CZ2008705A3

CZ2008705A3 - Zpusob prípravy DTPA sítovaných derivátu kyseliny hyaluronové a jejich modifikace

Info

Publication number: CZ2008705A3
Application number: CZ20080705A
Authority: CZ
Inventors: Buffa@Radovan; Velebný@Vladimír; Palek@Lukáš; Kettou@Sofiane; Pravda@Martin
Original assignee: Cpn S. R. O.
Priority date: 2008-11-06
Filing date: 2008-11-06
Publication date: 2010-04-14
Also published as: KR20110082609A; RU2011121239A; CA2742428A1; US20110218331A1; EP2350135A1; JP2012507615A; CZ301555B6; WO2010051783A1; BRPI0916131A2

Abstract

Vynález se týká modifikace kyseliny hyaluronové pomocí protonizovaného bis anhydridu DTPA (diethylentriaminpentaoctové kyseliny) ve slabe kyselém až neutrálním polárním aprotickém rozpouštedle bez prítomnosti externí báze za vzniku sítovaných produktu. Reakce probíhá pres krok tvorby komplexu, kde acylacním cinidlem je samotný kokation hyaluronanu konkrétne protonizovaný DTPA bis anhydrid. Výsledný sítovaný produkt (linker) obsahuje tri karboxylové skupiny a tri terciální aminy, které jsou schopny efektivne komplexovat ruzné kovy. Výslednou DTPA sítovanou kyselinu hyaluronovou je možné také hydrofobizovat pomocí mono, bis a tris funkcních alkylacních cinidel.

Description

Způsob přípravy DTPA síťovaných derivátů kyseliny hyaluronové a jejich modifikace

Oblast techniky

Vynález se týká nového způsobu modifikace kyseliny hyaluronové za vzniku síťovaných derivátů DTPA (diethylentriaminpentaoctové kyseliny) a reakcí těchto 5 modifikovaných derivátů. Modifikace kyseliny hyaluronové je provedena pomocí protonizovaneho DTPA bis anhydridu ve slabě kyselém až neutrálním polárním aprotickém rozpouštědle bez přítomnosti externí báze za vzniku síťovaných produktů. Linkery těchto síťovaných derivátů obsahují tři karboxylové skupiny a tři terciálni aminy, které jsou schopny efektivně komplexovat různé kovy a dávají také možnost dále modifikovat karboxylové 10 skupiny DTPA, např. hydrofobizovat síťovaný derivát alkylačními činidly.

Dosavadní stav techniky

Polysachandy jsou polymery složené z jednoduchých monosacharidů (monomemích jednotek) spojených glykosidickou vazbou. Podle počtu opakujících se jednotek rozlišujeme oligosacharidy (2 až 10 jednotek) a polysachandy (10 a více jednotek). Význam 15 poiysacharidů je značný. Polysachandy plní ftnkci nutriční, ochrannou, stavební (celulóza, chthn) nebo zásobní (škrob). Polymery obecně jsou charakterizovány průměrnou molekulovou hmotností, která se běžně pohybuje okolo 16.10³ g.moť' až 16,10⁶ gmol¹. Počet opakujících se jednotek je dán stupněm polymerizace.

Významným polysacharidem je kyselina hyaluronová:

komponovaná z opakujících se jednotek P-(l,3)-D-glukuronové kyseliny a P-(l,4)-^acetyiD-glukosaminu. Vyznačuje se velkou molekulovou hmotností 5.10⁴ až 5.10⁶ g.mof¹, která závisí na způsobu izolace a výchozím materiálu. Kyselina hyaluronová, respektive její sůl hyaluronan, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů, hraje 25 významnou roli v řadě biologických procesů jako je hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogeneze. Tento značně hydrofílní polysacharid je ve vodě rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.

Kyselina hyaluronová je zástupcem skupiny glykosaminoglykanů, která dále zahrnuje chondroitin sulfát, dermatan sulfát, keratan sulfát a heparan sulfát.

Acylace kyseliny hyaluronové

Acylace polysacharidů je nejčastéj i využívaná metoda k zavedení alkylového řetězce S který mění vlastnosti převážně hydrofilních látek na látky hydrofobní. Reakce se nejčastěji provádí působením anhydridů příslušných kyselin, chloridů kyselin nebo samotnou kyselinou za přídavku katalyzátorů.

