (도 12b).
실시예 11. 약물 탑재 하이드로겔의 약물 방출 효과
약물 탑재한 OSG/CS 하이드로겔이 약물을 방출하여 세포에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 항암제인 5-FU를 탑재한 OSG/CS 하이드로겔 상에서 HEK 293 세포 또는 HeLa 세포를 배양한 후 약물의 항암 효과를 LIVE/DEAD 분석으로 확인하였다. 구체적으로, 5-FU를 탑재한 OSG/CS 하이드로겔을 20 mm의 세포 배양 접시의 웰에 위치시키고 그 위에 1 × 105개의 HEK 293 세포 또는 HeLa 세포를 분주하여 배양하였다. 그 후, 배양 1, 3 및 5일차에 Calcein-AM (live cells, green fluorescence) 및 PI(propidium iodide, dead cells, red fluorescence)로 세포들을 염색한 뒤, IX73 Micromanipulator System 및 Fluorescence Inverted Microscope (Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포의 형광 이미지를 기록하였다.
그 결과, HEK293 세포는 5일 동안 잘 증식되었으나, 암세포인 HeLa 세포는 OSG/CS 하이드로겔에서 방출된 5-FU에 의해 사멸되는 것으로 나타났다 (도 13). 이를 통해, OSG/CS가 생체 의학에 적용하기 위한 스캐폴드로서 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (16)

  1. 산화된 숙시노글리칸 (oxidized succinoglycan, OSG) 및 키토산 (chitosan, CS)이 가교 결합(Cross-link)된 하이드로겔 (OSG/CS).
  2. 제 1항에 있어서, 망상 구조를 이뤄 다공성인, 하이드로겔.
  3. 제 1항에 있어서, 쉬프 염기 형성(Schiff base formation)에 의해 가교 결합된, 하이드로겔.
  4. 제 1항에 있어서, 산화된 숙시노글리칸 및 키토산이 1:4 내지 4:1의 몰비로 포함된, 하이드로겔.
  5. 제 1항에 있어서, pH 감응성인, 하이드로겔.
  6. 제 1항에 있어서, 자가-치유 특성을 가지는, 하이드로겔.
  7. 제 1항에 있어서, 항균성인, 하이드로겔.
  8. 제 1항의 하이드로겔 및 약물을 포함하는 약물전달체.
  9. 제 8항에 있어서, 약물이 하이드로겔에 담지된, 약물전달체.
  10. 제 8항에 있어서, pH 1 내지 4의 조건에서 선택적인 약물 방출이 가능한, 약물전달체.
  11. 제 8항에 있어서, 약물은 조영제, 나노입자, 항체, 항체 단편, DNA, RNA 또는 SiRNA를 포함하는 핵산, 펩타이드, 유전자, 단백질, 세포 및 화합물 (chemical compound)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약물전달체.
  12. 제 1항의 하이드로겔 또는 제 8항의 약물전달체를 포함하는 상처 드레싱 제재.
  13. 제 1항의 하이드로겔 또는 제 8항의 약물전달체를 포함하는 조직 공학용 지지체.
  14. a) 숙시노글리칸(succinoglycan, SG)을 산화시켜 산화된 숙시노글리칸을 제작하는 단계;
    b) 산화된 숙시노글리칸에 키토산을 첨가하는 단계; 및
    c) 산성 증기에 노출시키는 단계를 포함하는 pH 감응성 하이드로겔의 제조방법.
  15. 제 14항에 있어서, 산성 증기는 아세트산 증기(acetic acid atmosphere)인, pH 감응성 하이드로겔의 제조방법.
  16. 제 14항에 있어서, 주사제형 하이드로겔인, pH 감응성 하이드로겔의 제조방법.
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