Pnprava acyl-denvátů oligomerů kyseliny hyaluronové je patentována Couchmannem . a kol. (US patentWHOl; 1988), kde acylace probíhá jak na hydroxylové, tak ua amino 10 skupině deacetylovaného hyaluronanu. O-acylace zahrnuje reakci s orgamckou kyselinou za přídavku kyselého katalyzátoru (minerální kyseliny, organické nebo Lewisovy kyseliny) a aktivačního činidla fflMcyklohexylcarbodiimid, 2-chlor-l-methyl pyridiniumiodid a NN•carbonyl diimidazol), nebo používá anhydridů a chloridů kyselin v přítomnosti báze Mrchmori a kol. (JP patent 7309902, 1995) připravili acylovanou kyselinu hyaluronovou 15 reakcí s anhydridy karboxylových kyselin nebo jejich acylhalogenidy ve vodném prostředí obsahujícím s vodou misitelné organické rozpouštědlo v přítomnosti katalyzátoru Saponifikací acylových skupin kyseliny hyaluronové bylo docíleno derivátů s libovolným počtem acylových skupin. Chlorid kyseliny retinové a anhydrid kyseliny máselné použil k popravě spectfických derivátů hyaluronové kyseliny i Perbellini a kol. (WO 2004/056877 AI 20 2004). Pro syntézu v prostředí N.N- dimethylformamidu byla pouína kyselina hyaluronová ve formě tetrabutylamomiých solí.

Dale je zPV 2006-605 znám způsob modifikace polysacharidů, mj. i kyseliny hyaluronové, pomoci směsných anhydridů v prostředí vody nebo organického rozpouštědla, případně v přítomnosti přídavných látek. Nevýhodou tohoto způsobu oproti vynálezu je nízký 25 stupeň substituce kyseliny hyaluronové vynálezu a nutnost přídavného kroku způsobu, spočívající vtom, ze nestabilní sloučeninu RCO-O-CO-OR¹ je nutné si připravit těsně před reakcí.

JP 3975267 popisuje způsob acylace polysacharidů zahrnující reakci polysacharidů s anhydridem karboxylové kyseliny, kde je však nutné použít velký přebytek halogenidu 30 kovu, z čehož plynou vysoké nároky na čištění produktu a vysoké vstupní náklady. Jelikož DTPA je známá jako vysoce účinné komplexační činidlo, není vhodná pro použití ve způsobu podle JP 3975267 z důvodu extrémní náročnosti odstraňování přítomného kovu ze struktury HA-DTPA-kov. Další nevýhodou JP 3975267 je nutnost použití velkého přebytku anhydridů, což může významně navýšil vstupní náklady. Ještě další nevýhodou JP 3975267 je, že jako rozpouštědlo je nutné použít karboxylovu kyselinu, která má stejný řetězec jako použitý anhydnd, t.j. kyselina octová - acetanhydrid, kyselina propionová - propionanhydrid apod. V případe, ze příslušná karboxylová kyselina není v podmínkách reakce kapalná (např. kys.

5- benzoová aj.), postup nelze použít vůbec (není přítomné rozpouštědlo). Navíc jako rozpouštědlo je nutné použít karboxylovu kyselinu, která alespoň částečně rozpouští HA, což úplně vylučuje použití např. lipofilních karboxylových kyselin.

Síťování kyseliny hyaluronové

Síťovaní neboli „crosslinking“ kyseliny hyaluronové bylo popsáno několika způsoby. lp Mezi nejjednodušší způsoby patří síťování pomocí POC1₃ (US 5 783 691), Balasz a kol. síťovali kyselinu hyaluronovou pomocí divinylsulfonu (US 4 582 865). Dalšími reaktivními elektrofíly vhodnými pro síťování jsou aldehydy (US 4 713 448). Velmi rozšířenými činidly schopnými reagovat se dvěma polymery jsou epoxidy nebo bisepoxidy (WO 86/00912, WCX ;u2007/129828), kde nejznámějším zástupcem této skupiny je epichlorhydrin.

, Použitím EDC je možné zvýšit reaktivitu karboxylové skupiny kyseliny hyaluronové, která je pak schopna síťovacích reakcí s polyanionickými sloučeninami (US 4 937 270). Jiným zástupcem polynukleofilních reaktantů jsou polyhydrazidy (WO 2006/001046). Způsob síťování kyseliny hyaluronové pomocí polyanhydridu, poly(alkyloylchloridu), _f polyepoxidu, polykarbodiimidu byl shrnut v patentu (WO 00/46252). Při reakci bis karbodiimidu s kyselinou hyaluronovou (WO 2005/067994) dochází k síťování pomocí reaktivního eletrofílního činidla. Možnosti síťovat pomocí redox reakcí je zachycena v patentu (EP 1683812 AI), kde vzniká disulfidícké přemostění z thiolových derivátů kyseliny hyaluronové. Zvláštní skupinu síťování tvoří fotochemické reakce. Je známo, že vinylenová . skupina skořicové kyseliny nebo její aryl-substituovaný analog je schopný fotochemicky 25 cyklizovat na cyklobutan. Tuto skutečnost využili autoři patentu (EP 1217008 AI), kteří Ndeacylovaný derivát hyaluronové kyseliny acylovali na dusíku glucosaminové části polysachandu s chloridem kyseliny skořicové. Samotné síťování proběhlo ozařováním světlem vlnové délky 280 nm. Kromě skořicové kyseliny je taky možné použít jiné fotoreaktivní skupiny navázané na kyselinu hyaluronovou (WO 97/18224, EP 0763754 A2) které ozářením světlem vhodné vlnové délky dávají síťované deriváty. Patenty, které se věnovaly acylaci a síťování kyseliny hyaluronové v přítomnosti báze nebo v bazickém rozpouštědle, byly publikovány Yui a kol (US 6 673 919), resp. Nguyenem a kol (US : 5690961).

US 6509039 Bl popisuje zesíťované produkty biopolymerů obsahujících aminoskupiny, konkrétně produkty chitosanu nebo želatiny, s poly-anhydridy karboxylových kyselin, vznikající v prostředí kyseliny octové a acetonu. Nej důležitější rozdíl mezi US >6509039 Bl a tímto vynálezem spočívá v tom, ze popisuje modifikaci polysacharidů 5 obsahujících volnou aminoskupinu, zatímco kyselina hyaluronová (HA) neobsahuje volnu aminoskupinu. Postupy aplikované v patentu US 6509039 B1 by nebyly schopné významněji modifikovat HA, protože HA nemá dostatečně reaktivní skupinu pro reakci s anhydridem v navrhovaných podmínkách.

Mezi nevýhody výše uvedených známých řešení patří náročné čištění síťovaných 10 derivátů kyseliny hyaluronové od toxických nízkomolekulámích polárních sloučenin, které jsou uvězněny v síti derivátů, složitost známých postupů aj. Způsob podle vynálezu je oproti známým analogům jednodušší a nevyžaduje přítomnost výrazně toxických rozpouštědel nebo acylačních katalyzátorů.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je způsob přípravy derivátů kyseliny hyaluronové reakcí kyseliny hyaluronové s protonizovaným bis anhydridem DTP A (diethylentriaminpentaoctové kyseliny) dle Schématu 1:

Schéma 1: Reakce protonizovaného DTPA bis anhydridu s kys. hyaluronovou (HA-CH₂-0H)

Reakce probíhá ve slabě kyselém až neutrálním polárním aprotickém rozpouštědle bez přítomnosti externí báze za vzniku síťovaných produktů. Rozpouštědlo je s výhodou vybráno ze skupiny zahrnující DMSO, sulfolan nebo díalkylsulfony. Ve způsobu podle vynálezu je kyselina hyaluronová s výhodou ve formě volné kyseliny a má s výhodou molekulovou 25 hmotnost v rozsahu 1.10⁴ až 5.10⁶ β,ποΓ¹ a polydisperzitu v rozsahu 1,02 až 5,0.

. .

Navrhovaný postup je oproti známým analogům jednodušší a nevyžaduje přítomnost výrazně toxických rozpouštědel nebo acylačních katalyzátorů.

Schéma 2: Reakce HA-DTPA-HA s kovy a alkylačními činidly

Navázaní DTPA bis anhydridu estetickou vazbou probíhá při 15 až 70 °C, s výhodou při 60 °C, což je možné vysvětlil tím. že DTPA bis anhydrid je protonizován karbonovou , skupinou kyseliny hyaluronové za vzniku komplexu, kde acylačnfm činidlem je samotný ko10 kation hyaluronanu. Příslušná acylace probíhá buď přímo na některé hydroxy skupiné, anebo na karboxylátové skupiné glukoronové části a následně intramolekulově na hydroxy skupině -viz Schéma 3.

Schéma 3: Detailní schéma reakce protonizovaného DTPA bis anhydridu s kyselinou hyaluronovou.

H NMR spektrum směsi kyseliny hyaluronové a DTPA bis anhydridu í v deuterovaném DMSO v časech O.lh Aíh (viz obr. I) potvrauje zánik původních signálů vodíků -N-CH2-CH_rN- patřících DTPA bis anhydridu (3,3; 3,4; 3,65; 3,85 ppm) a vznik nové kvality (plků) v oblasti 3,2 - 3,8 ppm indikující vznik pratonovaného DTPA bis anhydridu. Tabulkové údaje pro pKa hodnoty analogických systémů ( R-COOH - pKa - 4. alkyLN - pKa ~ 11) tuto možnost také preferují,

Ve způsobu podle vynálezu se kyselina hyaluronová s výhodou rozpustí v DMSO nebo sulfolanu, pak se přidá DTPA bis anhydrid a směs se míchá bez přístupu vzdušné vlhkosti při teplotě 15 až 70 °C, s výhodou pri 60 °C, po dobu 1 až 150 h, s výhodou 24 h.

Linker, tj. získaný zesíťovaný derivát, obsahuje tři karboxylové skupiny a tři terciální aminy, ktere jsou schopny efektivně komplexovat různé kovy a dávají taky možnost 15 hydrofobizovat karboxylové skupiny DTPA linkeru pomocí mono, bis a trisfunkčních alkylačních činidel - viz Schéma 2.

Komplexy sit ováných derivátů kyseliny hyaluronové a diethylentriaminpentaoctové kysliny s atomy kovů se připraví reakcí chloridu nebo acetátu příslušného kovu, jako například kovů alkalických zemin - Ca, Mg nebo přechodných kovů - Fe, Gd, In, Zn, Eu, Tb ve vodě nebo v polárním aprotickém rozpouštědle při teplotě 15 až 70 °C, s výhodou při 20 °C 5 po dobu 1 min až 24 h. Z hlediska komplexačních vlastností DTPA se nabízí možnost tvorby chelátových komplexů DTPA hyalmonanu např. s gadoliniem pro diagnostické účely nebo s radioaktivním indiem ^I13In pro účely sledování distribuce hyaluronanu v živém organismu nebo zinkem, který by mohl v komplexu s DTPA hyaluronanem vykazovat určitou aktivitu využitelnou v kosmetice.

Hydrofobizace síťovaných derivátů kyseliny hyaluronové a diethylentriaminpentaoctove kyseliny nastává po reakci smono, bis nebo tris funkčními alkylačními činidly ve vodě nebo v polárním aprotickém rozpouštědle nebo směsi těchto rozpouštědel a báze při teplotě 15 až 70 °C, s výhodou při 60 °C, po dobu 1450 h. Alkylační činidla obecného vz₉rce R-X zahrnují alkyl(aryl)halogenidy, kde R je lineární nebo rozvětvený řetězec Ci -Τ₃ο volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin a X je halogen, nebo alkyl(aryl)sulfáty, kde R má výše uvedený význam a X je skupina -O-SO₂-R. Použité báze zahrnuji anorganické sloučeniny obecného vzorce MHCO₃, M₃C0_3j MF, kde M je alkalický kov, nebo dusíkaté organické báze obecného vzorce R₃N, kde R je alkyl C| ^C₃₀ s lineárním nebo rozvětveným řetězcem volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických 20 skupin.

Zde uváděné molekulové hmotnosti kyseliny hyaluronové a jejích derivátů jsou hmotnostně střední molekulové hmotnosti.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje změny v *H NMR spektru směsi kyseliny hyaluronové a DTPA bis 25 anhydridu v DMSO v čase 0,1 h -'24 h.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Modifikace kyseliny hyaluronové s DTPA bis anhydridetn.

Kyselá forma kyseliny hyaluronové HA-COOH (10 kDa, 50 mg) byla rozpuštěna v 30 bezvodém DMSO (5 ml) při 60 °C. DTPA bisanhydrid (95 mg) byl přidán k roztoku polysacharidu při 60 °C a směs byla míchána 24 h bez přístupu vzdušné vlhkosti. Po ochlazeni ledovou vodou byla přidána destilovaná voda a roztok 150 mg Na₂CO₃ v 30 ml vody, směs se míchala 30 min. a potom byla zředěna destilovanou vodou na 100 ml a dialyzována proti destilované vodě 7 Mt I L. Výsledný roztok byl lyofilyzován za vzniku 88 mg produktu.

M_w - 2800 kDa, Polydisperzita = 2,563 (stanoveno pomocí metody SEC-MALL),

IR 1739 cmstupeň substituce 110 % (počítáno z NMR na dimer polysacharidu), ^]H NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20 % aq NaOD) DTP A (δ 2,55 4H, 2,6 4H, 3,10 2H, 3,5 6H), ^,3C NMRDTPA (δ 183,0,182,8, 61,5, 61,1, 54,5, 54,4 ppm).

Příklad 2

Modifikace kyseliny hyaluronové s DTP A bis anhydridem to Kyselá forma kyseliny hyaluronové HA-COOH (10 kDa, 50 mg) byla rozpuštěna v bezvodém sulfolanu (5 ml) při 60 C. DTPA bisanhydrid (95 mg) byl přidán k roztoku polysacharidu při 60 ”C a směs byla míchána 24 h bez přístupu vzdušné vlhkosti. Po ochlazeni ledovou vodou byla přidána destilovaná voda a roztok 150 mg Na,CO, v 30 ml vody, směs se míchala 30 min a potom byla zředěna destilovanou vodou na 100 ml a dialyzována proti destilované vodě 7 krát 1 D. Výsledný roztok byl lyoliiyzován za vzniku 78 mg produktu.

M_w - 2600 kDa, Polydisperzita = 2,951 (stanoveno pomocí metody SEC-MALL),

IR 1739 cm stupeň substituce 98 % (počítáno z NMR na dimer polysacharidu), 'H NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20 % aq NaOD) DTPA (8 2,55 4H, 2,6 4H, 3,10 2H, 3,5 6H), ^,JC 20 NMR DTPA (8 183,0,182,5,61,5,61,1,54,5, 54,4ppm).

Příklad 3

Modifikace kyseliny hyaluronové s DTPA bis anhydridem

Kyselá fomta kyseliny hyaluronové HA-COOH (350 kDa, 50 mg) byla rozpuštěna v bezvodém DMSO (5 ml) při 60 °C. DTPA bisanhydrid (95 mg) hyl přidán k roztoku 25 polysacharidu při 60 °C a směs byla míchána 24 h bez přístupu vzdušné vlhkosti. Po ochlazení ledovou vodou byla přidána destilovaná voda a roztok 150 mg Na₂CO, v 30 ml vody, směs se míchala 30 min a potom byla zředěna destilovanou vodou na 100 ml a dialyzována proti destilované vodě 7 krát I L. Výsledný roztok byl lyoliiyzován za vzniku 83 mg produktu.

ÍR 1739 cm¹, stupeň substituce 90 % (počítáno z NMR na dimer polysacharidů), >H NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20 % aq NaOD) DTPA (δ 2,55 4H, 2,6 4H, 3,10 2H, 3,5 6H), ¹³C NMR DTPA (δ 183,0,182,8,61,5, 61,1, 54,5, 54,4 ppm).

Příklad 4

Modifikace kyseliny hyaluronové s DTPA bis anhydridem

Kyselá forma kyseliny hyaluronové HA-COOH (350 kDa, 50 mg) byla rozpuštěna v bezvodém DMSO (5 ml) při 60 °C. DTPA bisanhydrid (25 mg) byl přidán k roztoku polysacharidů při 60 °C a směs byla míchána 24 h bez přístupu vzdušné vlhkosti. Po - ochlazem ledovou vodou byla přidána destilovaná voda a roztok 150 mg Na₂COj v 30 ml IP vody, směs se míchala 30 min a potom byla zředěna destilovanou vodou na 100 ml a dialyzována proti destilované vodě 7 krát I ϋ Výsledný roztok byl lyofilyzován za vzniku 61 mg produktu.

IR 1739 cm'⁵, stupeň substituce 30 % (počítáno z NMR na dimer polysacharidů), Ή NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20 % aq NaOD) DTPA (δ 2,55 4H, 2,6 4H, 3,10 2H, 3,5 6H), ^l3C 15 NMRDTPA(Ó 183,0,182,8,61,5,61,1,54,5,54,4 ppm).

Příklad 5

Modifikace kyseliny hyaluronové s DTPA bis anhydridem

Kyselá forma kyseliny hyaluronové HA-COOH (350 kDa, 50 mg) byla rozpuštěna v . bezvodém DMSO (5 ml) při 60 °C. DTPA bisanhydrid (10 mg) byl přidán k roztoku 20 polysacharidů při 60 °C a směs byla míchána 24 h bez přístupu vzdušné vlhkosti. Po ochlazení ledovou vodou byla přidána destilovaná voda a roztok 150 mg Na₂CO₃ v 30 ml vody, směs se míchala 30 min a potom byla zředěna destilovanou vodou na 100 ml a dialyzována proti destilované vodě 7krát 1 Ů. Výsledný roztok byl lyofilyzován za vzniku 53 mg produktu.

IR 1739 cm'', stupeň substituce 6 % (počítáno z NMR na dimer polysacharidů), ⁵H NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20 % aq NaOD) DTPA (δ 2,55 4H, 2,6 4H, 3,10 2H, 3,5 6H), ^,3C NMR DTPA (δ 183,0,182,8,61,5,61,1, 54,5, 54,4 ppm).

Příklad 6

Modifikace kyseliny hyaluronové s DTP A bis anhydridem

Kyselá forma kyseliny hyaluronové HA-COOH (2000 IcDa, 50 mg) byla rozpuštěna v bezvodém DMSO (10 ml) při 60 C. DTPA bisanhydrid (95 mg) byl přidán k roztoku 5 polysacharidu při 60 °C a směs byla míchána 24 h bez přístupu vzduSné vlhkosti. Po ochlazeni ledovou vodou byla přidána destilovaná voda a roztok 150 mg Na₂COj v 30 ml vody, směs se míchala 30 min a potom byla zředěna destilovanou vodou na 100 ml a dialyzována proti destilované vodě 7krát I ji Výsledný roztok byl lyofilyzován za vzniku 68 mg produktu.

/

IR 1739 cm', stupeň substituce 76 % (počítáno z NMR na dimer polysacharidu), ’H NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20 % aq NaOD) DTPA (δ 2,55 4H, 2,6 4H, 3,10 2H, 3,5 6H), ¹³C NMR DTPA (δ 183,0,182,8,61,5,61,1, 54,5,54,4 ppm).

Příklad 7

Příprava komplexů HA-DTPA-Gd

Schéma 4

Do roztoku HA-DTPA (modifikované kyseliny hyaluronové z příkladu 5) (stupeň substituce 6 %moi, počítáno na dimer kyseliny hyaluronové, Ig) ve vodě (100ml) byl přidán 1% roztok GdCl₃.6H₂O (40 mg GdCl₃.6H₂O, 0,04 eq ve vodě) a směs byla míchána 1 h při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl pak dialyzován oproti 1 litru destilované vody, přičemž 25 v oddialyzovaném roztoku po odpaření solventu nebyla zjištěna přítomnost gadolinia pomocí π - : .

chelatačního barviva xylenolové oranže v acetátovém pufru. Z této skutečnosti a z faktu, že takto lze detekovat koncentraci Gd v 10'³ mg/ml, _je možné _{usouditj že víc než % % přidan}’ _hogadolinia bylo vázáno v HA-DTPA.

Příklad 8

Příprava komplexů HA -DTPA -Fe

Schéma 5

Do roztoku HA-DTPA (modifikované kyseliny hyaluronové z příkladu 5) (stupeň substituce 6 %mol, počítáno na dimer kyseliny hyaluronové, !'£) ve vodě (lOOhú) byl přidán / 1% roztok FeClj (20 mg FeCl₃, 0,04 eq ve vodě) a směs iyla míchána 1 h při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl pak dialyzován oproti 1 litru destilované vody, přičemž v oddialyzovanem roztoku po odpaření solventu nebyla zjištěna přítomnost železa pomocí chelatačního barviva xylenolové oranže v acetátovém pufru. Z této skutečnosti a z faktu, že takto lze detekovat koncentraci Fe v 10^-4 mg/ml, je možné usoudit, že víc než 97 % přidaného železa bylo vázáno v HA-DTPA.

Příklad 9

Příprava komplexů HA-DTPA-In

S R = Na, H, HA R’=Na,H

Schéma 6

Do roztoku HA-DTPA (modifikované kyseliny hyaluronové z příkladu 5) (stupeň substituce 6 %mol, počítáno na dimer kyseliny hyaluronové, Ig) ve vodě (lOOrnl) byl přidán 10 1% roztok InCb (17 mg InCl₃,0,04 eq ve vodě) a směs byla míchána 1 h při teplotě místnosti.

Výsledný roztok byl pak dialyzován oproti 1 litru destilované vody, přičemž v oddialyzovaném roztoku po odpaření solventu nebyla zjištěna přítomnost india pomocí chelatacmho barviva xylenolové oranže vacetátovém pufru. Z této skutečnosti a z faktu, že takto lze detekovat koncentraci In v lO^mg/ml, je možné usoudit, že víc než 97 % přidaného lý india bylo vázáno v HA-DTPA.

Příklad 10

Příprava komplexů HA-DTPA-Eu

R = Na, H, HA R* = Na,H

Schéma 7

Do roztoku HA-DTPA (modifikované kyseliny hyaluronové z příkladu 5) (stupeň substituce 6 %mol, počítáno na dimer kyseliny hyaluronové, Ig) ve vodě (100ml) byl přidán 1% roztok EuC1₃ (40 mg EuC1₃, 0,04 eq ve vodě ) a směs byla míchána fh při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl pak dialyzován oproti 1 litru destilované vody, přičemž 5 v oddialyzovaném roztoku po odpaření solventu nebyla zjištěna přítomnost europia pomocí chelatačmho barvivá xylenolové oranže v acetátovém pufhi. Z této skutečnosti a z faktu, že takto lze detekovat koncentraci Eu v 10'³ g/ml, je možné usoudit, že víc než 95 % přidaného europia bylo vázáno v HA-DTPA.

Příklad 11

Příprava komplexů HA-DTPA-Tb

R = Na, H, HA R¹ = Na, H

Schéma 8

Do roztoku HA-DTPA (modifikované kyseliny hyaluronové z příkladu 5) (stupeň substituce 6 %mol, počítáno na dimer kyseliny hyaluronové, íg) ve vodě (lOOinl) byl přidán 1% roztok TbCl₃ (40tng TbCl₃, 0,04 eq ve vodě) a směs byla míchána fh při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl pak dialyzován oproti 1 litru destilované vody, přičemž 20 v oddialyzovaném roztoku po odpaření solventu nebyla zjištěna přítomnost therbia pomocí chelatačního barviva xylenolové oranže v acetátovém pufru. Z této skutečnosti a z faktu, že takto lze detekovat koncentraci Tb v 10'³ g/ml, je možné usoudit, že víc než 95 % přidaného therbia bylo vázáno v HA-DTPA.

Příklad 12

Příprava komplexů HA-DTPA-Zn

R = Na,H,HA R¹⁼Na, H

Schéma 9

Do roztoku HA-DTPA (modifikované kyseliny hyaluronové z příkladu 5) (stupeň substituce 6 %nol, počítáno na dimer kyseliny hyaluronové, Ig) ve vodě (IWhU) byl přidán 10 roztok ZnCl₂ (0,04 eq) ve vodě a směs byla míchána 1 h pH teplotě místnosti. Výsledný roztok byl pak dialyzován oproti 1 litru destilované vody, přičemž v oddialyzovaném roztoku po odpaření solventu nebyla zjištěna přítomnost zinku pomoci chelatačního barviva xylenolové oranže v acetátovém pufru. Z této skutečnosti a z faktu, že takto lze detekovat koncentraci Zn v 10^J mg/ml, je možné usoudit, že víc než 97 % přidaného zinku bylo vázáno 16 v HA-DTPA.

Příklad 13

Příprava komplexů HA-DTPA-Ca

Do roztoku HA-DTPA (0,1 g, stupeň substituce 30’Anol, počítáno na dimer 5 hyaluronové kyseliny, derivát z příkladu 4) v 10 ml vody byl přidán roztok CaCl₂ (0,3 eq) ve vodě (2 ml) a směs byla míchána 1 h při teplotě místnosti. Reakčni směs byla pak zředěna na 300 ml a dialyzována oproti 7 krát 11 destilované vody. Výsledný roztok byl lyofilyzován za vzniku 110 mg produktu.

IR 1739cm ¹,¹H NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20% aq NaOD) DTPA (δ 2,4 4H, 2,7 4H, 3,15 2H, 3,30 6H) ¹³C NMR DTPA (δ 64,4,62,6, 58,5, 57.9 ppm).

ICP 3,1% Ca.

Příklad 14

Příprava komplexů HA-DTPA-Mg

Schéma 11

Do roztoku HA-DTPA (0,1 g, stupeň substituce 3O%mol, počítáno na dimer hyaluronové kyseliny, derivát z přikladu 4) v 10 ml vody byl přidán roztok MgCIz (0,3 eq) ve vodě (2 ml) a směs byla míchána I h při teplotě místnosti. Reakční směs byla pak zředěna na 300 mi a dialyzována oproti 7 krát 1 litru destilované vody. Výsledný roztok byl lyofilyzován 5 za vzniku 110 mg produktu.

IR 1739cm 'H NMR (měřeno po přidání 0,02 ml 20% aq NaOD) DTPA (δ 2,4 4H, 2,7 4H, 3,15 2H, 3,30 6H) ¹³C NMR DTPA (S 64,4,62,6, 58,5, 57.9 ppm).

ICP 2,3% Mg.

Příklad 15

Alkylace HA-DTPA-HA s alkylhalogenidy

Síťovaná forma kyseliny hyaluronové HA-DTPA (100 mg, derivát z přikladu 1) byla rozpuštěna ve vodě na 1% roztok a DMSO bylo přidáváno až do vzniku jemného zákalu při teplotě místnosti. Do směsi přidán nasycený vodný roztok NaHCOr (2 eq), hexylbromid (2 eq) a roztok byl zahříván na 60 ”C 48 h. Po ochlazení ledovou vodou byl přidán nasycený lý vodný roztok Na₂COr (5 eq), směs se míchala 30 min a pak byla zředěna destilovanou vodou na 150 ml, dialyzována oproti 5 litrům destilované vody (opakováno 7krat). Výsledný roztok byl lyofilyzován za vzniku 90 mg produktu.

IR 1738 cm·¹, 'HNMR hexyl (δ 0,85 3H, 1,3 4H, 1,35 2H, 1,70 2H, 4,25 2H)

Příklad 16

Alkylace HA-DTPA-HA s alkyltosyláty

Síťovaná forma kyseliny hyaluronové HA-DTPA (100 mg, derivát z příkladu 1) byla rozpuštěna v DMSO na 0,5% roztok. Do směsi byl pak přidán nasycený vodný roztok NaHCO₃ (2 eq), hexyl tosylát (2 eq) a roztok byl zahříván na 60 °C 48 h. Po ochlazení ledovou vodou byl přidán nasycený vodný roztok Na₂CO₃ (5 eq), směs se míchala 30 min a 25 pak byla zředěna destilovanou vodou na 150 ml, dialyzována oproti 5 litrům destilované vody (opakováno 7krát). Výsledný roztok byl lyofilyzován za vzniku 90 mg produktu.

IR 1737 cm'¹, 'H NMR hexyl (δ 0,86 3H, 1,3 4H, 1,35 2H, 1,70 2H, 4,27 2H).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy derivátů kyseliny hyaluronové reakcí kyseliny hyaluronové s anhydridem karboxylové kyseliny, vyznačující se tím, že se kyselina hyaluronová rozpustí ve slabě kyselém až neutrálním polárním aprotickém rozpouštědle, přidá se anhydrid karboxylové kyseliny při teplotě v rozmezí od 15 °C do 70 ^ŮC a směs se mícha po dobu 1 až 150 hodin, přičemž anhydrid karboxylové kyseliny je protomzovaný pomocí kyseliny hyaluronové na protonizovaný bis anhydrid diethylen-triaminpentaoctové kyseliny.
2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová je ve formě volné kyseliny.
3. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová má molekulovou hmotnost v rozsahu 1.10⁴ až 5.10⁶ g.mor¹ a polydisperzitu v rozsahu 1,02 až 5,0.
4. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že slabě kyselé až neutrální polární aprotické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující DMSO, sulfolan nebo dialkylsulfony.
5. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce kyseliny hyaluronové s protonizovaným bis anhydridem diethylentriaminpentaoctové kyseliny probíhá při teplotě 60 °C po dobu 24 hodin.
6. Použití derivátu získaného způsobem podle nároku 1 pro přípravu komplexu derivátu kyseliny hyaluronové s navázanou diethylentriaminpentaoctovou kyselinou s atomy kovů, kde derivát reaguje s halogenidem nebo acetátem kovu v prostředí vody a/nebo polárního aprotického rozpouštědla.
7. Použiti podle nároku 6, kde atomy kovů jsou kovy alkalických zemin Ca, Mg nebo přechodné kovy Fe, Gd, In, Zn, Eu, Tb a rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující DMSO, sulfolan nebo dialkylsulfony.
8. Použití derivátu získaného způsobem podle nároku 1 pro hydrofobizaci derivátu kyseliny hyaluronové s navázanou diethylentriaminpentaoctovou kyselinou pomocí alkylačních činidel, kde derivát reaguje s mono, bis anebo iris funkčním alkylačním činidlem obecného vzorce R-X obsahujícím jednu až tři skupiny X, kde R je alkylový lineární nebo rozvětvený řetězec C, - C₃₀, volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin, a kde X je halogen nebo skupina -O-SO₂-R, v prostředí vody a/nebo polárního aprotického rozpouštědla a báze, při teplotě 15 °C až 70 °C po dobu 1 až 150 hodin.
9. Použití podle nároku 8, kde báze je vybrána ze skupiny zahrnující anorganické sloučeniny obecného vzorce MHCO₃, M₂CO₃, MF, kde M je alkalický kov, nebo dusíkaté organické sloučeniny obecného vzorce R₃N, kde R je alkylový, lineární nebo rozvětvený řetězec Cj C₃₀ volitelně sobsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin, a rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující DMSO, sulfolan nebo dialkylsulfony.

1-5

Obr. 1 Změny v 'H NMR spektru směsi kyseliny hyaluronové a DTPA bis anhydridu v DMSO v čase 0,lh ^24h